专利名称：醋甲唑胺在制备治疗强直性脊柱炎的药物中的应用的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及醋甲唑胺的一种新的医药用途，即在制备治疗强直性脊柱炎的药物中
的应用。
背景技术：
强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis, AS)是一种结缔组织病，以中轴关节慢 性炎症为主，主要累及脊椎及骶髂关节，关节出现纤维化和骨性强直，最后导致畸形。该病 也可累及内脏及其他组织导致慢性进展性风湿病。强直性脊柱炎多见于16 30岁男性青 壮年，不同地区、不同种族的发病率有很大差异。我国强直性脊柱炎的发病率为0.3%。
临床上，强直性脊柱炎患者呈现多关节病变，且绝大多数首先侵犯骶髂关节，以后 上行发展至颈椎。少数病人先由颈椎或几个脊柱段同时受侵犯，也可侵犯周围关节。早期 病变处关节有炎性疼痛，伴有关节周围肌肉痉挛，有僵硬感。随着病情发展，各脊柱段及关 节活动受限和畸形，晚期整个脊柱和下肢变成强硬的弓形，向前弯曲。 强直性脊柱炎药物在治疗上一般从自身免疫调节入手，结合消炎止痛，吸收死骨， 达到早期控制病情、降低致残率目的。目前，强直性脊柱炎药物治疗临床常用药物如下
(1)非甾体类抗炎药(NSAIDs):该类药有消化止痛、减轻僵硬和肌肉痉挛作用。但 此类药物有浮肿、血尿、胃肠反应和肾脏损害等副作用。 (2)柳氮磺胺吡啶(sulfasalzine，SSZ):该类药物是5-氨基水杨酸和磺胺吡啶的 偶氮复合物，主要对患者的外周关节有效，但对脊柱和肌腱端病效果不佳。此类药副作用主 要为消化道症状、皮疹等。 (3)甲氨喋呤(methotrexate, MTX):甲氨喋呤的疗效与柳氮磺胺吡啶相似，对外 周关节炎症状有明显改善，但脊柱症状没有变化。该药副作用有胃肠反应、骨髓抑制、口腔 炎、脱发等。 (4)肾上腺皮质激素强直性脊柱炎患者同时患有急性虹膜炎或外周关节炎且非
甾体类抗炎药治疗无效时，可用肾上腺皮质激素局部注射或口服治疗。
(5)雷公藤多甙有消炎止痛作用。该类药副作用有胃肠反应、白细胞减少等。 治疗强直性脊柱炎药物还有其它中成药，包括风湿康胶囊、青藤碱(商品名正清
风痛宁)、白芍总苷胶囊、火把花根片等。近年来，以抗肿瘤坏死因子抗体融合蛋白为基础的
生物制剂"益赛谱(Etanerc印t)"，也开始在临床使用，而且疗效显著。该制剂也广泛用于
治疗类风湿性关节炎。但此类药物为进口，价格昂贵。 由于强直性脊柱炎病因不甚明了，所以到目前为止，无阻止强直性脊柱炎进展的 有效疗法，无论中、西医，都还没有特别有效的方法和针对性药物。广泛使用的抗强直性脊 柱炎药物主要用于缓解病情，而非根本性的治疗。 强直性脊柱炎的组织病理学研究表明，病变关节部位不但骨组织发生严重损伤， 其滑膜组织也出现明显的细胞增生和炎症。但是，到目前为止，有关强直性脊柱炎的研究大 都集中在病变的骨组织上，对滑膜在病变中的作用鲜有报道。即使有研究报道也只限于研究病人的血液和关节滑液，而非直接研究病变组织_滑膜。 醋甲唑胺商品名为尼目克司，化学名称为5-乙酰胺基_4-甲基-l-硫-3， 4_ 二 氮茂磺酰胺，Acetamide， N_[5_(aminosulfonyl)_3_methyl_l，3， 4-thiadiazol-2(3H)-ylidene]-，分子量为236. 274，分子式为C5H8N403S2，结构为
H3C 醋甲唑胺药效上讲属于利尿药，用于治疗原发性开角型青光眼、闭角型青光眼及 某些继发性青光眼。该类药物可抑制房水生成，大部分患者用药后房水生成可减40%。醋 甲唑胺是国家批准药物，其药物动力学、药理学和毒理学实验数据完备。 蛋白质组学技术蛋白质组指组织、细胞内全部的蛋白。随着人类基因组的解码， 有关疾病的研究已进入所谓后基因组时代。当代的病理学研究发展要求对基因表达产物做 全面和系统的分析，而非过去那样盲人摸象式的研究。蛋白质组学的研究理念和技术兴起 于上世纪九十年代末，主要以二维电泳和质谱为技术手段大规模研究蛋白质组特征，包括 蛋白质的表达水平，翻译后的修饰，蛋白与蛋白相互作用等，由此可在分子水平上对疾病发 生，细胞代谢等过程进行全面地分析。目前。蛋白质组学技术已经在基因水平上为肿瘤、心 血管疾病、感染性疾病等重大疾病的病引研究方面深入取得了很大突破口，为这些疾病的 深入研究提供了重要线索。
发明内容
利用蛋白质组学技术及其它分子生物学技术，本发明提供了醋甲唑胺的一种新用 途，即在制备治疗强直性脊柱炎的药物中的应用。 具体应用方法为患者口服，每日口服25毫克量醋甲唑胺片两片，早晚饭后各服 一次；一般一个月见效，能明显改善降低强直性脊柱炎BASDAI和BASFI指数，减轻颈痛、背 痛和髋痛，减少晨僵时间和减少疼痛关节数，可明显降低患者的血沉和免疫球蛋白水平。
图1为强直性脊柱炎滑膜组织的2D电泳结果。 图2为Western blotting分析碳酸酐酶I (CA1)在强直性脊柱炎滑膜组织中的表 达，其中，图2(A):与类风湿性关节炎(RA)和骨关节炎(OA)相比较，CA1在强直性脊柱炎 (AS)滑膜组织呈高表达。图2 (B):以GADffl为参照物，分析CA1表达的相对水平，证明CA1 在强直性脊柱炎滑膜组织中高表达。 图3为免疫组织化学方法分析碳酸酐酶I (CA1)在强直性脊柱炎滑膜组织中的表 达。 图4为ELISA方法分析碳酸酐酶I (CA1)在强直性脊柱炎滑液中的表达。
图5为碳酸酐酶抑制剂醋甲唑胺对强直性脊柱炎的治疗效果，其中，图5(A)为AS 活动指数对比示意图；图5(B)为AS功能指数对比示意图；图5(C为)ESR对比示意图；图 5(D)为IgG对比示意图;图5(E)为IgA对比示意图；图5(F)为lgM对比示意图。ESR正常参考值< 20mm/h，CRP正常参考值< 6g/L， IgG正常参考值7_16g/L， IgA正常参考值0. 7_4g/ L， IgM正常参考值0. 4-2. 3g/L。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明 实施例1 :为了探索强直性脊柱炎发病原因，本发明的发明人利用蛋白质组学技 术对强直性脊柱炎患者滑膜组织进行了研究。 为了发现强直性脊柱炎特异的致病蛋白因子，用骨关节炎和类风湿性关节炎滑膜 组织做对照。骨关节炎是老年退行性的骨损伤，类风湿性关节炎是自我免疫性疾病。虽然二 者均表现为关节炎，以二者做对照，可以有效地去除那些仅仅与骨损伤和免疫有关的蛋白， 而发现强直性脊柱炎特异表达的蛋白。同时做比较三种疾病在蛋白质组学研究中还是不多 见的。 方法首先按常规方法提取病变滑膜组织(每种疾病各10个标本)的总蛋白，测 定其蛋白质浓度后将同种疾病每个滑膜标本的总蛋白按等比例浓度混合，组成各自疾病组 织的样本池。这是蛋白质组学研究过程中通常的样本处理方法。对每个样本池进行二维蛋 白质电泳，分离组织的总蛋白，然后比较三种疾病样本的蛋白表达图谱。用扫描方法对每个 蛋白点的表达量进行定量分析，同一位置上的蛋白点若有三倍以上的表达量差异则被认为 是明显表达差异。 结果通过与骨关节炎和类风湿性关节炎滑膜组织蛋白表达谱进行比对，发现碳 酸酐酶I (Carbonic Anhydrase I)在强直性脊柱炎滑膜组织中呈现特异性高表达，如图1 所示，经与类风湿性关节炎和骨关节炎的电泳结果对照，发现碳酸酐酶I(CAl， #5蛋白点) 在强直性脊柱炎滑膜组织中高表达。 用western blotting方法对以上每种疾病的滑膜样本逐一分析，证实了碳酸酐酶 I在强直性脊柱炎滑膜组织中呈现特异性高表达，如图2所示，由图可知，与类风湿性关节 炎(RA)和骨关节炎(OA)相比较，CAl在强直性脊柱炎(AS)滑膜组织呈高表达。以GADPH 为参照物，分析CA1表达的相对水平，证明CA1在强直性脊柱炎滑膜组织中高表达。
发明人也用免疫组织化学方法对碳酸酐酶I在强直性脊柱炎滑膜组织中的表达 分布进行了研究，发现了该酶在病变滑膜中呈现高密度的免疫信号，说明碳酸酐酶I在强 直性脊柱炎滑膜组织中表达。另外，用ELISA方法对强直性脊柱炎患者的关节滑液中进行 了检测，如图3所示，与类风湿性关节炎(RA)和骨关节炎(OA)相比较，CAl在强直性脊柱 炎(AS)滑膜组织中呈高表达。发现碳酸酐酶I在该病的滑液样本中也呈现高水平表达，如 图4所示，与类风湿性关节炎(RA)和骨关节炎(OA)滑液相比较，CAl在强直性脊柱炎(AS) 滑液中呈高水平表达。 分析碳酸酐酶I是红细胞的主要蛋白质成分之一，分子量约为30000道尔顿， 含一条巻曲的蛋白质链和一个锌离子结合区域。碳酸酐酶最重要的功能是催化二氧化碳 (C02)水合作用形成碳酸酐HC0f。该反应是可逆反应，在生理pH值条件(pH^ 7)下快速 进行。上述反应对呼吸作用极为重要，可将体内废物(A通过循环系统带出体外。碳酸酐 酶的主要生理功能包括在血液及其他组织中维持酸碱平衡，帮助体内组织排除(A，确保以 C02和HC0f为催化底物的酶保持适度的底物浓度。实际上，自然界中广泛存在碳酸酐酶，该酶来源于植物、动物、微生物体及其残体，具有高效快速催化(A和HCOf之间的相互转化 的功能，对地球生态系统的碳循环和钙循环起着重要作用。 发明人对碳酸酐酶I在强直性脊柱炎关节滑膜中高水平表达的意义进行了研究 建立一体外反应体系，在Tris-HCl缓冲液(pH = 7)中加入牛红细胞中提取的碳酸酐酶I和 氯化钙。通入C02后，C02在此反应体系中被碳酸酐酶I催化成HC03—。不稳定的HC03—很快 与氯化*丐的^离子结合形成碳酸*丐沉淀(CaC03)。实际上，Ramana和Parissa也都分别完 成过类似实验，得到类似结果。钙盐是骨的重要组成成分。钙沉淀形成钙盐晶体是新骨形 成过程中极其重要的步骤。根据碳酸酐酶的酶学特征和体外实验结果，发明人认为强直性 脊柱炎关节滑膜中大量表达的碳酸酐酶I可以打破原来的(A和HC(V的酸碱平衡和适度的 底物浓度，促使C02水化合产生大量HC03—，在病变关节滑囊和肌腱附着点处形成钙盐沉淀， 从而促进骨钙化和矿化过程导致新骨形成。而新骨形成正是是强直性脊柱炎关节纤维化和 骨性强直的决定性过程。另外有实验表明，喂食碳酸酐酶抑制剂老鼠的牙齿出现畸形，说明 碳酸酐酶I确实与骨形成有密切关系。这是首次利用蛋白质组学方法发现强直性脊柱炎关 节新骨异常发生的关联基因。以上发现提示，抑制强直性脊柱炎关节滑膜中碳酸酐酶I的 活性是治疗该病的一个关键点。 目前在高等脊椎动物(包括人类)体内已发现15种碳酸酐酶同工酶，主要参与机 体内的呼吸作用、体液循环、生物合成反应(如糖异生、脂肪及尿素生成)、肿瘤生成、骨吸 收等生理过程。由于碳酸酐酶具有重要的生理和病理作用，有大量关于该酶抑制剂的研究 报道，而且该酶抑制剂作为药物早已广泛使用。临床上使用的碳酸酐酶抑制剂主要有无机 金属络合物和磺胺衍生物2类，其中磺胺类抑制剂是最为重要的一类。临床上使用的磺胺 类碳酸酐酶抑制剂主要用于治疗青光眼、结膜炎、虹膜炎、眼色素层炎或葡萄膜炎，至今已 有50年的历史，其作用机制是通过抑制碳酸酐酶同工酶减少眼房水生成，降低眼内压。目 前这类药物主要是乙酰唑胺(acetazolamide)和醋甲唑胺(methazolamide)。乙酰唑胺和 醋甲唑胺均为国家批准的药物，有大量药物动力学、药理学、毒理学实验数据。由于醋甲唑 胺的药效使乙酰唑胺的五十倍左右，因此，醋甲唑胺的药效已替代乙酰唑胺广泛使用。
实施例2:临床治疗 患者资料筛选2名强直性脊柱炎病人(分别称患者S和患者L)。患者病情处于 相似的发病阶段。诊断采用1984年修订的纽约标准。以上2名患者按如下分期诊断标准符 合中期强直性脊柱炎特征，即①颈、背、腰、髋、膝、肩、胸锁关节，肋间神经，骶髋关节疼痛， 活动受限，伴轻度强直；②X线片显示骶髋关节面破坏，关节边缘模糊，间隙变窄；③实验室 检查显示血沉增高(ESR)，C反应蛋白增高(CRP)。皆符合三条标准。患者无虹膜炎的历史、 现象或后遗症，类风湿因子RF阴性。患者以前曾接受上述强直性脊柱炎的常规治疗，病情 得到缓解，但无明显疗效。医生体检显示两名患者心、肺、肝等器官正常，也无眼部疾病。血 液检测、尿液检测显示两名患者除免疫球蛋白G、ESR、CRP夕卜，其它生理指标正常。另外，两 位患者的类风湿因子和抗CCP抗体阴性。 治疗方法使用醋甲唑胺片对患者进行治疗。患者在接受治疗前已停止服用其它 药物3个月以上。醋甲唑胺片由杭州澳医保灵药业有限公司生产，国药准字H20000035。患 者每人每日口服25毫克量醋甲唑胺片两片，早晚饭后各服一次，治疗期为三个月。为观察 醋甲唑胺治疗效果，在治疗期间不服用其它药物。在治疗前和治疗后每月复查一次，记录患者强直性脊柱炎AS活动指数(BASDAI)和AS功能指数(BASFI)状况，并进行血常规、尿常规、肝肾功能和血生化检查，重点检测患者ESR、 CRP的变化，也记录不良反应状况。患者均
签署知情权协议。
结果 患者S，男，28岁，有12年的强直性脊柱炎病史，治疗一个月后，AS功能指数BASFI由51降至37，第二个月后降至31。 AS疾病活动指数BASDAI治疗一个月后由27降至25，第三个月后降至22。治疗前后比较，患者BASDAI和BASFI均下降，差异均有统计学意义(均P < 0. 05)。患者在治疗后，颈痛、背痛、髋痛、触压痛和晨僵有逐步改善，其它关节的疼痛明显有改善，疼痛关节数减少。同时，患者关节活动能力明显增强。CRP治疗前为45mg/L，两个月后降至16mg/L， ESR治疗三个月后由36mm/h降至9mm/h。比较治疗前后，ESR明显均下降，差异均有统计学意义(均P〈0.05)。患者治疗前IgG明显超过正常范围，但IgA和IgM在正常范围以内。从治疗三个月后，患者血清IgG、 IgA和IgM明显下降，IgG降至正常范围，说明处于病情好转阶段。治疗期间患者无明显不良反应，但三个月后，尿检显示尿蛋白略有上升。另外，治疗第一个月后，患者血液钙离子浓度由高于正常值的3. 05mmol/L降至正常范围。以上结果见图5。通过临床观察和常规检测发现、患者经醋甲唑胺治疗三个月后，AS活动指数(BASDAI) ， AS功能指数(BASFI)和ESR明显下降，显示醋甲唑胺对该病的良好治疗效果。 患者L，男，28岁，有近3年的强直性脊柱炎病史，病情相对较轻。治疗一个月后，AS疾病活动指数BASFI由12降至8，三个月降至5。 AS活动指数BASDAI治疗一个月后由12降至8，三个月后降至3。总体上讲，治疗前后比较，患者BASDAI和BASFI均明显下降，差异均有统计学意义(均P〈0. 05)。患者治疗后三个月后，颈痛、背痛和髋痛明显改善，其它关节疼痛感和晨僵消失，说明疾病明显好于治疗前。该患者CRP和ESR治疗前后均在正常范围内，ESR治疗第一月内由7降至6，三个月后降至4。患者治疗前IgG高于正常值、IgA略高于正常值，IgM处于正常范围。治疗两个月后，IgG有所下降，降至正常值12.38mg/L。IgA无多大变化，一直稍微高于正常值。IgM治疗前后一致处于正常值。治疗期三个月后，尿检显示尿蛋白、胆红素和白细胞略有上升。患者治疗第一个月后，有腹泻和皮肤瘙痒症状，但在治疗三个月后消失。患者血液钙离子浓度治疗前后无大变化，一直处于正常范围。结果见图5。 讨论通过对以上2名患者的两个月的治疗观察，发现服用醋甲唑胺片一个月后，即能明显改善降低强直性脊柱炎BASDAI和BASFI指数，减轻颈痛、背痛和髋痛，减少晨僵时间和减少疼痛关节数、显示醋甲唑胺片对治疗强直性脊柱炎有明显的疗效。结果还显示，在ESR相对较高时，醋甲唑胺治疗可明显降低ESR。醋甲唑胺治疗对强直性脊柱炎患者免疫球蛋白水平影响不一。治疗第一个月后，可明显降低患者的免疫球蛋白G水平，但对免疫球蛋白A和M无大影响。虽然醋甲唑胺治疗无明显副作用，但两名患者尿液的蛋白水平均略有上升，一名患者也出现腹泻和皮肤瘙痒，与药物说明书所描述的药物副作用一致。影像学检查未发现强直性脊柱炎患者脊柱和骶髂关节有病情加重趋势。 结论醋甲唑胺片是潜在的治疗强直性脊柱炎的有效药物，值得今后在临床治疗作中应用。
意义到目前为止，传统的强直性脊柱炎治疗药物都是通过抑制炎症通路去治疗该病。而强直性脊柱炎除了炎症之外，更明显的组织病理特点是异常新骨生成并导致脊柱强直。所以，传统的治疗药物都只能缓解病情而无法达到根本治愈的目的，因为这些药物无法阻止骨的异常增生。另外，至今为止也无治疗强直性脊柱炎的专门药物。现有治疗药物，对类风湿性关节炎有更好的治疗效果，说明强直性脊柱炎的治疗需要有针对其病理特点的药物。醋甲唑胺可以有效抑制碳酸酐酶活性，抑制碳酸钙晶体形成——这一骨生成的决定性步骤，从而达到治疗骨强直的目的。
权利要求
醋甲唑胺在制备治疗强直性脊柱炎的药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了醋甲唑胺的一种新用途，即在制备治疗强直性脊柱炎的药物中的应用。具体应用方法为患者口服，每日口服25毫克量醋甲唑胺片两片，早晚饭后各服一次；一般一个月见效，能明显改善降低强直性脊柱炎BASDAI和BASFI指数，减轻颈痛、背痛和髋痛，减少晨僵时间和减少疼痛关节数，可明显降低患者的血沉和免疫球蛋白水平。
文档编号A61P19/02GK101785770SQ20101013171
公开日2010年7月28日 申请日期2010年3月25日 优先权日2010年3月25日
发明者常晓天, 张云忠, 闫新峰, 韩金祥 申请人:常晓天;张云忠;闫新峰;韩金祥