专利名称：梭菌毒素药物组合物的利记博彩app
梭菌毒素药物组合物本申请是国际专利申请，根据35U. S. C. § 119(e)，要求2008年12月10日提交的美国临时专利申请No. 61/121，345的优先权，并且根据35U. S. C. § 120，要求2008年12月 10日提交的美国专利申请No. 12/331,816的优先权，所述两份专利申请各自都以引用的方式全文纳入本说明书。药物组合物是包含至少一种活性成分和至少一种惰性成分的制剂，所述惰性成分被称作赋形剂，用作所述活性成分的稀释剂或运载体(vehicle)。赋形剂可用作以下一种或多种稳定剂、表面活性剂、填充剂、冷冻保护剂、冻干保护剂(lyo-protectant)、防腐剂和缓冲剂。可将药物组合物加工为固体形式，例如，可在给予患者之前用合适液体(例如盐水或水)复原的冻干或真空干燥的粉末。或者，可将药物组合物配制为水性溶液或悬浮液。大部分药物组合物包含小分子(或化学实体)作为它们的活性成分。近来，随着生物技术产业的出现，已经开发或正在开发包含蛋白质活性成分的药物组合物。遗憾的是，蛋白质活性成分很难稳定(即，维持在生物活性损失最小的状态)，从而导致在使用之前对所述药物组合物进行配制、复原(若需要)和储存的过程中蛋白质的损失和/或蛋白质活性的损失。稳定性问题可因蛋白质活性成分的表面吸附、物理不稳定性(例如变性或聚集)或化学不稳定性(例如交联、脱酰胺、异构化、氧化、酸或碱类的形成、Maillard反应和断裂) 而发生。为了防止所述不稳定性，已经使用多种基于蛋白质的赋形剂，如白蛋白和明胶，来稳定存在于药物组合物中的蛋白质活性成分。遗憾的是，尽管已知蛋白质赋形剂(如白蛋白或明胶)有稳定效应，然而它们在药物组合物中的应用存在明显的缺点。例如，白蛋白和明胶很贵并且越来越难以得到。此外， 当将血液产品或来自动物的产品如白蛋白和明胶给予患者时可使所述患者面临接受血液携带的病原体或传染原的潜在危险。因此，已经知道存在这样的可能性，即存在于药物组合物中的来源于动物的蛋白质赋形剂能够导致无意中将传染性成分纳入所述药物组合物。例如，已报道人血清白蛋白的使用可将阮病毒传递到药物组合物中。因此，需要寻找合适的可用于稳定存在于药物组合物中的蛋白质活性成分的非蛋白质赋形剂，例如稳定剂、冷冻保护剂和冻干保护剂。梭菌毒素的独特性质进一步限制和阻碍了选择用于含有梭菌毒素活性成分的药物组合物的合适非蛋白质赋形剂。例如，梭菌毒素是平均分子量为约150kDa的大蛋白质分子，并且进一步与使其大小增加至约300-900-kDa的非毒素结合蛋白质复合。梭菌毒素复合物的大小使其比较小的较不复杂的蛋白质更容易断裂和不稳定，因此，如果想要维持梭菌毒素的稳定性会增加配制和处理困难。因此，非蛋白质赋形剂(例如，稳定剂、冷冻保护剂和冻干保护剂)的使用必须能够以这样的方式与所述梭菌毒素活性成分相互作用即不使所述梭菌毒素变性、断裂或以其他方式失活或者不引起存在于毒素复合物中的非毒素结合蛋白质分解。与梭菌毒素活性成分相关的另一个问题是配制过程的所有步骤所必需的特别的安全性、精确性和准确性。因此，非蛋白质赋形剂本身不应该是有毒的或者难以处理的，从而不加重目前含有梭菌毒素活性成分的药物组合物的制剂中已经非常严格的要求。
与梭菌毒素活性成分相关的另一个困难是在所述药物组合物中使用的梭菌毒素的量极低。通常与酶一样，梭菌毒素的生物活性(至少部分)依赖于它们的三维构象。因此，梭菌毒素可被热、各种化学物质、表面拉伸和表面干燥解毒。此外，已知将通过已知的培养、发酵和纯化方法得到的梭菌毒素复合物稀释至药物组合物中所用的低得多的浓度会导致所述毒素迅速失活。药物组合物中所用的梭菌毒素活性成分的极低量使得该活性成分非常容易被吸附至例如实验室玻璃器皿、容器的表面、复原所述药物组合物的小瓶以及用于注射所述药物组合物的注射器的内表面。梭菌毒素活性成分的这种表面吸附能导致活性成分的损失和剩余梭菌毒素活性成分的变性，这两种情况都会降低所述药物组合物中活性成分的总活性。因此，非蛋白质赋形剂(例如稳定剂、冷冻保护剂和冻干保护剂)的使用必须能够作为表面阻断剂来防止梭菌毒素活性成分吸附至表面。目前为止，唯一成功用于此目的的稳定剂是来源于动物的蛋白质，例如，人血清白蛋白和明胶。与梭菌毒素活性成分有关的另一个问题是与复合物形成相关的pH-敏感性。例如，已知900-kDa BoNT/A复合物在pH 3. 5-6. 8下能溶于稀的水性溶液中。然而，在大于约 7的pH下，特别是当pH升至大于pH 8.0时，所述非毒素结合蛋白质从所述150-kDa神经 .■Jlf^!^^"；^，^^.^^*^^。 Edward J. Schantz et al. ,pp. 44-45,Preparation and characterization of botulinum toxin type A for human treatment,in Jankovic, J. , et al. , Therapy with Botulinum Toxin (Marcel Dekker, Inc.，1994)。由于所毒素结合蛋白质被认为维持或帮助稳定毒性所依赖的二级和三级结构，因此这些蛋白质的解离会产生更不稳定的梭菌毒素活性成分。因此，可用于配制含有梭菌毒素活性成分的药物组合物的非蛋白质赋形剂必须能够在保持梭菌毒素活性成分活性所必需的PH水平的限制内工作。根据梭菌毒素的独特性质和上述要求，寻找合适的可用于配制含有梭菌毒素活性成分的药物组合物的非蛋白质赋形剂很困难。在本发明之前，仅来源于动物的蛋白质赋形剂例如人血清白蛋白和明胶被成功用作稳定剂。因此，已知白蛋白本身或者白蛋白与一种或多种其他物质例如磷酸钠或柠檬酸钠一起可使冻干后的A型肉毒毒素有高复原率。遗憾的是，如前所述，人血清白蛋白作为合并的血液产品，当存在于所述药物组合物中时，至少可能带有传染性或致病性成分。实际上，任何动物产品或蛋白质，例如人血清白蛋白或明胶还能潜在地含有可在注射给患者后引起不良反应的热原或其他物质。因此需要的是梭菌毒素(例如肉毒毒素)由非蛋白质赋形剂稳定的梭菌毒素的药物组合物。本发明涉及梭菌毒素药物组合物，所述药物组合物含有一种或多种用于稳定存在于所述药物组合物中的梭菌菌素的非蛋白质赋形剂。因此，在本发明的一个方面，梭菌毒素药物组合物包含无动物蛋白质赋形剂和梭菌毒素活性成分。在另一个方面，梭菌毒素药物组合物包含至少两种无动物蛋白质赋形剂和梭菌毒素活性成分。在另一个方面，梭菌毒素药物组合物包含至少三种无动物蛋白质赋形剂和梭菌毒素活性成分。梭菌毒素活性成分可以是包含所述约150-kDa的梭菌毒素和总称为非毒素结合蛋白质(NAP)的其他蛋白质的梭菌毒素复合物、或者仅所述约150-kDa梭菌毒素自身，或修饰的梭菌毒素(例如，重靶向的梭菌毒素)。因此，在本发明的另一个方面，梭菌毒素药物组合物包含非蛋白质基的赋形剂和梭菌毒素活性成分。在另一个方面，梭菌毒素药物组合物包含至少两种非蛋白质基的赋形剂和梭菌毒素活性成分。在另外一个方面，梭菌毒素药物组合物包含至少三种非蛋白质基的赋形剂和梭菌毒素活性成分。梭菌毒素活性成分可以是包含所述约150-kDa梭菌毒素和总称为非毒素结合蛋白质(NAP)的其他蛋白质的梭菌毒素复合物、或者仅所述约150-kDa 梭菌毒素自身，或修饰的梭菌毒素(例如，重靶向的梭菌毒素)。在本发明的另一个方面，肉毒毒素药物组合物包含无动物蛋白质赋形剂和肉毒毒素活性成分。在另一个方面，肉毒毒素药物组合物包含至少两种无动物蛋白质赋形剂和肉毒毒素活性成分。在另外一个方面，肉毒毒素药物组合物包含至少三种无动物蛋白质赋形剂和肉毒毒素活性成分。肉毒毒素活性成分可以是包含所述约150-kDa肉毒毒素和多种 NAP的肉毒毒素复合物、或者仅所述约150-kDa肉毒毒素自身，或修饰的肉毒毒素(例如，重靶向的肉毒毒素)。在本发明的另一个方面，肉毒毒素药物组合物包含非蛋白质基的赋形剂和肉毒毒素活性成分。在另一个方面，肉毒毒素药物组合物包含至少两种非蛋白质基的赋形剂和肉毒毒素活性成分。在另外一个方面，肉毒毒素药物组合物包含至少三种非蛋白质基的赋形剂和肉毒毒素活性成分。肉毒毒素活性成分可以是包含所述约150-kDa肉毒毒素和多种 NAP的肉毒毒素复合物、或者仅所述约150-kDa肉毒毒素自身，或者改性的肉毒毒素(例如， 重靶向的肉毒毒素)。由肉毒杆菌(Clostridium botulinum)、破伤风梭菌(Clostridium tetani)、巴氏梭菌(Clostridium baratii)和丁酸梭菌(Clostridium butyricum)生产的梭菌毒素最广泛地用于人和其他哺乳动物的治疗和美容。肉毒杆菌的菌株生产七种抗原性不同的肉毒毒素类型(BoNT)，它们已通过研究人(BoNT/A、/B、/E和/F)、动物(B0NlVC1和/D)的肉毒中毒爆发被鉴定，或者从土壤中分离(BoNT/G)。各种BoNT相互具有大约35%的氨基酸同一性并且具有相同的功能区域组织和总结构构架。本领域技术人员知晓每种梭菌毒素类型中可存在氨基酸序列以及编码这些蛋白质的核酸在某种程度上不同的亚型。例如，目前有五种 BoNT/A 亚型ΒοΝΤ/Α 1、ΒοΝΤ/Α2、ΒοΝΤ/Α3、ΒοΝΤ/Α4 和 BoNT/A5，与另一种 BoNT/A 亚型相比，具体亚型显示出约89%的氨基酸同一性。尽管所有七种BoNT血清型具有相似的结构和药理学性质，然而各自也显示不同的细菌学特性。相反，破伤风毒素(TeNT)由同一族的破伤风梭菌产生。梭菌属的另外两个种，巴氏梭菌和丁酸梭菌也分别产生毒素BaNT和BuNT， 这两种毒素分别与BoNT/F和BoNT/E相似。梭菌毒素作为包含所述约150-kDa梭菌毒素连同非毒素结合蛋白质(NAP)的复合物由梭菌细菌释放。鉴定的NAP包括具有血凝反应活性的蛋白质，例如约17-kDa 的血凝素(HA-17)，约33-kDa的血凝素(HA-33)和约70_kDa的血凝素(HA-70)；以及无毒非血凝素(NTNH)，其是一种约130-kDa的蛋白质，参见，例如Eric A. Johnson and Marite Bradshaw, Clostridial botulinum and its Neurotoxins :A Metabolic and Cellular Perspective,39 Toxicon 1703-1722(2001)；禾口Stephanie Raffestin et al., Organization and Regulation of the Neurotoxin Genes in Clostridium botulinum and Clostridium tetani, 10 Anaerobe 93-10(^2004)。因此，A 型肉毒毒素复合物可由梭菌细菌以900-kDa、500-kDa和300_kDa的形式产生。B型和C1型肉毒毒素似乎仅以500_kDa 复合物的形式产生。D型肉毒毒素以300-kDa和500-kDa复合物的形式产生。最后，E型和 F型肉毒毒素仅以约300-kDa复合物的形式产生。所述复合物分子量的不同是由于NAP的比例不同。所述毒素复合物对于中毒过程很重要，因为它提供避免有害环境条件的保护、对蛋白酶消化的抗性并且看起来促进所述毒素的内化和激活。梭菌毒素各自都被翻译为单链多肽，所述多肽随后由天然蛋白酶通过在二硫环内的蛋白水解剪切而断裂。这种断裂发生在由形成二硫桥的两个半胱氨酸残基之间产生的分开的双链环区域内。该翻译后加工产生了包含一条约50kDa轻链(LC)和一条约IOOkDa重链(HC)的双链分子，所述轻链和重链由所述两条链之间的所述单个二硫键和非共价相互作用接合在一起。目前还不了解所述用于将所述单链分子转变为所述双链的天然蛋白酶。 在一些血清型中，例如BoNT/A，所述天然蛋白酶由所述细菌血清型以内源方式产生，并且所述断裂在所述毒素被释放到环境中之前在细胞内发生。然而，在其他血清型中，例如BoNT/ E，所述细菌菌株看起来不产生能够将所述毒素的单链形式转变为双链形式的内源性蛋白酶。在这些情况下，所述毒素作为单链毒素从细胞中释放，然后由环境中存在的天然蛋白酶转变为双链形式。
权利要求
1.一种无动物蛋白质的固体形式的梭菌毒素药物组合物，所述组合物包含梭菌毒素活性成分、有效量的糖赋形剂和有效量的表面活性剂赋形剂。
2.权利要求1的组合物，其中所述糖赋形剂是单糖、二糖或三糖。
3.权利要求1的组合物，其中所述单糖是蔗糖或海藻糖。
4.权利要求1的组合物，其中所述表面活性剂赋形剂是聚羟亚烃、聚山梨醇酯、聚乙二醇十二烷基醚或聚氧乙烯辛基苯基醚。
5.权利要求1的组合物，其中所述梭菌毒素活性成分储存在环境温度或冰点温度下时稳定至少1年。
6.权利要求1的组合物，其中所述组合物被缓冲为约pH5. 5至约pH6. 5。
7.权利要求6的组合物，其中所述组合物用柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、组氨酸缓冲液或组氨酸磷酸盐缓冲液来缓冲。
8.权利要求1的组合物，其中所述组合物还包含有效量的氯化钠。
9.权利要求1的组合物，其中所述组合物还包含有效量的非蛋白质聚合物赋形剂。
10.权利要求9的组合物，其中所述非蛋白质聚合物赋形剂是葡聚糖、聚乙二醇、聚乙烯亚胺、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙酸乙烯酯、菊粉、淀粉或淀粉衍生物。
全文摘要
包含梭菌毒素活性成分和至少两种赋形剂的无动物蛋白质的固体形式的梭菌毒素药物组合物。
文档编号A61K47/32GK102307571SQ200980156383
公开日2012年1月4日 申请日期2009年12月10日 优先权日2008年12月10日
发明者A·塞纳维拉特纳, A·巴色, D·马修森, G·达萨里, H·P·M·库马尔, H·T·特兰, J·Z·谢, T·J·亨特 申请人:阿勒根公司