专利名称：用于改善基因调节化合物的递送的化学修饰的细胞渗透性肽的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及用于胞内递送运载物(或负载物，cargo)的系统，该运载物包括选自具有至少4个碳原子的脂肪族线性或分支基团和/或包含2-4个环的环体系的至少一种组分A，该环可包含选自N、S、0和P的若干个杂原子，其中该(一种或多种)组分A结合于细胞渗透性肽B和/或其非肽类似物。本发明还涉及所述系统在死亡诊断中作为研究工具和作为靶向系统的用途、包含该系统的组合物并且尤其是药物组合物、覆盖有该系统的材料以及其中合并(或掺入)有该递送系统的材料。最后，本发明涉及新的肽。
背景技术：
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疏水性质膜构成活体动物中细胞的主要屏障，其允许必要分子的构成性和调节性内流进入而阻止其他大分子进入细胞内部。尽管跨越质膜的能力对于细胞维持非常关键，但是其仍然是推进现有药物开发需要克服的主要障碍之一。在过去的40年中，已开发了若干种用于操纵基因表达的基于寡核苷酸(ON)的方法。所述基础方法涉及使用表达感兴趣的基因的细菌质粒。另外，为了评价不同基因的功能方面，这是在临床环境中可利用的非常具有吸引力的策略，即基因疗法。起初认为基因疗法用于遗传性基因疾病的矫正治疗。然而，在过去的15年中，尽管还研究了其他获得性疾病，但用于癌症的实验性基因疗法已成为经常使用的治疗方法[I]。已出现了利用较短的ON-序列干扰基因表达的其他多种方法。最近积极开发了基于用于实现基因沉默的短干扰RNA(SiRNA)和用于操纵剪切模式的剪切校正ON(SCO)的反义方法[2，3]。尽管它们是调节基因表达的有效化合物，但是其疏水性却阻止了细胞内摄作用。尽管基因疗法对于未来各种疾病的治疗具有很大潜力，但是它具有一些严重的缺陷。首先，质粒较大，其大小通常超过lMDa，这使其不能透过细胞膜。第二，在临床试验中已使用病毒来实现治疗性基因的细胞内摄作用。尽管提供了递送基因的有效方法，但是这些方法可能会引起严重的免疫应答。因此，为了推进现有的基因疗法，需要更安全的递送系统，优选不依赖于病毒的使用。因此，人们加强了对有效的非病毒递送载体的研究。在现今的技术领域中，已在利用基于阳离子脂质体(Lipofectamine)或多聚阳离子聚合物的载体，并且这些载体对于常用细胞系的转染非常有效。然而，大部分这些载体要么对血清蛋白敏感、不能转染完整的细胞群、对于“难转染的”细胞无效，要么毒性太强。对于现在市场上销售的载体而言，似乎高效力和高毒性之间存在正相关。因此，急需寻找能够克服上述问题的递送媒介物。细胞渗透性肽(CPP)是近些年来关注度不断提高的一类肽。这是由于它们具有以相对无毒的方式运送各种本为非渗透性的大分子跨过细胞质膜的显著能力，如[4]中综述。这些肽的长度通常小于30个氨基酸(aa)并且具有阳离子和/或两性性质，其已被广泛用于体外和体内递送各种0N[5]。尽管这些肽一般是无毒的，但是仍存在一些与它们的用途有关的问题[6]。就ON-递送而言，CPP技术的一个缺点在于通常需要使肽共价结合至0N，这是一个繁杂的操作并且通常需要高浓度的肽结合物(轭合物)以获得显著的生物学反应[7，8]。一些研究已令人信服地显示简单地将CPP与ON混合的非共价共温育策略是有效的并且是一种无毒的方式。当使用与未经修饰CPP的共温育策略时，似乎所述复合物仍然被捕获在内涵体中并因此不能发挥生物反应[9]。理想条件下，将CPP设计成能够在胞吞作用之后更有效地逃逸内涵体区室(endosomal compartment),由此使得它们与寡核苷酸或质粒非共价复合。已尝试将CPP的应用与已知的转染试剂组合以减少获得生物反应所需的转染试剂的量或将CPP与已知的融合肽一起加入。另一种策略是一起加入高浓度的趋溶酶体剂(向溶酶体剂，lysosomotrophic agent)氯喹以增加CPP/0N复合物的效力，这显著增加了转染但是却仅限于体外使用，而且所需要的高浓度氯喹还带来了毒性问题。相关专利US 2007/0059353公开了一种具有细胞和核进入能力的脂质体。所提供的脂质体在其表面上具有包含多个连续精氨酸残基的肽，特别提供了其中的肽用疏水基团或疏水化合物修饰并且将该疏水基团或疏水化合物插入脂质双层中使得所述肽暴露在该 双层表面上的脂质体。除了构建此类复杂载体的困难之外，这一递送系统的问题还在于它们是以脂质体为基础的。若干团队已报导了用基于脂质体的递送系统转染后基因表达谱发生了变化，这在很大程度上阻碍了它们的使用。另外，寡聚精氨酸倾向于保持与内涵体区室结合并因此对于递送而言不是最优的。一种改进的策略是用一种或多种能够促进内涵体逃逸的化学物种(或化学实存物，chemical entity)化学修饰新设计的或现有的CPP。目前用于内涵体逃逸所选择的药物是氯喹(CQ)及其类似物。它是一种，正如它还被称作，趋溶酶体剂，其抑制内涵体酸化，在较高浓度下导致内涵体溶胀和破裂。若干美国专利公开了氯喹单独使用或与其他药物组合使用以抵抗各种疾病的用途。例如，第4，181，725号美国专利和A. M. Krieg等人的美国专利申请20040009949公开了氯喹与抑制性核酸组合用于治疗各种自身免疫疾病的用途。氯喹作为“趋溶酶体”剂能够从细胞内涵体/溶酶体释放物质的能力已被广泛记载。[Marches, 2004 ；A. Cuatraro 1990等]。然而，由于其毒性已要求禁止氯喹的体内使用，因为需要给予高浓度的游离氯喹以到达内涵体。(引用J. M. Benns等人,Istpara.,Bioconj, Chem. 11，637-645，(2000)尽管已证明氯喹有助于将质粒DNA释放进入细胞质，但是已发现其具有毒性并因此不能在体内使用。”)最近，标题为“氯喹偶合(偶联)的抗体和其他蛋白质以及它们的合成方法(Chloroquine coupled antibodies and other proteins with methods fortheirsynthesis) ”的第2007166281号USPTO申请公开了将氯喹和由其衍生的结构偶合于包含能够在可控条件下释放氯喹的可生物裂解连接(biocleavable linkage)的不同的载体组合物。第20070166281号申请的目的在于当载体到达其作用位点后提供使氯喹从蛋白质或肽活性剂或抗体控释。Kosak及其同事的专利US2006/0040879公开了组合物和用于制备偶合了氯喹的核酸组合物的方法。该现有技术已显示以足够高浓度的游离药物给予的氯喹增强了各种药剂从细胞内涵体释放进入细胞质。这些组合物的目的在于在需要释放核酸的相同位点提供可控量的氯喹，从而降低需要的总体剂量。本专利的目的在于实现与核酸组合物结合的氯喹的控释，这并不是该发明的主题，但是增强并简化了体外和体内基因疗法的递送。
发明内容
本发明提供了用于细胞内运载物递送的系统，其包括克服了非共价基因递送的所述缺陷(即低效和异源递送以及毒性)的新的一系列分子。本发明不需要可生物裂解的连接体(linker)来裂解氯喹类似物。本发明的系统包括不可逆地结合了氯喹的化合物。该系统包括具有脂肪酸修饰的改进的CPP的化合物，其可用于有效递送多种0N，而不具有现在市场上销售的递送物的毒性。新一代进一步衍生化的CPP能够将药物负载物有效递送至群体中的所有细胞中并将ON从其内涵体捕获(entrapment)中释放。本发明的权利要求描述了经修饰的和衍生化的递送肽以及它们的检测应用；增强的转染、剪接校正和siRNA递送。
图I经修饰的荧光素酶基因的前体-mRNA。将来自在核苷酸705处携带点突变的β-球蛋白基因的内含子2插入荧光素酶基因。用SCO对该位点实施的阻断使剪接重新定向至功能性mRNA。因此,这生成了依赖于SCO到达细胞核这一事实的阳性生物学判读(read-out)。图2用未修饰的CPP或与200nM SCO复合的脂质体2000转染试剂(Lipofectamine2000)处理后的定量摄取和剪接校正。A)Cy5-SC0与不同CPP以I : 5、1 : 10和I : 20的摩尔比复合后I小时的摄取。B)用A中相同组的复合物处理后的剪接校正。在无血清DEME中处理2h，然后用完全生长培养基替换培养基并再生长20h。C)用浓度不断增加的SCO处理后的剪接校正,根据制造商的使用说明使用脂质体2000转染试剂(Lipofectamine2000)。D)与B相同，但是用阻止内涵体酸化的75μΜ氯喹(CQ)共处理，并因此促进内涵体逃逸。这些结果明确显示未修饰的CPP能够引起SCO摄取但是不能诱导剪接校正。由于氯喹显著增加了剪接校正，有理由推断CPP/SC0复合物仅存在于内涵体区室内。图3凝胶阻滞试验。如之前所述形成复合物并跑PAGE胶lh。将肽与磷硫酰2' O-甲基RNA(即SCO)以5、10和20的摩尔比混合。将保留在孔中的物质定义为肽/SCO复合物。M918和紧随其后的TPlO是两种最强效的形成复合物的肽。图4用与SCO偶合的硬脂酰基修饰的CPP的摄取和剪接校正。A)如图2a进行定量摄取。与硬脂酰化的Arg9或pentratin复合的Cy5-SC0的摄取总体上高于PepFect肽。B)相同的肽和比例用于剪接校正。令人感兴趣的是P印Fect3诱导了正确剪接的显著增加而硬脂酰化的pentratin和Arg9的活性可忽略。尽管观察到低摄取，但PepFect2仍具有一些活性。图5a) Pepfect递送系统的一般结构，其中A =脂肪酸或二 -四环体系，1_8个拷贝，一些可能在分支的间隔区(spacer)上，B =细胞渗透性肽或其非肽类似物并且C =靶向部分例如导向肽(homing peptide)或适体,可为非共价结合。b)脂肪酸的实例硬脂酸的示意图，c)环体系的实例N-(2-氨基乙基)-N-甲基-K -[7-(三氟甲基)-喹啉-4-基]乙烷-1，2- 二胺。D) P印feet递送系统的图示结构和名称。图6TP10、TPlO与氯喹(CQ)以及P印Fect3 (TP10的硬脂酰化形式)之间促进SCO介导的剪接校正能力的比较。在较低的摩尔比I : 5时，P印Fect3诱导正确剪接的荧光素酶增加接近40倍，相比之下TPlO增加2倍。 然而，PepFect似乎仍有改进空间，因为用TPlO和氯喹共处理产生剪接的70倍增加。图7PepFect3 (N-端硬脂酰化)和PepFect4 (Lys7上垂直硬脂酰化)之间递送SCO的比较。两种肽均促进了 SCO-介导的剪接校正的剂量依赖性增加。将细胞在无血清培养基中处理4h，然后为细胞替换完全生长培养基，再生长20小时。细胞裂解后将发光数据测量值标准化为每孔中的蛋白质含量并表示为与未处理细胞相比的剪接倍数增加。PepFect3与SCO以摩尔比10复合而P印Fect4与SCO以摩尔比7复合。图8使用200nM SCO将 PepFect3 和 PepFect4 与脂质体 2000 转染试剂(Lipofectamine2000)进行比较。尽管PepFect3的活性略低于基于商购脂质体的转染剂Lipofectamine2000，但是PepFeCt4的活性超过该活性。如果与以5 μ M浓度临床前使用的CPP-吗啉轭合物(RXR)4-ΡΜ0相比，两种PepFect肽均在低25倍的SCO浓度下显示出优效。如图6进行实验。图9在Hela细胞中用PepFect肽转染荧光素酶编码的质粒。根据材料和方法部分的记载形成所有的转染复合物并在处理后24小时监测基因表达。A、C和E示出了来自以不同摩尔比分别与PepFectl、PepFect2或PepFect3复合的pGL3质粒的突光素酶表达。D)电荷比为I I时肽之间的比较。B)用阳性对照脂质体2000转染试剂(Lipofectamine 2000)转染后的荧光素酶表达。图10温育24h后，将CHO细胞中的用脂质体2000转染试剂(Lipofectamine2000)与用PepFect3对荧光素酶编码的质粒的转染进行比较。以范围为CR 0. 5-2的不同电荷比制备PF3和质粒的复合物并与根据制造商的使用说明使用的脂质体2000转染试剂的转染效率进行比较。将结果表示为相比于仅用质粒处理的细胞的基因表达的倍数增加。该图清楚地表明CR超过I时，PF3的活性大于脂质体2000转染试剂。图11在CHO细胞中24h后测量的用PF3或阳离子脂质体(Lipofectamine)进行的EGFP表达质粒的转染。PF3以不同CR与质粒复合并与脂质体2000转染试剂(Lipofectamine2000)比较。结果显示，尽管脂质体2000转染试剂的总体转染与PF3相当，但是当研究PF3肽时被转染的细胞数目显著更高。这些试验均在无血清培养基中进行。图12以不同细胞汇合度(confluency)在HEK293细胞中的质粒转染。基本按照图10进行试验，使用PF4与脂质体2000转染试剂比较。令人惊讶的是，在较高细胞密度并且CR高于I时转染增加，在将质粒运送到肾细胞中时，PF4的活性显著大于脂质体2000转染试剂。图13在不同的CR用PF3处理或用阳离子脂质体处理24h后HeLa细胞中的代谢活性。Y轴是相对于未处理细胞的代谢活性细胞的百分比。所述结果来自WST-I测定，其测量线粒体中的代谢活性，明显看出尽管与质粒复合的PF3对增殖的作用可忽略，但是根据制造商的使用说明用脂质体2000转染试剂处理后观察到显著的长期毒性。按照基因递送测定制备复合物，但是在96孔板而不是24孔板中进行处理。图14
比较P印Fect5和脂质体2000转染试剂递送抗_miR21 ON的效力的剂量-反应曲线。当以与ON的摩尔比非常低(为2)使用P印Fect5时，两种试剂显示出等效。图15IOOnM浓度下P印Fect5和脂质体2000转染试剂递送抗-miR21 ON的比较。当以摩尔比(MR)为5使用P印Fect5时，该肽比脂质体2000转染试剂显著更有效。如所预期的，未载体化的ON无活性。图16将脂质体2000转染试剂或PepFect5用作siRNA的递送剂时荧光素酶稳定的Hela细胞中荧光素酶下调的剂量-反应曲线。以摩尔比40使P印Fect5与siRNA复合，并且用25nM siRNA观察到的基因沉默与使用IOOnM siRNA的脂质体2000转染试剂所观察到的相当。图17比较以两个不同的摩尔比复合的P印Fect5(PF5)和PF6在荧光素酶稳定的BHK21细胞中运送siRNA靶向荧光素酶的效力。PF6优于PF5，特别是在低siRNA浓度时，尽管与PF6 一起使用的肽的量较低。图18荧光素酶稳定的骨肉瘤细胞(U20S)中高摩尔比(80)形成的PF6/siRNA复合物对荧光素酶下调的剂量-反应曲线。在低至5nM的浓度观察到明显的RNAi。图19在完全生长培养基中进行的PF6/siRNA复合物转染的剂量-反应曲线。随着siRNA浓度的增加观察到在荧光素酶稳定的BHK21细胞中荧光素酶表达的剂量依赖性降低。在此，预形成复合物并将其直接加入生长培养基中。转染后24h测量荧光素酶表达。图20用以不同摩尔比与50nM siRNA复合的PF6处理24h后BHK21细胞中的RNAi。即使在如10这样的低MR下，也有可能获得荧光素酶稳定的BHK21细胞中大于80%的荧光素酶下调。与使用脂质体2000转染试剂或任何其他基于脂质体的递送系统通常可能获得的作用相比，这是更强的RNAi作用。有趣的是，MR20和MR40之间的响应差异很小。这使得该递送系统比转染量的小变化对转染效率具有显著影响的脂质体2000转染试剂更易于使用。
图21通过FACS测量的用与脂质体2000转染试剂或P印Fect6复合的siRNA靶向EGFP处理后的EGFP稳定的CHO细胞中的下调。a)表示来自未处理细胞的荧光(蓝色)。b)分图示出了用IOOnM siRNA和脂质体2000转染试剂处理后的EGFP表达。蓝色群体代表非下调细胞，红色群体代表EGFP下调细胞。左下分图c)是仅用与PF6(摩尔比40)复合的25nMsiRNA处理的细胞。如图所示，90-95%的细胞具有较低的EGFP表达(红色)。最后，右下分图d)示出了在完全血清培养基中用与PF6复合的IOOnM siRNA处理后的EGFP表达。处理后48h，约98%的细胞的EGFP表达可忽略。总而言之，就诱导RNAi而言，PF6远比脂质体2000转染试剂更强效，由于观察到几乎完整的RNAi所以该递送似乎是普遍存在的。即使在完全血清培养基中，该肽的作用也比脂质体2000转染试剂更显著。图22
用siRNA处理48h的活EGFP-CHO细胞中的共聚焦显微分析。IOOnMsiRNA用作阴 性对照并且与IOOnM siRNA复合的脂质体2000转染试剂用作阳性对照。裸露的siRNA对EGFP表达具有非常小的影响而脂质体2000转染试剂如所预期的在一些细胞中诱导RNAi。与图21中显示的FACS柱状图一致，与50nM siRNA共温育的PF6在无血清培养基和完全生长培养基中均诱导完整的RNAi。而且，与脂质体2000转染试剂只进入细胞中的某一部分(最可能是分裂细胞)相比，PF6/siRNA颗粒以普遍存在的形式进入细胞。图23在EGPF-CH0细胞中经过单次siRNA处理后RNAi衰减动力学(decaykinetics)的流式细胞计量分析。以给定浓度的siRNA配制PF6/siRNA颗粒并在血清培养基(FM)或无血清培养基(SFM)中进行处理。然后将该效果与通过与脂质体2000转染试剂或寡核苷酸转染试剂复合的IOOnMsiRNA诱导的RNAi进行比较。所得结果清楚地表明24h后PF6诱导几乎完整的RNAi，与siRNA浓度无关。应将这一结果与分别用寡核苷酸转染试剂(Oligofectamine)和脂质体 2000 转染试剂(Lipofectamine 2000)(转染)观察到的 20%和55%下降(knock-down)相比较。此外,在最佳条件下，当使用PF6时RNAi响应持续4_5天。MR,摩尔比。图24骨肉瘤细胞中HPRTl mRNA的下调。在所有浓度的两个PF6摩尔比下均观察到显著的下降，而脂质体2000转染试剂在50 μ M siRNA浓度下未能诱导任何RNAi。在这些实验中，使用Dicer底物siRNA (用dicer加工的较长的形式)。在无血清培养基中处理细胞并在转染后24h通过RT-PCR分析mRNA水平。图25siRNA处理20小时后人SHSY5Y神经母细胞瘤细胞中的HPRTl下降。以两种不同的摩尔比配制PF6/siRNA颗粒并系列稀释得到100、50和25nM siRNA的终处理浓度。在完全生长培养基中进行处理并将该RNAi响应与通过与脂质体2000转染试剂复合的IOOnMsiRNA诱导的RNAi响应进行比较。当PF60与siRNA之比为MR40时，与使用IOOnMRNAi的脂质体2000转染试剂相比，甚至在25nM RNAi浓度下RNAi响应显著更强。这表明PF-系统不仅在血清中具有活性而且能以普遍存在的形式有效转染“难转染的”细胞。图26
用siRNA靶向HPRTl处理后大鼠原代混合胶质细胞培养物中的RNAi。在含血清条件和在无血清条件下，PF6在引起siRNA-介导的基因沉默方面比脂质体2000转染试剂显著更强效。图27用脂质体2000转染试剂或PF6处理24小时后CHO细胞中表达荧光素酶的质粒的转染。在肽与质粒的投料比(charge ratio, CR)为2时,在无血清培养基中观察到与阳离子脂质体相比PF6高一个对数级(log)的转染。甚至在血清培养基中，在CR4的情况下，该肽促使质粒转染的效率是脂质体2000转染试剂的2倍。图28Jurkat悬浮细胞中的EGFP质粒的转染。尽管脂质体2000转染试剂几乎完全失活，但是用PF6特别是在较高的投料配比下仍观察到明显的转染。在无血清培养基中在转 染后24小时通过FACS测量EGFP表达。b)对应的Jurkat转染的直方图。尽管总体转染水平很低，但是PF6具有转染群体中的大部分细胞的能力。c)不依赖于细胞汇合度的Jurkat质粒转染。有趣的是，用PF6可以不依赖汇合度而转染大部分的细胞。图29用与SCO复合的PF5类似物处理后Hela细胞中的剪接校正。在这一条件下，使用具有与四个I-萘氧基乙酸(1-naftoxy acetic acid)形成垂直分支的赖氨酸的TPlO代替氟喹部分来评价融合性质(fusogenic property)的重要性。该图示出了使用200nM SCO,在血清培养基和无血清培养基中，以5至25的不同肽/SCO摩尔比处理的Hela pluc705细胞中相对于对照的荧光素酶表达的成倍增加。相比于之前观察到的PF5的100倍增加，这些结果表明该肽的活性显著较低，在剪接时达到12倍增加。图30A，用Pefectl4/SC0复合物处理24h后Hela细胞中的剪接校正。PF14复合物具有高活性，与摩尔比和血清的存在无关。在200nM SCO浓度下，与脂质体2000转染试剂相比，PF14将SCO递送至细胞内部的活性显著更高。甚至在如50nM SCO这样的低浓度下也观察到剪接的50倍增加。B)该图示出了在血清培养基中以30至40的不同肽/siRNA摩尔比处理稳定表达荧光素酶基因的BHK-21细胞后相对于对照的荧光素酶表达百分数，并与根据制造商的使用说明进行的阳离子脂质体转染相比较。在摩尔比为35时，PF14的活性事实上比阳离子脂质体更高，即使是使用低4倍的siRNA浓度时也是如此。图31用PF3、PF5或它们的混合物处理细胞后Hela细胞中的剪接校正。当使用PF3和PF5的混合物时，与以相同的摩尔量单独使用每一种肽相比，剪接增加了将近4倍。
具体实施例方式本发明涉及被设计用于胞内运载物(或负载物，cargo)递送的系统，其包括选自具有至少4个碳原子的脂肪族线性或分支部分和/或包含2-4个环的环体系的至少一种组分A，该环可包含选自N、S、0和P的若干个杂原子，其中(一种或多种)组分A结合于细胞渗透肽B和/或其非肽类似物，并且其中所述递送系统能够通过共价或非共价结合递送运载物。该递送系统被称作PepFect (参见示例性的表I和图5c)。
根据该递送系统的一种实施方式，其进一步包括至少一个组分C，其为能够到达感兴趣的特定细胞或组织的靶向部分。该靶向部分可以是适体或诸如导向肽的靶向肽或受体配体。根据该递送系统的另一种实施方式，其进一步包括被递送至细胞、组织中或跨越细胞层的运载物。可将一种或多种组分A、一种或多种组分C以及一种或多种运载物共价偶合至肽(B)的氨基酸侧链和/或N-和/或C-端。在一些PepFect化合物中，使用分支的树状结构的间隔区。可通过非共价或共价结合(covalentconjugation)来添加祀向部分C。该细胞递送系统可包括通过肽键彼此结合的多于一种肽B。此外，组分A、C和运载物中的一种或多种可通过间隔臂与一个或多个肽B结合。根据本发明，该递送系统可包括在无任何运载物的条件下以任意顺序彼此偶合的 一种或多种组分A、一种或多种肽B、一种或多种祀向组分C。一个或多个肽B可与一种或多种组分A在无任何靶向组分C且无任何运载物的条件下以任意顺序偶合。这些可被递送用于在后续阶段进一步偶合运载物。本发明涉及通过使用此类递送系统向靶细胞体内或体外递送运载物的方法。一个或多个肽B和一种或多种运载物可在无任何靶向组分C的条件下以任意顺序与一种或多种组分A偶合。一个或多个肽B和一种或多种运载物可以任意顺序与一种或多种组分A以及一种或多种靶向组分C偶合。本发明还涉及新的细胞渗透性肽以及如何生产所述P印Fect构建体的方法。组分A组分A可以是一种或若干种具有至少4个碳原子的脂肪族线性或分支部分和/或包含2-4个环的环体系，该环可包含选自N、S、0和P的若干个杂原子，其中(一种或多种)组分A结合于细胞渗透性肽B和/或其非肽类似物。A还可以是衍生自任意有机化合物优选脂肪酸的任何酰基、硬脂酰基、胆汁酸或其衍生物、胆留醇基、胆酸、脱氧胆酸盐、石胆酸盐或棕榈酸盐。脂肪族组分A可以具有4-30个碳原子并且可以是脂肪酸。这样的脂肪族酸可以包含 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、
30个碳原子或这些数字产生的任意区间。其还可以是它们的衍生物。(一个或多个)官能团可以不是竣酸而是-0H、_SH、-NH2、-CH0、COXR中的任一种或多种但不限于此，其中X是O或S，R是任意脂肪族或芳香部分，或盐形成中的反离子例如Na+、K+等，或卤素。根据一种实施方式，脂肪酸可包含10-30个碳原子并且可选自硬脂酸或其C18衍生物或月桂酸、肉豆蘧酸、棕榈酸、花生四烯酸和山嵛酸，它们结合于细胞渗透性肽的侧链残基、C端或N端。而且，该链可含有饱和/不饱和键。此外，组分A还可以是由2-4个饱和或不饱和的3-8元环组成的二 -四稠环体系的一个或多个拷贝，其环体系中可包含选自N、S、0、B或P的一个或若干个杂原子。其可以是联苯基、二苯醚、胺、硫化物或周位和/或邻位稠合的且选自但不限于喹啉、异喹啉、喹噁啉、戍搭烯(并环戍二烯，pentalene)、萘、庚搭烯(庚间三烯并庚间三烯,heptalene)、辛搭烯(并环辛二烯，octalene)、降茨烧(norbonane)、金刚烧、Π引哚、二氢R引哚、甘菊环烃(环戍并环庚五烯，azulene)、苯并B丫庚因(benzazepine)、B丫唳、蒽、联苯撑、苯并菲和苯并蒽以及它们的类似物，但不限于此。这样的类似物可包含一个或多个羧基和/或一个或多个另外的官能团，例如但不限于一个或多个胺、一个或多个硫醇、一个或多个羟基、一个或多个酯以及一个或多个醛。根据一种实施方式，组分A的四个拷贝可通过赖氨酸分支间隔而结合于侧链残基上。这些环体系还可被例如具有pH缓冲能力的其他基团取代以使内涵体不稳定或者是用于核苷酸相互作用的缩合部分(condensing moiety)。取代基的实例可以是但不限于一个至若干个伯胺、仲胺和/或叔胺，被取代或以任何脂肪族或芳香族部分或它们组合被包括其中，还以线性、分支或环状方式或它们的组合被零至若干个原子间隔开。实例为N' -(7-氯喹啉-4-基)-N，N_ 二乙基-戊烷-1，4-二胺(氯喹)或其衍生物、二-四环体系(萘和/或由联苯基连接)、4-8元环、环体系中的一个至若干个杂原子 结合至如I所述的建构体(图5)的任意位置。另一有用的实例是N-(2-氨基乙基)-N-甲基-N' -[7-(三氟甲基)-喹啉-4-基]乙烷-1，2-二胺。它们可具有长度不同的(一个或多个)间隔臂(图5c)。通过偶合(偶联)至多个赖氨酸残基的活化的琥珀酰化侧链来完成喹啉类似物的引入，这提供了与载体共价结合的多个拷贝的喹啉类似物。实施例12中描述了优选的条件。本发明还涉及合成喹啉类似物偶合肽或其非肽类似物的方法，该方法包括(a)活化肽上的赖氨酸的步骤和(b)共价偶合喹啉类似物。为了能够偶合氯喹-胺衍生物(进一步公开于实施例12)，通过用琥珀酸酐对赖氨酸残基的ε氨基进行合适的修饰达到对肽的赖氨酸侧基(pendant group)的活化。将如此获得的肽的多个羧基进一步原位活化,即与喹啉类似物的偶合同时进行。这一操作优于迄今为止的文献中描述的操作，其中形成半稳定的活性酯例如NHS，然后偶合由胺衍生化的羟基氯喹。本文描述的方法是新颖的并达到对反应更好的控制和更高的产率。该喹啉类似物是新颖的，据我们所知，文献中没有通过伯二胺衍生物进行氯-三氟甲基-喹啉的氨基烷基化的记载。通过例如在烷基链末端引入额外的胺来促进共价结合。烷基链的功能是为芳香性环体系相互作用提供空间和缓冲能力。氯喹类似物由用三氟甲基、具有被许多原子间隔的两个胺的烷基链以及位于烷基链的另一末端与第二个胺间隔若干个原子用于进一步结合的官能团取代的喹啉系统组成，但不限于此。优选四个拷贝的组分A通过赖氨酸分支间隔区而结合(或轭合)至侧链。本发明进一步意在包括将多个拷贝的喹啉衍生物偶合(偶联)至包含合适数量的多聚(L-赖氨酸)侧基的肽B，均通过琥珀酸酐或本领域技术人员已知的任何其他合适的衍生化试剂修饰。肽组分B肽组分B可选自以下序列的一个或多个拷贝
序歹丨JSEQ ID No
AGYLLGKINLKALAALAKKILL
权利要求
1.一种用于胞内运载物递送的系统，包含选自具有至少4个碳原子的脂肪族线性或分支部分和/或包含2-4个环的环体系的至少一种组分A，所述环可含有选自N、S、O和P的若干个杂原子，其中，所述(一种或多种)组分A结合于细胞渗透性肽B和/或其非肽类似物。
2.根据权利要求I所述的系统，其中，组分A和B各自具有至少一个用于结合的官能团。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的系统，进一步包含至少一种组分C，所述组分C为革巴向部分。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的系统，进一步包含一种运载物。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的系统,其中，一种或多种组分A、一种或多种组分C以及一种或多种运载物结合于肽B和/或其非肽类似物的侧链、和/或N-端和/或C-端。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的系统，包含多于一种肽B。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的递送系统，其中，所述物种A选自疏水物种，优选具有10-30个碳原子的脂肪酸或其衍生物，优选硬脂酸或其C18衍生物，例如月桂酸、肉豆蘧酸、棕榈酸、花生四烯酸和山嵛酸；包含杂原子的和/或被取代的2-4环体系，例如喹啉或萘类似物。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的系统，其中，所述组分A、C和所述运载物中的至少一种与间隔臂结合。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的系统，其中，所述物种B选自以下序列的一个或多个拷贝SEQ ID NO 1.AGYLLGKINLKALAALAKKILSEQ ID NO 2AGYLLGKLLOOLAAAALOOLLSEQ ID NO 3RKKRKKKRXRHXRHXRHXRSEQ ID NO 4MVTVLFRRLRIRRACGPPRVRVSEQ ID NO 5RKKRKKK(HXH)4SEQ ID NO 6LLOOLAAAALOOLLSEQ ID NO 7RQIKIWFQNRRMKWKKSEQ ID NO 8RRRRRRRRRSEQ ID NO 9MVTVLFRRLRIRRACGPPRVRVSEQ ID NO IOGALFLGFLGAAGSTMGAffSQPKKKRKVSEQ ID NO 11FILFILFILGGKHKHKHKHKHKSEQ ID NO 12FILFILFILGKGKHKHKHKHKHKSEQ ID NO 13FILFILFILGKGKHRHKHRHKHRSEQ ID NO 14YLLGKINLKALAALAKKILSEQ ID NO 15GDAPFLDRLRRDQKSLRGRGSTLSEQ ID NO 16PFLDRLRRDQKSLRGRGSTLSEQ ID NO 17PFLNRLRRDQKSLRGRGSTLSEQ ID NO 18PFLDRLRRNQKSLRGRGSTLSEQ ID NO 19PFLNRLRRNQKSLRGRGSTLSEQ ID NO 20PFLNRLRRNLKSLRGRLSTLSEQ ID NO 21PFLDRKRRDQKSLRGRGSTLSEQ ID NO 22RHRHRHHHGGPFLDRLRRDQKSLRGRGSTLSEQ ID NO 23PNNVRRDLDNLHACLNKAKLTVSRMVTSLLEKSEQ ID NO 24PNNVRRDLDNLHAMLNKAKLTVSRMVTSLLEKSEQ ID NO 25PNNVRRDLNNLHAMLNKAKLTVSRMVTSLLQKSEQ ID NO 26PFLNRLRRNLKSLRGRLSTLSEQ ID NO 27PFLN RKRRNLKSLRGRLSTLSEQ ID NO 28INLKALAALAKKIL
10.根据权利要求1-9中任一项所述的系统，其中，所述物种B选自含有式Ny1-Bx1-Ny2-Bx2-Ny3的序列的肽，其中B是碱性氨基酸，N是中性氨基酸,并且X1' X2> Y1^ y2和％是2至8的整数。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的系统，其中，所述物种B选自LLOOLAAAALOOLL[SEQ ID No 6],尤其是 AGYLLGKLL00LAAAAL00LL[SEQ ID No 2]或INLKALAALAKKIL[SEQ ID No 28]并且尤其是AGYLLGKINLKALAALAKKIL[SEQ ID No 1]以及氨基酸的缺失、加入、插入和置换。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的系统，其中，所述细胞渗透性肽B和/或其非肽类似物的C端被修饰。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的系统，其中，所述运载物选自由寡核苷酸及其被修饰的形式组成的组中，包括单链寡核苷酸(DNA、RNA、PNA、LNA以及所有的合成寡核苷酸)、双链寡核苷酸(siRNA、shRNA、陷阱dsDNA等)、质粒以及合成核苷酸类似物的其他变体。
14.根据权利要求1-12中任一项所述的系统，其中，所述运载物选自由与荧光标记物、细胞或肿瘤导向肽、适体、受体配体、包含与失活肽偶合的可裂解位点的间隔区、肽配体、细胞毒性肽、生物活性肽、诊断试剂、蛋白质、药物例如抗癌药物或抗生素组成的组中的一个或多个成员连接的组。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的系统，进一步包含至少一种显像剂和/或标记分子。
16.根据权利要求15所述的系统，其中，所述标记分子是用于标记或定量胞内mRNA的分子信标，包括基于淬灭突光的信标和基于FRET技术的信标。
17.根据权利要求1-6中任一项所述的系统，包括与其结合的循环清除修饰剂，如PEG。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的系统在疾病的诊断、用作研究工具和用作靶向系统中的应用。
19.一种包含多于一种如权利要求1-18中任一项所述的递送系统的组合物，其中，所述递送系统包含不同的组分AjP /或不同的肽B、和/或不同的组分C和/或不同的运载物并且还可以包含循环清除修饰剂，如PEG。
20.根据权利要求19所述的组合物，其中，所述递送系统包含至少两种不同的肽B并且还可以包含循环清除修饰剂，如PEG。
21.一种药物组合物，包含如权利要求1-17中任一项所述的递送系统和/或如权利要求19和20中任一项所述的组合物。
22.—种材料，其覆盖有一种或多种如权利要求1-17中任一项所述的递送系统。
23.—种材料，所述材料中合并有一种或多种如权利要求1-17中任一项所述的递送系统。
24.一种肽，含有式Ny1-Bxi-Ny2-Bx2-Ny3的序列，其中，B是碱性氨基酸，N是中性氨基酸并且X以及yi、y2和y3是2至8的整数。
25.根据权利要求24所述的肽，其中，所述物种B选自LLOOLAAAALOOLL[SEQID NO 6]，尤其是 AGYLLGKLLOOLAAAALOOLL[SEQ ID NO 2]或 INLKALAALAKKIL[SEQ ID NO :28]并且尤其是AGYLLGKINLKALAALAKKIL [SEQ ID NO 1]以及氨基酸的缺失、加入、插入和置换。
全文摘要
本发明涉及用于胞内递送运载物的系统，包括选自具有至少4个碳原子的脂肪族线性或分支部分和/或包含2-4个环的环体系的至少一种组分A，所述环可包含选自N、S、O和P的若干个杂原子，其中组分A结合于细胞渗透性肽B和/或其非肽类似物。本发明还涉及该系统在疾病诊断、作为研究工具和作为靶向系统中的用途、包含该系统的组合物尤其是药物组合物、覆盖有该系统的材料以及其中掺有该递送系统的材料。最后，本发明涉及新的肽。
文档编号A61K31/00GK102811744SQ200980145373
公开日2012年12月5日 申请日期2009年9月16日 优先权日2008年9月16日
发明者卡里姆·阿梅德, 萨米尔·埃尔安达路西, 彼得·古特斯塔姆, 马蒂亚斯·哈尔布林克, 亨里克·约翰松, 厄洛·朗格尔, 塔维·勒托, 玛丽亚·林德格伦, 伊姆雷·梅格尔, 兰纳·西拉德, 卡特里·罗森塔尔艾兹曼, 乌尔夫·泰德巴克, 佩·伦丁 申请人:卡里姆·阿梅德, 萨米尔·埃尔 安达路西, 彼得·古特斯塔姆, 马蒂亚斯·哈尔布林克, 亨里克·约翰松, 厄洛·朗格尔, 塔维·勒托, 玛丽亚·林德格伦, 伊姆雷·梅格尔, 兰纳·西拉德, 卡特里·罗森塔尔 艾兹曼, 通用电气健康护理生物科学股份公司, 佩·伦丁