专利名称：一种甲型肝炎灭活疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种甲型肝炎灭活疫苗的制备方法以及由所述方法制备的甲型肝炎灭活疫苗。
背景技术：
甲型肝炎，简称甲肝，是一类高发病率的病毒性传染病，可导致暴发流行，我国是甲型肝炎的高流行区，接种甲型肝炎疫苗是预防甲肝流行的最有效措施。
目前世界上有两种疫苗用于甲肝的预防控制，一种是甲肝减毒活疫苗，甲型肝炎减毒活疫苗如L-A-1株已规模生产近20年，在预防控制甲肝的暴发流行、降低发病率方面，起到了巨大作用，但减毒活疫苗存在毒力返祖、对一些个体如免疫缺陷者可能诱发严重疾病等缺点；另一种为灭活疫苗。甲型肝炎灭活疫苗免疫后抗体产生快，可用于控制甲肝暴发流行的应急免疫接种，在安全性、有效性及使用范围等方面均优于减毒活疫苗。近10年来，甲肝灭活疫苗的应用均显示其具有安全性好、免疫后抗体水平高、保护率高、效期长、稳定性好的优点。
灭活疫苗常用强毒株制备，在生产过程中存在感染操作者致病的危险，用减毒株制备甲肝灭活疫苗的操作过程更为安全，且大大提高疫苗的安全性，因此有必要研制用减毒株制备灭活疫苗，同时实现规模化生产的制备甲肝灭活疫苗的方法。
发明内容
本发明针对现有技术中制备用强毒株制备甲肝灭活疫苗存在感染风险的缺陷，提供一种用减毒株制备甲型肝炎灭活疫苗的方法，该方法所需甲肝病毒量少，工艺简单，具有规模化应用前景。
为了实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案 一种制备甲型肝炎灭活疫苗的方法，包括如下步骤 步骤1将甲型肝炎病毒毒种接种于人胚肺二倍体细胞2BS株，培养至病毒增殖高峰期，用胰酶常规消化细胞； 步骤2离心取沉淀加入细胞裂解液，使其充分作用； 步骤3加入聚乙二醇使其充分作用，离心取沉淀用PBS缓冲液悬浮，加入氯仿抽提，制备粗制甲肝病毒液； 步骤4步骤3制备的粗制甲肝病毒液经凝胶层析纯化后，经0.2μm滤膜除菌，灭活； 步骤5将步骤4制备的甲肝病毒液经超滤膜超滤，经氢氧化铝佐剂吸附，制成甲型肝炎灭活疫苗。
作为优选，步骤1所述毒种为甲型肝炎病毒L-A-1减毒株，已于1992年12月21日保藏在武汉中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNo.V92004。
作为优选，步骤1所述培养为利用多层细胞工厂或3L转瓶进行培养。
细胞工厂(cell factory)，是一种设计精巧的细胞培养装置，可在有限的空间内利用最大限度的培养表面，从而节省了大量的空间，并可节省贵重的培养液。更重要的是，它可有效地保证操作的无菌性，从而避免因污染而带来的原料、劳务和时间损失。在本发明的具体实施方式
中，采用丹麦NUNC公司生产的NUNC多层细胞工厂，是目前应用较多的细胞工厂系统，可用于如疫苗、单克隆抗体或生物制药等工业规模生产，特别适合于贴壁细胞，也可用于悬浮培养。
作为优选，步骤2具体为离心取沉淀加入细胞裂解液在2-8℃作用16-24h，所述细胞裂解液为含质量百分比2-5％乙二胺四乙酸二钠的0.2-0.5％去氧胆酸钠溶液。本发明所述细胞裂解液为发明人经过大量试验研制的细胞裂解液，可有效裂解病毒感染的细胞，使甲肝病毒充分释放。
步骤3中经PEG沉淀、氯仿抽提，可基本去除细胞杂蛋白。作为优选，步骤3所述聚乙二醇分子量为6000，终浓度为体积百分比8％～10％。
作为优选，步骤3所述PBS缓冲液为pH 5.5～7.5的0.01-0.02mol/L的PBS缓冲液。
作为优选，步骤4所述灭活具体为终浓度为200-250μg/ml的甲醛溶液灭活12-14天。步骤4所述凝胶优选为丙烯葡聚糖凝胶，在具体实施方式
中采用上海索莱宝生物科技有限公司生产的Sephacryl S-400HR。
作为优选，步骤5所述超滤膜的截留分子量为50-100KD。
本发明还提供由所述方法制备的甲型肝炎灭活疫苗。
作为优选，所述疫苗中灭活甲肝病毒浓度为640～1280EU/ml。经小鼠体内效力试验结果表明，本发明所述甲型肝炎灭活疫苗抗原含量为1280EU/ml时，半数有效稀释倍数高于参比苗，其免疫原性优于参比苗。
本发明采用的甲型肝炎病毒L-A-1减毒株的抗原性滴度达到较高水平，可有效地提高病毒产率，且减毒株制备的疫苗更加安全；使用国际上先进的细胞培养器多层细胞工厂，进行细胞培养，有效利用了空间，从而节省厂房面积，提高疫苗生产能力；经PEG沉淀、氯仿抽提，可基本去除细胞杂蛋白，再经一步凝胶过滤层析纯化，可得到高纯度较高的甲肝病毒。
本发明所述方法简化了工艺，降低了生产成本，并能够实现甲型肝炎灭活疫苗的规模化生产。
具体实施例方式 本发明公开了一种制备甲型肝炎灭活疫苗的方法及由所述方法制备的疫苗，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供的制备甲型肝炎灭活疫苗的方法，包括步骤1将甲型肝炎病毒毒种接种于人胚肺二倍体细胞2BS株，培养至病毒增殖高峰期，用胰酶常规消化细胞；步骤2离心取沉淀加入细胞裂解液，使其充分作用；步骤3加入聚乙二醇使其充分作用，离心取沉淀用PBS缓冲液悬浮，加入氯仿抽提，制备粗制甲肝病毒液；步骤4步骤3制备的粗制甲肝病毒液经凝胶层析纯化后，经0.2μm滤膜除菌，灭活；步骤5将步骤4制备的甲肝病毒液经超滤膜超滤，经氢氧化铝佐剂吸附，制成甲型肝炎灭活疫苗。
按照本发明，具体实施方式
中的实施例采用国际上先进的细胞培养器细胞工厂或3L转瓶，培养接种了甲型肝炎病毒L-A-1减毒株的人胚肺二倍体细胞(2BS株)，同时采用胰酶和细胞裂解液裂解病毒感染的细胞，使甲肝病毒充分释放，有效地提高了疫苗生产能力，能够实现甲型肝炎灭活疫苗的规模化生产，且简化了工艺，降低了生产成本。
下面结合实施例，进一步阐述本发明 实施例1 取长满单层的转瓶培养的人二倍体细胞(2BS株)，经0.25％胰蛋白酶消化，按比例接种至10层、40层细胞工厂，同时取L-A-1减毒株工作种子批毒种经适当稀释，接种人二倍体细胞，置35℃±0.5℃静止培养19-26天，期间每隔7-10天换液1次，待病毒增殖高峰期，弃去培养液，洗涤后经胰酶消化，将病毒感染的细胞悬液离心弃上清；离心沉淀按2-4倍比例加入含质量百分比2-5％乙二胺四乙酸二钠的0.2-0.5％去氧胆酸钠溶液，室温振荡2h，充分混匀，4℃作用24h，以充分裂解细胞，使病毒释放；加入终浓度为8％的聚乙二醇(MW6000)，4℃沉淀过夜，4500r/min离心1.5h；离心沉淀用1/10体积的0.01mol/L PBS缓冲液(pH 6.3)悬浮；加入等体积氯仿，重复抽提3～5次，制成粗制甲肝病毒液；将Sephacryl S-400HR凝胶装入层析柱中，用0.01mol/L PBS缓冲液(pH 6.3)平衡后，将粗制甲肝病毒液上样，用0.01mol/L PBS缓冲液(pH 6.3)洗脱，收集病毒洗脱峰，为纯化的甲肝病毒液；再经0.2μm滤膜除菌过滤，在无菌条件下加入终浓度为200μg/ml的甲醛37℃灭活12天。灭活的甲肝病毒液经50KD的超滤膜超滤，进一步检定合格后，根据病毒抗原性滴度水平做适当稀释，经氢氧化铝佐剂吸附制成半成品，将半成品分装于无菌的西林瓶中，制成成品疫苗。
表1.实施例1制备的甲肝灭活疫苗成分 本发明制备的甲型肝炎灭活疫苗经检定，无菌试验、异常毒性试验、pH值等检定项目均合格，氢氧化铝吸附后甲肝病毒无解离，体外相对效力达到1.48，检定数据见表1。
细菌内毒素检查方法和异常毒性检查方法均参照现行版《中国药典》附录相关方法进行；体外相对效力测定参照《中国药典》(2010版)附录XS进行。
表2实施例1制备的甲肝灭活疫苗成品检定结果 实施例2 取长满单层的转瓶培养的人二倍体细胞(2BS株)，经0.25％胰蛋白酶消化，按比例接种3L转瓶，同时取L-A-1减毒株工作种子批毒种经适当稀释，接种人二倍体细胞，置35℃±0.5℃旋转培养19-26天，期间每隔7-10天换液1次，待病毒增殖高峰期，弃去培养液，洗涤后经胰酶消化，将病毒感染的细胞悬液离心弃上清；离心沉淀按2-4倍比例加入含质量百分比2-5％乙二胺四乙酸二钠的0.2-0.5％去氧胆酸钠溶液(细胞裂解液)，室温振荡2h，充分混匀，4℃作用24h，以充分裂解细胞，使病毒释放；加入终浓度为10％的聚乙二醇(MW6000)，4℃沉淀过夜，4500r/min离心1.5h；离心沉淀用1/10体积的0.01mol/L PBS缓冲液(pH 6.3)悬浮；加入等体积氯仿，重复抽提3～5次，制成粗制甲肝病毒液；将Sephacryl S-400HR凝胶装入层析柱中，用0.01mol/L PBS缓冲液(pH7)平衡后，将粗制甲肝病毒液上样，用0.02mol/L PBS缓冲液(pH7)洗脱，收集病毒洗脱峰，为纯化的甲肝病毒液；再经0.2μm滤膜除菌过滤，在无菌条件下加入终浓度为250μg/ml的甲醛37℃灭活14天。灭活的甲肝病毒液经100KD的超滤膜超滤，进一步检定合格后，根据病毒抗原性滴度水平稀释至1280EU/ml，经氢氧化铝佐剂吸附制成半成品，将半成品分装于无菌的西林瓶中，制成成品疫苗。甲肝灭活疫苗(1.0ml)含有如下成分 表3.实施例2制备的甲肝灭活疫苗成分 本发明制备的甲型肝炎灭活疫苗经检定，无菌试验、异常毒性试验、pH值等检定项目均合格，氢氧化铝吸附后甲肝病毒无解离，体外相对效力达到1.59，成品检定数据见表4。
细菌内毒素检查方法和异常毒性检查方法均参照现行版《中国药典》附录相关方法进行；体外相对效力测定参照《中国药典》(2010版)附录XS进行。
表4实施例2制备的甲肝灭活疫苗检定结果 实施例3 将本发明实施例1、实施例2提供的甲型肝炎灭活疫苗进行小鼠体内效力试验，计算半数有效稀释倍数，观察其免疫原性。
取雌性NIH小鼠，体重16-18g，随机分组。试验分为4组，每组20只，阴性对照组注射氢氧化铝疫苗稀释剂；试验苗1组和试验苗2组分别注射实施例1和实施例2制备的疫苗，1280EU/ml；参比苗组国外甲型肝炎灭活疫苗，1440EU/ml。用疫苗稀释剂将试验苗和参比苗进行4倍系列稀释，共3个稀释度1∶4、1∶16和1；64。每只小鼠腹腔注射1.0ml，免疫4周后，心脏采血，离心分离血清，-20℃保存备用。采用ELISA竞争抑制法检测抗HAV抗体，按照Reed-Muench法计算半数有效稀释倍数。结果见表5。
表5本发明所述甲肝灭活疫苗小鼠效力试验结果
小鼠体内效力试验结果表明，实施例1和实施例2制备的甲肝灭活疫苗抗原含量为1280EU/ml时，半数有效稀释倍数均高于参比苗，其免疫原性优于参比苗，因此本发明提供的甲肝灭活疫苗优选HAV抗原含量为1280EU/ml。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
权利要求
1.一种制备甲型肝炎灭活疫苗的方法，包括如下步骤
步骤1将甲型肝炎病毒毒种接种于人胚肺二倍体细胞2BS株，培养至病毒增殖高峰期，用胰酶常规消化细胞；
步骤2离心取沉淀加入细胞裂解液，使其充分作用；
步骤3加入聚乙二醇使其充分作用，离心取沉淀用PBS缓冲液悬浮，加入氯仿抽提，制备粗制甲肝病毒液；
步骤4步骤3制备的粗制甲肝病毒液经凝胶层析纯化后，经0.2μm滤膜除菌，灭活；
步骤5将步骤4制备的甲肝病毒液经超滤膜超滤，经氢氧化铝佐剂吸附，制成甲型肝炎灭活疫苗。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1所述毒种为甲型肝炎病毒L-A-1减毒株，已于1992年12月21日保藏在武汉中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No.V92004。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1所述培养为利用多层细胞工厂或3L转瓶进行培养。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2具体为离心取沉淀加入细胞裂解液在2-8℃作用16-24h，所述细胞裂解液为含质量百分比2-5％乙二胺四乙酸二钠的0.2-0.5％去氧胆酸钠溶液。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3所述聚乙二醇分子量为6000，终浓度为体积百分比8％～10％。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3所述PBS缓冲液为pH 5.5～7.5的0.01-0.02mol/L的PBS缓冲液。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4所述灭活为终浓度为200-250μg/ml的甲醛溶液灭活12-14天。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤5所述超滤膜的截留分子量为50-100KD。
9.根据权利要求1-8任一项所述方法制备的甲型肝炎灭活疫苗。
10.根据权利要求9所述的甲型肝炎灭活疫苗，其特征在于，所述疫苗灭活甲肝病毒浓度为640～1280EU/ml。
全文摘要
本发明涉及生物技术领域，公开了一种甲型肝炎灭活疫苗的制备方法，即培养接种了甲肝病毒L-A-1减毒株的人胚肺二倍体细胞2BS细胞株至病毒增殖高峰期，用胰酶、细胞裂解液常规消化细胞，收获病毒液，经PEG沉淀、氯仿抽提，去除细胞杂蛋白，再经一步凝胶过滤层析纯化、滤膜除菌、超滤膜超滤、氢氧化铝佐剂吸附，制成甲型肝炎灭活疫苗。由此方法制得的甲型肝炎灭活疫苗经小鼠体内效力试验结果表明，半数有效稀释倍数高于参比苗，其免疫原性优于参比苗。本发明所述方法可提高疫苗安全性，简化工艺，降低生产成本，实现甲型肝炎灭活疫苗的规模化生产。
文档编号A61P31/14GK101816786SQ20101016051
公开日2010年9月1日 申请日期2010年4月30日 优先权日2010年4月30日
发明者刘令九, 岳立广, 赵小琳, 徐艳玲, 侯丽娟, 李海滨, 刘兵, 岳丹, 蔡晖, 徐晓霞, 李景良 申请人:长春生物制品研究所