一种能无限自我更新的神经干细胞、其制备方法及其用途的利记博彩app

专利名称：一种能无限自我更新的神经干细胞、其制备方法及其用途的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及细胞学、神经生物学领域，具体地，本发明涉及一种神经干细胞、其制备方法及其用途。
背景技术：
神经干细胞(neural stem cell, NSC)是一类具有分裂潜能和自我更新能力的母细胞，它可以通过不对等的分裂方式产生神经组织的各类细胞。根据分化潜能的时序分为 主要存在胚胎时期的神经管上皮细胞、放射状胶质神经元和神经母细胞。放射状胶质神经元主要存在于幼年时期，可以分裂产生本身并同时产生神经元前体细胞或是胶质细胞；神经母细胞主要存在于成年动物体中，可以产生神经前体细胞、神经元和各类神经胶质细胞。 而根据部位分类可以主要分两类可发育为外周神经细胞、神经内分泌细胞和Schwann氏细胞和平滑肌细胞等的神经嵴干细胞(neural crest stemcell, NC-SC)；可发育成为神经系统的大部分细胞，称为中枢神经干细胞(CNS-SC)，主要存在于脑部。目前将具有分化为神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞的能力，能自我更新并足以提供大量脑组织细胞的细胞都统称为NSC。在神经系统疾病的治疗方面，除了传统的药物、手术及康复治疗外，近年来细胞移植治疗神经系统疾病研究得到了广泛开展，主要包括骨髓间充质干细胞、胚胎干细胞与NSC 移植等。2009年，Sharp等人成功的将人胚胎干细胞注射到脊髓损伤的大鼠体内，从而使大鼠恢复了运动能力(Jason Sharp, Jennifer Frame, Monica Siegenthaler, et al. Human embryonic Stem Cell-Derived OligodendrocyteProgenitor Cell Transplants Improve Recovery after CervicalSpinal Cord Injury. Stem Cells，2009，1002 (10) ·)。但直接注射胚胎干细胞还存在形成肿瘤的风险。Brederlau等人将分化16天人胚胎干细胞移植入 Parkinson病大鼠体内，结果显示在22只大鼠中有16只生成畸胎瘤；而将分化23d的细胞进行移植实验却未发现生成畸胎瘤情况(Brederlaua.，Correia A. S.，Anisimovs S. V.， et al. Transplantation of Human Embryonic Stem Cell-Derived Cells toa Rat Model of Parkinson's Disease :Effect of In VitroDifferentiation on Graft Survival and Teratoma Formation. StemCells, 2006, 24 1433 1440.)。这说明未完全分化的细胞容易生成畸胎瘤，直接应用到临床还是存在风险的。而利用NSC进行细胞移植治疗神经系统疾病是有效且安全的选择。NSC细胞不具有成瘤性，具有向神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞分化的潜能；是未分化的原始细胞，不表达成熟的细胞抗原，不被免疫系统识别，具有低免疫源性；其组织融合性好，可以与宿主的神经组织良好融合，并在宿主体内长期存活，是最理想的细胞移植材料。NSC不仅可以存活和整合入宿主组织中，分化出神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞，填充因损伤造成的空洞，并且可以和宿主细胞之间形成突触样的结构，使神经组织损伤区域的结构得以重建，进而恢复中枢神经系统的部分功能(YW Z，et al. . Oligodendrocyteprogenitor cells derived from human embryonic stem cellsexpress neurotrophic factors. Stem
3Cells and Development. 2006，15 :943_952·)，因此业内一直致力于NSC的临床应用研究。NSC可以由胚胎干细胞、诱导多能干细胞和其它干细胞分化而来。胚胎干细胞(embryonic stem cell, ES)是从哺乳动物的囊胚内细胞群(inner cell mass, I CM)和原始的生殖细胞(primordial germcells, PGC)着床前胚胎内细胞团中分离出来的一种全能性的多功能干细胞，这种细胞可以在体外进行扩增培养(Reubinof B E, hsyksonP, Turetsky T, et al. Neural progenitors from human emb ryonicstem cells. Nat Biotehnol，2001，19 (12) :1134_1140.)。胚胎干细胞具有可以自我复制、自我更新并能发育为完整的生物个体并可以产生后代的能力，在一定的条件下，其可以分化为人体的200多种类型的细胞，并可以构建成心、肺、肝、脾、肾等各种组织和器官，最终可以发育成一个完整的生物个体(Heins N, Englund MC, SjoblomC, et al. Derivation, characterization, and differentiation ofhuman embryonic stem cells. Stem Cells, 2004,22(3) :367-376. Reubinoff BE, Pera MF, Fong CY, et al. Embryonic stem cell linesfrom human blastocysts:somatic differentiation in vitro. NatBiotechnol, 2000,18(4) :399-404.)。胚胎干细胞与成体组织中的干细胞不同，胚胎干细胞具有以下特点具有多向分化潜能和受精卵的某些特性，保持未分化状态，具有自我复制的能力，可以分化为生物体内各种类型的组织细胞；可以在体外培养的条件下通过单细胞克隆建立有相同遗传特性的稳定的细胞系，可长期增殖培养并保持高度未分化状态和发育潜能性；胚胎干细胞端粒酶活性呈阳性，具有维持端粒长度，保持干细胞增殖能力的重要作用；胚胎干细胞注射到裸鼠皮下，可形成畸胎瘤；胚胎干细胞也较易于形成嵌合体动物和进行基因改造， 从而成为细胞与个体之间的桥梁并成为临床细胞移植治疗新的细胞来源。日本京都大学的Yamanaka等研究发现利用逆转录病毒将c_Myc、Klf4、0ct4、 Sox2这4个转录因子基因整合入小鼠成纤维细胞可以获得成体细胞诱导的多能干细胞 (induced pluripotent stem cell, iPS细胞)，即多能性干细胞。通过用逆转录病毒向小鼠皮肤的成纤维细胞中导入4个不同作用的关键基因0ct3/4、Sox-2、Klf-4与C-myc， 使它们与原有基因发生重组，成功地对成纤维细胞实现了基因重新编排，产生的细胞最终具有胚胎干细胞的特性，具备变成机体任何细胞的潜能，它们能和真正的胚胎干细胞一样发育，参与形成胎儿小鼠的身体各部分(Okita K, Ichisaka T, Yamanaka S. Generationof germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature. 2007 ；448 (7151) 313-7. Wernig Μ,Meissner A,Foreman R,et al. In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotentES-cell-like state. Nature. 2007 ；448(7151) :318_24·)。2007 年 11月底，Yamanaka课题组及Thomson JA课题组同时从人的纤维细胞诱导成具有多分化潜能的 iPS 细胞(Takahashi K, Tanabe K, OhnukiM, et al. Induction of pluripotent stem cells from adult humanfibroblasts by defined factors. Cell. 2007 ；131 (5) 861-72. YuJ, Vodyanik MA,Smuga-Otto K,et al. Induced pluripotent stemcell lines derived from human somatic cells. Science. 2007 ；318 (5858) :1917_20)。2008 年 1 月哈佛大学 Daley GQ i果题组也证实了这一实验(Park IH, Zhao R，West JA, et al. Reprogramming ofhuman somatic cells to pluripotency with defined factors.Nature.2008 ； 451 (7175) 141-6) 国内中科院广州生物医药与健康研究院的裴端卿、秦大江课题组掌握并发展了干细胞研究新技术，利用未经修饰并且不带有选择标记的小鼠成体细胞，探索
4出了直接运用ip s技术的新途径，并获取了近千分之三左右的高成功率(Qi H, PeiD. The magic of four-induction of pluripotent stem cells fromsomatic cells by 0ct4, Sox2, Myc and Klf4. Cell Res. 2007 ； 17 (7) :578_80)。iPS细胞类似胚胎干细胞，具有胚胎干细胞的很多生理生化特性，例如，可以在体外快速增殖并稳定传代；并可持续表达胚胎干细胞的标志蛋白0ct4，Sox2, SSEA-I和 Nanog ；持续具有碱性磷酸酶活性；裸鼠皮下注射有成瘤性；体内体外分化实验证明可分化为三胚层；小鼠和大鼠的多能性干细胞还可获得嵌合鼠等。继小鼠之后，用逆转录病毒将 c-Myc.Klf4.0ct4.Sox2这4个转录因子基因整合入人成纤维细胞可以获得人的iPS细胞。 与此同时，用慢病毒将0Ct4、SOX2、NanOg、Lin28基因整合入人成纤维细胞也获得了多能性干细胞。从高度分化的体细胞诱导产生多能性干细胞，有广泛的应用前景，例如，多能性干细胞可以用于建立体外疾病模型，进行药物筛选和细胞替代疗法等，而且，将体细胞转化为有胚胎干细胞特性的细胞系后，那么一种高度分化的体细胞就可可能转变为另一种高度分化的体细胞。因为多能性干细胞的研究有可能避免诸多的伦理问题，因此，全世界许多实验室也投入了 iPS细胞的研究工作，并且成功将多种细胞诱导为多能性干细胞，如成纤维细胞、终末期分化的淋巴细胞、角质细胞、肝细胞、胃上皮细胞和属于成体干细胞的神经干细胞。NSC在动物实验和临床前研究中已显示出良好的应用前景。2009年1月22日， 美国著名的胚胎干细胞研发公司GERON公司获FDA批准，将开展用ES分化而来的神经胶质祖细胞GRN0PC1治疗脊髓损伤的人体试验。GERON公司前期的临床前研究表明GRN0PC1 注射到脊髓损伤的部位，能够迁移到受损部位并能够成熟为有功能的少突胶质细胞，这些细胞具有轴突再生和分泌因子的功能，注射GRN0PC1的实验组动物较对照组运动功能得到显著改善。将从人胚胎分离得到的NSC直接移植到大鼠帕金森疾病模型的大脑内部后， NSC可以向表达酪氨酸羟化酶(TH)的多巴胺能神经元分化，并明显改善运动不平衡症状； 移植到亨廷顿舞蹈症(Huntington’ s disease, HD)大鼠模型脑内后，实验中可以得到大量的由NSC分化来的神经元细胞，这些细胞可以沿着宿主的白质区纤维束包括正常的纹状体传出途径投射，其中发现部分可以重建神经通路。一些研究也证明将人胚胎干细胞分化来的少突状神经胶质细胞，移植到动物体内可以明显改善其运动功能和促进髓鞘损伤部位的再生(Keirstead HS, Nistor G，Bernal G，et al. Humanembryonic stem cell-derived oligodendrocyte progenitor eel!transplants remyelinate and restore locomotion after spinalcord injury. J Neurosci.，2005，25(19) :4694_4705· Nistor GIiTotoiu M0, Haque N，et al. Human embryonic stem eellsdifferentiate into oligodendrocytes in high purity andmyelinate after spinal cord transplantation. Glia.，2005，49 (3) 385-396. Utzschneider DA, Archer DR, Kocsis JD, etal. Transplantation of glial cells enhances action potentialconduction of amyelinated spinal cord axons in themyelin-deficient rat. Proc Natl Acad Sci，1994，91 (1) :53_57. Warrington AE, Barbarese E，Pfeiffer SE. Differentialmyelinogenic capacity of specific developmental stages of theoligodendrocyte 1ineage upon transplantation intohypomyelinating hosts. J Neurosci Res. ,1993,34(1) :1_13.)0
但是目前从ES定向分化获得的NSC或者直接从动物体内分离培养的NSC在体外培养时通常只能传几代，不能无限自我更新，难以为临床应用提供更多的细胞。目前多使用转基因的方法，建立NSC永生化细胞系。这类NSC能自我复制并在体外大量增殖，在移植入人体内后仍具有多向分化潜能，但转基因操作对这类细胞的临床应用存在威胁，而且这类细胞还往往具有高致瘤性。以往认为中枢神经系统的神经元在出生前或出生后不久，就失去再生能力。因此，提供无致瘤性、且能够在体外快速增殖和稳定传代的NSC，成为目前的当务

发明内容
为此，申请人经过深入研究，终于通过将ES细胞和诱导多能干细胞进行定向分化后，或者直接从动物脑组织中分离后进行体外培养，获得了一类可以在体外长期传代培养且的细胞，该细胞同时表达0ct4和Soxl。已知0ct4是POU家族的转录因子，是植入前胚胎发育的重要调节因子，是哺乳动物多能性细胞维持多能状态的关键调控因子，是细胞多能性的标志。Sox家族的HMG-box转录因子在维持神经干细胞多潜能能力方面扮演着重要的角色，Soxl是胚胎干细胞向神经干细胞分化过程中表达最早的神经标志物，它只在神经系统中表达，并且可以标识在神经管内增殖的神经干细胞池。因此，Soxl较巢蛋白在鉴定神经干细胞方面更具有特异性。Sox 家族的其他成员如Sox2和Sox3等在神经前体细胞中也有表达。Soxl是神经细胞最为早期的信号标记蛋白。该类细胞在仅为N2B27的基础培养液内不能长期维持生存。添加GSK/3 信号通路抑制剂CHIR99021可以维持0ct4的表达，CHIR99021的添加剂量在一定范围内与 0ct4的表达量正相关。CHIR99021还可以维持多种非神经细胞的增殖和自我更新。本发明还添加一种ROCK信号通路抑制剂Y27632，主要维持细胞Soxl的表达，在一定范围内，Soxl 的表达量与Y27632的添加剂量正相关。由此确定所获得的细胞是NSC (神经干细胞)。通过经实验验证本发明的这类NSC细胞可以在无血清无饲养层的化学培养基内培养，裸鼠体内注射不存在致瘤性，临床应用安全性好。而且该类NSC细胞可以在有血清的条件下只分化为各种神经细胞。由此使为临床应用提供大量的NSC成为可能，进而完成了本发明。具体地，本发明提供了以下多个方面的内容。在一个实施方案中，本发明提供了一种神经干细胞，其特征在于同时表达标志蛋白0ct4和Soxl，并可在体外快速增殖和稳定传代。另一个实施方案中，本发明提供了一种神经干细胞(neural stemcelLNSC)株，这类细胞主要的特征是1)同时表达特征蛋白0ct4和Soxl，其中0ct4是维持该类NSC在体外长期传代和自我更新的关键基因，而Soxl的表达证明该类NSC仍是神经干细胞；2)可以在无血清无饲养层的培养液内培养；3)可在体外长期传代和扩增，细胞核型正常；4)能继续分化为多种神经元和神经胶质细胞。本发明所述的神经干细胞，还同时表达Sox2、Nestin和Pax6。
本发明所述神经干细胞，其分离自哺乳动物的脑组织。在本发明的一个实施方案中，提供了获得本发明的NSC细胞的方法，具体包括无菌条件下获得从动物的胎儿脑组织(例如小鼠胎儿脑组织)，用胰酶消化分散后，用含添加 ROCK信号通路抑制剂和GSK/3信号通路抑制剂的神经细胞培养液培养至有神经球样细胞悬浮，将悬浮细胞继续消化传代培养，收集继续存活的少数表达0ct4和Soxl的细胞，由此获得本发明的NSC细胞。其中所述的动物的胎儿脑组织可以来自人、大鼠、小鼠、狗、兔、猴子等。在本发明的一个实施方案中，本发明所述的神经干细胞是通过定向分化哺乳动物胚胎干细胞或诱导多能干细胞获得的。在本发明的一个实施方案中，本发明所述的NSC可以通过对动物(例如小鼠和大鼠)的神经细胞ES的定向分化获得，所述的方法的特征是分化液为添加ROCK信号通路抑制剂和GSK/3信号通路抑制剂的神经细胞培养液，将ES细胞先贴壁分化至表达Soxl 的细胞开始聚集悬浮成神经球时，收集悬浮的神经球，再Laminin上继续贴壁培养，通过贴壁-悬浮-再贴壁的方法完成NSC细胞富集。由于添加了 GSK/3信号通路抑制剂，这类细胞还低表达0ct4，可以在无血清无饲养层的化学限定性培养基内长期培养。本发明所述的神经干细胞，其在体内可以分化为神经元和神经胶质细胞。在本发明的又一个实施方案中，该类细胞在含血清的基础培养液内只分化为神经细胞。添加不同的诱导分化因子，该类细胞也可分化为表达HB9的运动神经元，表达TUJl、 TH的多巴胺神经元和表达等标记物的胶质细胞。在本发明的又一个实施方案涉及本发明的神经干细胞在制备治疗神经退行性疾病的药物中的用途。神经退行性疾病(Neurodegenerative disease)是一类慢性、进行性神经系统疾病，主要包括帕金森氏症、老年痴呆症、脑中风、退行性心脏病等老年性疾病，且多发于高龄的人群，近些年来，随着社会的老龄化程度加剧，神经退行性疾病在所有疾病中占有越来越重要的地位。随着神经退行性疾病发病率的逐年上升，此类疾病也受到了世界的许多专家和学者的关注，并成为医学上的一大难题。在本发明的又一个实施方案涉及本发明的神经干细胞在治疗脊髓损伤(spinal cord injury, SCI)中的用途，SCI是中枢神经系统常见的严重创伤，因其高致残率和高病死率，SCI —直是世界性的医学难题。传统的治疗手段如手术减压、药物与高压氧等虽然可以有效减轻其继发损害，但是无力解决SC I治疗的核心问题——重建神经元、轴突与突触后联系，恢复中枢神经系统的功能。在SCI病人中，大多数为青壮年，此类损伤导致的劳动力丧失对病人、家庭和社会带来了极大的痛苦和负担。因此，对SC I病人进行积极救治，挽救肢体功能，尽可能恢复伤者的生活能力，甚至劳动能力，具有极其重要的经济价值和社会效益。目前SCI的综合治疗手段主要包括外科治疗、药物治疗、物理治疗、组织与细胞移植及功能重建五大方面。这些手段可以有效减轻SCI的继发性损害，但难以恢复SCI的原发性损害所导致的中枢神经传导结构与功能的缺失。NSC是治疗SCI最理想的细胞移植材料，NSC 不仅可以存活和整合入宿主组织中，分化出神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞，填充因损伤造成的空洞，并且可以和宿主细胞之间形成突触样的结构，使神经组织损伤区域的结构得以重建，进而恢复中枢神经系统的部分功能。在本发明的又一个实施方案涉及本发明的神经干细胞在发育生物学等基础研究领域的用途。本发明通过添加ROCK信号通路抑制剂，使多能干细胞全部定向为NSC，该类 NSC不仅可在体外分化为多种神经细胞，而且这类NSC细胞表达多能干细胞标记物0ct4，而且具有长期自我更新的潜能。本发明证明了该类细胞的存在。


图1显示为倒置显微镜下(10X5倍)神经球干细胞照片。图2显示为激光共聚焦显微镜下荧光照片，其中红色标记为Nestin表达一抗为鼠抗Soxl单克隆抗体(1 100)，二抗为山羊抗鼠荧光二抗(1 100)；绿色标记为0ct4 表达一抗为鼠抗0ct4单克隆抗体(1 100)，二抗为山羊抗鼠荧光二抗(1 100)；蓝色为DAPI标记细胞核。图3显示为倒置显微镜下46c小鼠ES细胞经6-8d分化形成悬浮的神经球干细胞。图4显示为图3的神经球干细胞在荧光显微镜下观察结果，因46c为Soxl-EGFP， 表明形成的神经球干细胞表达Soxl基因。图5显示为分化得到的神经元细胞免疫荧光染色后，荧光显微镜下观察结果。 A标记为Tujl，其中一抗为鼠抗Tujl单克隆抗体(1 100)，二抗为山羊抗鼠荧光二抗 (1 100) ；B标记为DAPI ;C显示为Merge图。图6显示为分化得到的多巴胺神经元TH染色荧光显微镜下结果。A标记为TH，其中一抗为兔抗TH单克隆抗体(1 100)，二抗为鼠抗兔荧光二抗(1 100) ；B标记为DAPI 染核；C显示为Merge图。图7显示为分化得到的运动神经元HB9染色荧光显微镜下结果。A标记为HB9，其中一抗为山羊抗HB9单克隆抗体(1 100)，二抗为兔抗山羊荧光二抗(1 100) ；BDAPI染核；C显示为Merge图。
具体实施例方式下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。实施例1 原代小鼠神经干细胞的分离和培养1)小鼠胎儿的获取和脑组织的原代培养断颈法处死怀孕5d以上的小鼠，在无菌条件下打开腹腔，取出子宫，并用含抗生素的PBS洗3次。将胎儿从子宫中取出，去除躯干，在显微镜下将脑组织小心剥离。将剥离的脑组织用0. 25%胰酶消化2min，用血清终止后，吹打数次，1000转离心5min，倒掉上清， 用N2B27+CHIR99021(3mM)+Y27632(10nmol/L)培养液洗两次后，再加入预热的该培养液在 5% CO2、37°C的培养箱培养。2)小鼠神经干细胞的传代和纯化上述原代细胞培养3天后可消化传代，吸出培养液，加入0. 25%胰酶消化液，控时消化2min，加入血清终止消化，1000转离心5min。弃去上清液，加入培养液，继续培养。培养液是条件性的选择培养液(与原代培养液成分相同)，在多次传代后，大部分细胞死亡，NSC以悬浮的形式存在并可长期传代培养。3)细胞冷冻保存用0. 25%胰蛋白酶消化细胞大约2分钟，用吸管将细胞悬液吸到15ml离心管内， 再轻轻的吹打细胞，使其分散成小的细胞团块，对干细胞而言，小的细胞团块比单个的细胞较易冷冻存活，冷冻保存的细胞团块应比消化传代时的细胞团块稍大一点点。1000转离心 2分钟。用冻存液重悬细胞，无饲养层培养的细胞可加入30%的血清替代物，DMSO的浓度仍为10%。DMSO在室温时对细胞毒性较大，冻存液最好现用现配，配置冻存液时，培养液和血清都不需要预热，按比例配好冻存液后，直接悬浮细胞，每冻存管加入Iml细胞悬液，可先放入4°C冰箱30min，然后放在冻存用泡沫盒内，-70°C过夜。再放入液氮灌内永久保存。实施例2 从胚胎干细胞定向神经干细胞分化1)小鼠胚胎干细胞向NSC定向步骤将mES细胞(小鼠46C胚胎干细胞，由美国加州大学应其龙教授惠赠)用0. 25% 胰蛋白酶消化为单细胞悬液，加入血清终止离心后，用定向神经分化培养液(与原代培养液成分相同)重悬。重悬的细胞转入培养板前，应用50 μ g/ml浓度的Laminin包被培养板2个小时以上，以辅助细胞贴壁。细胞接种密度在每毫升1. OX IO4与1. OX IO5个细胞之间，细胞贴壁后呈单层贴壁生长，细胞之间有明显界限，细胞太密，细胞增殖过快，会很快长满培养皿，细胞密度过低，不利于细胞增殖。细胞培养3天后传代，需传至不铺任何基质胶的新培养板，以保证细胞可以同时聚集形成漂浮的神经球。2)小鼠NSC的富集和鉴定ES细胞在神经分化培养液内贴壁分化5d后开始聚集悬浮，聚成圆形的神经球(图 1)，这类神经球免疫荧光染色后表达Soxl和0ct4(图2)，部分分化的杂细胞不能形成这种漂浮的神经球。漂浮的神经球继续悬浮培养2d。2d后所有悬浮的神经球都开始表达神经干细胞标记物Soxl (图3，图4)积聚的神经球转入新铺有Laminin的培养板中，漂浮的神经球可以迅速贴壁，聚团的神经细胞开始铺展，通过先贴壁分化_悬浮培养_再贴壁分化完成对NSC的富集过程。通用荧光染色步骤待染色细胞先用PBS洗一遍，再用4%多聚甲醛固定20min，PBS洗涤三次，每次lOmin。加入含0. 3% Triton和1 % BSA的PBS室温孵育 40min, PBS洗三次，每次lOmin。加入一抗室温60min，PBS洗三次，每次lOmin。加入二抗室温避光45min，PBS洗三次，每次lOmin。加入DAPI，染核lOmin，PBS洗三次，每次lOmin。 以PBS 甘油(2 1)封片，荧光显微镜下观察拍照。实施例3 =NSC细胞裸鼠皮下注射成瘤实验NSC细胞用胰酶消化，分散成单个细胞后重悬于0. 3ml的PBS中。细胞悬液注射于雄性Balb/c裸鼠腋下部皮下。2周后可以看到注射ES细胞对照组裸鼠腋下出现畸胎瘤。 瘤体30-50天后成熟。成熟畸胎瘤分离后固定于10%中性福尔马林中，石蜡包埋进行常规组织学切片，HE染色，并进行显微照相。而注射NSC细胞组未见成瘤。实施例4 =NSC向多种神经细胞分化对NSC细胞继续诱导为运动神经元的方法为N2B27+RA (IuM)分化4d， N2B27+RA (IuM) +SHH (100ng/ml)分化 7d，N2B27+SHH (50ng/ml) + ⑶NF (10ng/ml) +BDNF (lOng/ ml)+IGF(10ng/ml)分化IOd左右诱导为成熟的表达HB9的运动神经元细胞；诱导NSC继续分化为多巴胺神经元的方法为N2B27+SHH(100ng/ml) +FGF8 (lOOng/
9ml)分化 5d, SHH(100ng/ml)+FGF8 (100ng/ml)+bFGF (10ng/ml)分化 8-10d, N2B27+⑶NF(10ng/ml)+BDNF(10ng/ml)+IGF(10ng/ml)分化 IOd 左右。对分化得到的神经元细胞进行免疫荧光染色后，荧光染色方法同上，荧光显微镜下观察结果。多巴胺运动神经元标记物Tujl和TH表达见图5和图6所示。运动神经元标记物HB9表达见图7。经过上述各个实验试验，证明本发明成功地获取了 NSC细胞，而且所提供的NSC细胞的免疫原性低，不存在动物源性血清和饲养层污染，而且可以在体外长期传代，因此能为临床细胞治疗等应用提供大量安全有效的NSC，意义重大。而且该类细胞同时表达0ct4和 Soxl蛋白，具有长期的自我更新能力和稳定的神经干细胞特性，有利于研究干细胞的自我更新与分化机理。尽管本发明的具体实施方式
已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
权利要求
1.一种神经干细胞，其特征在于同时表达标志蛋白0ct4和Soxl，并可在体外快速增殖和稳定传代。
2.根据权利要求1所述的神经干细胞，还同时表达S0X2、NeStin和Pax6。
3.一种分离、体外培养权利要求1的神经干细胞的方法，其包括如下步骤无菌条件下获得从动物的胎儿脑组织，用胰酶消化分散后，用含添加ROCK信号通路抑制剂和GSK/3信号通路抑制剂的神经细胞培养液培养至有神经球样细胞悬浮，将悬浮细胞继续消化传代培养，收集继续存活的少数表达0ct4和Soxl的细胞，收获所述细胞，即得到神经干细胞。
4.一种分离、体外培养权利要求1的神经干细胞的方法，其特征在于使用分化液为添加ROCK信号通路抑制剂和GSK/3信号通路抑制剂的神经细胞培养液对动物的神经细胞ES 进行定向分化，包括步骤在所述分化液环境中将ES细胞贴壁分化，至表达Soxl的细胞开始聚集悬浮成神经球时收集悬浮的神经球，使之在Laminin上继续贴壁培养，通过贴壁、悬浮、再贴壁的方式进行细胞富集，收集富集得到的细胞，即得到神经干细胞。
5.权利要求1-4中任一项的神经干细胞，其来自人、大鼠、小鼠、狗、兔或猴子。
6.权利要求3或4的方法，其中使用N2B27基础培养液作为基础细胞培养液，ROCK信号通路抑制剂是Y27632，GSK/3信号通路抑制剂是CHIR99021。
7.权利要求1-2所述的神经干细胞在制备治疗神经退行性疾病的药物中的用途。
8.权利要求7的用途，其中所述神经退行性疾病选自下述疾病中的一种帕金森氏症、 老年痴呆症、脑中风和退行性心脏病。
9.权利要求1-2所述的神经干细胞在制备治疗脊髓损伤的药物中的用途。
10.权利要求1-2所述的神经干细胞在制备神经元和神经胶质细胞中的用途。
全文摘要
本发明提供一种神经干细胞株(NSC)，该类NSC细胞株可以分离自不同种属的动物脑组织，也可以由胚胎干细胞、诱导多能干细胞和其它干细胞分化而来。其特征在于这类NSC可在体外快速增殖并稳定传代；可持续表达标记蛋白Oct4和Sox1；可以高效分化为多种神经元和神经胶质细胞。本发明还提供有关NSC细胞的建系方法和用途。
文档编号A61P9/00GK102191221SQ20101012610
公开日2011年9月21日 申请日期2010年3月17日 优先权日2010年3月17日
发明者刘韬, 吴孟超, 彭欣荣, 李琳芳, 钱其军, 高海霞 申请人:中国人民解放军第二军医大学东方肝胆外科医院