专利名称：肽基精氨酸脱亚胺酶(pad)抑制剂的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及医学领域，特别是涉及自身免疫性疾病并且最特别是涉及类风湿性关 节炎(RA)的预防和治疗。本发明还涉及酶学领域。本发明涉及开发酶抑制剂的方法，并且 公开了肽基精氨酸脱亚胺酶(EC 3.5.3. 15)的有效抑制剂。这些PAD抑制剂可以用于制备 治疗自身免疫性疾病，尤其是治疗RA、牛皮癣和多发性硬化(MQ的药物。
背景技术：
RA是常见的自身免疫性疾病，流行于约的全世界人口中。它是多种因素引起 的并且表现为关节滑膜发炎，从而导致关节肿胀和疼痛。发炎过程通常导致软骨破坏以及 不可逆的骨质侵蚀。抗CCP的自身抗体在RA的发作和永存中起着重要作用。首先，已证实抗CCP的 抗体对RA是高特异性的。多项研究结果显示对这些抗体呈现血清阳性反应的每个个体不 是已经患有RA就是在将来会发展这种疾病。抗CCP抗体的存在(尤其是当存在高滴定度 时)是侵蚀性疾病结果的前兆{Nijenhuis et al.，2004}。最后，已证实抗CCP抗体是在炎 症位点局部产生的。在RA患者的滑膜物质中发现的抗CCP抗体与总IgG的比例看起来比 在相同患者血清中的要明显高得多{Masson-BessiAre et al，2000，Reparon-Schuijt et al，2001}。滑膜中产生抗CCP的血浆细胞的存在预示着在炎症位点CCP特异性B细胞的抗 原驱动的化脓。抗CCP抗体在关节炎产生中的作用的支持来自对Fc y RIIB敲除小鼠的研 究。已证实，源于患有活性RA患者的血浆或血清的免疫球蛋白可在这些小鼠中引起炎症和 组织学损害{Petkova et al，2006}。在胶原诱发的关节炎模型中，据报道，抗瓜氨酸化蛋 白的抗体可加重组织损伤，证实了这些抗体在自身免疫性关节炎的发病机制上的直接作用 {Kuhn et al，2006}。在最近的一片文章中，Hill及其同事报道了瓜氨酸化纤维蛋白原可 以在DR4-IE转基因小鼠中引起关节炎，表现为滑膜增生随后关节强直。T细胞表位扫描和 抗体微阵列分析鉴定出瓜氨酸特异性反应的独特模式，这在用未修饰的纤维蛋白原免疫的 DR4-IE转基因小鼠中或在用瓜氨酸化纤维蛋白原免疫的野生型C57BL/6小鼠中均未发现。 这些观察结果直接暗示着瓜氨酸化纤维蛋白原对于RA相关的MHC II型分子是致关节炎的 {Hill et al，2008}。与抗原驱动的机制一致，已证实瓜氨酸化蛋白在发炎的RA滑膜中存在。据报道 纤维蛋白α-和β-链的瓜氨酸化形式不仅仅存在于RA患者的滑膜中{Masson-Bessigre et al，2001}。M抗原的分子特征将M鉴定为瓜氨酸化波形蛋白。M抗原可被RA自身抗 体特异性地定向，据报道它存在于发炎的滑膜中。源自单核细胞的巨噬细胞中的钙流入导 致波形蛋白的瓜氨酸化，该巨噬细胞在发炎的滑膜中大量存在，并且巨噬细胞响应促炎信 号通分泌波形蛋白这一事实与瓜氨酸化波形蛋白在RA发生中的作用是一致的IVossenaar and van Venrooi j, 2004} 0除了纤维蛋白和波形蛋白，其他瓜氨酸化自身抗原可在发炎的 关节中产生。通过使用蛋白质组学方法，在RA患者的滑膜组织鉴别出13种自身抗原性瓜 氨酸化蛋白，包括纤维蛋白原{Matsuo et al，2006}。据报道，瓜氨酸化酶PAD4 (见下)在 濒死的粒细胞中被激活，并且这会导致核蛋白的瓜氨酸化{Nakashima et al.，2002}。很可能的是在发炎的滑膜中，凋亡的粒细胞不被完全清除，这是先前在系统性红斑狼疮患者身 上观察到的现象{Ren et al，2003}，并且作为结果瓜氨酸化蛋白可能暴露于免疫系统下。瓜氨酸化是精氨酸残基翻译后转化为瓜氨酸残基，这是由肽基精氨酸脱亚胺酶 (PAD)催化的。肽基精氨酸脱亚胺酶(PAD ；EC 3. 5. 3. 15)催化蛋白中的精氨酸残基转化为 瓜氨酸残基。没有tRNA是为瓜氨酸存在的，瓜氨酸残基在蛋白中的存在无一例外地是翻 译后修饰的结果。在哺乳动物中(人类、小鼠和大鼠)，鉴定出五种PAD同型(PAD1-PAD6; ‘PAD4，和‘PAD5，用于相同的同型)，每种由不同的基因编码{Vossenaar et al, 2003b} 所有的这些酶的活性极度依赖于Ca2+的存在，并且不能将游离的L-精氨酸转化为游离的 L-瓜氨酸。真核细胞中的一氧化氮合酶(EC 1. 14. 13. 39)或细菌中的精氨酸脱亚胺酶(EC 3.5.3.6)可以将游离的L-精氨酸转化为游离的L-瓜氨酸。这些酶是非Ca2+依赖性的。高同源性的PAD酶之间最显著的不同在于它们的组织特异性表达。在表皮中，在 角化细胞分化的最后阶段，PADl (同物异名PAD I、I型PAD)参与角蛋白丝的瓜氨酸化，这 对角质化包膜的重组是重要的。在表皮中另一个瓜氨酸化位点是毛囊，其含有PAD3(同物 异名PAD III、III型PAD)及其天然底物毛透明蛋白(THH)。THH是内根鞘细胞以及毛囊 和较小程度上的其他分化的上皮细胞的髓质层的主要结构蛋白。最近鉴定出的PAD同型 PAD6(同物异名ePAD)被发现存在于在早期胚胎形成中起重要作用的小鼠卵母细胞的细 胞质层中。发现它的人直系同源物(orthologue)的表达局限于卵巢、睾丸和末梢血白细胞 {Chavanas et al.，2004}。最初，该PAD同型被命名为ePAD，但是基于其他PAD的系统编号 方式，该同型被重命名为PAD6 {Vossenaar et al. , 2003b} 0最广泛表达的同型PAD2 (同物 异名PAD II、II型PAD、PAD-H19)存在于许多不同的组织中，如骨骼肌、脑、脾、分泌腺和巨 噬细胞。尽管具有广泛的表达模式，但是只有髓鞘碱性蛋白(MBP)和波形蛋白被鉴定为天 然底物。MS患者能产生抗MBP的自身免疫性应答。MBP是髓鞘中的大量蛋白，并且其瓜氨酸 化发生于中枢神经系统的发育过程中。在钙离子载体诱导的人和小鼠巨噬细胞的凋亡中， 观察到波形蛋白的瓜氨酸化，并且如上所述，显示瓜氨酸化波形蛋白是RA特异性的抗Μ自 身抗体的靶标。与如上所讨论的主要位于细胞的细胞质中的PAD相反，PAD4同型(同物异 名=PAD IV、IV 型 PAD、HL-60PAD、PAD V、V 型 PAD、PAD 14)位于细胞核中。发现 PAD4 的核 定位信号存在于该蛋白的N端区。PAD4主要在末梢血粒细胞和单核细胞中表达。PAD4在 细胞核中的底物是组蛋白核心蛋白(H2A、H3和H4)和核磷蛋白/B23，核磷蛋白/B23是在 核糖体组装、核与质的转运以及中心体的复制中发挥功能的核仁蛋白。基于这些表达特征，两种PAD同型即PAD2和PAD4，是在与RA中免疫应答相关的蛋 白瓜氨酸化中发挥作用的瓜氨酸化酶的候选物。PAD2和PAD4存在于单核细胞、巨噬细胞和 粒细胞中，这些细胞大量存在于发炎的滑膜中{Chapuy-Regaud et al.，2003}。PAD通常作为无活性的酶存在于细胞溶质或核质中，因为该位点钙离子浓度低于 激活它们所需要的浓度。然而，在细胞死亡中，质膜的完整性丧失，导致Ca2+从细胞外空间 流入(细胞外Ca2+浓度为 1(Γ3Μ，足够使PAD激活)并随后激活细胞内PAD。选择性地或 同时地，激活的PAD酶可以从濒死的细胞中渗出并催化细胞外蛋白的瓜氨酸化。人PAD4蛋白的晶体结构在多年前已有描述{Arita et al.，2004}。存在和不存在 钙离子以及带有和不带结合底物的催化上无活性的突变体的PAD4晶体结构的比较，揭示 了 5个Ca2+结合位点，并且显示Ca2+的结合诱发构象变化从而产生活性位点裂口(cleft)。结构数据确定了催化三联体Cys-His-Glu/Asp定位于活性位点裂口中，在先前，部分基于 其他精氨酸修饰酶的结构信息而认为其存在催化位点的中心。基于这一保守模式以及底 物结合模式与其他精氨酸转化酶的底物结合模式是相似的这一假设，提出了该催化机制 {Shirai et al.，2001}，其他精氨酸转化酶如二甲基精氨酸二甲基氨基水解酶和L-精氨酸 脱亚胺酶。主要起作用的是Cys-645和His-471，Cys-645对精氨酸胍基的碳原子发动亲核 攻击，His-471的作用是通用碱基。 如上所述，越来越多的证据支持抗CCP抗体及其抗原靶标在RA病理生理学中的作 用。瓜氨酸化肽和RA相关的HLA单倍型的瓜氨酸依赖性相互作用进一步支持了瓜氨酸化 蛋白在RA的病因学上的作用{Hill et al，2003}。如上所述，同一个团队的近期数据显示， 在DR4-IE转基因小鼠中关节炎确实是由瓜氨酸化纤维蛋白原诱发的{Hill et al，2008}。 总之，这些数据表明，抗CCP抗体在RA中的特异性产生是在瓜氨酸化抗原暴露于免疫系统 和/或瓜氨酸化抗原被免疫系统识别的水平上介导的。一旦产生抗CCP抗体，在滑膜中与 瓜氨酸化蛋白的免疫复合物的形成，可以引发发炎过程的进展。对患有RA的患者进行的B 淋巴细胞消减实验的结果支持了抗CCP抗体在RA发病机制中的作用{Cambridge et al., 2003}。已知PAD酶及其产物瓜氨酸化蛋白在多种其他人类疾病中发挥作用，尤其是在诸 如牛皮癣、MS和系统性红斑狼疮的自身免疫性疾病中。在牛皮癣中，角质细胞增生非常快并且仅仅约四天就从基底层转移到表面。皮肤 不能足够快地脱落这些细胞因而它们积聚成粗厚干燥的斑点或斑块。在正常的角质细胞 中，角蛋白Kl在最后的分化中被PADl瓜氨酸化。这一过程使角蛋白纤维变得更紧密，这是 表皮正常角质化进程是必需的。牛皮癣患者过度增生斑块中的角质细胞不含有瓜氨酸化角 蛋白KlUshida-Yamamoto et al.，2000}。尚未清楚的是，是增强的细胞增生阻止了 PAD 进行足够的瓜氨酸化还是PAD的失活允许角质细胞过度增生和积聚。虽然这一机制尚未清 楚，但牛皮癣患者表皮中的异常瓜氨酸化明显与PADl相关。MS是CNS的慢性炎症病症，表现为自身免疫性介导的髓鞘的破坏。髓鞘细胞围绕 轴突形成多组双层结构，轴突由脂质蛋白复合物以约3 1的比例组成。两种主要的蛋白 即MBP和蛋白脂质蛋白，占蛋白成分的85%。MBP是高阳离子蛋白，能与带负电荷的磷脂如 磷脂酰丝氨酸形成很强的相互作用。在健康成人的约18%的MBP分子中，6个(19个中的) 精氨酸被瓜氨酸化{Wood et al. ,1989, Wood et al.，1996}。剩余的MBP分子不包含瓜氨 酸。在MS患者中，MBP-cit6的比例增至总MBP的45%。MBP_cit6的减少的净正电荷引起 MBP分子的部分未折叠并且使其与磷脂的相互作用减弱{Boggs et al. , 1999,Pritzker et al.，2000}。虽然MBP-Cit6能比非瓜氨酸化MBP更快地形成脂质复合物，但是所形成的复 合物堆积不如非瓜氨酸化MBP形成的堆积浓密{Boggs et al, 1999,Beniac et al，2000}。 MBP-cit6比非瓜氨酸化MBP被组织蛋白酶D降解要快4倍{Cao et al.，1999}。在急性 爆发性MS的罕见案例中(马尔堡型(Marburg type))，80 %的MBP分子被高度瓜氨酸化 (MBPcit 18) {Wood et al.，1996}。严重未折叠的MBPcitl8比正常MBP被组织蛋白酶D降 解要快45倍{Cao et al.，1999}。关于紫杉醇的临床试验正在进行中，紫杉醇是抗癌药物 泰素(taxol)的活性成分{O'Connor et al.，1999}。低剂量的紫杉醇可以在体外抑制MBP 被PAD2瓜氨酸化{Pritzker et al.，1998}。用紫杉醇进行治疗削弱了临床症状并且促使损伤的髓鞘进行髓鞘再生{Moscarello et al.，2002}，从而强调了 PAD作为脱髓鞘性疾病 中的候选因素的可能的重要性{Moscarello et al.，20022x}。发明详述干扰与瓜氨酸化蛋白(水平的改变)相关的自身免疫性疾病的一个潜在的靶标是 PAD。阻断瓜氨酸化蛋白在炎症位点例如在RA发炎的滑膜中的产生，会阻止免疫复合物的 形成并且因此预计将抑制受侵袭的关节发炎过程的进展。因为瓜氨酸化蛋白在滑膜中没有 明显的生理学作用，所以预计干扰它们的产生不会引起严重的副作用。因此，优选在不必要的自身免疫性反应位点例如在发炎的滑膜中，旨在特异性抑 制PAD活性的治疗干预对RA患者的关节破坏过程是高度特异性的。与RA相似，在患有MS的患者中，也可以通过给予PAD抑制剂从而阻止髓鞘碱性蛋 白(MBP)的过度或异常瓜氨酸化，这会导致髓鞘层中的脂质复合物更浓密地堆积、MBP更好 地折叠以及使MBP被组织蛋白酶D降解的敏感性降低。目前，在临床试验中，用低剂量的紫 杉醇抑制MBP被PAD2瓜氨酸化。用紫杉醇进行治疗削弱了临床症状并且诱发损伤的髓鞘 进行髓鞘再生{Moscarello et al.，2002}。然而，紫杉醇是一种带有许多不利副作用的高 毒性药物，即使在低剂量下。紫杉醇和泰素化合物不是PAD抑制性分子特异性的。目前，没有特异性的PAD抑制剂被公开是适合于治疗其他自身免疫性病症，如RA、 MS、SLE或牛皮癣。本发明的目标是提供可以可逆或优选不可逆地抑制PAD酶，尤其是人 PAD2和PAD4酶的分子。苯甲酰-L-精氨酸乙酯(BAEE)已广泛用作确定PAD活性的底物。一种相关的化 合物即苯甲酰-L-精氨酸酰胺，被用作确定PAD4底物复合物的晶体结构的底物。这表明， 虽然PAD不将游离的L-精氨酸转化为L-瓜氨酸，但是与BAEE化学相关的化合物可能适合 活性位点裂口并且竞争结合底物分子。在这方面尤其感兴趣的是半胱氨酸，它是催化三联 体的一部分，并且认为其在亲核催化反应中起必不可少的作用。通过稳定催化裂口的四面 体络合物，可以阻止瓜氨酸化产物的形成。因此，本发明提供了 PAD抑制剂，其基于对活性 位点半胱氨酸的共价修饰从而成功地实现抑制，优选以低剂量的抑制剂。公开的抑制剂可 以以可逆的方式抑制PAD，但是优选不可逆地和/或共价地结合于PAD酶，最优选结合于活 性位点催化的半胱氨酸残基上。化合物在第一方面，本发明提供了能抑制肽基精氨酸脱亚胺酶(PAD)的新分子或化合 物。PAD的抑制在本文中定义为通过使用实施例4、5、6和/或7中的任一个所提供的测定 在体外抑制PAD活性的化合物的能力。术语“抑制”是本领域公认的并且指下调或抑制PAD 的活性(PAD2和/或PAD4的活性)，不是两者联合就是分别地。通过使用最低浓度为优选 最少 0. OOOOOOlmM 或 0. 000001,0. 00001,0. 0001,0. 001,0. 01,0. 1,0. 5、1、2、5 或 IOmM 的上 述化合物，这种抑制优选指抑制最少5 %的不带有上述化合物的上述酶的最初活性。被检测 的PAD酶的活性在实施例6中有描述。更优选地，抑制是指抑制至少10%，甚至更优选地 至少20 %、至少30 %、至少0 %、至少50 %、至少70 %、至少90 %、至少95 %或更多。最优选 地，没有PAD2和/或没有PAD4的活性被测定出来。本文所定义的本发明的任一化合物，如本文所述，能抑制PAD的活性，预期其能作 为用于预防、治疗和/或延缓自身免疫性病症症如RA的药物而发挥功能。
本发明的化合物优选能抑制PAD的活性，更优选能抑制PAD2和/或PAD4的活性。 该化合物优选包含肽部分和亲电子基团，优选氨基酸Ω所携带的巯基活性亲电子基团，其 中(a)该肽包含至少约5个氨基酸但不多于约20个氨基酸，该肽的部分包含至少基序(bl)、(b2)、(b3)或(b4)中的一个(bl)G/S/T-D/S-Ω-D/G/S-G/S(b2)H/K/F/L/ff-S/D/H-Ω-D/E-H/Y/F/ff(b3)Y/A/K/H/L-F/Y/H-Ω-N/G/H/Y—K/A/F(b4)Y-D/S-Ω-D/G/S-G/S其中Ω代表携带亲电子基团的氨基酸，优选巯基活性亲电子基团。(c)任选地肽序列的N-末端和/或C-末端被修饰。肽部分由肽的序列代表。因此本发明所包括的肽序列可以包含或组成为带有如上 定义的(bl)、(b2)、(b3)和/或(b4)基序的序列。因此本发明所包括的肽的序列可以是并 列的两个或三个或更多个(bl)、(b2)、(b3)和(b4)基序。然而，优选的肽的序列包含或组 成为(bl)或( )或(b!3)或(b4)基序更优选单个(bl)或( )或(b!3)或(b4)基序。更 优选的肽的序列包含或组成为(bl)或( )或(b4)基序。优选的化合物包含或组成为SEQ ID NO :12_21，107-143，优选20_21、120、122、 127-143，更优选 20、21、127、128、136-143，甚至更优选为 138、141、142、143。包含(bl)基序或由其组成的更优选的肽序列可见于实施例1 参见表2的所有肽 序列，除了 Ll用作对照(SEQ ID NO 1-10以及Ll为SEQ ID NO :11)。在该表的每个肽序列 中，为了获得如上定义的本发明的相应抑制剂，应该将R取代为Ω。因此，优选的肽的序列 包含或组成为SEQ ID N0:l-10，其中R被Ω取代。优选的抑制剂进一步见于实施例1 (SEQ ID NO :12-20)。因此优选的抑制剂包含或组成为SEQ ID NO 12-20、SEQ ID NO :126,127, 142。更优选的抑制剂包含或组成为SEQ ID NO :20、127、142。甚至更优选的抑制剂包含SEQ ID NO :20或由其组成，其中C-末端通过添加酰胺而被修饰。最优选的抑制剂包含SEQ ID NO :142或由其组成。包含( )基序或由其组成的优选的肽序列在表5中被鉴定出并且预期其形成特 异性抑制至少PAD4的化合物参见表5中的所有肽序列(SEQ ID NO :47-71)。在该表的每 个肽序列中，为了获得如上定义的本发明的相应抑制剂，应将R取代为Ω。因此，优选的肽 序列包含或组成为SEQ ID N0:47-71，其中R被Ω取代。优选的抑制剂包含或组成为SEQ ID Ν0107-125、129-141。更优选的抑制剂包含或组成为 SEQ ID NO 120、122、129-141。甚 至更优选的抑制剂包含或组成为SEQ ID NO :136、137、138、139、140。最优选的抑制剂包含 SEQ ID NO 138或由其组成。包含(b!3)基序或由其组成的优选的肽序列在表9中被鉴定出并且预期其形成特 异性抑制至少PAD2的化合物参见表9中的所有肽序列，除了 Ll用作对照(SEQ ID NO 92-106以及SEQ ID NO :11作为对照Li)。在该表的每个肽序列中，为了获得如上定义的本 发明的相应抑制剂，应该将R取代为Ω。因此，优选的肽的序列包含或组成为SEQ ID NO 92-106，其中R被Ω取代。预期在表10中所鉴定出的优选的肽序列(选自表5和9中已鉴定出的那些)形成特异性抑制PAD2和PAD4的化合物参见表10中的所有肽序列，除了 Ll和L2用作对照。 在该表的每个肽序列中，为了获得如上定义的本发明的相应抑制剂，应将R取代为Ω。优选的抑制剂包含肽部分，所述肽部分包含(b4)基序或由其组成，并且由包含或 组成为SEQ ID NO :21、128、143的序列代表。更优选的抑制剂由包含SEQ ID NO :143或由 其组成的序列代表。甚至更优选的抑制剂包含SEQ ID NO :21或由其组成，其中C-末端已 通过添加酰胺而被修饰。该抑制剂是优选的，因为已证明它在体内动物模型中表现出显著 的抑制活性(参见实施例10)。本发明优选的化合物在它们的(bl)基序中具有两个D残基。相应的肽的序列包 含G/S/T-D-Q-D-G/S或由其组成。本发明其他优选的化合物在它们的(b2)基序中具有两个D残基。相应的肽序列 包括 H/K/F/L/W-D- Ω -D-H/Y/F/W 或由其组成。更优选的化合物是那些在表4、5、9或10的任一个中被鉴定出来的肽序列(参见 这些表中的所有肽序列，除了用作对照的Ll和L2之一。在该表的每个肽序列中，为了获得 如上定义的本发明的相应抑制剂，应将R取代为Ω。更优选的化合物是那些在表11、12或15的任一个中被鉴定出来的化合物(除了 来自用作对照的L2的一个化合物)。表15的抑制剂由SEQ IDNO :107-111代表。优选的 抑制剂包含或包括SEQ ID NO: 107-111。每个这些化合物已被明确表征为PAD2和/或PAD4抑制剂。本发明的化合物包含至少约5个但不多于约35个，优选不多于约25、20、15、10、 9、8、7个氨基酸的肽部分，能与PAD酶相互作用，并且其亲和力(Km)可以为InM到ImM，优 选为InM到100 μ M，优选为InM到10 μ Μ。在本发明中，我们明确地证实了 7个氨基酸的长 度足以赋予化合物特异性(只有PAD酶，优选PAD2和/或PAD4可以被抑制而其他酶类不 行)并且是有效的PAD2和/或PAD4抑制剂。这种长度是非常有吸引力的，因为这类化合 物可以很容易地被化学合成。因此，本发明的化合物包含至少约5个但不多于约35个，优 选不多于约 34、33、32、31、30、四、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、 12、11、10、9、8、7个氨基酸的肽部分，并且该化合物可以与本文所定义的PAD酶相互作用。 优选的化合物包含肽部分，所述肽部分包含7个氨基酸的长度。本文描述了肽序列，其从左 向右阅读，氨基(N-)末端位于左侧，而羧基(C-)末端位于右侧。亲电子基团本发明的化合物优选包含亲电子基团，更优选巯基活性亲电子基团，任选地通过 间隔子部分连接于肽部分。亲电子基团是具有低电子密度的部分(也称为亲电体)，其能与 另一种具有高电子密度的部分(也称为亲核体)反应。在本文中，具有低电子密度的部分 可以表示，该部分具有比有高电子密度部分低的电子密度。因此，带有高电子密度的部分可 以表示其是带有比具有低电子密度部分更高的电子密度的部分。本申请的巯基活性亲电子 基团优选氟脒(fluoroamidine)或氯脒(chloroamidine)的结构和性质是这样的在室温 下(或在37°C下)抑制剂的巯基活性亲电子基团和PAD酶的活性中心之间的化学反应是可 能的，从而产生共价偶联的酶-抑制剂复合物。亲电子基团或优选巯基活性亲电子基团，优选由如在本发明的化合物中鉴定出来 的氨基酸Ω携带。Ω可以是任何氨基酸。Ω可以是修饰的氨基酸。预期本发明的化合物能与PAD酶相互作用，优选PAD2和/或PAD4，并且优选但不限于能通过与PAD酶的催化位 点(或裂口)上的半胱氨酸残基的巯基部分相互作用或结合而抑制它们的活性。该抑制已 经在本申请的实例中被广泛证实。巯基活性亲电子基团或亲电子基团或亲电子阱(electrophilic trap)任选地通 过间隔基团或部分与分子的肽部分相连，并且可以是本领域已知的可以被技术人员轻易选 出的任何巯基活性亲电子基团。在下文中，巯基活性亲电子基团是指，在生理学PH值的水 溶液条件下能与巯基(SH)基团尤其是半胱氨酸的巯基基团形成共价键的任何基团。优选 地巯基活性亲电子基团选自卤甲基酮、α，β -不饱和酮、α，β -不饱和酯、α，β -不饱和 砜、α，β -不饱和酰胺、α ,β-不饱和磺胺、α ,β-不饱和氰、乙烯基膦酸酯、乙烯基膦酸、 环乙亚胺、马来酰亚胺、二氮甲基酮、环氧化物和脒的基团。在更优选的实施方案中，巯基活性或亲电子基团是卤脒基团。在本文中术语卤脒 是指拥有结构元件-NH-C( = NH)-CH2-X的基团，其中X是卤素。因此，O(FA)或氟脒是指 带以下侧链的氨基酸-CH2-CH2-CH2-NH-C( = NH)-CH2-F,并且O(CA)或氯脒是指带以下侧 链的氨基酸-CH2-CH2-CH2-NH-C( = NH)-CH2-Cl0卤脒基团可以是氟脒、氯脒、碘脒或溴脒。 用氟脒可获得最佳结果。在更优选的实施方案中，巯基活性亲电子基团由本文所鉴定的氨基酸Ω携带。最 优选地，Ω是鸟氨酸。因此，在最优选的化合物中，鸟氨酸携带亲电子基团或阱，该亲电子基 团或阱是卤脒基团，该卤脒基团是氟脒、氯脒、碘脒或溴脒。甚至更优选的为这样的化合物， 其中所述鸟氨酸携带氟脒或氯脒。最优选的是这样的化合物，其中所述鸟氨酸携带氟脒。技术人员将间隔子连接于肽上是其工作范围，例如将间隔子偶联于肽上常见的羧 酸、羟基、巯基和胺基团上是常规的工作。通常游离的胺基团是非常适合连接间隔子。同样 将间隔子偶联于亲电子基团，优选将间隔子偶联于能与巯基反应的巯基活性亲电子基团， 将仅仅包含常规实验，并且在这此不需要进一步详述。将本发明的PAD抑制性分子的肽部分连接于亲电子基团，优选连接于巯基活性亲 电子基团的间隔子，可以代表一种连接基团，该基团由含有1-12个碳原子的线性的或分支 的、饱和的或(多)不饱和的链组成；其中任选地，4-6个原子一起可形成饱和的环或芳香 环；和/或其中任选地，1-6个原子可能已被1-4个N-、0-或S原子或其组合取代。更优选 地，间隔子是由含有3-8个碳原子的分支的或线性的饱和或(多)不饱和的链组成；其中任 选地，4-6个原子一起可形成饱和的环或芳香环；和/或其中任选地，1-3个原子可能已被 1-3个N-、0-或S原子或其组合替代。在优选的实施方案中，肽骨架和亲电子阱或亲电子基团或巯基活性亲电子基团之 间的间隔子是包含3-6个碳原子的线性饱和的脂肪链。为了确保能在体外和体内抑制PAD活性的本发明分子的足够的半衰期，分子的肽 部分优选被修饰从而确保生物降解性降低和生物有效性足够。或者肽可以被环化从而避免 例如肽酶在末端降解。同样，非自然存在的氨基酸和/或通常不存在于人体内的氨基酸， 或肽拟似物，可以用于分子的肽部分，来阻止降解和/或增强化学或生物稳定性和生物有 效性。PAD抑制性分子的肽部分可以包含D-氨基酸、β-氨基酸、α-甲基氨基酸和/或 α -烯基氨基酸，从而在给予待治疗的个体化合物后，阻止、延缓或抑制生物降解。肽部分的C-或N-末端的修饰
在本发明的化合物中，可以用保护基团修饰或延伸肽的羧基末端，保护基团可防 止酶促降解和/或提高在水溶液中的化学稳定性和/或可溶性。本发明的化合物可以包含 C-末端保护基团，该基团是线性的或分支的烷基、芳香基或烷基芳香基基团，任选地含有 N、0、S或卤素取代的部分，总共包含3到约25个原子。优选地，C-末端保护基团选自以下基团NH2、NH-NH2、NffiV8、NH-Mffin CH2CN、队-8、 O-RnCHUnCR^IVJUNRhRH和CH2-NIV8IV8,其中对于每个队_8，独立地选择如下所 述的队到化之一，并且其中-R1代表含有1-12个碳原子的分支的或线性的饱和或(任选多)不饱和的链；-R2代表含有1-12个碳原子的烷基基团，其中4-8个碳原子形成环状部分；-R3代表队或R2，其中多达1-4个碳原子已被N-、0_或S-原子或其组合取代；-R4代表含有6-12个成环碳原子的芳香基、双芳香基或融合的芳香基基团；- 代表R4，其中1-4个碳原子已被N-、0-或S-原子或其组合取代；- 代表烷基芳香基基团，其中烷基部分是线性的、分支的或环状的，并且由1-6个 碳原子组成，而芳香基部分由6个碳原子组成；-R7代表&，其中烷基部分的1-3个原子和/或芳香基部分的1-4个原子已被N-、 0-或S-原子或其组合取代；并且，-R8代表被1-4个另外的取代基取代的队到R7,该取代基选自以下基团(C1-C6) 烷基、(C3-C6)环烷基、(C1-C6)烯基、(C1-C6)炔基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)硫代烷氧基、硝 基、卤素和带有4-6个成环原子的杂环基团，该成环原子中1-5个是碳原子而1-3个是N-、 0-或S-原子或其组合。本发明的化合物的肽部分也可以在肽的氨基末端受到保护。可以用保护基团修饰 或延伸肽的氨基末端，其中N-末端保护基团可以是线性的或分支的烷基、芳香基或烷基芳 香基基团，任选地含有N、0、S或卤素取代的部分，总共包含3到约25个原子。优选地，N-末 端保护基团选自以下基团=I^8-C(O)、I^8-O-C(O)、队_8，IV8-SO2，或可以存在相同或不同的 两个这类保护基团中，其中对于每个IV8，独立地选择如下所述的R1到&之一，其中-R1代表含有1-12个碳原子的分支的或线性的饱和或(任选多)不饱和的链；-R2代表含有1-12个碳原子的烷基基团，其中4-8个碳原子形成环状部分；-R3代表Rl或R2，其中多达1_4个碳原子已被N-、0_或S-原子或其组合取代；-R4代表含有6-12个成环碳原子的芳香基、双芳香基或融合的芳香基基团；优选 R4-SO2或2-萘磺酰基基团，其中R4是带有10个碳原子的芳香基基团(例如，萘基)；- 代表R4，其中1-4个碳原子已被N-，0_或S-原子或其组合取代；- 代表烷基芳香基基团，其中烷基部分是线性的、分支的或环状的，并且由1-6个 碳原子组成，而芳香基部分由6个碳原子组成；-R7代表&，其中烷基部分的1-3个原子和/或芳香基部分的1-4个原子已被N-、 0-或S-原子或其组合取代；并且，-R8代表被1-4个另外的取代基取代的队到R7,该取代基选自以下基团(C1-C6) 烷基、(C3-C6)环烷基、(C1-C6)烯基、(C1-C6)炔基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)硫代烷氧基、硝 基、卤素和带有4-6个成环原子的杂环基团，该成环原子中1-5个是碳原子而1-3个是N-、 0-或S-原子或其组合。
作为优选的实施方案，本发明的化合物是这样的，用乙酰基基团修饰肽序列的 N-末端被和/或将C-末端修饰为酰胺。发现这些化合物作为抑制剂的稳定性得到提高。作为另一个优选实施方案，本发明的化合物是这样的，通过添加2-萘磺酰基基团 修饰肽序列的N-末端。这类化合物有引人注目的特性，因为它们作为抑制剂的稳定性得到 提高，并且出人意料地发现它们作为PAD2和PAD4的抑制剂抑制活性或效力得到改善(参 见实施例9)。本发明优选的化合物包含肽部分，所述肽部分包含或组成为实施例9的表23 所鉴定的序列SEQ ID NO 115或119。作为另一个优选实施例，本发明的化合物是这样的，通过添加D-氨基酸修饰肽序 列的C-末端。这类化合物有引人注目的特性，因为它们作为抑制剂的稳定性得到提高，并 且出人意料地发现它们具有的抑制剂活性不受该修饰的影响(参见实施例9)。本发明的优 选的化合物包含肽部分，所述肽部分包含或组成为实施例9的表沈所鉴定的序列SEQ ID NO :120-127。作为更优选的实施例，本发明的化合物是这样的，通过添加2-萘磺酰基基团修饰 肽序列的N-末端，并且通过添加D-氨基酸修饰肽序列的C-末端。本发明优选的化合物包 含肽部分，所述肽部分包含或组成为实施例9的表观所鉴定的序列SEQ ID N0:U8-135。当存在几个非极性氨基酸时肽部分可能会不充分溶解，为了提高肽部分的可溶 性，可以通过添加可溶性增强极性基团尤其是在肽部分的N-和/或C-末端，来修饰肽部 分。可溶性基团优选为位于肽部分的N-和/或C-末端和N或C末端的保护基团之间的间 隔子部分。在最优选的实施例中，可溶性基团代表带有NH-(CH2-CH2-O-)m-(CH2)n-C(0)结构 的极性间隔子部分，其中m = 1-6而η = 0、1或2。 虽然PAD活性可在胞外空间被抑制，但是PAD的抑制也可以发生于胞内，例如抑制 组蛋白和其他底物的瓜氨酸化，例如来改变基因表达。为了促进或增强细胞摄取本发明的 PAD抑制性分子，在另一个实施方案中，抑制性肽分子可以融合于蛋白转导结构域或细胞渗 透肽上。几个蛋白和小肽具有转导穿过生物膜的能力，而不依赖于典型的受体或内吞作用 介导的通路。这些蛋白的实例包括HIV-ITAT蛋白、单纯疱疹病毒I(HSV-I)DNA结合蛋白 VP22和果蝇触角足基因(Antp)同源转录因子。源自这些蛋白的小蛋白转导结构域(PTDs) 可以融合于其他大分子、肽或蛋白，从而成功地将它们转运到细胞内，包括本说明书的多肽 和修饰的多肽。转导结构域的序列比对显示了高碱性氨基酸含量(Lys和Arg)，这可以促进 这些区域与膜上带负电荷的脂质相互作用。二级结构分析显示所有这三个结构域之间没有 一致的结构。本发明的化合物能在体外和/或体内、在胞内和/或胞外抑制PAD酶。PAD2和/ 或PAD4是最优选的，因为这些酶是参与自身免疫性相关瓜氨酸化过程的酶。组合物在另一个方面，本发明提供了包含本文所早先定义的化合物个至少一种赋形剂的 组合物，所述组合物优选为用于治疗和/或预防优选人的自身免疫性病症的药物组合物或 药物。所述组合物或化合物也可以用于延缓这类病症的发展。自身免疫性病症是这样的 疾病，其中，免疫系统靶向内源性抗原，从而对组织造成损伤，异常的瓜氨酸化通常在个体 的免疫系统识别自身抗原中发挥作用。涉及本发明的化合物或组合物可以用于制备用来 治疗或预防PAD相关的和/或瓜氨酸化相关的疾病或病症或PAD恶化的疾病或病症的药物。尤其是，本发明的PAD抑制性化合物或组合物可以用于制备用于治疗自身免疫性病症 的药物，所述自身免疫性病症如但不限于RA、MS、牛皮癣、系统性红斑狼疮(SLE)、桥本氏甲 状腺炎(Hashimoto’ s thyroiditis)、甲状腺机能亢进(Graves，s disease)、系统性硬化 (硬皮病)、新生儿狼疮综合征、特发性炎性肌病、青少年慢性关节炎、牛皮癣关节炎、自身 免疫性肝炎、混合性结缔组织病(MCTD)、干燥综合症(Sj0gren’s syndrome)和韦格纳肉芽 月中(Wegener， s granulomatosis)。本发明的化合物可以用药物可接受的赋形剂配制。因此本发明的组合物包含本发 明的化合物和至少一种赋形剂。配制适合于多种给药模式(非肠道或口服)的药物组合 物是在本领域内是已知的，并且在多种教科书中有所描述，如Remmington Pharmaceutical Sciences (雷明顿药物学)，Mack publishing co.，1989。对于本发明给定的化合物，和/ 或对于待治疗的自身免疫性病症，和/或对于体内给药/定位模式，可以适当调整药物组合 物。可以优选的是，将药物组合物或制剂中的本发明的PAD抑制性化合物与其他活性化合 物联合，其他活性化合物如免疫抑制性试剂和/或炎症抑制性试剂。可以与本发明的PAD 抑制性分子联合使用的免疫抑制性化合物的优选实例是咪唑硫嘌呤(依木兰(Imuran))、 环孢霉素(A)、巯基嘌呤(巯基嘌呤，6-MP)，炎症抑制性试剂的优选实例是NSAIDs (非固醇 类抗炎药物)或如强的松龙的皮质类固醇。在优选的实施方案中，本发明的药物组合物是用于治疗RA的组合物，并且是用于 非肠道优选局部给药的诸如药膏或存储制剂(cbpository formulation)的组合物，其可局 部应用于发炎的关节。最优选的这类组合物包含赋形剂，该赋形剂允许经皮给予PAD抑制 性化合物，例如脂质体制剂。在另一个优选的实施方案中，本发明的组合物是用于治疗RA 的组合物，并且是这样的组合物，其用于通过注射到受RA侵袭的和/或发炎的关节，优选直 接注射到关节的滑液中，或任选地替换关节的滑液而非肠道优选局部给药，单个剂量的每 次注射浓度为1 μ g到0. 1,0. 5、l、2、5、10mg，这取决于化合物的亲和力和活性、个体关节的 大小和炎症的严重性。然而，鉴于本发明抑制性分子或化合物的高特异性，预期会产生极少 副作用，并且通过口服摄取或静脉内或肌肉内注射来进行PAD抑制剂的全身给药是其他可 行的给药途径。尤其是，如前文所述，本发明的药物可以用于治疗和/或预防个体优选人的自身 免疫性疾病的方法中，并且最优选用于治疗RA和MS的方法中。在本发明的内容中，待治疗的生物或个体(individual)或个体(subject)可以是 动物或人类。优选地，生物是人类。优选地，被治疗的生物体因为例如潜在的遗传倾向和/ 或个体的年龄和/或个体的生活方式(例如营养习惯和/或缺乏身体活力)而疑似具有产 生诸如RA自身免疫性病症的高风险性。术语“预防”应当理解为包括完全防止、预防以及降低个体患有上述疾病或情况的 风险。该术语也应当理解为包括缓解已经发生的症状。本文所用的术语“延缓”是指将化合物给予生物，即处于待治疗的病症前期的患 者，本领域已知的方法在该患者中诊断了相应病症的前期形式(pre-form)。优选地，将疾病 症状的意外出现延缓至少数月至一年或更长。术语“治疗(treatment)”或“治疗(treating) ”被理解为为了抵抗疾病/病症或 失调症而管理以及护理病人。
本文所定义的本发明的每种化合物适用于预防、延缓和/或治疗本文所定义的自 身免疫性病症。因此在优选的实施例中，本发明的化合物或组合物用作本文早先所定义的药物。在本公开及其权利要求书中，动词“包含”及其词形变化以其非限制性含义使 用，意指包括在该词之后的项目，但是并不排除没有特意提及的项目。此外，用不定冠 词"a(—个)"或"an(—个)"提及要素并不排除该存在多于一个该要素的可能性，除 非文本中明确规定有一个并且只有一个该元素。因此不定冠词"a"或"an"通常意指 “至少一个”。此外动词“由……组成”可以用“主要由……组成”取代，意指除了所具体限定的 那些外，本文所定义的化合物或组合物还可以包含其他化合物，所述其他化合物不改变本 发明的独特性质。在本发明的文本中，当在关于化合物的内容中使用时，单词“约”(即约5 个氨基酸)意指有5-6个氨基酸。将本说明书所引用的所有的专利和文献资料通过引用整体并入本文。以下实施例 仅为了例证性目的而提供，并非意图以任何方式限制本发明的范围。附图简要说明
图1.将表达人PAD2或PAD4蛋白的C0S-1细胞的裂解液在IOmMCaCl2存在下于 37°C孵育30分钟。裂解液中蛋白的瓜氨酸化可通过SDS-PAGE/western印迹观察到，之后 修饰瓜氨酸残基并且与抗修饰的瓜氨酸抗体一起孵育(1和4泳道)。使用Ra3 scFv抗体 (3和6泳道)和作为阴性对照0和5泳道)的无关的scFv (针对GST)，通过免疫亲和纯 化，从裂解液中分离瓜氨酸化蛋白。图2.用链霉亲和素碱性磷酸酶显影的印迹通过SDS-PAGE凝胶电泳分析不同量的生物素化的抑制剂肽(生物素-Ahx-D-S-K -K-H-D-O(FA)-D-F-L-Y-S-D-酰胺，O(FA)=鸟氨酸氟脒，Ahx = 6-氨基己酸)和固定量的 His标记的PAD4的混合物。将蛋白转移至PVDE膜上，并且用链霉亲和素碱性磷酸酶结合物 显影，随后用NBT/BCIP可视化。在表18中对样品进行了详细说明。图3.用小鼠抗His —抗、羊抗小鼠碱性磷酸酶二抗显影的印迹。通过SDS-PAGE凝胶电泳分析不同量的生物素化的抑制剂肽(生物素-Ahx-D-S-K -K-H-D-O(FA)-D-F-L-Y-S-D-酰胺，O(FA)=鸟氨酸氟脒，Ahx = 6-氨基己酸)和固定量的 His标记的PAD4的混合物。将蛋白转移至PVDE膜上并且用小鼠抗His抗体作用，随后用羊 抗小鼠碱性磷酸酶结合物显影，之后用NBT/BCIP可视化。在表18中对样品进行了详细说 明。图4.通过比色测定使用DAMO和安替比林来修饰苯甲酰瓜氨酸乙酯，确定多种化 合物抑制所述的PAD将苯甲酰精氨酸乙酯转化为苯甲酰瓜氨酸乙酯的能力。在不存在任何 抑制性化合物的情况下，将BAEE的转化设定为100%。图5.该图阐明所观察到的 PAD 介导的肽 D-S-K-K-F-H-R-G-F-L-Y-S-D (0708-33， MH22+calc = 800. 39,MH3s+calc = 533. 93)转化为其瓜氨酸变体(ΔΜ = 0. 98Da)的质谱数据。A 底物肽 D-S-K-K-F-H-R-G-F-L-Y-S-D (上图)和被 PAD 100 % 转化的产物肽 D-S-K-K-F-H-Cit-G-F-L-Y-S-D(下图)的质谱。B :3+-信号的放大。
C :2+-信号的放大。图6.使用胶原蛋白抗体诱发的关节炎(CALA)模型(MQR ；18. 101)测试PAD抑制 剂CXP5.7-011(SEQ ID NO 143)的治疗效果。在第0天，用2，8mg抗胶原蛋白抗体腹腔注 射小鼠。在第3天，通过腹腔注射给予LPS(25 μ g/小鼠)。从第3天到第11天(除了第9 天)，每天给予抑制剂(含有20mM磷酸钠的200 μ 1 PBS中的0. 5mg CXP5. 7-011)或作为 安慰剂的200 μ 1含有20mM磷酸钠的PBS。每天对动物的炎症程度进行评分直至第14天。 在每个时间点标记每个实验组(5只小鼠)的平均关节炎评分。
实施例实施例1 基于天然底物的抑制剂已在蛋白水平上鉴定出PAD的多个底物。已证明，在体内尤其是蛋白中的精氨酸 可以转化成瓜氨酸(Cit)，然而其他的精氨酸看起来是完全抵抗转化为瓜氨酸。由这些观 察报告来看，显然精氨酸残基的化学环境决定它的底物特性。为了研究在被PAD酶转化的 精氨酸的周围最常被发现的侧翼氨基酸的特性，将编码PAD2和PAD4的cDNA克隆入带有编 码VSV-G标签的序列的真核表达载体pCI-NE0(Promega，Leiden, The Netherlands)的框 内。用产生的构建体转染培养的C0S-1或HEK293细胞，并且通过免疫印迹，使用转染48小 时后制备的细胞提取物和在兔子中产生的单特异性抗PAD抗血清来检验PAD在这些细胞中 的表达。结果显示PAD2和PAD4在这些细胞中均有效表达。用抗修饰的瓜氨酸抗体(AMC) 分析这些细胞的提取物，在用修饰肽基瓜氨酸的试剂进行western印迹处理之后{Senshu et al.，1992}，如基于细胞中的低钙浓度所预期的，表明未能测定到瓜氨酸化蛋白。为了使 细胞蛋白发生瓜氨酸化，将细胞在含有PH 7. 4的20mM Tris-HCl、10mMβ -巯基乙醇、IOOmM NaCl、10%甘油和无EDTA的蛋白酶抑制剂的缓冲液中裂解，随后在添加氯化钙至终浓度为 IOmM后，将裂解液于37°C孵育30分钟。作为对照，在5mM EDTA存在的情况下平行孵育裂 解液。在用化学修饰混合物处理电转移到增强的硝酸纤维素膜上的蛋白之后，用AMC抗体 进行的免疫印迹分析显示，这一过程导致裂解液中多种细胞蛋白的钙-和PAD-依赖性瓜氨 酸化(图1)。重要的是，在针对不同PAD酶而获得的瓜氨酸化蛋白形式中，观察到差异，这表明 差异存在于PAD2和PAD4的底物特异性中。随后，通过免疫亲和纯化，使用RA3单链抗体片 段(scFv)，将瓜氨酸化蛋白从细胞裂解液中分离出来，RA3单链抗体片段对瓜氨酸化表位 是特异性的{Raats et al.，2003}。在用胰蛋白酶消化纯化的蛋白之后，通过串联质谱确 定所得肽的氨基酸序列。基于质谱数据，鉴定含有瓜氨酸化残基的肽。在源自表达PAD2和 PAD4的C0S-1细胞的蛋白中，分别鉴定出总共90和57种瓜氨酸化肽，从PAD2和PAD4的 HEK-293细胞材料中，分别获得107和38种瓜氨酸化肽。在瓜氨酸化残基的N-末端5个 残基和C-末端5个残基之间的每个位点的氨基酸频率源自这些位点的组合序列并且在表 1中显示。基于这些数据，合成PAD2-和PAD4-特异性的13-mer (单元单体)肽，其在中心 位置含有精氨酸(表幻。通过将这些肽与细菌表达的、His6标记的、IMAC纯化的重组酶一 起孵育，之后用MALDI-T0F和ESI-Q-TOF质谱分析产物，研究人PAD2和PAD4酶将这些肽瓜 氨酸化的效率。这些肽瓜氨酸化的效率列于表2。91
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权利要求
1.能抑制PAD活性的化合物，包含肽部分和由氨基酸Ω携带的巯基活性亲电子基团，其中(a)所述肽部分包含至少约5个氨基酸而不多于约20个氨基酸；(b)所述肽包含基序(bl)、(b2)、(b3)或(b4)中的至少一个 (bl)G/S/T-D/S-Ω-D/G/S-G/S(b2)H/K/F/L/ff-S/D/H-Ω-D/E-H/Y/F/ff (b3)Y/A/K/H/L-F/Y/H-Ω-N/G/H/Y-K/A/F (b4)Y-D/S-Ω-D/G/S-G/S 其中Ω代表携带巯基活性亲电子基团的氨基酸(c)任选地所述肽序列的N-末端和/或C-末端是修饰的。
2.如权利要求1所述的化合物，其中所述巯基活性亲电子基团是卤脒基团，优选是氟 脒或氯脒。
3.如权利要求1或2所述的化合物，其中Ω是鸟氨酸。
4.如权利要求1-3中任一项所述的化合物，其中(bl)所定义的基序为G/S/ T-D-Q-D-G/S，和(b2)所定义的基序为 H/K/F/L/W-D-Ω-D-H/Y/F/W。
5.如权利要求1-3中任一项所述的化合物，其中所述基序是(b4)。
6.如权利要求1-5中任一项所述的化合物，其中所述肽序列包含7个氨基酸或由其组成。
7.如权利要求1-6中任一项所述的化合物，其中用乙酰基基团修饰所述肽序列的N-末 端和/或将所述C-末端修饰为酰胺。
8.如权利要求1-6中任一项所述的化合物，其中所述肽序列的N-末端通过添加2-萘 磺酰基基团来修饰和/或任选地所述C-末端通过添加D-氨基酸来修饰。
9.如权利要求1-7中任一项所述的化合物，其中所述肽序列包含或组成为在表4、5、9 或10中任一个中所鉴定的肽序列，即SEQ ID NO :47-71，92-106，其中R被Ω取代。
10.如权利要求1-9中任一项所述的化合物，其中化合物如在表11、12或15中任一 个中或实施例1中所鉴定的，除了源自对照肽序列L2的化合物，所述化合物优选包含或组 成为 SEQ ID NO :12-21,107-143，优选 20-21、120、122、127-143，更优选 20、21、127、128、 136-143，甚至更优选 138、141、142、143。
11.如权利要求1-8中任一项所述的化合物，其中所述肽部分包含或组成为实施例9中 的表28所鉴定的序列SEQ ID NO 128-1350
12.包含权利要求1-11中任一项所定义的化合物和至少一种赋形剂的组合物，优选所 述组合物适用于局部给药，优选在关节注射或局部经皮给药。
13.如权利要求12所述的组合物，还包含免疫抑制剂和/或炎症抑制性试剂。
14.如权利要求1-11中任一项所述的化合物或权利要求12-13中任一所述的组合物， 作为药物的用途，其中所述药物优选用于预防、延缓和/或治疗自身免疫性病症，优选其中 所述自身免疫性病症为RA。
15.如权利要求1-11中任一项所述的化合物或权利要求12-14中任一所述的组合物在 制备用于预防和/或治疗自身免疫性病症的药物中的用途，优选其中所述自身免疫性病症 为RA0
全文摘要
本发明涉及PAD抑制剂，其适宜用作抗自身免疫性疾病例如RA的药物。
文档编号A61K38/17GK102105486SQ200980129510
公开日2011年6月22日 申请日期2009年6月15日 优先权日2008年6月16日
发明者宙斯弗·玛丽亚·亨德瑞克·拉茨, 弗劳瑞斯·佩特鲁斯·约翰尼斯·泽欧德路斯·陆特耶斯, 格拉尔德乌斯·宙斯弗·玛丽亚·普瑞京, 理查德·翰恩瑞克·布拉奥弗, 简·沃特·德瑞杰福特 申请人:智拉力克斯公司, 莫迪奎斯特公司, 莱顿教学医院