专利名称：狂犬病毒Evelyn-Rokitnicki-Abelseth(ERA)减毒活疫苗候选株的构建与筛选的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及重组病毒疫苗领域，更具体地，本发明涉及一种狂犬病毒减毒疫苗突 变株，其中狂犬病毒的糖蛋白的333位点由精氨酸突变为谷氨酸。本发明还涉及该狂犬病 毒减毒疫苗突变株的制备方法和应用。
背景技术：
狂犬病是由狂犬病病毒引起的一种死亡率极高的人兽共患传染病[1]。近两年我国 人狂犬病的发病和死亡数均超过3000人/年，疫情呈明显上升态势，对人类健康和社会安 定构成极大威胁[2’3]。流行病学调查表明，几乎所有的温血动物对狂犬病病毒都易感。野生 动物是狂犬病病毒的自然储存宿主，犬、猫等家养动物是狂犬病的主要传播者。因此，防控 人狂犬病的关键应从源头上控制动物狂犬病M。疫苗接种是控制狂犬病的有效手段。目前，世界上预防狂犬病最广泛使用的是灭 活的狂犬病疫苗。这类疫苗尽管有效，但需要接种多针才能诱导足够的免疫保护，而且价格 昂贵。与细胞培养疫苗相比，用感染动物的神经组织制备的灭活疫苗成本较低，但是，这类 疫苗会产生严重的副反应，因此，目前灭活的狂犬病疫苗在发展中国家的应用受到极大限 制。然而，仅含少量病毒的减毒活疫苗就能有效诱导保护性免疫反应，因为这种疫苗中的活 病毒能在接种的动物体内繁殖并合成病毒抗原。这类疫苗的生产成本通常比灭活疫苗显著 降低，而且可以通过非注射的方式进行接种。但减毒活疫苗毒株有时可由于自身残留的毒 力或者病毒在体内繁殖期间产生致病性变异而在接种的动物中引发狂犬病。这就是通常不 使用减毒的活疫苗的主要原因。另一个原因是用传统的方法开发减毒活疫苗周期长不可预 测性多b’6]。因此，应用反向遗传技术通过体外对狂犬病病毒关键基因进行突变、基因间置 换和基因重排等操作构建与筛选重组毒株，则是获得比现有疫苗更安全、更有效、更廉价的 狂犬病减毒活疫苗的有效手段[7’8]。狂犬病毒为弹状病毒科狂犬病毒属单股负链RNA病毒。基因组约121Λ，编码核蛋 白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、糖蛋白(G)和大蛋白或依赖RNA的RNA聚合酶(L)五个 结构蛋白。由于狂犬病毒无DNA复制中间体，不能发生病毒基因组与宿主细胞基因组的整 合；弹状病毒中的大部分都具很高病毒滴度，具有容纳和高水平表达外源多肽和蛋白的能 力；用所构建的负链RNA病毒免疫动物，能够诱导很强的体液免疫和细胞免疫反应，为此狂 犬病毒等负链RNA病毒成为极具潜力的疫苗载体候选者[9a°’11]。1994年khnell等首次建立了狂犬病毒的反向遗传操作技术，从感染性质粒中成 功拯救狂犬病毒SAD-B19株[12]，这是狂犬病毒研究的里程碑。研究者们随后陆续建立了 其他株病毒的反向遗传系统[13’14]。简要地说，表达全长反义基因组RNA的质粒(基因组质 粒)和三种分别表达病毒N、P、L蛋白的质粒(辅助质粒)共转染到细胞中。然后，反义基 因组RNA和这些蛋白组成一种反义基因组核糖核蛋白体(RNP)复合物。由于反义基因组 RNP复合物与在狂犬病病毒感染细胞中所产生的RNP复合物具有相同的生物活性，因此，用反义基因组RNP作为模板即可合成基因组RNA，随后从基因组RNP中合成mRNA并表达病毒 蛋白。基因组RNP、其他病毒蛋白、M和G蛋白组装后即产生了感染性重组狂犬病病毒。在 基因水平上操作狂犬病病毒，仅仅需要通过常规的分子克隆方法改变基因组质粒上的病毒 cDNA序列，然后，将改造过的基因组质粒同辅助质粒一起用上述的方法转染进细胞中。在这 个系统中，为了提高疫苗毒株的安全性和免疫原性，可以有意地改变它的某些生物学性状， 而经典的方法则依赖于减毒相关性突变在传代过程中随机、偶然地发生。在狂犬疫苗的研究中，针对糖蛋白(G)的研究最为活跃。糖蛋白(G)为狂犬病病 毒跨膜蛋白，是狂犬病毒致病性的主要成分，也是诱导机体保护性免疫的主要抗原[15]。Ito 等利用亲代强毒Nishigahara株的G基因取代子代弱毒RC-HL株全基因组中的G基因，获 得拯救的病毒，研究病毒对大鼠的致病力，研究发现原先弱毒的RC-HL株毒力增强[16’17]。由 此说明了糖蛋白对于病毒致病性的重要性。糖蛋白的结构与毒力密切相关[18]。在与编码 糖蛋白的基因(G基因)有关的狂犬病毒毒力致弱性研究中，除进行G基因突变研究外，近 十几年来国外学者还进行了 G基因的删除[19]、基因重排_、插入额外的G基因[21]等研究； 在国内，目前郭霄峰等已有狂犬病毒拯救成功的报道[22’&。ERA(Evelyn-Rokitnicki-Abelseth)株是在获得了 SAD株后，又经地鼠肾细胞传 了 35 40代后，再于BHK-21细胞上传了 6代，获得的SAD株的派生株，为纪念Evelyn、 Rokitnicky 禾口 Abelseth 三人而命名。
发明内容
本发明人所用狂犬病毒疫苗株为一株进口 ERA株疫苗的克隆株， ERA(Evelyn-Rokitnicki-Abelseth)克隆株。为消除其毒力返强的隐患，本研究通过反向遗 传操作构建其感染性克隆，采用PCR突变技术将狂犬病毒糖蛋白(G或GP)的333位精氨酸 突变为谷氨酸，构建出一免疫原性好、无致病性的狂犬病病毒基因突变疫苗候选株。更具体地，本发明提供以下各项1. 一种狂犬病毒减毒疫苗突变株，其中狂犬病毒的糖蛋白的333位点由精氨酸 (R)突变为谷氨酸(E)。在本发明中，这种狂犬病毒减毒疫苗也称为狂犬病毒GP333位R —E 突变株。2.根据以上1所述的狂犬病毒减毒疫苗突变株，其中狂犬病毒的糖蛋白的333位 点的密码子由AGA突变为GAA。3.根据以上1或2所述的狂犬病毒减毒疫苗突变株，其中所述狂犬病毒为ERA株。 在本发明的一个优选实施方案中，根据本发明的狂犬病毒减毒疫苗突变株其基因组序列如 SEQ ID No. 1 所示。4.根据以上1-3中任一项的狂犬病毒减毒疫苗突变株在制备用于预防狂犬病的 药物中的应用。5. 一种制备狂犬病毒减毒疫苗突变株的方法，其特征在于将狂犬病毒的糖蛋白的 333位点由精氨酸突变为谷氨酸。6.根据以上5的所述方法，其中狂犬病毒的糖蛋白的333位点的密码子由AGA突 变为GAA。7.根据以上5或6所述的方法，其中所述狂犬病毒为ERA株。
8.根据以上5-7中任一项所述的方法，其包括以下步骤(1)构建转录质粒，该转录质粒包括狂犬病毒的全长基因组cDNA序列；(2)将步骤(1)的转录质粒中狂犬病毒的全长基因组cDNA序列中编码糖蛋白的 333位点的精氨酸的密码子突变为编码谷氨酸的密码子；(3)构建一个或多个转录辅助质粒，该辅助质粒分别包括编码所述狂犬病毒的核 蛋白(NP)的cDNA序列、编码所述狂犬病毒的磷蛋白(P)的cDNA序列、和编码所述狂犬病 毒的依赖RNA的RNA聚合酶(大聚合酶蛋白)(L)的cDNA序列；(4)将步骤O)中构建的转录质粒和步骤(3)中构建的转录辅助质粒共转染所述 狂犬病毒复制许可的宿主细胞，培养转染后的宿主细胞，救获重组狂犬病毒减毒疫苗突变 株。9.根据以上8所述的方法，其中所述宿主细胞是BHK-21细胞。10.根据以上8所述的方法，其中所述转录辅助质粒分别是pCI-N、pCI-P和 PCI-L0在本发明的一个优选实施方案中，根据以上8所述的方法的步骤O)中构建的转录 质粒是PCI-RV G333R/E(其中编码糖蛋白的333位点的精氨酸的密码子(AGA)已经突变为 编码谷氨酸的密码子(GAA))。狂犬病病毒的反向遗传操作技术由Schnell等于1994年首先建立，该系统应用T7 启动子系统，拯救病毒的效率较低，且需要痘苗病毒的参与影响了对所拯救病毒的筛选鉴 定。我们已成功建立了狂犬病毒ERA株反向遗传操作系统，该系统在以往的操作系统上进 行了改进，使用了 CMV启动子，无需痘苗病毒的辅助，将ERA株全基因组表达质粒以及辅助 质粒共转染细胞，就能使病毒获得拯救，从而节省了操作时间，提高了病毒的拯救效率，该 系统的建立为狂犬病毒致病性的研究提出了新思路，也为新疫苗候选毒株的开发提供了良 好的技术平台。
图1.狂犬病病毒ERA株全长cDNA的构建；图2. GP333位R — E突变株全长cDNA的构建；图3A和3B. GP333位R — E突变株的鉴定(间接免疫荧光结果)；图4. GP333位R — E突变株的鉴定(电子显微镜负染观察)；图5. GP333位R — E突变株的鉴定(RT-PCR电泳结果)；图6. GP333位R — E突变株的鉴定(已纯化PCR产物的测序分析)；图7. GP333位R — E突变株的生长动力学特性；图8和图9. GP333位R — E突变株的遗传稳定性；图10. GP333位R — E突变株的致病性(乳鼠)；图11. GP333位R — E突变株的致病性(成年鼠)。
具体实施例方式下文将参考实施例详细描述本发明，所述实施例仅是意图举例说明本发明，而不 是意图限制本发明的范围。本发明的范围由后附的权利要求具体限定。实施例1狂犬病毒GP333位R — E突变株的构建和生物学活性鉴定
1材料和方法1. 1细胞与病毒Vero细胞(非洲绿猴肾细胞，ATCC No. CCL-81)培养基为含10%胎牛血清的 DMEM ；NA细胞(神经瘤细胞，购自长春军事医学科学院)培养基为含10%胎牛血清的MEM ； BHK-21细胞(乳仓鼠肾细胞，ATCC No. CCL-10)培养基为含5%胎牛血清的DMEM ；试验所 用狂犬病毒疫苗株为ERA株疫苗(购自中国兽医药品监察所，AV61)，病毒中和实验所用狂 犬病毒标准毒株CVS购自长春军事医学科学院。1. 2主要试剂和仪器PrimerSTAR HS DNA Polymerase, T4 DNA连接酶，及限制性内切酶均购自 TaKaRa公司。RNA提取试剂Trizol，鼠源反转录酶(MLV)试剂盒，磷酸钙转染试剂盒 (Calciumphosphate Transfection Kit)均购自 Invitrogen 公司，胶回收(Gel Extraction Mini Kit)及质粒小量提取试剂盒(Plasmid Mini Kit)均购自上海华舜。质粒中量提取试 剂盒购自QIAGEN公司。普通显微镜与荧光显微镜分别购自Leica公司。不同型号离心机 均购自BECKMAN公司。P2级生物安全柜购自LABC0NC0公司。1.3 引物1. 3. 1 ERA全长cDNA克隆引物序列及酶切位点参照GeneBank中提供的狂犬病毒ERA株基因序列(GenBank Accession No. EF206707)，设计RT-PCR引物将全序列分为7段(Rl至R7，所用引物分别为R1F/R1R，R2F/ R2R, R3F/R3R, R4F/R4R, R5F/R5R, R6F/R6R 和 R7F/R7R)，引物序列见表 1。表1 ERA全长cDNA克隆引物
引物名称引物序列RlFGTCACTGCTAGCTGGTGTTAAGCGTCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACTATAGGAAAGGAATTCCTATAGTCACGCTTAACAACCAGATCAAAG CMidHam)RlRACTCGGCGAATGAGTTTGGAC (含 Sail)R2FTCGAATCATGATGAATGGAGGR2RCAGCCCACTGGAAGATAAAGG (含 Bst 11071)R3FCTGAGGGCATGAACTGGGTATR3RTCCCTGTCCCTCTGAGATTGT (含 SphI)R4FAAGAGTCAATCGATCAGAACCR4RCACAGGGACCGAACGTCTCTT (含 StuI)R5FAGAGAGCAGAAAAGTTTAGGCR5RTTGCCTCTCGAAACTCTGAAT (含 EcoRI)R6FGACGAGGTGGACAAGGTGGAGR6RCCCACTGAACCACTCTCAAGC (含 ApaI)R7FGTCTCGGAGCTTGACATAAGGR7RCAGGTCGGACCGCGAGGAGGTGGAGATGCCATGCCGACCCACGCTTAACA A ATA AACA AC A (CpoM HdvRz 序列)1. 3. 2狂犬病病毒糖蛋白(GP蛋白)333位分子修饰用引物ERA株GP333位R — E引物P1F、PlR及突变鉴定引物P2F、P2R见表2。表2 ERA GP333位R — E突变引物对，斜体加粗部分为突变碱基引物名称引物序列PlFGCTCACTACAAGTCAGTCG/4AACTTGGAATGAGATCCTPlRAGGATCTCATTCCAAGTT7TGACTGACTTGTAGTGAGCP2FAGCATTTCCGCCCAACACCAGP2RCCGAGGATTCCAACAACT1.4全长cDNA克隆的构建1. 4. 1狂犬病病毒ERA株全长cDNA的构建利用表1所示的引物，通过一系列RT-PCR反应，构建了覆盖整个基因组的7个片 段(R1-R7)，利用各个片段间重叠部分的酶切位点，在pCI载体(购自promega)上连接组装 获得了 11932nt的完整cDNA克隆，序列拼接结果已经登录GenBank，登录号为FJ913470 (其 全序列与SEQ ID No. 1的区别仅在于编码糖蛋白的333位点的密码子没有由AGA突变为 GAA)。在全长cDNA片段两端分别连有具有自我催化功能的锤头状核酶(Ham)和丁型肝炎核 酶(HdvRz)，构建完成的质粒命名为pCI-RV(其全序列见SEQ ID No. 5)(具体克隆过程见图 1)。将表达核蛋白(NP)、磷酸蛋白(P)及大聚合酶蛋白(L)基因的开放阅读框架(ORF)cDNA 分别紧接着克隆在PCI空载体T7/CMV启动子下游，分别构成转录辅助质粒pCI-N，pCI-P, pCI-L (质粒pCI-N、pCI-P和pCI-L的核苷酸序列分别如SEQ ID Nos. 2，3和4所示)。1. 4. 2 GP333位R — E突变株全长cDNA的构建使用TaKaRa MutanBEST kit (Code No. D401)试剂盒，将 GP333 位(原碱基序列为 AGA,利用PCR方法突变为GAA)，使原来的精氨酸(R)突变为谷氨酸(E)，构建完成的质粒命 名为pCI-RVG333R/E。具体实验步骤如下以构建完成的狂犬病病毒ERA株全长cDNA克隆pCI_RV为模板，以RVGF 5'-GGCC GTTTAAACAACATCCCTCAAAAGACTCA-3’和 RVGR :5，-GGCCGTTTAAACTTTTTTTCTCGACTGAAAAGCTTA GATGAC-3’为引物进行PCR扩增，目的片段克隆至pBluescript的EcoRV位点并经序列测定 分析，确定正确后命名为pblue-RVG。使用TaKaRa MutanBEST kit (Code NO. D401)试剂盒，以试验室已构建保存的 pblue-RVG 质粒为模板进行 PCR 扩增，反应体系为Pyrobest DNA Polymerase(TaKaRa) (5U/y L)0. 5μ L,上下游引物(P1F、PlR)各 1 μ L, IOXPyrobest BufferII 5 μ L, dNTP Mixture (各2. 5mM) 4 μ L，模板1 μ L，补加灭菌蒸馏水至50 μ L ；反应条件94°C 30S, 55 °C 30S，72°C 5min，共30个循环。1 %琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。切胶回收目的DNA片 段，加1 μ L DpnI酶于回收产物中混勻，37°C孵育lh，将4 10 μ L DpnI消化产物转化至 100 μ L的大肠杆菌感受态细胞中，挑取4-5个克隆进行序列的测定及分析。测序正确的质 粒命名为 pblue-RVG333R/E。将pblue-RVG333R/E突变部分组装连入pCI_RV质粒中，替换未突变部分，即将 pblue-RVG333R/E通过xhol消化后与同样处理过的pblue空质粒连接，筛选正向连接质粒， 再用 SpeI 和 HindIII 双切，连接于 pblue_RV(XhoI/XhoI)的 SpeI 和 HindIII 之间，筛选 出的阳性质粒命名为pblue-RV(xhoI/xhoI)G333R/E。将pCI空载体Nhel、MluI双切后与 pCI-RV全长质粒NheI、MluI酶切回收产物连接，鉴定出的阳性克隆命名为pCI-RV(N/M)。将 pbIue-RV(xhol/xhol)G333R/E 经 XhoI、MluI 双切后连接 pCI-RV(N/M)Xhol,MluI 酶切回收 产物，鉴定阳性克隆命名为 pCI-RV (N/M) G333R/E。将 pCI-RV (N/M) G333R/E 经 NheI、MluI 消化后与PCI-RV全长质粒NheI、MluI消化产物连接，鉴定出的阳性克隆即为pCI-RV G333R/ E(其全序列见SEQ ID No. 6)(具体过程见图2)。1. 5 GP333位R — E突变株的拯救BHK-21细胞接种于35mm六孔板中，待生长至50% 80%单层时，采用CaPO4转染 试剂将转录质粒pCI-RV G333R/E及辅助质粒pCI-N、pCI_P和pCI-L分别以5 μ g、2. 5 μ g、 1. 25 μ g和1. 25 μ g的量共转染BHK-21细胞，37 V 5% CO2培养，具体操作按磷酸钙转染试 剂盒(Calcium phosphate Transfection Kit)说明书进行。转染后8 12h，弃去转染混 合物，用含10% DMSO的PBS液休克细胞2. 5min,加入完全DMEM培养液，37°C 5% CO2培养； 4 5d后将细胞刮下来，取500 μ L细胞悬液接种于生长过夜、密度约80%的单层Vero细 胞，感作Ih后加入含5%胎牛血清的DMEM，37°C 5% CO2培养3 5d，将细胞悬液继续在单 层Vero细胞上传代三次以上，收获鉴定。1. 6 GP333位R — E突变株的鉴定1. 6. 1间接免疫荧光(IFA)鉴定Vero细胞接种于M孔板中，待生长至80% 90%单层时，按MOI约为1感染收获 的病毒液，37°C感作Ih后加入完全培养液继续培养，3d后弃培养上清，PBS洗涤细胞2次， 用冷3%多聚甲醛室温固定30min，PBST(PBS+Tween)洗涤细胞3次后用BSA封闭，分别 以1 100稀释的鼠抗ERA全病毒高免血清(高免血清是用ERA多次接种小鼠制备的)和 相应稀释倍数的阴性血清作为一抗，作用30min。PBST洗涤细胞3次后加入适当倍数稀释 的稀荧光素(FITC)标记的兔抗鼠二抗(Sigma)，作用30min，PBST洗涤后荧光显微镜观察 结果。1.6.2电镜观察及RT-PCR鉴定收集感染细胞上清悬液，采用磷钨酸负染法制备样本，常规透射电镜观察病毒粒 子形态；取拯救病毒250 μ L，提取RNA (Trizol法)。用1. 3. 2中的P2F和P2R作为引物进行 RT-PCR，对扩增的产物进行序列分析，以确定救获的病毒是否为GP333位R(AGA) — E(GAA)
突变株。1. 7 GP333位R — E突变株的传代、滴定与生长动力学已鉴定正确的病毒按1. 5的方法继续进行扩增至F7代，病毒细胞培养物经反复冻 融3次，-70°C冻存作为种毒，用于对救获病毒的生物学特性分析。种毒作10倍连续梯度稀 释，以100 μ L接种于NA细胞(神经瘤细胞)，37°C感作Ih后加入完全培养液继续培养，3d 后弃培养上清，PBS洗涤细胞2次，用冷3%多聚甲醛室温固定30min，PBST洗涤细胞3次后 用1%BSA封闭，分别以1 100稀释的鼠抗ERA全病毒高免血清和相应稀释倍数的阴性血 清作为一抗，作用30min。PBST洗涤细胞3次后加入适当倍数稀释的荧光素(FITC)标记的 兔抗鼠二抗，作用30min，PBST洗涤后荧光显微镜观察结果，从而测得病毒滴度，滴度用PFU 表示；按0. 01M0I接种单层Vero细胞，分别于感染后Id (天)、2d、3d、4d、5d和6d按时间顺 序分别收获取样，取样结束后把收获的病毒做10倍系列稀释，以100 μ L接种于NA细胞，按 照上述方法固定染色，荧光显微镜下观察结果，绘制病毒生长动力曲线。1. 8 GP333位R — E突变株遗传稳定性检测1. 8. 1乳鼠脑内接种(MIT)传代具体步骤为用酒精棉球对1 3d乳鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)头部进行局部消毒后，用ImL灭菌注射器分别吸取处理过的接种用病毒液(GP333位 R — E突变株)，在接种部位垂直进针深约0. 25cm,颅内接种0. 03mL,通常一种病毒注射5 6只乳鼠，注射后的乳鼠应在有高效滤过装置的负压饲养笼内饲养，可用烧热的镊子迅速对 乳鼠断尾或断耳区分。接种乳鼠归窝前需先用酒精棉球涂抹母鼠鼻部，以免母鼠因嗅到异 味而吃掉接种乳鼠。7 IOd后，如发现乳鼠哺乳力减弱、步样失调、麻痹，剖取鼠脑用生理 盐水或PBS研磨，制成10% 30%的勻浆液(W/V)，2000r/min离心30min，取上清，将青霉 素/链霉素双抗(Gibco) (1000IU/mL)等抗菌素按1 4量加入离心上清中，混勻后置4°C 感作过夜，接种前7000r/min离心lOmin，无菌取出上清，如上方法继续传代。将传至不同代 次的病毒(SN-1 (SN是鼠脑的拼音缩写，字母后面的数字表示传代的代数，以下同)、SN-3和 SN-5)，分别提取RNA，以1. 3. 2中的P2F和P2R为引物进行RT-PCR，对扩增的产物进行序列 分析，以确定传代多次后修饰的减毒株糖蛋白序列的稳定性、GP333位是否仍为E、是否发 生回复突变。1. 8. 2 NA细胞(神经瘤细胞)传代为了检测修饰后的减毒株的遗传稳定性，将突变株病毒在NA细胞上进行连续多 次传代。具体步骤为NA细胞接种于6孔板中，待生长至80% 90%单层时，按MOI约为 0.01感染病毒(GP333位R —E突变株)，37°C 5% CO2培养，逐日观察应无CPE，至第4天 将病毒细胞培养物经_20°C /37°C反复冻融3次，-70°C保存；将收获的病毒进行滴定后，按 MOI约为0. 01感染新鲜的NA细胞，至第4天冻融收毒，按如上方法继续传代。将传至不同 代次的病毒(NA-1、NA-5、NA-IO, NA-15 和 NA-20)，分别提取 RNA,以 1. 3. 2 中的 P2F 和 P2R 为引物进行RT-PCR，对扩增的产物进行序列分析，以确定传代多次后修饰的减毒株糖蛋白 序列的稳定性、GP333位是否仍为E、是否发生回复突变。2 结果2. 1GP333位R — E突变株的鉴定间接免疫荧光结果显示病毒感染的细胞培养物可见绿色荧光，阴性对照没有荧光 信号(图3A和;3B)；经电子显微镜负染观察，观察到了呈弹状的病毒粒子，如图4所示，符合 狂犬病毒电镜下的形态特征；RT-PCR电泳结果可见一条大小约为980bp的特异性条带(图 5)；已纯化PCR产物的测序分析表明，GP333位R(AGA)已突变为E(GAA)(图6)；扩增至F7 代的GP333位R — E突变株病毒IFA滴定结果为107PFU/mL ；生长动力学结果表明病毒与 24h后开始复制，在第5d达到最高峰，表现类似狂犬病毒野生型对照株的生长动力学特性 (图7)。由此可见，救获的病毒为GP333位R(AGA) — E (GAA)突变株，且具有较高的生长滴 度。命名为 rRV-G333R/E。2. 2 rRV-G333R/E突变株的遗传稳定性以传至不同代次的鼠脑毒(SN-1、SN-3和SN_5)和传至不同代次的NA细胞毒 (NA-1、NA-5、NA-10、NA-15和NA-20)反转录产物为模板，用P2F和P^为引物作PCR扩增， 均扩增出了 980bp的特异性条带，与理论值大小相同。进一步测定其序列并分析，结果与传 代前毒种的核苷酸及氨基酸序列相同，GP333位均为E(GAA)(图8和图9)，均未发生回复突变。实施例2狂犬病毒rRV_G333R/E突变株的致病性除非另外特别指出，本实施例的材料和方法同实施例1。
rRV-G333R/E突变株致病性检测将狂犬病毒ERA野生型对照株(106PFU/mL)、rRV_G333R/E突变株(107PFU/mL)原 液分别以50 μ L/只脑内接种乳鼠及成年Balb/c小鼠(3周龄，10 13g，购自北京维通利 华实验动物技术有限公司)，各病毒株分别接种10只，接种后的小鼠置于高效滤过装置的 负压饲养笼内饲养，逐日观察至接种后观天，记录存活数，接种后4天内死亡的鼠为非特异 性死亡，不作统计。结果狂犬病毒ERA野生型对照株、rRV_G333R/E突变株脑内接种乳鼠均致死。野 生型对照株攻毒后第6天乳鼠已全部死亡，而突变株攻毒后第7天引起乳鼠死亡，至第10 天时才全部死亡，与野生型对照株相比病程较缓慢(图10)；脑内接种成年鼠后，突变株完 全不致病，接种后的小鼠均健康存活(图11)，体重无明显减轻，说明突变株比野生型对照 株毒力弱，对成年鼠是安全的。实施例3狂犬病毒rRV_G333R/E突变株的免疫原性除非另外特别指出，本实施例的材料和方法同实施例1。rRV-G333R/E突变株免疫原性检测1. rRV-G333R/E突变株对鼠的免疫原性将狂犬病毒ERA野生型对照株(106PFU/mL)、rRV_G333R/E突变株(107PFU/mL)原 液分别稀释至106PFU/mL和2*106PFU/mL，以100 μ L/只经肌肉注射途径人工免疫5周龄成 年Balb/c小鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)，各病毒株分别免疫5只小鼠， 另设非免疫对照组，免疫后21d用同代次病毒，以相同剂量经肌肉注射加强免疫，加强免疫 三周后采血测定血清中和抗体滴度。2. rRV-G333R/E突变株对犬的免疫原性将狂犬病毒ERA野生型对照株(106PFU/mL)、rRV_G333R/E突变株(107PFU/mL)原 液分别稀释至106PFU/mL和2*106PFU/mL，以ImL/只经肌肉注射途径人工免疫3月龄比格 犬(购自军事医学科学院实验动物中心，经RFFIT检测狂犬病中和抗体阴性)，各病毒株分 别免疫5只比格犬，另设非免疫对照组，免疫后21d用同代次病毒，以相同剂量经肌肉注射 加强免疫，分别与一次免疫21d和加强免疫14d后采血并分离血清。血清经56°C 30min灭 活后，按常规快速荧光灶抑制试验(RFFIT)以狂犬病毒标准攻击毒CVS作为攻击毒株(购 自长春军事医学科学院)检测中和抗体。具体过程为血清样品连续20倍至1280倍倍比 稀释，同时设阴、阳性血清对照。将稀释好的血清与含1000个LD50 CVS病毒等体积混合， 37°C孵育lh，取100 μ L加到过夜生长的M孔Vero细胞，感染后4 经间接免疫荧光法观 察CVS在细胞的感染情况。记录100%攻毒接种物被中和的最高血清稀释倍数，观察视野中 无感染细胞，作为被检血清的中和抗体滴度。结果以CVS作为攻击病毒株，检测所采集的小鼠及犬免疫血清中和抗体，在 接毒后48h时进行间接免疫荧光检测，并在荧光显微镜下观察结果。经野生型疫苗株和 rRV-G333R/E突变株免疫所采集的小鼠及犬免疫血清都具有较高的中和抗体水平；犬一次 免疫后21d采血，同时以相同剂量、相同途径进行加强免疫，免疫14d后再采血，结果显示突 变株一次免疫21d血清的中和抗体水平比野生型疫苗株诱导产生的抗体水平稍低，而经过 二次加强免疫两毒株血清抗体水平均有显著提高，且突变株加强效果更为明显。具体数据 见表3和表4。
表3免疫小鼠血清RFFIT试验结果
权利要求
1.一种狂犬病毒减毒疫苗突变株，其中狂犬病毒的糖蛋白的333位点由精氨酸突变为 谷氨酸，优选其中狂犬病毒的糖蛋白的333位点的密码子由AGA突变为Gkk0
2.根据权利要求1所述的狂犬病毒减毒疫苗突变株，其中所述狂犬病毒为 ERA(Evelyn-Rokitnicki-Abelseth)克隆株。
3.根据权利要求2的狂犬病毒减毒疫苗突变株，其基因组序列如SEQID No. 1所示。
4.一种制备狂犬病毒减毒疫苗突变株的方法，其特征在于将狂犬病毒的糖蛋白的333 位点由精氨酸突变为谷氨酸，优选将狂犬病毒的糖蛋白的333位点的密码子由AGA突变为 GAA。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述狂犬病毒为ERA克隆株。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其包括以下步骤(1)构建转录质粒，该转录质粒包括狂犬病毒的全长基因组cDNA序列；(2)将步骤⑴的转录质粒中狂犬病毒的全长基因组cDNA序列中编码糖蛋白的333位 点的精氨酸的密码子突变为编码谷氨酸的密码子，优选突变后的全长基因组cDNA序列如 SEQ ID No. 1 所示；(3)构建一个或多个转录辅助质粒，该辅助质粒分别包括编码所述狂犬病毒的核蛋白 (NP)的cDNA序列、编码所述狂犬病毒的磷蛋白⑵的cDNA序列、和编码所述狂犬病毒的依 赖RNA的RNA聚合酶(大聚合酶蛋白)(L)的cDNA序列；和(4)将步骤中构建的转录质粒和步骤(3)中构建的转录辅助质粒共转染所述狂犬 病毒复制许可的宿主细胞，培养转染后的宿主细胞，救获重组狂犬病毒减毒疫苗突变株。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述宿主细胞是BHK-21细胞。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述转录辅助质粒分别是质粒pCI-N、pCI-P和 pCI-L，其中质粒pCI-N、pCI-P和pCI-L的核苷酸序列分别如SEQ ID Nos. 2，3和4所示。
9.通过权利要求4-8中任一项所述的方法制备的狂犬病毒减毒疫苗突变株。
10.试剂盒，其包括根据权利要求1-3任一项所述的狂犬病毒减毒疫苗突变株或通过 权利要求4-8中任一项所述的方法制备的狂犬病毒减毒疫苗突变株。
全文摘要
本发明涉及一种狂犬病毒减毒疫苗突变株，其中狂犬病毒的糖蛋白的333位点由精氨酸突变为谷氨酸。本发明还涉及该狂犬病毒减毒疫苗突变株的制备方法和应用。
文档编号A61P31/14GK102134562SQ20101010915
公开日2011年7月27日 申请日期2010年1月22日 优先权日2010年1月22日
发明者冯娜, 夏咸柱, 杨松涛, 步志高, 王喜军, 葛金英 申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所