专利名称：类固醇激素修饰的阳离子聚合物及其基因复合物的制备的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及阳离子聚合物基因载体和基因治疗领域，具体涉及类固醇激素修饰的阳离子聚合物的制备方法及其应用。本发明还涉及聚合物与质粒DNA形成复合物及其应用。
背景技术：
基因治疗是将目的基因作为“药物”输送到患者体内，以治疗疾病的一种追根溯源 的分子治疗技术。基因治疗对于许多先天性疾病和获得性疾病(如癌症、自身免疫疾病、糖 尿病、心脏病、高血压等)是一种有效的治疗方法，它能在体内产生生物活性因子或阻止细 胞内非正常机制，使相应疾病得以防止、减轻、代偿或纠正，直至最终治愈各种疾病。因此基 因治疗将是解决因基因变异所引发疾病的首选策略。在基因治疗的具体实施中，基因传输载体的选择至关重要。目前常见的基因传输 载体包括病毒载体和非病毒载体两大类，用于基因治疗临床实验中约有70%以上是使用病 毒载体，但其存在潜在的安全隐患、免疫原性、基因有效荷载量低等缺点，这极大的限制了 其临床应用。相比而言，非病毒载体的安全性优良、基因荷载量大、制备过程简单等方面具 有突出优势。但由于体内存在多种生理障碍，使非病毒载体转基因效率相对较低。理想的基因传输载体应当能够安全、有效、可控地将外源性治疗基因递送至靶细 胞，克服各种生理屏障是确保载体发挥基因治疗作用的前提。人体内的生理屏障包括(1) 血液屏障DNA及其转运载体在血液中必须保持物理化学稳定性；(2)细胞膜屏障DNA/载 体复合物需要选择靶细胞，并穿过细胞膜；(3)内涵体和溶酶体基因/载体复合物在胞内 必须从内涵体中逃逸，并不被溶酶体酶降解；(4)胞浆屏障基因/载体复合物在胞浆中的 扩散受到严重阻碍，其必须穿过胞浆而后进入核内才可进行基因表达；(5)核膜屏障除 有丝分裂时外，外来物质进入核内的唯一途径就是核孔复合物(nuclear pore complex, NPC)。在克服各种生理屏障时，阳离子聚合物非病毒载体有较大的优势，因为研究者能 够在聚合物的骨架上进行多样性的物理化学修饰，使聚合物具有特定功能化的基团以满足 克服生理屏障的基因传输需要。目前常见的阳离子多聚物有聚乙烯亚胺(polyethylenimine，PEI)、多聚赖氨 酸(poly-L-lysine，PLL)、鱼精蛋白、多聚精氨酸、壳聚糖(chitosan)、多胺树突状物 (polyamidoamine dendrimer)、聚丙烯亚胺树突状物(polypropylenimine dendrimers)、 多聚组氨酸、组氨酸赖氨酸分枝状聚合物等。自1995年Boussif等报道了 PEI可作为非病 毒基因载体后，由于其制备方法简单、价格便宜、转染效率高和“质子海绵效应”等优点，PEI 成为阳离子聚合物基因载体研究的热点。但与病毒载体相比，阳离子聚合物的细胞转染效 率要低很多，其中最主要限制步骤是来自胞内的核膜屏障。细胞核表面的核孔复合物对进 出细胞核的粒子有着极其严格的控制，大部分基因传输载体均不能有效通过核孔复合物。非常遗憾，聚合物基因载体在细胞核靶向转运方面的研究仍进展缓慢。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题之一是提供一种具有细胞核靶向功能的阳离子聚合物。本发明所要解决的技术问题之二是提供一种具有靶向性、辅助肿瘤治疗、辅助抗 炎治疗多重作用的阳离子聚合物，充分提高基因靶向传输和基因表达效率。本发明所要解决的技术问题之三是提供一种工艺简单，适用可靠，成本低廉的上 述阳离子聚合物的制备方法。本发明所要解决的技术问题之四是提供上述阳离子聚合物作为基因载体的应用。本发明应用类固醇激素修饰阳离子聚合物，得到具有细胞核靶向功能的基因载 体。类固醇激素包括糖皮质激素(Glucocorticoid，GC)和雌激素等。类固醇激素能够通过 非基因组效应与细胞膜上的激素受体结合位点发生特异性，携带外源物质进入细胞；同时 存在于细胞浆(核)内非活性形式的激素受体与GC结合后，受体构象发生改变，使受体上 的核定位序列暴露，协助激素_受体复合物通过细胞核孔复合物进行核转运；随后激素_受 体复合物在细胞核内二聚体化，并与靶基因启动子附近的特异序列激素反应元件(HRE)结 合，发挥基因组调节效应调节基因的转录过程，抑制或增强相关基因的表达，从而发挥重要 的生理作用。此外，近年来还有许多实验证实经类固醇激素处理过的细胞核，其核膜表面的 核孔复合物的孔径会显著增大，并能够迅速有效地帮助大分子物质进入细胞核。因此，使用 类固醇激素修饰阳离子聚合物可实现细胞核靶向。本发明提供的阳离子聚合物还具有辅助肿瘤治疗、辅助抗炎治疗的多重作用，为 基因治疗提供了一种崭新的思路。类固醇激素及受体与多种肿瘤的发生和治疗关系密切， 如在多数的妇科肿瘤中雌激素受体高表达，成为多种癌症发生的明显标志之一和潜在的靶 向治疗靶点，服用类固醇激素药物可以有效地降低卵巢癌等的发生几率。此外，类固醇激素 还可以用于抗炎，抗免疫等方面的治疗。许多肿瘤的发生同时伴随着炎症以及免疫功能的 异常(比如致炎因子NF-κ B)，并且非病毒载体在递送DNA的过程中往往会引起一定的免疫 原性和炎症反应，从而致降低了基因治疗的效果。糖皮质激素能通过依赖性调节和蛋白干 扰机制阻遏致炎蛋白的表达，引起肿瘤细胞的凋亡。本发明提供的类固醇激素修饰的阳离子聚合物的制备方法如下a.类固醇激素溶于有机溶剂中，加入氧化剂，在N2保护下反应，将类固醇激素21 位α -羟基酮氧化为羧基，停止反应，除去溶剂，溶解沉淀，调节溶液PH值，使产物析出，沉 淀经洗涤、过滤、干燥即得氧化类固醇激素；b.将阳离子聚合物与氧化类固醇激素溶于有机溶剂中，加入催化脱水剂，在N2保 护下反应，停止反应，过滤除去反应溶液中不溶物，透析，0. 8 μ m滤膜过滤，干燥即得类固醇 激素修饰的阳离子聚合物。所述阳离子聚合物是可与质粒DNA静电自组装形成复合物的聚合物，包括聚乙烯 亚胺、多聚赖氨酸、多聚精氨酸、多聚组氨酸、组氨酸赖氨酸分枝状聚合物、壳聚糖氨基衍生 物、多胺树突状物、聚丙烯亚胺树突状物。所述类固醇激素是21位具有α-羟基酮结构的激素，包括地塞米松、皮质酮、倍他 米松、甲基氢化泼尼松、泼尼松龙、氢化泼尼松龙、去炎松、可的松、氢化可的松、曲安缩松、倍氯米松、氟轻松、氟甲松龙、氯泼尼醇、卤米松、去羟米松、丙酮缩氟氢羟龙。上述聚合物作为基因载体应用的转染效率受到阳离子聚合物相对分子量和类固 醇激素修饰量的影响，为使该载体的效率最优，选用不同相对分子量的阳离子聚合物和类 固醇激素修饰量比较筛选。优选的聚乙烯亚胺的分子量范围为600 70，000道尔顿，壳聚糖氨基衍生物的分子量范 围为10000 100000道尔顿，多胺树突状物的代数范围为1 10 ；类固醇激素的修饰量为 3% 30%。更优选的阳离子聚合物为聚乙烯亚胺(分子量范围为1800 25，000道尔顿)；类固醇激 素为地塞米松。在制备方法a步骤中，氧化剂用量增加，氧化类固醇激素产率增加，有利于反应； 在制备方法b步骤中，不同的聚乙烯亚胺与氧化类固醇激素投料质量比例可控制反应程 度，得到不同类固醇激素修饰量的阳离子聚合物。优选的步骤a中所使用的氧化剂为高碘酸或高碘酸盐；类固醇激素与氧化剂的摩尔比例 范围为1 0. 1 1 5;反应时间范围为3 72h;反应温度范围为-4°c 37°C。步骤b中阳离子聚合物与类固醇激素的投料质量比例为20 1 1 20;聚乙 烯亚胺与氧化类固醇激素反应时间为4 48h ；催化脱水剂为1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙 基碳二亚胺盐酸盐(EDC)或1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟 基琥珀酰亚胺(NHS)合用；反应温度范围为0°C 37°C。更优选的步骤a中所使用的氧化剂为高碘酸钾；类固醇激素与氧化剂的摩尔比例范围为 1 0. 5 1 1.5;反应时间为24h;反应温度为室温(15-30°c)。步骤b中阳离子聚合物与类固醇激素的质量比例为10 1 1 1;所使用的催 化脱水剂为EDC ；反应时间为24h ；反应温度为0°C。所述制备方法路线图如下<formula>formula see original document page 6</formula>本发明还提供所述聚合物作为基因载体的应用，其特征在于包括下列步骤将聚合物和质粒DNA分别溶于缓冲溶液，取两种溶液混合，室温静置IOmin 2h， 聚合物和质粒DNA通过静电自组装形成聚合物/质粒DNA复合物。所述的质粒DNA，其特征在于质粒DNA是包含报告基因、抗癌基因、细胞因子基因 的可在真核细胞中重组表达的质粒DNA。聚合物载体与质粒DNA的制备方法及质量比例会影响所制得的复合物粒径、细胞 毒性及转染效果。优选的聚合物溶液的溶媒为磷酸盐缓冲液、或4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液(HEBS缓冲 液)、或氯化钠溶液、或葡萄糖溶液；质粒DNA溶液的溶媒为三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四 乙酸缓冲液(TE缓冲液)；聚合物溶液的浓度范围为0. 01 10mg/ml ；质粒DNA溶液的浓度 范围为0. Ol 10mg/ml ；载体与质粒DNA的质量比例范围为0. OOl 60 ；载体和质粒DNA 混合后静置时间为IOmin 2h。更优选的聚合物溶液的溶媒为磷酸盐缓冲液；聚合物溶液的浓度范围为0. 1 lmg/ml ；质 粒DNA溶液的浓度范围为0. 1 lmg/ml ；载体与质粒DNA的质量比例范围为0. 1 20 ；载 体和质粒DNA混合后静置时间为0. 5 Ih。本发明通过凝胶阻滞实验验证聚合物对质粒DNA的包裹能力，并通过核酸酶降解 实验考察聚合物/质粒DNA复合物抵抗核酸酶降解的能力，进而验证复合物在转染条件下 的稳定性，详见实施例6。
本发明通过MTT法测试了类固醇激素修饰的阳离子聚合物的细胞毒性，具体步骤 见实施例9。本发明提供了聚合物/质粒DNA复合物在转染细胞中的应用，其特征在于聚合 物基因载体的人体肿瘤细胞、或内皮细胞、或上皮细胞等的基因转导，把载有质粒DNA的复 合物与人体肿瘤细胞、或内皮细胞、或上皮细胞等共培养，复合物可携带质粒DNA转导入细 胞。本发明使用类固醇激素修饰的阳离子聚合物进行体外转染实验，以验证聚合物/ 质粒DNA复合物的基因转导效果，具体步骤见实施例8。
本发明提供的聚合物/质粒DNA复合物作为基因载体的应用，其特征在于可以用 于注射给药、或粘膜给药、或口服给药。本发明的优点(1)本发明所制备的聚合物具有细胞核靶向性；(2)本发明所制备的聚合物具有靶向性、辅助肿瘤治疗、辅助抗炎治疗多重作用；(3)本发明所提供的制备方法工艺简单，适用可靠，成本低廉；(4)本发明提供的聚合物可荷载的质粒DNA范围广泛，外源质粒DNA大小范围可以 从几十bp到几千kb，克服了病毒载体外源基因荷载量小的缺点；(5)本发明提供的聚合物/质粒DNA复合物可用于多个基因联合转导，同时也可作 为平台技术用于制备可治疗多种疾病的基因传输系统。
图1为氧化地塞米松(a)和地塞米松-聚乙烯亚胺接枝聚合物(b)的1H-NMR图 谱；图2为凝胶阻滞实验电泳图片；图3为核酸酶降解实验电泳图片；图4为复合物的粒径结果示意图；图5为样品体外细胞转染实验的荧光照片。
具体实施例方式应充分说明的是，以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。例 如本发明所描述的聚乙烯亚胺也可以是聚乙烯亚胺的衍生物，其分子量也不应局限于所采 用的分子量。而作为靶向分子的类固醇激素种类不局限于实施例中所采用的范围，应具备 更广阔的选择尺度范围，所有这些都不应成为对权利要求的限制。实施例1地塞米松修饰 的聚乙烯亚胺聚合物的合成取0. Ig地塞米松，溶解于20ml无水乙醇，加入一定量H2SO4溶液，调解pH至3左 右，在N2保护下加入高碘酸钾溶液使之完全混合，在室温下反应24h，旋转蒸发除去溶剂得 到白色沉淀，加入0. 05mol/LNa0H溶液溶解沉淀，用HCl调节体系pH至2，室温放置2h，4°C 过夜，抽滤，以水洗涤沉淀，P2O5真空干燥即得到氧化地塞米松(O-Dex)。将PEI (Sigma, MW =25000)与中间体氧化地塞米松分别溶于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，将两溶液混合后 置冰浴中，取适量的EDC溶解于DMF中，缓慢滴加至PEI和O-Dex的混合溶液中，反应24h。反应结束后，加入相当于DMF总量5-10倍的0°C预冷的双蒸水，抽滤除去不溶物。滤液在双蒸水中透析(MWCO = 3500) 2天，透析液0. Sum滤膜过滤，低压冻干，即为地塞米松修饰的聚 乙烯亚胺聚合物(Dex-g-PEI)。通过核磁共振对聚合物进行结构确证。氧化地塞米松的1H-NMR图谱(附图1中a 所示)中，S 12. 4归属为α -羟基酮氧化产生的羧基中的羟基。Dex-g-PEI的H1-NMR图谱 (附图1中b所示)中，δ 0.9和1. 2归属为地塞米松五元环13、16位的甲基峰，且PEI的 亚甲基特征峰从2. 7位移至3. 2，证明PEI中化学接入了地塞米松，根据PEI亚甲基的积分 面积与地塞米松甲基积分面积的比值可计算出地塞米松修饰量为12.3%。结果表明，聚乙 烯亚胺化学连接在氧化地塞米松的的20位羧基上，生成了 Dex-g-PEI聚合物。实施例2泼尼松龙修饰的聚乙烯亚胺聚合物的合成取0. Ig泼尼松龙，溶解于20ml无水乙醇，加入一定量!^04溶液，调解pH至3左 右，在N2保护下加入高碘酸钾溶液使之完全混合，在室温下反应24h，旋转蒸发除去溶剂得 到白色沉淀，加入0. 05mol/L NaOH溶液溶解沉淀，用HCl调节体系pH至2，室温放置2h，4°C 过夜，抽滤，以水洗涤沉淀，P2O5真空干燥即得到氧化泼尼松龙(O-Pon)。将PEI (Sigma, MW =25000)与中间体氧化泼尼松龙分别溶于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，将两溶液混合后 置冰浴中，取适量的EDC溶解于DMF中，缓慢滴加至PEI和O-Pon的混合溶液中，反应24h。 反应结束后，加入相当于DMF总量5-10倍的0°C预冷的双蒸水，抽滤除去不溶物。滤液在双 蒸水中透析(MWC0 = 3500) 2天，透析液0. Sum滤膜过滤，低压冻干，即为泼尼松龙修饰的聚 乙烯亚胺聚合物(Pon-g-PEI)。实施例3地塞米松修饰的壳聚糖氨基衍生物聚合物的合成取0. Ig地塞米松，溶解于20ml无水乙醇，加入一定量H2S04溶液，调解pH至3左 右，在N2保护下加入高碘酸钾溶液使之完全混合，在室温下反应24h，旋转蒸发除去溶剂得 到白色沉淀，加入0. 05mol/LNa0H溶液溶解沉淀，用HCl调节体系pH至2，室温放置2h，4°C 过夜，抽滤，以水洗涤沉淀，P2O5真空干燥即得到氧化地塞米松(O-Dex)。将壳聚糖氨基衍 生物(壳聚糖来自玉环县海洋生物化学有限公司，MW= 10000，壳聚糖氨基衍生物为自制产 品)与中间体氧化地塞米松分别溶于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，将两溶液混合后置冰浴 中，取适量的EDC溶解于DMF中，缓慢滴加至PEI和O-Dex的混合溶液中，反应24h。反应结 束后，加入相当于DMF总量5-10倍的0°C预冷的双蒸水，抽滤除去不溶物。滤液在双蒸水中 透析(MWC0 = 3500) 2天，透析液0. Sum滤膜过滤，低压冻干，即为地塞米松修饰的壳聚糖氨 基衍生物聚合物(Dex-g-Chi)。实施例4泼尼松龙修饰的壳聚糖氨基衍生物聚合物的合成取0. Ig泼尼松龙，溶解于20ml无水乙醇，加入一定量H2S04溶液，调解pH至3左 右，在N2保护下加入高碘酸钾溶液使之完全混合，在室温下反应24h，旋转蒸发除去溶剂得 到白色沉淀，加入0. 05mol/L NaOH溶液溶解沉淀，用HCl调节体系pH至2，室温放置2h， 4°C过夜，抽滤，以水洗涤沉淀，P2O5真空干燥即得到氧化泼尼松龙(O-Pon)。将壳聚糖氨基 衍生物(壳聚糖来自玉环县海洋生物化学有限公司，MW= 10000，壳聚糖氨基衍生物为自制 产品)与中间体氧化泼尼松龙分别溶于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，将两溶液混合后置冰 浴中，取适量的EDC溶解于DMF中，缓慢滴加至PEI和O-Pon的混合溶液中，反应24h。反应 结束后，加入相当于DMF总量5-10倍的0°C预冷的双蒸水，抽滤除去不溶物。滤液在双蒸水中透析(MWCO = 3500) 2天，透析液0. Sum滤膜过滤，低压冻干，即为泼尼松龙修饰的壳聚糖氨基衍生物聚合物(Pon-g-Chi)。实施例5Dex-g_PEI/质粒DNA的构建及电泳阻滞实验为考察聚合物包裹DNA的能力，以实施例1所制备的地塞米松修饰的聚乙烯亚胺 聚合物为例，说明该实验的具体步骤。将聚合物Dex-g-PEI溶于PBS缓冲液(pH = 7. 4)中， 配制成0. lmg/ml的溶液；质粒DNA溶于TE缓冲液(pH = 7. 4)中，配制成0. lmg/ml的溶 液。按载体与质粒 DNA 质量比例 0. 133,0. 266,0. 398,0. 531,0. 664,0. 797,0. 930、1. 062、 1. 195，在涡旋混合仪上混和lmin，室温静置0. 5h，载体和质粒DNA通过静电自组装成复合 物，复合物中所含DNA均为2 μ g。分别取15 μ 1复合物溶液进行琼脂糖凝胶电泳观察DNA 阻滞情况。电泳条件0. 7%琼脂糖(含GoIdViewer )，0. 5 XTBE缓冲液，电压90V，电泳时 间90min，结果如附图2所示。图2中第一泳道为质粒DNA对照，第二到第八泳带分别对应聚合物与DNA的质量 比为 0. 133,0. 266,0. 398,0. 531,0. 664,0. 797,0. 930,1. 062,1. 195。由于聚合物中带正电 荷的氨基通过静电作用同DNA中带负电的磷酸基团结合，从而将DNA包裹在复合物内部，使 其条带消失。根据结果，当质量比为0.531时条带消失，说明载体与DNA完全结合。实施例6核酸酶降解实验为进一步验证经过包裹的DNA抗核酸酶降解的能力，以实施例1所制备的地塞米 松修饰的聚乙烯亚胺聚合物为例，说明该实验具体步骤。制备聚合物与DNA的质量比分别 为 0. 133,0. 398,0. 664、1. 594 的复合物(其中含 DNA3 μ g)，加入含有 3unit DNase I 的反 应缓冲液(pH 7. 4,50mM Tris-HCl, IOmM NaCl, IOmM CaCl2,6mM MgCl2)，37°C下孵育 lh，然 后加入10μ 1的EDTA(0. 1M)，80°C下加热IOmin灭活DNase I。样品中加入30μ1的肝素 (10mg/ml)，涡旋15min使DNA从复合物中解聚，进行电泳实验，其结果如附图3所示。附图3中第一泳道为经酶解后的质粒DNA，第二泳道至第五泳道分别对应载体/ DNA的质量比分别为0. 133,0. 398,0. 664、1. 594，第六泳道为DNA对照。根据结果可以看出， 当质量比大于0. 398时，能够保护DNA不被核酸酶降解，而没有载体保护的质粒DNA (第一 泳道)则被完全降解了。实验说明所制备的聚合物载体能够有效地保护DNA，使DNA不会在 转染过程中被降解。实施例7动态光散射(DLS)测定Dex-g-PEI/质粒DNA复合物粒径大小将实例2中制备得到的质量比为0.664的复合物，取50 μ 1用PBS稀释到1000 μ 1， 用粒径和电位测定仪(Brookhaven，BI-ZetaPALS)进行测定，结果见附图4。根据实验结果， 质量比为0. 664时，Dex-g-PEI/DNA复合物的粒径在160nm左右呈均一分布。实施例8细胞转染实验转染前一天，将对数生长期的H印G2细胞接种于24孔板，使得次日细胞融合率达 80%-90%。转染前4h，将细胞用无血清无双抗的培养基孵育。于24孔板中加入质量比为 1. 594的Dex-g-PEI/DNA复合物，于37°C、5% CO2条件下培养4_6h，更换有血清无双抗的培 养基，继续培养24h，对细胞进行荧光检测，观察GFP的表达，结果见附图5。根据实验结果，图5中能观察到一定强度和数量的绿色荧光蛋白的表达，说明质 量比为1. 594的Dex-g-PEI/DNA复合物具有较理想的转染效果。实施例9MTT法测定聚合物的细胞毒性
将处于对数生长期的!fepG2细胞用0. 02 % EDTA消化，制成细胞悬液，分别以 1 X 105/ml细胞浓度加入96孔酶标板内，每孔100 μ 1，设五复孔，置37°C 5% CO2孵箱内培养 24h左右，再分别加入终浓度为5、25、50、75和100 μ g/ml的Dex-g-PEI，以未经修饰的PEI 为对照，分别孵育24h后，每孔加入5mg/ml MTT溶液20 μ 1，继续培养4h，弃去全部上清，加 入DMS0100 μ 1/孔，微型振荡器上振动5min，使结晶完全溶解，于酶联仪570nm波长处测定 吸光度值(A)，A值越高活细胞数也越多。根据A可计算药物对细胞的活力抑制率。 (1_加药组细胞平均吸■) χ100% 对照组细胞平均吸光值根据实验结果，在不同浓度下经统计分析，Dex-g-PEI的细胞毒性低于PEI。实施例lODex-g-PEI/DNA复合物基因传输系统荷瘤小鼠体内转基因试验将!fepG2细胞株接种于BALB/C裸鼠皮下，建立肿瘤模型，待瘤块长至直 径约0.3 0. 5cm时，将荷瘤裸鼠随机分组，每组5只，分别为生理盐水组、质粒 pIRES2-EGFP-p53 组、PEI/pIRES2_EGFP_p53 组、Dex-g-PEI/pIRES2_EGFP-p53 组。小鼠尾静 脉内注射携带5ugpIRES2-EGFP-p53质粒的复合物进行基因治疗，每天注射一次，连续注射 3天，于第4日处死裸鼠，观察肿瘤形态变化。分离肿瘤并称重，以PBS缓冲液(pH 7.0)漂 洗肿瘤组织2次，OCT包埋液包埋肿瘤组织，冷冻切片，风干，随后在荧光显微镜下观察EGFP 的表达。结果显示，PEI/pIRES2-EGFP-p53 组、Dex-g-PEI/pIRES2_EGFP-p53 组瘤体重量减 轻，Dex-g-PEI/pIRES2-EGFP-p53组绿色荧光亮度较其他组强。实施例llDex-g-PEI/DNA复合物基因传输系统荷瘤小鼠肺部粘膜给药转基因试 验用雄性无胸腺裸鼠构建LM-6骨肉瘤细胞模型，将SA0S-LM6人源骨肉瘤细胞株 静脉折射6周肺转移，8周后可见肺部明显肿瘤形貌。将荷瘤裸鼠随机分组，每组5只， 分别为生理盐水组、质粒 pIRES2-EGFP-p53 组、PEI/pIRES2_EGFP-p53 组、Dex-g-PEI/ pIRES2-EGFP-p53组。将药液气雾给药至肺部粘膜，给药量为2mg质粒/IOml气雾溶液。初 次给药后第三天再次给药，一周两次共六周，然后处死裸鼠，分离肺部肿瘤并称重。以PBS 缓冲液(PH 7.0)漂洗肿瘤组织2次，OCT包埋液包埋肿瘤组织，冷冻切片，风干，随后在荧 光显微镜下观察。结果显示，PEI/pIRES2-EGFP-p53 组、Dex-g-PEI/pIRES2_EGFP-p53 组瘤 体重量减轻，Dex-g-PEI/pIRES2-EGFP-p53组绿色荧光亮度较其他组强。实施例12抗炎作用6-8周的雄性BALB/c小鼠随机分组，每组5只，分别给予PBS、地塞米松、 Dex-g-PEI。地塞米松给药剂量为2mg/kg (1 %乙醇的PBS溶液)，按等摩尔量地塞米松计给 予相当剂量的Dex-g-PEI。30min后，小鼠腹腔注射1.5mL 3%硫胶质(1%乙醇的PBS溶 液)。注射4h后，收集腹水，计数中性粒细胞。结果显示，与PBS组相比，Dex-g-PEI可抑制 腹水中的中性粒细胞聚集。
权利要求
一种类固醇激素修饰的阳离子聚合物，由阳离子聚合物共价连接氧化类固醇激素而成，其特征在于包括下列步骤a.类固醇激素溶于有机溶剂中，加入氧化剂，在N2保护下反应，将类固醇激素21位α-羟基酮氧化为羧基，停止反应，除去溶剂，溶解沉淀，调节溶液pH值，使产物析出，沉淀经洗涤、过滤、干燥即得氧化类固醇激素；b.将阳离子聚合物与氧化类固醇激素溶于有机溶剂中，加入催化脱水剂，在N2保护下反应，停止反应，过滤除去反应溶液中不溶物，透析，0.8μm滤膜过滤，干燥即得类固醇激素修饰的阳离子聚合物。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于阳离子聚合物与类固醇激素的投料质 量比例为20 1 1 20，类固醇激素的修饰量为3% 30%。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于阳离子聚合物是可与质粒DNA静电自 组装形成复合物的聚合物，包括聚乙烯亚胺、多聚赖氨酸、多聚精氨酸、多聚组氨酸、组氨酸 赖氨酸分枝状聚合物、壳聚糖氨基衍生物、多胺树突状物、聚丙烯亚胺树突状物。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于类固醇激素21位具有α-羟基酮结 构，包括地塞米松、皮质酮、倍他米松、甲基氢化泼尼松、泼尼松龙、氢化泼尼松龙、去炎松、 可的松、氢化可的松、曲安缩松、倍氯米松、氟轻松、氟甲松龙、氯泼尼醇、卤米松、去羟米松、 丙酮缩氟氢羟龙。
5.根据权利要求1所述的聚合物作为基因载体的应用，其特征在于包括下列步骤将聚合物和质粒DNA分别溶于缓冲溶液，取两种溶液混合，室温静置IOmin 2h，聚合 物和质粒DNA通过静电自组装形成聚合物/质粒DNA复合物。
6.根据权利要求5所述的质粒DNA，其特征在于质粒DNA是包含报告基因、抗癌基因、 细胞因子基因的可在真核细胞中重组表达的质粒DNA。
7.根据权利要求5所述的聚合物/质粒DNA复合物作为基因载体的应用，其特征在于 聚合物基因载体的人体肿瘤细胞、或内皮细胞、或上皮细胞的基因转导，把载有质粒DNA的 复合物与人体肿瘤细胞、或内皮细胞、或上皮细胞共培养，复合物可携带质粒DNA转导入细 胞。
8.根据权利要求5所述的聚合物/质粒DNA复合物作为基因载体的应用，其特征在于 可以用于注射给药、或粘膜给药、或口服给药。
全文摘要
本发明涉及类固醇激素修饰的阳离子聚合物及其基因复合物的制备。本发明所要解决的技术问题是提供一种具有细胞核靶向功能，辅助肿瘤治疗，辅助抗炎治疗的多重作用的阳离子聚合物，并提供一种工艺简单，适用可靠，成本低廉的上述阳离子聚合物的制备方法。该聚合物的制备方法为类固醇激素溶于有机溶剂中，经氧化剂氧化，纯化，干燥即得氧化类固醇激素；将阳离子聚合物与氧化类固醇激素溶于有机溶剂中，加入催化脱水剂反应，纯化，干燥即得类固醇激素修饰的阳离子聚合物。本发明还提供上述阳离子聚合物作为基因载体的应用。该聚合物与质粒DNA形成的复合物具有很好的靶向性，优良的安全性，较高的转染效率，具有广泛的基因适应性。
文档编号A61K47/48GK101812177SQ20101001724
公开日2010年8月25日 申请日期2010年1月5日 优先权日2010年1月5日
发明者卢韵, 周建平, 姚静, 范颖 申请人:中国药科大学