专利名称：短棒状杆菌或其组合物在制备治疗乙型肝炎药剂中的应用的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及一种短棒状杆菌制剂(CPP)或无细胞短棒状杆菌制剂(NCPP)在制药领域中的应用，尤其涉及在制备治疗乙型病毒性肝炎药剂药剂中的应用，或联合抗乙型肝炎免疫球蛋白在制备治疗乙型病毒性肝炎药剂中的应用，属于药物领域。
背景技术：
乙型病毒性肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)引起的一种世界性疾病。发展中国家发病率高，据统计，全世界无症状乙肝病毒携带者(HBsAg携带者)超过2. 8亿，我国约占1.3 亿。多数无症状，其中1/3出现肝损害的临床表现。目前我国有乙肝患者3000万。乙肝的特点为起病较缓，以亚临床型及慢性型较常见。无黄疸型HBsAg持续阳性者易慢性化。本病主要通过血液、母婴和性接触进行传播。注射乙肝疫苗是预防和控制乙型肝炎的有效措施。拉米夫定是近年上市的一种抗乙肝病毒药，其英文名称为Lamivudine，化学名为 2，3，-双脱氧 _3，-硫代胞嘧啶(2，-3，deoxy-3，-thiocytidine)，又称 3-TC。国内外随机对照临床试验表明，每日口服IOOmg可明显抑制HBV DNA水平，HBeAg血清学转换率随治疗时间延长而提高，治疗1、2、3、4和5年后HBeAg血清转换率分别为16%、17%、23%、28% 和35% ；治疗前ALT水平较高者，一般HBeAg血清学转换率也较高。长期治疗可以减轻炎症，降低肝纤维化和肝硬化的发生率。随机对照临床试验表明，本药可降低肝功能失代偿和 HCC (肝细胞癌)发生率。在失代偿期肝硬化患者也能改善肝功能，延长生存期。国外研究结果显示，拉米夫定治疗儿童慢性乙型肝炎的疗效与成人相似，安全性良好。对乙型肝炎肝移植患者，移植前用拉米夫定；移植后，拉米夫定与乙肝免疫球蛋白 (HBIG)联用，可明显降低肝移植后HBV再感染，并可减少HBIG剂量。拉米夫定的化学本质是核苷类似物，而核苷酸则是合成人体遗传物质DNA和RNA 的原料。核苷类似物在结构上模拟核苷酸的结构，但却不具有核苷酸的功能。因此在DNA 合成过程中，核苷类似物可以掺入进去，但却不能合成有正常功能的核酸链，从而终止病毒的复制。近几年来，拉米夫定作为一种新的核苷类似物广泛被医患接受，其作用机制为抑制病毒DNA多聚酶和逆转录酶活性，并对病毒DNA链的合成和延长有竞争性抑制作用。拉米夫定可迅速有效降低血清HBV DNA水平，但是停药后复发率高，长期应用可导致病毒变异。拉米夫定是一个抑制病毒的药物，并不能清除乙肝病毒，因为对乙肝病毒cccDNA 没有作用，cccDNA在人体内的半衰期大约为3-4年，如果cccDNA持续存在，病毒就不会得到清除，停药后必然复发。因此在应用拉米夫定时，其疗效并不完全取决于药物本身，还和病人对HBV的特异性免疫反应状态及病毒毒力密切相关，对于特异性免疫反应弱的病人单独应用拉米夫定很难达到清除病毒的目的，还要想办法提高机体对HBV特异性免疫反应， 可以考虑联合应用胸腺肽、治疗性疫苗及高效价乙肝免疫球蛋白等。拉米夫定虽然见效快，但是1和2年之后的变异率很高(自身免疫力高低决定是否出现变异)。随用药时间的延长患者发生病毒耐药变异的比例增高(第1、2、3、4年分别为14%、38%、49%和66% )，从而限制其长期应用。另外，部分患者在停用本药后，会出现 HBV DNA和ALT水平升高，在发生病毒耐药变异后会出现病情加重，个别患者甚至可发生肝功能失代偿。因此，市场上迫切需要新的抗乙肝病毒药药物。
发明内容
本发明的目的在于提供一种短棒状杆菌制剂(CPP)或无细胞短棒状杆菌制剂 (NCPP)在制药中的新应用，即在制备治疗乙型病毒性肝炎感染中的应用，以及短棒状杆菌制剂或无细胞短棒状杆菌制剂联合乙肝免疫球蛋白或抗乙型肝炎免疫球蛋白在制备治疗乙型病毒性肝炎感染药剂中的应用。所述短棒状杆菌制剂是由短棒状杆菌(CP)经甲醛灭活后制成的制剂，所述NCPP为纳米级、颗粒大小均一、吸收度及扩散度提高，低热原、无甲醛残留，与全菌体制剂具有相同的脾激活及抑瘤等生物学活性，可减少CPP的发烧、注射局部红肿、硬结，肝肾毒性等副作用；短棒状杆菌制剂(CPP)或无细胞短棒状杆菌制剂(NCPP) 作为一种非特异性免疫调节剂，均具有明显的抗病毒的作用，可用于乙型病毒性肝炎感染的治疗或辅助治疗。为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为一种短棒状杆菌制剂在制备治疗乙型病毒性肝炎药剂中的应用。一种无细胞短棒状杆菌制剂在制备治疗乙型病毒性肝炎药剂中的应用。本发明所述的短棒状杆菌制剂(CPP，2000版《中国生物制品规程》)是一种非特异性免疫调节剂。它是由短棒状杆菌(CP)经甲醛灭活后制成的死菌苗，其制备过程公开在 1995版及2000版《中国生物制品规程》。目前应用的CPP制剂还有法国Merleux研究所生产的灭活菌苗；英国Wellcome药厂生产的灭活菌苗等。CPP具有激活单核吞噬细胞系统的能力。CPP对免疫系统的作用主要表现在激活单核巨噬细胞、使NK细胞活性增强、促进机体对多种抗原产生IgG和IgM、诱尘干扰素、白细胞介素-2等，因此具有抗肿瘤和抗感染作用。CPP的抗肿瘤作用已为许多实验和临床研究所证实。对实验动物接种肿瘤前后应用CPP，能显著抑制某些实体瘤(如乳腺癌、黑色素瘤等)、腹水型肿瘤及白血病的生长。肿瘤消退的动物对于再次攻击的肿瘤细胞有特异性的抵抗力。CPP对肿瘤转移亦有抑制作用。CPP抗肿瘤及抗感染的核心是通过激活巨噬细胞，使其数量和质量大大提高，激活的巨噬细胞可将肿瘤细胞及感染的微生物杀死。CPP作为免疫调节剂用于肿瘤及其它疾病的治疗已有数十年的历史，其通过激活单核巨噬细胞系统抗肿瘤、抗感染的效果已被公认。02123571. 6,02123570. 8和02123572. 4已经申请了一种无细胞短棒状杆菌制剂、
其制备方法和在制备治疗结核病药物上的用途。本发明所述无细胞短棒状杆菌制剂(NCPP)为由短棒状杆菌(CP)经破碎制备的无细胞制剂，粒度小于lOOnm。其中所述的CP，学名为粉刺丙酸杆菌(propionibacterium acnes)菌号为 65101 (76-27 或 7627),65102(H-84)或 65103 (77-1 或 771)。所述的NCPP的热原小于160EU/ml，蛋白质含量10 40% (g/g)，核酸含量3 25% (g/g)，其余为多糖。优选本发明NCPP的热原小于60EU/ml，蛋白质含量20 30% (g/g)，核酸含量3 10% (g/g)，其余为多糖。本发明NCPP的粒度优选为50 80nm。本发明所述的NCPP是通过下述步骤制备的1)CP工作种子批菌种连续2 4次传代后接种于大瓶或营养罐，在培养基中培养 5 7天2)收集无杂菌污染的菌体，加热煮沸15 60分钟得到菌液3)无菌试验合格的菌液经洗涤后，用破碎装置破碎菌体；4)菌体破碎后的悬液经离心后收集沉淀，洗涤沉淀制成悬液5)将悬液分装后加热灭菌，得到无细胞短棒状杆菌制剂。其中步骤1)中所述的CP学名为粉刺丙酸杆菌，菌号为65101 (76-27或7627)、 65102(H-84)或 65103 (77-1 或 771)。培养基为选自硫乙醇酸盐、蛋白胨、肝或酵母透析液培养基中的一种，且为低热原
培养基。步骤1)中培养条件为36 37°C培养。优选所述培养基为不含琼脂的硫乙醇酸盐培养基。其中步骤3)中所述的菌体是灭活菌，菌体浓度为50 500亿/ml。所述破碎装置是将菌体破碎到小于lOOnm，优选粒度为50 SOnm的超高压射流对撞机。其中所述菌体破碎是在无菌条件下进行。其中步骤幻中所述的洗涤是将沉淀物用无菌生理盐水离心洗涤至少2次步骤 4)中所述的洗涤是将沉淀物用无菌生理盐水离心洗涤O 5次。步骤4)菌体破碎后悬液的离心条件是在4°C 室温、6000 12000rpm离心30 150分钟。步骤5)中所述的加热为在60 65°C加热0. 5 2小时。本发明中所述培养基优选为经过0. 22 μ m或0. 45 μ m膜过滤的低热原培养基。本发明所述的制备方法中，还包括将步骤5)得到的NCPP冷冻干燥，得到NCPP的冻干制剂。上述方法制备的NCPP热原小于160EU/ml，蛋白质含量10 40% (g/g)，核酸含量 3 25% (g/g)，其余为多糖。优选上述方法制备的NCPP热原小于60EU/ml，蛋白质含量20 30% (g/g)，核酸含量3 10% (g/g)，其余为多糖。上述方法制备的NCPP粒度小于lOOnm，优选粒度为10_50nm。本发明中所述的无菌检验合格是指按照《中国生物制品规程》规定的方法检验不得有任何细菌生长。本发明中由于采用低热原培养基，特别是硫乙醇酸盐培养基，并结合严格的质控， 以及整个生产过程中无菌低热原操作，保证了最终产品低热原和无杂菌的污染。本发明通过超高压射流对撞机将CP破碎至纳米级，通过选择不同的离心力(转速)，确定了离心提取条件，获得的沉淀部分为NCPP，经多次动物试验证明，该制剂与全菌体具有相同的脾激活及抑瘤等生物学活性，上清部分则无脾激活及抑瘤作用，表明本发明的NCPP具有良好的生物学活性。为了消除CPP中残留甲醛对机体的刺激性，尤其是对敏感胸膜的刺激性，本发明中采用加热灭活替代了甲醛灭活。动物实验表明，加热灭活的NCPP、CPP较甲醛灭活的CPP 具有相同的脾激活及抑瘤等生物学活性。超高压射流对撞机的工作原理是将混有被加工物的液体用高压泵(工作压力为 10-3000kgf/cm2)加压后分成两股，以高速射流进入两片直径为8mm人造金刚石晶片组成的通道中，相向对撞后流出。由于液体的速度很高，流体相向对撞时产生很强的冲击波，使金刚石晶片产生高频、高强超声波。大功率高频超声波使被加工物颗粒瞬间粉碎、超微化。本发明的制备过程中，为更好地破碎菌体，采用超高压射流对撞机，在菌体浓度为 50 500亿/ml，工作压力为800 1500kgf/cm2的条件下破碎，破碎后的菌体悬液在4°C 室温下，6000 12000rpm离心30 150分钟，弃上清，沉淀用无菌生理盐水溶液洗涤0 5次后制成悬液，经配制、分装，在60 65°C加温0. 5 2小时，无菌试验合格后合并，得到高质量、粒度和均一性良好的目的产品。本发明的NCPP是将CP的细胞破碎至纳米级，经离心去除无效的上清部分，收集沉淀部分制备的，产品具有低热原、无杂菌污染、无甲醛残留，颗粒具有纳米级，粒度均一，吸收度和扩散度提高，有利于人体吸收并提高药效同时可减少发烧、胸痛，注射局部红肿、硬结等副作用，是一种有前途的免疫制剂。根据需要，本发明的NCPP可以制成无菌生理盐水的悬浮制剂，固体含量为1. Omg/ml或2. Omg/ml，也可以制成冻干粉针或适合药用的其他剂型本发明的CPP可为目前常用的剂型，如悬浮制剂、冻干粉针或适合药用的其他剂型。本发明所用的CPP、NCPP均为非特异性免疫增强剂，NCPP是由CP经破碎制备的无细胞制剂，为纳米级、颗粒大小均一、吸收度及扩散度提高，低热原、无甲醛残留，与全菌体制剂具有相同的脾激活及抑瘤等生物学活性，可减少CPP的发烧、胸痛，注射局部红肿、硬结，肝肾毒性等副作用，因此NCPP克服了 CPP的一些不足，可作为一种性能优异的非特异性免疫增强剂应用于抗肿瘤和抗感染等疾病的治疗。本发明的CPP、NCPP均为非特异性免疫增强剂，主要作用于巨噬细胞，对单核巨噬细胞系统具有强大而持久的刺激，且可通过促进造血多能干细胞分化为单核巨噬细胞，调动机体免疫系统蕴藏的潜力，发挥抗癌、杀微生物功能。CPP、NCPP抗乙型肝炎病毒作用主要是通过对单核巨噬细胞系统强大而持久的刺激，引起单核巨噬细胞增生、活化、吞噬功能增强及诱导分泌干扰素(IFN-γ)、白细胞介素 (IL-2)活性氧(Η202、Ν0)等杀伤因子及增强NK细胞杀伤活性，达到抑制和杀伤乙型肝炎病毒的目的。本发明的一种短棒状杆菌制剂或无细胞短棒状杆菌制剂在用于制备治疗乙型肝炎病毒药剂时，其用法为1 7次/周，每次0. 5 ％ig，肌肉注射或其他适宜途径给药， 1 4周为一个疗程或遵医嘱。可间隔用或连续使用几个疗程。本发明的短棒状杆菌制剂或无细胞短棒状杆菌制剂经动物实验证实对乙型病毒性肝炎的感染具有很好的治疗作用。本发明所用的CPP、NCPP为一种免疫调节剂，用于制备治疗乙型病毒性肝炎药剂，具有如下优点1.本发明提供了 CPP、NCPP新的医药用途，对治疗乙型病毒性肝炎提供了新的途径。2.本发明的NCPP制剂具有低热原、无杂菌污染、无甲醛残留，颗粒具有纳米级，粒度均一，吸收度和扩散度提高，有利于人体吸收并提高药效；同时可减少发烧、注射局部红肿、硬结，肝肾毒性等副作用，是一种有前途的免疫制剂，可作为用于制备治疗乙型病毒性肝炎药剂。3.本发明的制备工艺简单，可制成口服液、注射液、片剂等剂型，使用方便。4.本发明的NCPP制剂克服了化学药物治疗乙型病毒性肝炎易产生耐药性的缺
点ο本发明的制备方法、吸收性能及动物急性毒性实验的具体实施方式
同专利 ZL03157454. 8。
具体实施例方式以下具体实施方式
用于详细描述本发明，并不对本发明构成限制。实验例INCPP对北京麻鸭乙型病毒性肝炎感染的保护作用一、材料和方法1.材料1. 1动物1日龄北京麻鸭，150只，雌雄不限，购自北京前进种鸭厂。1. 2鸭乙型肝炎病毒阳性血清采自上海麻鸭，由中国医学科学院药物生物技术研究所惠赠，_20°C保存。1. 3质粒pUC18-DHBV-DNA(含有DHBV全基因组DNA)，由中国医学科学院药物生物技术研究所惠赠，_20°C保存。1.4 供试品供试品1 无细胞短棒状杆菌制剂(NCPP)，性状白色均一不透明液体，由中国药品生物制品检定所提供。供试品2 乙肝免疫球蛋白，由中国药品生物制品检定所提供。1. 5阳性药物拉米夫定(3TC)，剂型片剂，规格100mg/片，葛兰素史克制药有限公
1. 6 试剂Dig标记和检测试剂盒=Boehringer公司产品，SDS 购自华美生物工程公司，Citric Acid(柠檬酸三钠)Sigma公司产品，MALEIC ACID =Sigma 公司产品，Tris Amresco 公司产品氢氧化钠北京化工厂生产，氯化钠北京化学试剂公司生产，1.7其他材料Hybond N+ / 月莫(0. 45 μ m) 自 Amersham Phamacia Biotech ^W]，
2.方法2. 1建立鸭乙型肝炎动物模型1日龄北京麻鸭，经胫静脉注射麻鸭DHBV阳性鸭血清，每只0. 3ml,以构建鸭乙型肝炎动物模型。7天后取血，对每只模型麻鸭进行标记，进行real-time PCR及斑点杂交试验，检测血清中DHBV-DNA含量，筛选感染阳性麻鸭。2. 2实验分组及给药本次试验共设置10组，其中正常对照组(1组)10只麻鸭(不接种鸭乙肝病毒DNA阳性血清，仅给予生理盐水)，其余9组均选取经过筛选确证为DHBV感染阳性的麻鸭进行试验，除阳性药物组为5只外，其余各组均为15只，分别为模型组(给予生理盐水)、阳性药组(拉米夫定50mg/kg，)、NCPP 组(0. 5mg/只)、联合应用(NCPP 0. 5mg/只+乙肝免疫球蛋白1 25，0. 5ml/只)，拉米夫定灌胃给药，每日给药1次；供试品NCPP经肌肉注射给药、乙肝免疫球蛋白静脉注射给药，每2天给药一次，即分别在模型建成后的第1天、第3天、第5天、第7天和第9天给药。各组分别在给药前(Dtj)、给药后第5天(D5)、给药后第10天(Dltl)及停药后第 3天(P3)取鸭血清测DHBV-DNA含量，ALT、AST (在P3时取血清检测)含量，停药3天后各组麻鸭处死，并取肝脏作病理组织学检查。表1.实验分组
权利要求
1.一种短棒状杆菌制剂或无细胞短棒状杆菌制剂在制备治疗乙型病毒性肝炎感染药剂中的应用。
2.一种短棒状杆菌制剂或无细胞短棒状杆菌制剂联合乙肝免疫球蛋白或人源化或人源性抗乙型肝炎免疫球蛋白在制备治疗乙型病毒性肝炎感染药剂中的应用。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，其中所述短棒状杆菌制剂是由短棒状杆菌经甲醛灭活后制成的制剂。
4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，其中所述的无细胞短棒状杆菌制剂是由短棒状杆菌经破碎制备的无细胞制剂，粒度小于lOOnm，优选50 80nm。
5.根据权利要求1、2或4所述的应用，其特征在于，其中所述的无细胞短棒状杆菌制剂热原小于160EU/ml，蛋白质含量10 40% (g/g)，核酸含量3 25% (g/g)，其余为多糖。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，其中所述的无细胞短棒状杆菌制剂热原小于60EU/ml，蛋白质含量20 30% (g/g)，核酸含量3 10% (g/g)，其余为多糖。
7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，其中所述的短棒状杆菌为粉刺丙酸杆菌， 菌号为 76-27、H-84 或 77-1。
8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，其中所述的无细胞短棒状杆菌制剂通过下述方法制备的1)短棒状杆菌工作种子批菌种连续2 4次传代后接种于大瓶或营养罐养基中培养 5 7天2)收集无杂菌污染的菌体，加热煮沸15 60分钟得到菌液；3)无菌试验合格的菌液经洗涤后，用破碎装置破碎菌体4)菌体破碎后的悬液经离心后收集沉淀，洗涤沉淀制成悬液5)将悬液分装后加热灭菌，得到无细胞短棒状杆菌制剂。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，其中所述的培养条件为36 37°C；所述培养基为不含琼脂的硫乙醇酸盐培养基；所述的菌体是灭活菌，所述破碎装置是将菌体破碎到小于lOOnm，优选粒度为50 SOnm的超高压射流对撞机，破碎在无菌条件下进行步骤3)中所述的洗涤是将沉淀物用无菌生理盐水离心洗涤至少2次步骤4)中所述的洗涤是将沉淀物用无菌生理盐水离心洗涤0-5次菌体破碎后悬液的离心条件是在4°C 室温下，6000 12000rpm离心30 150分钟；步骤幻中所述的加热为在60 65°C加热0. 5 2小时。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，将步骤幻得到的无细胞短棒状杆菌制剂冷冻干燥，得到无细胞短棒状杆菌的冻干制剂。
全文摘要
本发明涉及一种短棒状杆菌制剂(CPP)或无细胞短棒状杆菌制剂(NCPP)在制药领域中的应用，尤其涉及在制备治疗乙型病毒性肝炎感染药剂中的应用，以及CPP或NCPP联合乙肝免疫球蛋白(HBIG)或抗乙型肝炎免疫球蛋白(人源化或人源性抗HBs)在制备治疗乙型病毒性肝炎感染药剂中的应用。所述CPP是由短棒状杆菌(CP)经甲醛灭活后制得的制剂，所述CPPP为纳米级、颗粒大小均一、吸收度及扩散度提高，低热源、无甲醛残留；本发明的CPP具有一定的抗乙型病毒性肝炎感染的作用，NCPP的效果较为明显，尤其以CPP甚或NCPP联合抗HBIG或HBs效果更为显著。
文档编号A61K35/74GK102232971SQ20101015070
公开日2011年11月9日 申请日期2010年4月20日 优先权日2010年4月20日
发明者李守悌, 高尚先 申请人:中国药品生物制品检定所