专利名称：灭活日本脑炎病毒颗粒作为佐剂的用途的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及使用灭活日本脑炎病毒(下文亦称为“JEV”)颗粒作为各种混合疫苗 或多价疫苗的佐剂的方法。
背景技术：
传染性疾病的疫苗接种应当优选在婴儿期完成。为此，需要在固定时段内接种多 种疫苗。作为各种感染性疾病的有效疫苗接种方法，已开发出其中若干疫苗混合在一起的 混合疫苗。混合疫苗有许多优点，包括(i)可以同时提供防止多种病原体的保护，(ii)可 以排除多次疫苗接种方案的麻烦，(iii)可以降低疫苗接种的成本(技术性费用)，减轻 接受预期疫苗接种率提高的疫苗接种个体的时间负担，(iv)可以减轻医务人员的负担，和 (ν)可以通过降低疫苗接种频率减少废料从而减轻环境负担。因此，对于混合疫苗，其中包 含的疫苗抗原越多越好。然而，要混合在一起制备混合疫苗的疫苗抗原的数目有限。也就是说，要混合的疫 苗抗原的数目越多，则可以给予的每一种疫苗抗原的量就越少。而且，某些抗原种类可彼此 干扰，从而导致其诱导抗体的能力降低，这可能导致疫苗的抗体效价降低，使得难以有效防 止感染。直到本发明前已公布的具体的混合疫苗包括白喉/百日咳/破伤风(DPT)混合疫 苗制品“疫苗组合物”(参见例如专利参考文献1)、含有人乳头瘤病毒(HPV)抗原的混合疫 苗“新型组合物”(参见例如专利参考文献2、、多价DPT脊髓灰质炎疫苗“多价DTP-脊髓灰 质炎疫苗”(参见例如专利参考文献幻、在通过所述方法获得的灭活疫苗和混合疫苗中诱导 活疫苗的细胞免疫活性的方法(参见例如专利参考文献4)等。除此之外，还已经公布了多 种组合的混合疫苗。对于日本脑炎病毒疫苗，已报告了与DPT疫苗、乙型肝炎疫苗OfepB)、 甲型肝炎疫苗(HepA)等的混合疫苗(参见例如非专利参考文献1)。需要开发具有更多组 合的混合疫苗，但是上述疫苗的作用降低仍是问题。为了解决这个问题，需要开发具有较高 的抗体效价同时尽可能少的抗原量的这类佐剂。一般来说，已知当将佐剂加入疫苗抗原中时，可提高疫苗抗原的免疫原性，佐剂包 括铝凝胶颗粒(铝盐)；包含矿物油作为主要成分的油佐剂；表面活性剂样佐剂，例如从白 色扁豆中纯化的皂苷；以及衍生自胞内毒素的THl诱导佐剂(LPS等)。对于用于动物疫苗 的佐剂，常常使用局部活性比铝佐剂高的油佐剂。然而，对于用于人疫苗的佐剂，除功效外 还需要安全性。对于用于人疫苗的佐剂，迄今为止主要使用铝凝胶，因为其功效已得到证实，但是 已开始选用最近新开发的MPL和双链RNA。已知的佐剂组合物包括由免疫刺激剂(MPL) 和金属盐组成的“疫苗”(参见例如专利参考文献5)、包含例如3D-MPL、角鲨烯、α-生 育酚、聚氧乙稀山梨醇酐单油酸酯等油的水包油乳剂“佐剂组合物”(参见例如专利参考 文献6)、合成化合物佐剂“免疫佐剂化合物”(参见例如专利参考文献7)、利用霍乱毒素 的“疫苗制品”(参见例如专利参考文献8)、利用由肝炎病毒的表面抗原的成颗粒多肽(particle-forming polypeptide)形成病毒样颗粒(VLP)的“使用病毒样颗粒作为佐 剂”(参见例如专利参考文献9)等等。对于日本脑炎病毒疫苗，目前使用的灭活疫苗的制备方法是将日本脑炎病毒 (JEV)接种至小鼠脑部，从具有脑炎症状的脑部纯化出病毒，并用福尔马林将病毒灭活。已 经开发出使用非洲绿猴肾上皮(Vero)细胞代替小鼠脑的灭活JEV疫苗(参见例如专利参 考文献10、11和12)。然而，仍未了解这些JEV颗粒具有佐剂活性。专利参考文献1 :W02002/080965专利参考文献2 日本专利申请号专利参考文献3 :ff098/00167专利参考文献4 日本专利申请号专利参考文献5 日本专利申请号专利参考文献6 日本专利申请号专利参者文献7 日本专利申请号专利参考文献8 :ff000/23107专利参者文献9 :ff098/08146专利参考文献10 :ff000/20565专利参考文献11 日本专利申请号2000-83657专利参考文献12 日本专利申请号2004-65118非专利参考文献1 研究公布号 329，1991 年 9 月，HAVANT GBiPOLYVALENT ANTIGEN VACCINE FOR HUMAN USE’ 3297
发明内容
(本发明要解决的技术问题)如上所述，虽然需要开发同时对更多感染性疾病有免疫力的混合疫苗，但是混合 的疫苗抗原数越多，强加入的每种疫苗抗原的量就越少。因此，为了弥补这一缺点，需要开 发即使具有较少量的抗原也可获得较高抗体效价的这类佐剂。(解决技术问题的技术手段)在这种情况下，本发明的发明人认真地进行了持续的研究活动，结果发现，与相应 的不含所述灭活JEV颗粒的疫苗溶液相比，将灭活JEV颗粒加入含有针对多种感染性疾病 (即白喉、百日咳、破伤风、脊髓灰质炎、乙型肝炎和甲型肝炎)的全部或部分抗原的疫苗溶 液中，可以较高的水平且较快地诱导免疫，也就是说，灭活JEV颗粒的确具有作为佐剂的活 性，因此完成了本发明。直到本发明为止，都不存在利用由灭活JEV颗粒本身所发挥的佐剂 活性的构思，相反本发明之前灭活JEV颗粒均只是用作混合疫苗的疫苗抗原。本发明的发 明人首次提出该构想。本发明的一个目的是提供使用灭活JEV颗粒作为各种混合疫苗和含 有JEV的混合疫苗的佐剂的方法。因此，本发明如下(1) 一种使用灭活日本脑炎病毒作为疫苗的佐剂的方法。(2)上述(1)的方法，其中灭活日本脑炎病毒是使由细胞培养得到的日本脑炎病 毒灭活而获得的灭活日本脑炎病毒。
:2004-67696
:2001-253833 :2007-262097 :2007-231029 :2002-535411
(3)上述(1)或O)的方法，其中灭活日本脑炎病毒具有颗粒样结构。(4)上述(1)-(3)中任一项的方法，其中疫苗是混合疫苗。(5) 一种用于制备疫苗的方法，所述方法包括加入灭活日本脑炎病毒作为佐剂的步骤。(6)上述(5)的方法，其中灭活日本脑炎病毒是通过使由细胞培养得到的日本脑 炎病毒灭活而获得的灭活日本脑炎病毒。(7)上述(5)或(6)的方法，其中灭活日本脑炎病毒具有颗粒样结构。(8)上述(5)-(7)中任一项的方法，其中所述步骤是将灭活日本脑炎病毒加入疫 苗的步骤。(9)上述(5)-(8)中任一项的方法，其中疫苗是其中两种或更多种不同疫苗混合 在一起的混合疫苗。(10)上述(9)的方法，其中所述疫苗选自白喉疫苗、百日咳疫苗、破伤风疫苗、脊 髓灰质炎疫苗、甲型肝炎疫苗、乙型肝炎疫苗、狂犬病疫苗、麻疹疫苗、风疹疫苗、流感疫苗、 流行性腮腺炎疫苗、水痘疫苗、轮状病毒疫苗(rota vaccine)、天花疫苗、黄热病疫苗、螨型 脑炎疫苗、B型流感嗜血杆菌结合疫苗(Hib vaccine)、伤寒疫苗、霍乱疫苗、BCG疫苗、肺炎 球菌疫苗和针对由脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitidis)引起的脑膜炎疫苗。(11)上述(5)-(10)中任一项的方法，其中灭活日本脑炎病毒颗粒为250ng/ mL-34μ g/mL。(12)通过上述(5)-(11)中任一项的方法制备的疫苗。(13)上述(12)的疫苗，其包含铝佐剂。(比现有技术更有效的效果)本发明提供用于制备包含灭活JEV颗粒作为佐剂的疫苗的方法以及通过所述方 法制备的疫苗。例如，与相应的未加入所述灭活JEV颗粒的疫苗相比，将灭活JEV颗粒加入 混合疫苗中作为佐剂，可以较高的水平并较快地诱导免疫。也就是说，因为可以用较少量的 抗原获得能够实现防止感染的特定的抗体效价，因此可以减少包含在混合疫苗中的各种抗 原的量，从而使得混合疫苗中可包含更多种的抗原。此外，按照本发明的方法，不仅仅可以发挥混合疫苗的免疫作用，还可以提高防止 日本脑炎病毒感染的抗体效价。因此，本发明的混合疫苗还用作日本脑炎疫苗。附图简述
图1图示对用DPT疫苗和JEV颗粒的混合物免疫的小鼠的血清进行ELISA的结果。 a 抗TT抗体效价；b 抗PT抗体效价；c 抗DT抗体效价；d 抗JEV抗体效价。图2图示对用DPT疫苗和JEV颗粒的混合物以不同浓度免疫的小鼠的血清进行 ELISA的结果。a 抗TT抗体效价；b 抗PT抗体效价；c 抗DT抗体效价。图3图示对用DPT疫苗和JEV颗粒的混合物以不同浓度免疫的小鼠的血清进行 ELISA的结果。a 抗TT抗体效价；b 抗PT抗体效价；c 抗DT抗体效价。图4图示对用IPV疫苗和JEV颗粒的混合物免疫的大鼠的血清进行ELISA的结果。 a 抗PV-I抗体效价；b 抗PV-2抗体效价；c 抗PV-3抗体效价。图5图示对用HB疫苗和JEV颗粒的混合物免疫的小鼠的血清进行ELISA的结果 (抗HB抗体效价)。
图6图示对用H印A疫苗和JEV颗粒的混合物免疫的小鼠的血清进行ELISA的结 果(抗HVA抗体效价)。实施本发明的最佳方式本发明的特征是制备疫苗的方法，所述方法包括加入灭活JEV作为佐剂的步骤。
用于本文的JEV病毒株可以是任何病毒株而没有特别限制。本发明使用北京-1病 毒株。可通过下述两种方法获得JEV。一种方法是，将JEV接种至小鼠脑中，使病毒在脑中 繁殖，然后从中纯化出来。另一种方法是将JEV接种在培养细胞中，培养病毒感染的细胞， 从培养后的JEV感染细胞和培养物上清液中纯化出病毒。从动物保护的观点出发，优选用 培养细胞进行繁殖的方法。对于用于JEV繁殖的宿主细胞，可以使用Vero细胞以供JEV充 分繁殖，并产生具有较高抗原性的抗原。用于细胞增殖培养的培养基适当地选自常用于组 织培养的培养基，例如M199培养基、Eagle MEM培养基等，优选任选补充了氨基酸、盐、抗霉 菌剂/抗细菌剂、动物血清等的Dulbecco MEM培养基。有时可以进行采用高密度培养的微 载体以获得大量的JEV颗粒。已知许多微载体用于此目的。适于Vero细胞生长的微载体 ^Mi Cytodex(Cytodex I, Amersham Pharmacia Biotech)，浓度为 5g/L 或更少。可根据细胞类型、接种病毒的量、培养规模和培养方法等的组合，来调整培养温度 和培养持续时间。例如，当用Vero细胞通过静置培养或滚瓶培养繁殖JEV时，可将细胞培 养在由Dulbecco MEM培养基组成的生长培养基中，该培养基补充了非必需氨基酸和牛血 清，培养温度为32°C _38°C，培养持续时间为2-7天。对于JEV的繁殖，当生长达到稳定期 时通过吸出法除去培养基，在用磷酸盐缓冲液/盐水洗涤几次后，将JEV以0. 01-0. 0001的 感染复数(M.O. I)接种至细胞。对于病毒接种后使用的维持培养基，优选可以使用无血清 的低蛋白质水平培养基。例如，可以使用补充了 L-谷氨酸的VP-SFM(GIBCO)。可将细胞于 上述培养温度培养4-7天。完成培养后，可以回收所得培养物，即细胞破碎溶液或培养物上 清液，加入福尔马林，在4°C左右静置1-3月或更长时间以灭活病毒。对于从所得到的含JEV的溶液中纯化出JEV颗粒，可以采用常用于蛋白质化学法 的纯化方法，例如离心、盐析、正常过滤、超滤、等电沉淀、电泳、离子交换层析法、凝胶过滤 层析法、亲和层析法、疏水层析法、羟磷灰石层析法等。可选择其中合适的方法并且可以联 用。在本文的实施例中，通过使含有JEV的溶液进行蔗糖梯度离心，分级分离后合并JEV颗 粒的流分，用纤维素硫酸酯凝胶进行亲和层析法从而纯化JEV颗粒。纯化后，含有灭活JEV 的溶液可用例如磷酸盐缓冲液或盐水稀释成适于用作佐剂的病毒含量。可将由此得到的含 有灭活JEV颗粒的溶液加入各种疫苗中作为佐剂。本发明的方法可用于针对病毒感染性疾病的疫苗或用于针对细菌感染性疾病的 疫苗。针对病毒感染性疾病的疫苗包括例如针对甲型肝炎、乙型肝炎、狂犬病、脊髓灰质炎、 麻疹、风疹、流感、黄热病、螨型脑炎、流行性腮腺炎、水痘、轮状病毒、天花等的疫苗。针对细 菌感染性疾病的疫苗包括针对例如百日咳、白喉、破伤风、伤寒、霍乱、脑膜炎奈瑟氏球菌引 起的脑膜炎、Hib (流感嗜血菌(Haemophilusinfluenzae)b型)、BCG、肺炎球菌等的疫苗。 以上疫苗可以单独使用，或者可以是其中两种或更多种疫苗混合在一起的混合疫苗。然而， 当灭活JEV颗粒用作佐剂时，由于可以减少包含在疫苗中的抗原的量，因此所述疫苗可优 选用作其中抗原量受限制的混合疫苗。剂型可以是注射剂、注射器型剂、经皮吸收剂和喷雾剂，疫苗为液体制剂时，其中液体-液体制品已在增量步骤(a bulking step)中混合；系统制剂，其中液体-液体产品 和液体-冻干产品装在临用时一按即混合的容器中；或其中液体-液体产品和液体-冻干 产品在临用时手工混合的制剂。给药途径包括肌内注射、皮下注射、经皮给药等，这可根据 目的适当地选择。给药途径还可以是给予相同部位，或者可以给予不同部位。对于上述疫苗，可将合适的佐剂加入抗原溶液中以提高免疫原性。可根据抗原的 种类、数目和量适当地设定待加入佐剂的量。佐剂的种类包括氢氧化铝凝胶、磷酸铝凝胶、 硫酸铝凝胶、矿物油、非矿物油等。大多使用铝凝胶，其已用于许多人用疫苗中并且其已经 被充分证明是安全的。虽然已经证明铝凝胶是安全的，但是如果不注意其剂量，则可能出现 毒副作用例如铝性脑病或铝性骨病。因此，优选以尽可能低的量使用铝凝胶。因为本发明 的灭活JEV颗粒允许降低含铝疫苗中铝凝胶的量，所以本发明的疫苗可有效地与铝凝胶联 用。在发挥佐剂活性时，可以250ng/mL-34 μ g/mL的范围使用灭活JEV颗粒，优选 1-16μ g/mL，更优选2-8 μ g/mL。对于将灭活JEV颗粒加入疫苗中的时间安排，可在制备所 述疫苗的同时或之后加入灭活JEV颗粒。例如，可将合适量的灭活JEV颗粒加入减毒活疫 苗的贮备液或灭活疫苗的贮备液或其混合物中，然后将溶液适当地用磷酸盐缓冲液或盐水 稀释。在加入灭活JEV颗粒前，需要时可使用铝凝胶。可分别以50ng/mL-80yg/mL的范围 和100-400 μ g/mL的范围使用疫苗和铝凝胶。将含有灭活JEV颗粒的疫苗或混合疫苗经皮下、肌内或真皮内注射给予动物时所 诱导的免疫应答与将不含灭活JEV颗粒的疫苗给动物注射时所诱导的免疫应答作比较，评 价作为佐剂的灭活JEV颗粒。为了评价，可以使用小动物，例如大鼠、小鼠、豚鼠或兔。例 如，可从用含有灭活JEV颗粒的疫苗免疫的动物中采血，从中分离出血清，测定所得血清的 抗体(效价)，用于与得自用不含灭活JEV颗粒的疫苗免疫的动物血清的抗体(效价)进行 比较，从而评价作为佐剂的灭活JEV颗粒。可以采用测定抗体(效价)方法中的任一种方 法，包括ELISA、EIA、用毒素和细胞系等的中和试验。通过下列参考实施例和实施例更详尽地说明本发明，但不应解释为是对本发明的 限制。参考实施例1按照日本专利申请号2000-83657中所述制备日本脑炎病毒颗粒。简单地说，以 0. 01的Μ. 0. I.将日本脑炎病毒(北京-1)接种至用DulbeccoMEM培养基悬浮培养而生长 的Vero细胞中，在37°C吸收90分钟后，使细胞在相同温度下培养3_5天，同时补充培养基。 将培养物溶液进行蔗糖-梯度离心，回收病毒流分，病毒颗粒通过纤维素硫酸酯凝胶纯化。 为了灭活病毒颗粒，将病毒颗粒在0. 08% (体积)福尔马林条件下于冰箱中静置半年左右。 将因此得到的灭活日本脑炎病毒颗粒用于实施例。通过Lowry方法测定灭活日本脑炎病毒 颗粒中蛋白质的量。参考实施例2(1)用于测定抗体效价的ELISA对于抗原固定化，百日咳类毒素(PT)为2. 5 μ g/mL、白喉类毒素(DT)为5 μ g/mL、 破伤风类毒素(TT)为5 μ g/mL、乙型肝炎病毒表面抗原(HB)为5 μ g/mL、脊髓灰质炎病毒1 型为1. 9Du/mL、脊髓灰质炎病毒2型为0. 975Du/ml、脊髓灰质炎病毒3型为1. 5Du/mL、灭活JEV颗粒为5yg/mL。对于HB和灭活JEV颗粒，蛋白质的量通过Lowry方法测定。对于各 DPT，蛋白质氮的量通过Kjeldahl方法测定，并转化成蛋白质的量。对于脊髓灰质炎病毒， 测定D抗原的量。以100 μ L/孔将待固定化的抗原加入96孔板(Nunc，Maxisorp)中，将板 在4°C静置过夜以固定化。次日，各孔用350 μ L含有0.05%吐温20 (PBST)的PBS洗涤三 次，力口入 350 μ L/ 孑L用 PBS 稀释 4 倍的 Block Ace (DainipponSumitomo Pharma Co.，Ltd.， 下文简写为“BA”)，将板在室温下静置2小时。2小时后，充分除去4倍稀释的BA，各孔用 350 μ L/孔PBST洗涤三次。然后，样品用已用含有0. 05%吐温20的PBS稀释10倍的BA稀 释，加入稀释样品各100 μ L/孔。在37°C反应2小时后，各孔用350 μ L/孔的PBST洗涤三 次。充分弃去洗涤溶液后，分别将100 μ L/孔的HRP标记的抗小鼠IgG山羊抗体(American Qualax, A131PS)或HRP标记的抗小鼠IgG大鼠抗体(Zymed，04-6020)、HRP标记的抗大鼠 IgG(H+L)山羊抗体(Zymed，81-9520)加入各孔中于37°C反应1小时，各抗体用稀释样品所 用的溶液稀释2000倍。1小时后，充分弃去溶液，各孔用350 μ L/孔的PBST洗涤四次，并用 等量的蒸馏水洗涤两次。以100 μ L/孔加入显色底物TMB+(Dako)，在避光、室温下反应30 分钟。然后，以100 μ L/孔加入IN硫酸终止显色，于450nm测定吸光度。(2)标准血清的制备和抗体效价的计算在用防止感染性疾病的抗原免疫动物2-4周后，使用通过下述抗体效价测定系统 证实有充足抗体效价的血清作为标准血清。举例来说，针对各DPT抗原的标准血清是从通 过腹膜内给予0. 5mL稀释5倍的现有DPT制品免疫2周的动物中采血得到的血清。对于 各抗原的抗体的效价，将未免疫的沈-30只小鼠的血清用样品的稀释溶液稀释50倍或200 倍，如上所述以一式两份对各稀释样品进行ELISA，测定OD 450nm。测定的OD 450nm的平 均值加2乘以标准差被设定为截止值。对标准血清进行系列稀释，并测定OD 450nm。使用 超出截止值(PT 12, 800 倍，DT 96, 000 倍，TT :320，000 倍，JEV :1，024, 000 倍)的稀释倍 数作为标准血清的抗体效价。也就是说，在此稀释倍数下的血清被设定为样品测定中各个 抗体效价的1EU。对于抗脊髓灰质炎病毒抗体的ELISA，使用稀释100倍的样品测定0D。(3)测定抗HB抗体的抗体效价和测定转阳率对于抗HB抗体效价，不仅仅采用ELISA，而且还采用IMx Ausab测定系统(abbott， 2262-83)来测定抗体效价和转阳率。实施例1 :JEV颗粒对DPT疫苗抗原的佐剂活性将参考实施例1中得到灭活日本脑炎病毒(JEV)颗粒和各DPT抗原按表1所示组 成混合在一起。将所得混合物(0. 5mL)腹膜内接种到10周龄(雄性)SPF小鼠0^57BL/6S ； 4只小鼠/组)。在接种前和在初次接种后第2、3和4周从动物采血。在第4周采血后，用 相同混合物给予加强剂量。在第二次接种后第1周和第2周给动物采血，按照参考实施例 2-(1)中所述的测定抗体效价的方法测定各个血清的抗体效价。结果，未观察到由于加入 JEV而引起抗原彼此负干扰。与只有DPT的组相比，在加入JEV的组中，DPT(PT、DT、TT)的 各个抗原的抗体效价较高(图la、图lb、图Ic)。在初次接种后第2周可观察到JEV颗粒的 佐剂活性。表权利要求
1.一种使用灭活日本脑炎病毒作为疫苗的佐剂的方法。
2.权利要求1的方法，其中所述灭活日本脑炎病毒是通过使由细胞培养得到的日本脑 炎病毒灭活而得到的灭活日本脑炎病毒。
3.权利要求1或2的方法，其中所述灭活日本脑炎病毒具有颗粒样结构。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述疫苗是混合疫苗。
5.一种用于制备疫苗的方法，所述方法包括加入灭活日本脑炎病毒作为佐剂的步骤。
6.权利要求5的方法，其中所述灭活日本脑炎病毒是通过使由细胞培养得到的日本脑 炎病毒灭活而得到的灭活日本脑炎病毒。
7.权利要求5或6的方法，其中所述灭活日本脑炎病毒具有颗粒样结构。
8.权利要求5-7中任一项的方法，其中所述步骤是将灭活的日本脑炎病毒加入疫苗的 步骤。
9.权利要求5-8中任一项的方法，其中所述疫苗是将两种或更多种不同疫苗混合在一 起的混合疫苗。
10.权利要求9的方法，其中所述疫苗选自白喉疫苗、百日咳疫苗、破伤风疫苗、脊髓灰 质炎疫苗、甲型肝炎疫苗、乙型肝炎疫苗、狂犬病疫苗、麻疹疫苗、风疹疫苗、流感疫苗、流行 性腮腺炎疫苗、水痘疫苗、轮状病毒疫苗、天花疫苗、黄热病疫苗、螨型脑炎疫苗、B型流感 嗜血杆菌结合疫苗、伤寒疫苗、霍乱疫苗、BCG疫苗、肺炎球菌疫苗和针对脑膜炎奈瑟氏球菌 (Neisseria meningitidis)引起的脑膜炎的疫苗。
11.权利要求5-10中任一项的方法，其中所述灭活日本脑炎病毒颗粒为250ng/ mL-34μ g/mL。
12.—种疫苗，其通过权利要求5-11中任一项的方法制备。
13.权利要求12的疫苗，其包含铝佐剂。
全文摘要
本发明公开了灭活日本脑炎病毒颗粒作为佐剂的用途。具体来说，本发明公开了灭活日本脑炎病毒(JEV)颗粒作为疫苗或组合疫苗的佐剂的用途，其中将JEV北京-1病毒株接种到Vero细胞中，培养所述JEV感染的细胞以得到培养细胞或培养物上清液，从所述培养细胞或培养物上清液中纯化出JEV颗粒，并用福尔马林使所述JEV颗粒灭活，从而得到所述JEV颗粒；制备(组合)疫苗的方法，所述方法包括加入JEV颗粒的步骤；以及通过所述方法制备的(组合)疫苗。
文档编号A61P31/06GK102112153SQ20098013072
公开日2011年6月29日 申请日期2009年5月27日 优先权日2008年6月4日
发明者上仲一义, 松田纯一, 森山真, 野崎周英 申请人:一般财团法人化学及血清疗法研究所