一种小鼠酪氨酸羟化酶启动子及其重组表达载体的利记博彩app

专利名称：一种小鼠酪氨酸羟化酶启动子及其重组表达载体的利记博彩app
技术领域：
本发明属于基因工程领域，涉及一种小鼠酪氨酸羟化酶启动子及其重组表达载体。
背景技术：
真核生物基因的表达受到转录前、转录水平、转录后加工、转运、翻译水平以及蛋白 活性的调控，其中转录水平的调控是基因表达中最基本最重要的环节，启动子是基因表达 所必需的，决定了目的基因表达的空间、时间和表达的强度。启动子是人们利用基因工程 和转基因技术定向改造动物的重要限制因素，也是决定目的基因在细胞特异性或组织特异 性靶向治疗的重要环节。
目前大多数神经系统疾病治疗基因的载体携带启动子多为病毒启动子，主要有
cytomegalovirus(CMV)、 SV40 early (simian virus-40)、 Rous sarcoma virus(RSV)启动子。它 们能驱使外源基因在大多数转染的细胞中表达，但无细胞和组织特异性。
酪氨酸羟化酶(Tyrosine Hydroxylase, TH)是儿茶酚胺类物质合成的限速酶。TH表 达的水平和活性直接影响到细胞中儿茶酚胺的量，从而影响到许多重要的生理功能。在神 经系统发育和分化过程中，TH在多重机制的作用下，以组织特异型方式表达。TH主要 分布在黑质致密部、腹侧背盖区、下丘脑、嗅球的多巴胺能神经细胞中，和蓝斑部位、侧 盖系统的去甲肾上腺素能神经细胞以及脑干的肾上腺能神经细胞中。TH在脑内的分布， 显示不同细胞中TH基因表达的量不同，且存在不同的转录调控机制。
小鼠钙结合蛋白D28k(CalbindinD-28k， CaBP)是EF臂钙结合蛋白家族的成员之一， 广泛分布于神经系统。CaBP作为一种钙离子快速缓冲蛋白，通过对各种生物化学信号的 反应，与钙离子结合，来限制细胞内游离钙离子浓度的过度升高；CaBP还可以作为酶激 活剂激活Ca2+-ATP酶来调节钙离子的浓度，以及通过调节离子通道来促进钙离子的扩散, 在神经元细胞出现长时间高强度神经活动时保护细胞免受钙超载的损害等。20世纪80年 代后期，在帕金森病(Parkinson's disease, PD)研究中发现PD患者中脑黑质致密部 尚存少量抗变性能力很强的多巴胺(Dopamine, DA)神经元细胞，而这些DA神经元细胞的一个共同的特征是它的胞内都含CaBP。研究表明Cfl/W"&72D-2狄过量表达，能降低神经元细胞内钙离子浓度，对缺血状态下的神经元细胞起保护作用，并且能够促进神经元细胞轴突生长和增加其长度，还可以通过caspse-3、钙离子介导死亡信号通路和p38信号通路保护细胞、抑制细胞凋亡。而细胞凋亡是包括PD在内的多种神经退性疾病中神经元细胞的最终归属。因此，调控外源性Ca/Wm^ D-2狄在DA神经细胞内过表达将是开展PD防治的重要手段。

发明内容
本发明的目的是提供一种小鼠酪氨酸羟化酶启动子及其重组表达载体。本发明的另一目的是提供含有该启动子的重组表达载体在调控目的基因在多巴胺神经细胞内特异性表达中的应用。
一种小鼠酪氨酸羟化酶启动子，其特征在于它们具有序列表SEQ IDNO.l或SEQ IDN0.2所示的核苷酸序列。将具有序列表SEQ IDNO.l所示的核苷酸序列的启动子命名为THP1;将具有序列表SEQ IDNO.2所示的核苷酸序列的启动子命名为THP2。
含有启动子THPi或THP2的重组表达载体。
其中，重组载体pTHP!或pTHP2是由THP!或THP2取代pcDNA3质粒中CMV启动子所得。该重组表达载体具有真核细胞组织特异性，能调控EGFP报告基因或其他目的基因在多巴胺能神经细胞中特异性表达。
其中重组表达载体pTHPrCB或pTHP2-CB是在pTHPi或pTHP2中THPi或THPz序
列下游的多克隆位点插入07/W"^" D-2狄基因序列所得。该重组表达载体具有真核细胞
组织特异性，能调控小鼠钙结合蛋白Ca/W"&力Z)-2SA:基因在多巴胺能神经细胞中特异性表达。
所述含有THPi、 THP2启动子的重组表达载体在调控目的基因在DA神经细胞内特异性表达中的应用。
所述重组表达载体pTHPl-CB或pTHP2-CB在制备抗DA神经细胞凋亡药物中的应用。
本发明的有益效果
调控外源基因在特定组织细胞内稳定表达是开展基因治疗和转基因动物制备的重要
4前提，我们用分子生物学手段克隆出的THPi、 THP2启动子具有特异性调控靶基因在多巴胺能神经细胞中表达的能力，体外实验显示THP卜THP2组织特异性，能够调控报告基因在多巴胺能神经细胞内表达，报告基因在多巴胺能神经细胞内表达率分别为8.01%、7.97%，而在非多巴胺神经细胞报告基因在细胞内表达率却只有1.02%、 0.89%。中脑黑质致密部多巴胺神经细胞退行性病变是造成PD主要原因之一，目前，各种常规治疗效果有限，基因治疗是治疗PD—个新的有效手段，基因治疗一个关键因素就是保证目的基因在特定多巴胺能神经细胞内表达又不影响其他细胞生理功能，从而维持黑质致密部多巴胺神经细胞正常生理功能。THP!、 THP2将能够特异性调控Cfl/W"d""-2狄基因、细胞因子和神经营养因子基因在多巴胺能神经细胞内表达，达到治疗PD目的。同时，我们克隆THP"THP2方法和思路也将对其它启动子研究提供帮助。
CaBP对DA神经细胞具有保护作用，提高DA祌经细胞内CaBP水平，能够保护细胞免受钙超载的损害、抑制细胞凋亡。我们构建pTHP2-CB重组表达载体使用THP启动子调控外源性Ca/6/"^w D-2欣表达，与对照组相比能显著提高细胞内CaBP水平，从而抑制神经细胞的凋亡。pTHP2-CB直接进行脑内转染(或病毒包装转染)将能提高黑质致密部DA神经细胞内CaBP水平，为开展PD防治研究提供了一个有效的手段。另夕卜，细胞内CaBP水平提高，将可能引起其它相关细胞因子表达量的改变，这将为我们深入研究PD发病机制提供新的平台，同时也为治疗PD药物研究提供新的靶点。


图lpTHP^ pTHP2、 pTHP3、 pTHP4、 pTHPs双酶切鉴定电泳图
1泳道为pTHP5双酶切条带，2泳道pTHP4为双酶切条带，3泳道pTHP3为双酶切条带
4泳道pTHP2为双酶切条带，5泳道为pTHPl双酶切条带，6泳道为Mark。
图2 pTHPl-EGFP转染MN-9D细胞EGFP表达结果图3 pTHP2-EGFP转染MN-9D细胞EGFP表达结果图
图4 pTHP3-EGFP转染廳-9D细胞EGFP表达结果图
图5 pTHP4-EGFP转染MN-9D细胞EGFP表达结果图
图6 pTHP5-EGFP转染MN-9D细胞EGFP表达结果图
图7 pTHPl-EGFP、pTHP2-EGFP、pTHP3-EGFP、pTHP4陽EGFP、pTHP5-EGFP转染顧-9D细胞EGFP表达率统计结果图
图8 pTHPl-EGFP转染ECV细胞EGFP表达结果9 pTHP2-EGFP转染ECV细胞EGFP表达结果10 pTHP3-EGFP转染ECV细胞EGFP表达结果11 pTHP4-EGFP转染ECV细胞EGFP表达结果12 pTHP5-EGFP转染ECV细胞EGFP表达结果图
图13 pTHPl-EGFP、pTHP2-EGFP、pTHP3-EGFP、pTHP4-EGFP、pTHP5-EGFP转染MN-9D
细胞EGFP表达率统计结果图
图14重组表达载体pTHP2-CB的物理图谱
图15 THP2启动子调控外源性Ca/Wnd力￡>-2狄在多巴胺能神经细胞中表达。图16 MN-9D细胞+6-OHDA后细胞凋亡图其中，箭头所指向的是凋亡细胞
图17未经6-OHDA处理正常MN-9D细胞细胞凋亡图其中，箭头所指向的是凋亡细胞
图18转染pTHP2-CB的MN9D细胞+6-OHDA细胞凋亡图其中，箭头所指向的是凋亡细胞
图19转染pcDNA3-EGFP的MN9D细胞+6-OHDA细胞凋亡图其中，箭头所指向的是凋亡细胞图20 MN-9D细胞凋亡结果统计图
具体实施例方式
实施例l THP1、 THP2、 THP3、 THP4、 THP5启动子序列克隆
以成年C57BL/6J小鼠尾巴为实验材料，提取其基因组DNA并以其为模板，参照GenBank中TH基因5'段序列(编号AF415235)，设计5对特异性引物，并在引物上、下游5'端分别加入限制性内切酶BamH I和HindIII酶切位点，PCR扩增出3650bp、2379bp、 2000bp、 1500bp、 450bp序列THP1、 THP2、 THP3、 THP4、 THP5 (Prime STARTTMHS DNA Polymerase来自TaKaRa公司)。其中，用于扩增THP1、 THP2、 THP3、 THP4、THP5的上游引物序列分别为SEQ ID N0.7、 SEQ ID N0.8、 SEQ ID N0.9、 SEQ ID NO.IO、说明书第5/15页
SEQIDNO.ll，用于扩增THP1、 THP2、 THP3、 THP4、 THP5的下游引物序列均为SEQIDN0.12。 PCR反应体系为50ul: 5 XPrimeSTAR Buffer(Mg2+pIus)10ul、 dNTP Mixture4ul、上游引物(10uM)lul、下游引物(10uM)lul、 DAN0.5ul、 PrimeSTARTMHS 0.5ul、双蒸水35ul。 PCR反应循环参数98°C 2min, 98°C IOS、 50°C 15S、 68°C 0. 5 4min，进行30个循环，68°C 10min， 4'C保存。PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测并用胶回收试剂盒回收(QIAquick Gel Extraction Kit来自Qiagen公司)，回收片段送上海生工公司测序，THP1 、 THP2、 THP3、 THP4、 THP5序列分别为SEQ ID NO.l 、 SEQ ID N0.2、 SEQ ID NO.3 、SEQ ID NO.4、 SEQIDN0.5。
实施例2重组表达载体pTHP。 pTHP2、 pTHP3、 pTHP4、 pTHP5的构建
将质粒pcDNA3 (Invitrogen公司)用内切酶BgLlI和HindIII双酶切(上海生工公司)切除pcDNA3质粒中CMV启动子，同时用Hindffl、 BamH I (上海生工公司)分别双酶切克隆的5个THP启动子序列，酶切产物回收，用T4DNA连接酶(上海生工公司)分别连接pcDNA3酶切后的线性片段和上述5个THP启动子序列双酶切产物，得重组表达载体分别命名为pTHP卜pTHP2、 pTHP3、 pTHP4、 pTHP5。该五个重组表达质粒分别转化DH5a感受态细胞(Invitrogen公司)，挑取阳性单克隆，按照《分子克隆实验指南》进行转化。少量质粒制备，用SVMiniprepsDNApurification system (Promega公司)提取质粒，HindIII、 Sspl (上海生工公司)双酶切鉴定，见图l。实施例3报告基因EGFP表达载体的构建
HindIII、 Not I (上海生工公司)双酶切pEGFP-Nl质粒(Invitrogen公司)，回收EGFP片段，继续用Hindin、 Notl分别双酶切实施例2中获得的上述5个重组表达载体，回收线性片段，分别用T4DNA连接酶与EGFP片段连接，连接产物转化DH5a感受态细胞，挑取阳性单克隆，提取质粒，HindIII、 Notl双酶切鉴定。重组表达载体命名为pTHPl國EGFP、 pTHP2-EGFP、 pTHP3-EGFP、 pTHP4-EGFP、 pTHP5-EGFP。实施例4 THP启动子片段特异性调控能力测定
用EndoFree Plasmid Maxi Kit (Qiagen公司)大提5个上述重组表达载体，大提质粒制备方法参照《分子克隆实验指南》，并分别用LipofectaminTM2000 Reagent (invitrogen公司)转染MN-9D细胞(多巴胺能神经细胞)、ECV细胞(非多巴胺能神经细胞)。转染48h后，流式细胞仪检测表达EGFP细胞数。结果显示5个THP启动子片段均能调控EGFP报告基因在MN-9D细胞中表达，表达率无明显差异；ECV细胞中，3650bp、2400bp启动子片段调控EGFP在ECV细胞中表达能力很弱与其它3个THP片段调控能力相比差异极显著，见图2 图13。从而证明长度为3650bp、 2379 bp的THP1、 THP2启动子片
段具有特异性调控靶基因能力。
实施例5 Oz/Z)/wA力￡>-2战基因表达载体pTHP2-CB的构建和体外表达
根据GenBank中C"/6/"&w "-2狄cDNA序列(编号AK002635)设计一对引物，在上、下游引物5'端分别加入限制性内切酶HindIII和NotI酶切位点，上游引物序列为SEQ ID N0.13,下游引物序列为SEQ ID N0.14。取小鼠脑组织提取总mRNA(Trizol —步法)，Promega公司二步法试剂盒进行RT-PCR扩增出Ca/6/w&" i)-2战基因cDNA序列，送上海生工公司测序，其序列为SEQIDN0.6。 RT-PCR反应体系5XBuffer8wl、 dNTPs4ul、上游引物(10uM) lul、下游引物(10uM)lul、 RT反应产物1 iU 、 Taq聚合酶0.5 U 1、无酶水34.5 lU。反应循环参数98°C 2min ; 98°C 15s， 57°C 15s， 68°C lmin;循环
30次；68。C10min， 4°C保存。
按照实施例3步骤，用上述RT-PCR所扩增的Ca版"&" Z)-2狄基因cDNA序列取代重组pTHPrEGFP中EGFP片段，构建重组表达质粒pTHP2-CB (图14)。 HindIII、 NotI双酶切鉴定后，Lipofectamin TM2000 Reagent脂质体法转染MN-9D细胞，按照下列步骤进行免疫沉淀法测定C"版m/i" Z)-2S基因cDNA表达(图15):收集正常MN-9D细胞和转染脂质体质粒的MN-9D细胞，消化裂解，取上清用Lowry法测定总蛋白浓度。牛血清白蛋白为标准品。样品分别取含400ug蛋白的提取液，加入320W IP buffer 、 5pl20薩ol/LDTT及6|xl CaBP抗体(一抗，Sigma公司)，平缓旋转混匀4'C过夜。加入20^1proteinA/G旋转混匀4°C 2小时，4。C离心，沉淀用IPbuffer进行充分洗涤3次。免疫沉淀复合物加蛋白处理液，IOO'C， 5min处理后按照6"i/等方法(Gu Z, Jiang Q, and ZhangG. c-Jun N-terminal kinase activation in hippocampal CA1 region was involved inischemic injury. Neuror印ort， 2001, 12: 897-900)用等量蛋白样品进行SDS-PAGE电泳分离后，转移至NC膜上，转移后的NC膜经5y。脱脂奶粉封闭后加入兔抗鼠CaBP单克隆抗体(1:2000) ，4'C过夜。用washing buffer(5minx3次)洗膜，加入羊抗兔IgG-AP( Sigma公司)，室温反应2h。同上洗膜。以NBT/BCIP显色，水洗终止反应。
8Hoechst (Sigma公司)染色法测定转染pTH-CB质粒后，MN-9D细胞抗凋亡情况(图6):MN-9D细胞以2x105密度接种到24孔板，细胞密度达到60%;用pTH2-CB和pcDNA3两种质粒脂质体转染MN-9D细胞；24h后，加入200nmol/L 6-OHDA，作用30min后，用无血清培养基冲洗两遍，换新全培养基培养12h后去除培养基，迅速加250)Lil新鲜的3.7%甲醛固定细胞，室温条件下孵育20min;用PBS冲洗细胞，避光加入Hoechst染料10min，吸去染料，荧光显微镜照相，显微镜下统计染色细胞数，结果见图16 图20。
结果显示pTHP2-CB表达载体能够表达CaBP，表达的CaBP具有抗凋亡能力。<110〉朱孝荣、高殿帅、虞正权
〈120〉一种小鼠酪氨酸羟化酶启动子及其重组表达载体<160> 14
<210〉 1
<211> 3650
〈212> DNA〈213〉人工序列<220〉
<223〉 THPi小鼠酪氨酸羟化酶启动子序列
〈400〉 1
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<210> 4〈211〉 1500〈212〉 DNA<213>人工序列<220>
〈223〉 THP4小鼠酪氨酸羟化酶启动子序列〈400〉 4
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1080
1140
1200
1260
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1500
<210> 5〈211〉 450〈212〉 DNA〈213>人工序列<220〉
〈223> THP5小鼠酪氨酸羟化酶启动子序列<400> 5
aagctagtga gagggctcct agatttattt gtctccaaggcatgaaccct tgggtaatcc agcatgggcg ctcccatatgtctagatgtc tcctgtccca gaacaccagc cagcccctgtggagggtgat tc卿ggcag gtgctgcgac agtggatgcaggctctctcg tccgtcgccc tcgctctgtg cccacccccgcgtgg卿gg atgcgcagga ggtaggaggt gggggacccatggcctttaa gaggccgcct gcctggcaag ggctgtggagcttgcactat gcccaccccc agcgcctcct
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〈210〉 6<211〉 783<212>腿〈213〉人工序列〈220〉
<223>小鼠C"/W"&" Z)-2狄基因cDNA序列<400> 6
atggcagaat cccacctgca gtcatctctg atcacagcct cacagttttt tgagatctgg 60
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gatggcaacg gatacataga tgaaaatgag ctggatgctt tgctgaaaga tctgtgtgag 660
aagaacaaac eiggasttgga tattaacaat attactacat acaagaagaa catsatggcc 720
ttgtcggatg gagggaagct gtaccgaaca gaccttgctc ttattctttc tgctggagac 780aac 783
〈210〉 7<211〉 31<212〉腿〈213〉人工序列<220〉
〈223〉 THP!上游引物序列<400〉 7
ctaggatccc gacagtggat gcaattagat c 31
〈210〉 8<211> 31〈212〉腿<213>人工序列〈220〉
<223> THP2上游引物序列<400〉 8
ctaggatccg a卿gggctg ggtctggtaa g 31
〈210〉 9<211> 31〈212〉 DNA
15〈213〉人工序列<220〉
<223〉 THP3上游引物序列<400〉 9
ctaggatccg tggtgggcat gcagacctag g 31
<210〉 10<211> 32〈212> DNA〈213>人工序列<220〉
〈223> THP4上游引物序列<400〉 10
ctaggatccg atcttggcac agtgtggtct ac 32
<210> 11<211〉 31<212> DNA〈213〉人工序列<220>
〈223〉 THP5上游引物序列<400> 11
ctaggatcaa tgattggtat ggctggggtc c 31
〈210〉 12〈211〉 32〈212〉腿<213〉人工序列<220>
〈223〉 THP" THP2、THP3、 THP4、 THPs下游引物序列<400〉 12
agcaagctta gctggtggtc ccgagttctg tc 32
〈210〉 13〈211> 35〈212〉 DNA〈213>人工序列<220>
<223>小鼠Ca版mftw D-2狄基因cDNA序列上游引物序列〈400〉 13
agcaagctta ccatggcaga atcccacctg cagtc 35〈210〉 14<211〉 37〈212〉 DNA<213〉人工序列〈220〉
<223〉小鼠C"版"J/" D-2狄基因cDNA序列下游引物序列〈400〉 14
acgcggccgc ctagttgtct ccagcagaaa gaataag 3权利要求
1、一种小鼠酪氨酸羟化酶启动子，其特征在于它具有序列表SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
2、 含有权利要求l所述启动子的重组表达载体。
3、 根据权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于该重组表达载体是由权利要求l所 述的小鼠酪氨酸羟化酶启动子取代pcDNA3质粒中CMV启动子所得。
4、 根据权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于该重组表达载体是由权利要求1所 述的小鼠酪氨酸羟化酶启动子取代pcDNA3质粒中CMV启动子，并在该小鼠酪氨酸羟化 酶启动子下游的多克隆位点插入C"/6/"d"D-2战基因序列所得。
5、 权利要求2或3所述重组表达载体在调控目的基因在多巴胺神经细胞内特异性表达中 的应用。
6、 权利要求4所述表达载体在制备抗多巴胺神经细胞凋亡药物中的应用。
全文摘要
本发明属于基因工程领域，公开了一种小鼠酪氨酸羟化酶启动子及其重组表达载体。所涉及的启动子THP₁、THP₂是从小鼠酪氨酸羟化酶基因5′端序列中筛选得到3650bp、2379bp 2个核苷酸序，含启动子THP₁、THP₂的重组表达载体可应用于调控目的基因在多巴胺能神经细胞内特异性表达。以THP₁、THP₂为启动子，小鼠钙结合蛋白D28k基因为靶基因，质粒pcDNA3为出发质粒构建了重组表达载体pTHP₂-CB，该载体能够在多巴胺能神经细胞中特异性表达小鼠钙结合蛋白D28k，所表达的蛋白具有抗细胞凋亡作用，可在制备抗DA神经细胞凋亡药物中的应用。
文档编号A61K48/00GK101671673SQ200910232900
公开日2010年3月17日 申请日期2009年10月21日 优先权日2009年10月21日
发明者朱园园, 朱孝荣, 虞正权, 袁红花, 高殿帅, 高秀先 申请人:朱孝荣;高殿帅;虞正权