结合人TNFα的人抗体的利记博彩app

专利名称：：结合人TNFα的人抗体的利记博彩app结合人TNFci的人抗体本申请是申请日为1997年2月10号，申请号为97193635.8的发明名称为"结合人TNFa的人抗体"的发明专利申请的分案申请。
背景技术：
：肿瘤坏死因子a(TNFa)是由许多细胞类型(包括单核细胞和巨噬细胞)产生的细胞因子，其原始鉴定是基于其诱导某些小鼠肿瘤坏死的能力(参见例如Old，L.(1985)Science，630-632)。随后，一个与恶病质相关的名称为恶病质素的因子表明是与TNFa相同的分子。据信TNFa参与介导休克(参见例如Beutler，B.和Cerami，A.(1988)An皿.Rev.Biochem.^2:505-518;Beutler，B.禾口Cerami，A.(1988)An皿.Rev.Immunol.工625-655)。另外，据信TNFa参与各种各样的其它人类疾病和紊乱的病理生理学，包括脓毒症、感染、自身免疫疾病、移植物排斥和移植物抗宿主病(参见例如Moeller，A.等(1990)Cytokine^:162-169;Moeller等的美国专利5，231，024号；Moeller，A.等的欧洲专利公开260610Bl号，Vasilli，P.(1992)An皿.Rev.Immunol.盖:411-452;Tracey，K.J.和Cerami，A.(1994)An皿.Rev.Med.^:491-503)。由于人TNFa(hTNFa)在各种各样的人体素乱中的有害作用，已设计治疗策略以抑制或抵消hTNFa的活性。特别是，已寻找与hTNFa结合或中和hTNFa的抗体做为抑制hTNFa活性的手段。一些最早的这种抗体是由用hTNFa免疫的小鼠的淋巴细胞制备的杂交瘤分泌的小鼠单克隆抗体(mAbs)(参见例如HahnT;等，(1985)ProcNatlAcadSciUSA^:3814-3818;Liang，C_M.等(1986)Biochem.Biophys.Res.Co匪n.137:847-854;Hirai，M.等(1987)J.Immunol.Methods巡57-62;Fendly，B.M.等(1987)Hybridoma&:359-370;Moeller，A.等(1990)Cytokine2:162-169;授予Moeller等的美国专利5，231，024号；Wallach，D.的欧洲专利公开186833Bl号；01d等的欧洲专利申请公开218868A1号；Moeller，A.等的欧洲专利公开260610Bl号)。虽然这些小鼠抗hTNFa抗体经常展示与hTNFa的高亲和力(例如Kd《10—9M)并能够中和hTNFa活性，但它们的体内使用受与给与人类小鼠抗体相关的问题所限制，所述问题例如为血清半衰期短、不能触发某些人体效应物的功能和引出不想要的人体内抗该小鼠抗体的免疫应答("人抗鼠抗体"(HAMA)反应)。为试图克服与在人体内使用全鼠抗体相关的问题，已对鼠抗hTNFa抗体进行遗传工程使其更"人类化"。例如，已制备嵌合抗体，其中抗体链的可变区为鼠源，而抗体链的恒定区为人源(Knight，D.M等(1993)Mol.Immunol.巡1443-1453;Daddona，P.E.等的PCT公开W092/16553号)。另外，也已制备人化抗体，其中所述抗体可变区的超变域为鼠源，但所述可变区的其余部分和所述抗体恒定区为人源(Adair，J.R.等的PCT公开WO92/11383号)。然而，因为这些嵌合抗体和人化抗体仍然保留一些鼠序列，因此它们仍然可能引出不想要的免疫反应，即人抗嵌合抗体(HACA)反应；特别是当长期给药时，例如用于慢性适应症，例如类风湿性关节炎(参见例如Elliott,M.J.等(1994)Lancet344:1125-1127;Elliot,M.J.等(1994)Lancet344:1105-1110)。优于鼠mAbs或其衍生物(例如嵌合抗体或人化抗体)的hTNFa抑制剂可以是完8全人类抗hTNFa抗体，因为这种药剂甚至在长期给与时也不会引起该HAMA反应。已使用人类杂交瘤技术制备了抗hTNFa人单克隆自身抗体(Boyle，P.等(1993)Cell.Immunol.152:556-568;Boyle，P.等(1993)Cell.Immunol.152:569-581;Boyle等的欧洲专利申请公开614984A2号)。然而，据报道这些杂交瘤来源的单克隆自身抗体对hTNFa的亲和性太低，以致于不能用常规方法计算，不能结合可溶性hTNFa并且不能中和hTNFa诱导的细胞毒性(参见Boyle等；见上述)。另外，人杂交瘤技术的成功取决于产生hTNFa特异性自身抗体的淋巴细胞在人外周血中的自然存在。某些研究已在人类对象中检测到抗hTNFa血清自身抗体(Fomsgaard，A.等(1989)Scand.J.Immunol.巡219-223;Bendtzen，K.等(1990)Prog.LeukocyteBiol.遍447-452)，而其它的研究未检测到(Leusch，H_G.等(1991)J.Immunol.Methods里145-147)。除自然发生的人抗hTNFa抗体之外的另一选择是重组hTNFa抗体。已描述了以相对低亲和性(即Kd10—7M)和快解离速率(即K。ff10—2秒—0结合hTNFa的重组人抗体(Griffiths,A.D.等(1993)EMB0J.11:725-734)。然而，由于它们的相对快速解离的动力学，这些抗体可能不适于治疗用途。另外，已描述了一种重组人抗hTNFa，它不中和hTNFa活性，却增强hTNFa与细胞表面的结合并增强hTNFa内在化(Lidbury，A.等(1994)Biotechnol.Ther.5:27-45;Aston，R.等的PCT公开W092/03145号)。因此，仍然需要以高亲和性和慢解离动力学地结合可溶性hTNFa并具有中和hTNFa活性包括hTNFa诱导的细胞毒性(体外和体内)和hTNFa诱导的细胞激活的能力的人抗体，诸如重组人抗体。发明概要本发明提供特异性与人TNFa结合的人抗体，最好是重组人抗体。本发明抗体的特征为高亲和性和慢解离动力学地与hTNFa结合和中和hTNFa的活性，包括hTNFa诱导的细胞毒性(体外和体内)和hTNFa诱导的细胞激活。本发明抗体的其它特征为与hTNFa而非hTNFP(淋巴细胞毒素)结合并具有与除人TNFa之外的其它灵长类TNFa和非灵长类TNFa结合的能力。本发明的抗体可以是全长的(例如IgGl或IgG4抗体)或可以仅包含抗原结合部分(例如Fab、F(ab')2或scFv片段)。本发明最优选的重组抗体D2E7称为D2E7，有一包含SEQIDNO:3的氨基酸序列的轻链CDR3域和一包含SEQIDNO:4的氨基酸序列的重链CDR3域。该D2E7抗体最好具有包含SEQIDNO:1的氨基酸序列的轻链可变区(LCVR)和包含SEQIDNO:2的氨基酸序列的重链可变区(HCVR)。在一个实施方案中，本发明提供分离的人抗体或其抗原结合部分，它以不高于1X10—8M的Kd和不高于1X10—3广的K。ff速率常数(均由表面等离子体激元共振测定)与人TNFa解离，并在标准体外L929检测中以不高于1X10—7M的ICs。中和人TNFa细胞毒性。该分离的人抗体或其抗原结合部分更优选地以不高于5X10—4s—^甚至更优选地以不高于1X10—V—1的K。ff与人TNFa解离。更优选的是，在标准体外L929检测中以不高于1X10—8M、甚至更优选地以不高于1X10—9M、甚至再更优选地以不高于5X10—"M的ICs。中和人TNFa细胞毒性。在另一实施例中，本发明提供具有以下特征的人抗体或其抗原结合部分a)以不高于1X10—3s—1的U由表面等离子体激元共振测定)与人TNFa解离；b)具有一轻链CDR3域，该域包含SEQIDNO:3的氨基酸序列，或通过于位置1、4、5、7或8的单丙氨酸置换或通过于位置1、3、4、6、7、8和/或9的1_5个保守氨基酸置换从SEQIDIDNO:3修饰的氨基酸序列；c)具有一重链CDR3域，该域包含SEQIDNO:4的氨基酸序列，或通过于位置2、3、4、5、6、8、9、10或11的单丙氨酸置换或通过于位置2、3、4、5、6、8、9、10、11和/或12的1_5个保守氨基酸置换从SEQIDN0:4修饰的氨基酸序列。更优选的是，该抗体或其抗原结合部分以不高于5X10—4s—1的K。ff与人TNFa解离。再更优选的是，该抗体或其抗原结合部分以不高于1X10—4s—1的K。ff与人TNFa解离。在再一实施方案中，本发明提供人抗体或其抗原结合部分，其LCVR具有的CDR3域包含SEQIDN0:3的氨基酸序列、或通过于位置1、4、5、7或8的单丙氨酸置换从SEQIDN0:3修饰的氨基酸序列，其HCVR具有的CDR3域包含SEQIDNO:4的氨基酸序列、或通过于位置2、3、4、5、6、8、9、10或11的单丙氨酸置换从SEQIDNO:4修饰的氨基酸序列。更优选地，该LCVR另外具有包含SEQIDN0:5的氨基酸序列的CDR2域，并且该HCVR另外具有包含SEQIDNO:6的氨基酸序列的CDR2域。再更优选地，该LCVR另外具有包含SEQIDNO:7的氨基酸序列的CDR1域，并且该HCVR具有包含SEQIDNO:8的氨基酸序列的CDR1域。在再一实施方案中，本发明提供具有包含SEQIDNO:l的氨基酸序列的LCVR和包含SEQIDNO:2的氨基酸序列的HCVR的分离人抗体或其抗原结合部分。在某些实施方案中，该抗体具有一IgGl重链恒定区或一IgG4重链恒定区。在其它实施方案中，该抗体是一Fab片段、一F(ab')2片段或一单链Fv片段。在另一些实施方案中，本发明提供抗体或其抗原结合部分，其LCVR具有选自以下氨基酸序列的一个CDR3域SEQIDNO:3、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO:26或其HCVR具有选自以下氨基酸序列的一个CDR3域SEQIDNO:4、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29、SEQIDNO:30、SEQIDNO:31、SEQIDNO:32、SEQIDNO:33、SEQIDNO:34禾卩SEQIDNO:35。在再一实施方案中，本发明提供中和人TNFa而非人TNFP(淋巴细胞毒素)活性的分离人抗体或其抗原结合部分。在一最佳实施方案中，该人抗体或其抗原结合部分中和人TNFa、黑猩猩TNFa和选自以下的至少一种其它的灵长类TNFa的活性狒狒TNFa、狨TNFa、猕猴TNFa和恒河猴TNFa。最好是，该抗体亦中和至少一种非灵长类TNFa的活性。例如，在一分实施方案(subembodiment)中，该分离人抗体或其抗原结合部分亦中和犬TNFa的活性。在另一分实施方案中，该分离人抗体或其抗原结合部分亦中和猪TNFa的活性。在再一分实施方案中，该分离人抗体或其抗原结合部分亦中和小鼠TNFa的活性。本发明的另一方面涉及编码本发明抗体或其抗原结合部分的核酸分子。本发明优选的核酸分子编码D2E7LCVR，具有图7和SEQIDNO:36所示的核苷酸序列。本发明的另一优选核酸分子编码D2E7HCVR，具有图8和SEQIDNO:37所示的核苷酸序列。本发明亦包含携带本发明抗体编码核酸的重组表达载体、导入这种载体的宿主细胞，也包括通过培养本发明的宿主细胞制备本发明的抗体的方法。本发明的再一方面涉及使用本发明的抗体或其抗原结合部分抑制人TNFa活性的方法。在一个实施方案中，该方法包括用本发明的抗体或其抗原结合部分接触人TNFa，使得抑制人TNFa活性。在另一实施方案中，该方法包括将本发明的抗体或其抗原结合部分给与患病(其中TNFa活性是有害的)的人类受治疗者，使得抑制该人类受治疗者中的人TNFa活性。该疾病可以是例如脓毒症、自身免疫疾病(例如类风湿性关节炎，变态反应，多发性硬化，自身免疫性糖尿病，自身免疫性眼色素层炎和肾病综合症)、传染性疾病、恶性肿瘤、移植物排斥或移植物抗宿主病、肺功能紊乱、骨疾病、肠功能紊乱或心脏功能紊乱。附图简述图1A和IB展示了下述的氨基酸序列D2E7的轻链可变区(D2E7VL;亦示于SEQIDNO:1)、D2E7VL的丙氨酸扫描突变体(LD2E7*.Al、LD2E7*.A3、LD2E7*.A4、LD2E7*.A5、LD2E7*.A7和LD2E7*.A8)、D2E7相关抗体2SD4的轻链可变区(2SD4VL;亦示于SEQIDNO:9)和其它D2E7相关轻链可变区(EPB12、VL10E4、VL100A9、VL100D2、VL10F4、L0E5、VLL0F9、VLL0F10、VLL0G7、VLL0G9、VLL0H1、VLL0H10、VL1B7、VL1C1、VL1C7、VL0.1F4、VL0.1H8、L0E7、L0E7.A和L0E7.T)。图1A展示所述FR1、CDR1、FR2和CDR2域。图1B展示所述FR3、CDR3和FR4域。所述轻链CDRl("CDRL1")、CDR2("CDRL2")和CDR3("CDRL3")域位于框内。图2A和2B展示了下述的氨基酸序列D2E7的重链可变区(D2E7VH;亦示于SEQIDNO:2)、D2E7VH的丙氨酸扫描突变体(HD2E7*.Al、HD2E7*.A2、HD2E7*.A3、HD2E7*.A4、HD2E7*.A5、HD2E7*.A6、HD2E7*.A7、HD2E7*.A8和HD2E7*.A9)、D2E7相关抗体2SD4的重链可变区(2SD4VH;亦示于SEQIDNO:10)和其它D2E7相关重链可变区(VHlBll、VH1D8、VH1A11、VH1B12、VH1-D2、VH1E4、VH1F6、VH1G1、3C-H2、VH1-D2.N禾口VH1-D2.Y)。图2A展示所述FR1、CDR1、FR2和CDR2域。图2B展示所述FR3、CDR3和FR4域。所述重链CDR1("CDRH1")、CDR2("CDRH2")和CDR3("CDRH3")域位于框内。图3是一曲线图，描述与鼠抗hTNFa抗体MAK195相比，由人抗hTNFa抗体D2E7对TNFa诱导的L929细胞毒性的抑制。图4是一曲线图，描述与鼠抗hTNFa抗体MAK195相比，由人抗hTNFa抗体D2E7对rhTNFa与U-937上的hTNFa受体结合的抑制。图5是一曲线图，描述与鼠抗hTNFa抗体MAK195相比，由人抗hTNFa抗体D2E7对TNFa诱导的ELAM-1在HUVEC上表达的抑制。图6是一柱状图表，描述与鼠抗hTNFa抗体MAK195(空心柱)相比，通过给与人抗hTNFa抗体D2E7(实心柱)保护D_半乳糖胺致敏小鼠免受TNFa诱导的致死性。图7展示D2E7的轻链可变区的核苷酸序列，在该核苷酸序列下是预期的氨基酸序列。在所述CDRLl、CDRL2和CDRL3区下划线。图8展示D2E7的重链可变区的核苷酸序列，在该核苷酸序列下是预期的氨基酸序列。在所述CDRHI、CDRH2和CDRH3区下划线。图9是一曲线图，描述D2E7抗体治疗对做为多关节炎模型的Tgl97转基因小鼠平均关节尺寸的影响。发明详述本发明涉及以高亲和性、低解离速率和高中和能力地与人TNFa结合的分离人抗体或其抗原结合部分。本发明的各个方面涉及抗体和抗体片段以及其药用组合物、以及制备这种抗体和片段的核酸、重组表达载体和宿主细胞。本发明亦包括用本发明的抗体检测人TNFa或在体外或体内抑制人TNFa活性。为更易理解本发明，首先定义某些术语。本文所用的术语"人TNFa"(本文縮写为hTNFa或简单地写为hTNF)是指以17kD分泌形式和26kD膜结合形式存在的人细胞因子，其生物学活性形式由非共价键连接的17kD分子的三聚体组成。hTNFa的结构另外描述于例如Pennica，D.等(1984)Nature312:724-729;Davis，J.M.等(1987)Biochemistry逃1322-1326;和Jones，E.Y.等(1989)Nature，225-228。术语人TNFa包括重组人TNFa(rhTNFa)，它可以通过标准重组表达方法制备或购买得到(R&DSystems,目录号210-TA,Minne即olis，MN)。本文所用的术语"抗体"是指免疫球蛋白分子，它们由四条多肽链组成，即由二硫键相互连接的二条重链(H)和二条轻链(L)。每条重链由重链可变区(本文简写为HCVR或VH)和重链恒定区组成。该重链恒定区由CH1、CH2和CH3三个结构域组成。每条轻链由轻链可变区(本文简写为LCVR或VL)和轻链恒定区组成。该轻链恒定区由一个结构域即CL组成。VH和VL区可以进一步划分为超变区，称为互补性决定区(CDR)，其间散布着更为保守的称为框架区(FR)的区域。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，它从氨基末端至羧基末端的排布顺序如下FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。本文所用的抗体的"抗原结合部分"(或简称为"抗体部分")指保留与抗原(例如hTNFa)特异性结合能力的抗体的一个或多个片段。已发现可以由全长抗体的片段行使抗体的抗原结合功能。在抗体的"抗原结合部分"术语中包括的结合片段的例子包括(i)一个Fab片段，由VL、VH、CL和CHl域组成的单价片段；(ii)一个F(ab')2片段，包含在铰链区由二硫桥连接的二个Fab片段的二价片段；(iii)一个Fd片段，由VH和CH1域组成;(iv)一个Fv片段，由抗体单臂的VL和VH域组成;(v)—个dAb片段(Ward等，(1989)Nature341:544-546)，由一个VH域组成;和(vi)一个分离的互补性决定区(CDR)。另外，尽管该Fv片段的二个结构域VL和VH由独立的基因编码，但可以采用重组方法用能使它们成为单蛋白链的合成接头将它们连接，在该单蛋白链中所述VL和VH区配对形成单价分子(已知为单链Fv(scFv);参见例如Bir等(1988)Science242:423-426:和Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA^:5879-5883)。这种单链抗体亦包含于术语抗体的"抗原结合部分"之中。亦包括其它形式的单链抗体，例如双抗体。双抗体是二价的双特异性抗体，其中VH和VL域表达于一个多肽单链上，但所用的接头太短使得同一链上的这二个结构域不能配对，因此迫使这些结构域与另一链的互补结构域配对而创造出二个抗原结合位点(参见例如Holliger，P.等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA巡6444-6448;Poljak，R.J.等(1994)Structure2:1121-1123)。另外，抗体或其抗原结合部分可以是一个较大的免疫粘附分子的一部分，该分子由该抗体或抗体部分与一个或多个其它蛋白或肽通过共价或非共价结合而形成。这种免疫粘附分子的例子包括用抗生蛋白链菌素核心区制备四聚体scFv分子(Kipriyanov，S.M.等(1995)HumanAntibodiesandHybridomas6:93-101)和使用半胱氨酸残基、标记肽和C末端多组氨酸标记制备二价生物素化scFv分子(Kipriyanov，S.M.等(1994)Mol.Immunol,^i:1047-1058)。可以采用常规技术例如用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶分别消化完整抗体，从完整抗体制备诸如Fab和F(ab')2片段的抗体部分。另外，可以按照本文描述的标准重组DNA技术获得抗体、抗体部分和免疫粘附分子。本文使用的术语"人抗体"包括具有得自人种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区的抗体。本发明的人抗体例如在CDR中和在CDR3中可以包括未被人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过体外随机或定点诱变或通过体内体细胞突变导入的突变)。然而，本文使用的术语"人抗体"不包括其中CDR序列得自其它哺乳动物种(例如小鼠)并已被移植至人框架序列的抗体。本文使用的术语"重组人抗体"包括通过重组方法制备、表达、创造或分离的所有人抗体，例如用转染至宿主细胞的重组表达载体表达的抗体(在以下第II节进一步描述)、从重组、联合人抗体文库中分离的抗体(在以下第III节进一步描述)、从用人免疫球蛋白基因转基因的动物(例如小鼠)分离的抗体(参见例如Taylor,L.D.等(1992)Nucl.AcidsRes.巡6287-6295)或通过涉及将免疫球蛋白基因序列剪接至其它DNA序列的任何其它方法制备、表达、创造或分离的抗体。这种重组人抗体具有得自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。然而，在某些实施方案中，对这种重组人抗体进行体外诱变(或使用人Ig序列转基因动物时为体内体细胞诱变)，因此所述重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是那些虽然得自人种系VH和VL序列并与之相关、但在体内的人抗体种系的所有组成部分中都不天然存在+的序列。本文使用的"分离抗体"是指大致不含具有不同抗原特异性的其它抗体的抗体(例如特异性结合hTNFa的分离抗体大致不含有与hTNFa之外的抗原特异性结合的抗体)。然而，与hTNFa特异性结合的分离抗体具有对其它抗原(例如来自其它种的hTNFa)的交叉反应性(在以下详细讨论)。另外，分离抗体可以大致不含其它细胞物质和/或化学物质。本文使用的"中和抗体"(或"中和hTNFa活性的抗体")是指与hTNFa结合导致hTNFa的生物学活性被抑制的抗体。这种对hTNFa生物学活性的抑制可以通过测定hTNFa生物学活性的一个或多个指标进行评价，所述指标例如hTNFa诱导的细胞毒性(或者体外或者体内)、hTNFa诱导的细胞激活和hTNFa与hTNFa受体的结合。可以通过本领域已知的一种或多种标准体外或体内检测评价这些hTNFa生物学活性指标(参见实施例4)。最好是，通过抑制hTNFa诱导的L929细胞的细胞毒性评价抗体中和hTNFa活性的能力。做为另一个或者二者择一的hTNFa活性指标，可以评价抗体抑制hTNFa诱导的ELAM-1在HUVEC上的表达的能力，做为hTNFa诱导的细胞激活的量度。本文使用的术语"表面等离子体激元共振"是指一光学现象，它允许通过例如使用BIAcore系会充(PharmaciaBiosensorAB，Uppsala，Sweden禾口Piscataway，NJ)检领lj在生物传感器基质中蛋白质浓度的改变进行实时生物特异性相互作用分析。有关进一步的描述，参见实施例1和Jnsson，U.等(1993)Ann.Biol.Clin,:19-26;J。llSSOn,U.等(1991)BiotechniquesU:620-627;Johnsson，B.等(1995)J.Mol.Recognit.§:125-131;和Johnnson，B.等(1991)Anal.Biochem.198:268-277。本文使用的术语"K。ff"是指抗体从所述抗体/抗原复合物解离的解离速率常数。本文使用的术语"Kd"是指特定抗体_抗原相互作用的解离常数。本文使用的术语"核酸分子"包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链或双链，但最好是双链DNA。本文使用的与编码结合hTNFa的抗体或抗体部分(例如VH、VL、CDR3)的核酸有关的术语"分离核酸分子"是指下述核酸分子，其中编码该抗体或抗体部分的核苷酸序列不含其它编码与hTNFa之外的抗原结合的抗体或抗体部分的核苷酸序列，所述其它序列可能在人基因组DNA中天然位于该核酸的侧翼。因此，例如编码抗TNFa抗体的VH区的本发明的分离核酸分子不含任何其它编码与TNFa之外的抗原结合的其它VH区的序列。本文使用的术语"载体"是指有能力运送与其连接的另一核酸的核酸分子。载体的一种类型是"质粒"，是指其中可以连接其它DNA片段的环状双链DNA环。载体的另一类型是病毒载体，其中在病毒基因组中可以连接其它DNA片段。某些载体能够在其导入的宿主细胞中自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和附加体哺乳动物载体)。其它载体(例如非附加体哺乳动物载体)可以在导入该宿主细胞时被整合入该宿主细胞的基因组，由此可以与该宿主基因组一起复制。另外，某些载体能够指导它们可操作地连接的基因的表达。这种载体在本文中称为"重组表达载体"(或简称为"表达载体")。一般而言，在重组DNA技术中使用的表达载体的常见形式为质粒。在本说明书中，可以将"质粒"和"载体"互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，本发明包括具有相同的功能的其它形式的表达载体，例如病毒载体(例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。本文使用的术语"重组宿主细胞"是指导入了重组表达载体的细胞。应理解这种术语不仅指特定的对象细胞，而且指这种细胞的后代。因为在后续世代中由于或者突变或者环境影响可能发生某些修饰，事实上这种后代可以与亲本细胞不同，但却仍然包含于本文使用的术语"宿主细胞"的范围之内。在下面的小节中更详细地描述本发明的各种方面。I.与人TNFa结合的人抗体本发明提供以高亲和性、低解离速率和高中和能力与人TNFa结合的分离人抗体或其抗原结合部分。本发明的人抗体优选地是重组的、中和人抗TNFa抗体。最优选的本发明重组中和抗体在本文中称为D2E7并具有图1A、1B和图2A、2B分别展示的VL和VH序列(D2E7VL区的氨基酸序列亦示于SEQIDNO:1;D2E7VH区的氨基酸序列亦示于SEQIDNO:2)。以下概述了与表现出高亲和性和低解离动力学的鼠抗hTNFaMAK195mAb和另一个与D2E7、2SD4有关的人抗hTNFa抗体相比的D2E7的结合特性K。ffK。nKd化学抗体S6C1M—Sec—1Mi十fiD2E7IgGl8.81X10—51.91X1056.09X10—101.22SD4IgG48.4X10—34.20X1052.00X10—80.8薩195F(ab，)28.70X10—51.90X1054.60X10—101.4在用几种体外和体内检测评价时，该D2E7抗体及其相关抗体亦表现出强大的中和hTNFa活性的能力(参见实施例4)。例如，这些抗体中和hTNFa诱导的L929细胞的14细胞毒性的IC5。值的范围为约10—7M至约10—1QM。当D2E7以全长IgGl抗体表达时，中和hTNFa诱导的L929细胞的细胞毒性的ICs。值的范围为约1.25X10—1QM。另外，当以Fab、F(ab'h或scFv片段表达该抗体时，保持D2E7的中和能力。D2E7亦抑制通过hTNFa诱导的ELAM-1在HUVEC上的表达测定的TNFa诱导的细胞激活(IC5。=约1.85X10—1QM)和hTNFa与U-937细胞上的hTNFa受体的结合(IC5。=约1.56X10—1QM)。关于后者，D2E7抑制hTNFa与p55和p75hTNFa受体的结合。另外，该抗体抑制hTNFa在小鼠体内诱导的致死性(ED5。=1-2.5iig/小鼠)。关于D2E7的结合特异性，该抗体与各种形式的人TNFa结合，包括可溶性hTNFa、跨膜hTNFa和结合至细胞受体的hTNFa。D2E7不特异性地与其它细胞因子结合，例如淋巴细胞毒素(TNFP)、IL-1a、IL-1P、IL_2、IL_4、IL_6、IL_8、IFNy和TGFP。然而，D2E7确实表现出对来自其它物种的肿瘤坏死因子的交叉反应性。例如，该抗体以与中和hTNFa大致相同的IC50值中和至少五种灵长类(黑猩猩、狒狒、狨、猕猴和恒河猴)TNFa的活性(参见实施例4，E小节)。D2E7亦中和小鼠TNFa的活性，尽管其效果比中和人TNFa低1000倍(参见实施例4，E小节)。D2E7亦结合犬和猪TNFa。在一个方面，本发明涉及D2E7抗体和抗体部分、D2E7相关抗体和抗体部分和其它具有与D2E7相同性质(例如以低解离动力学和高中和能力高亲和性地与hTNFa结合)的其它人抗体和抗体部分。在一个实施方案中，本发明提供分离人抗体或其抗原结合部分，它以不高于1X10—8M的Kd和不高于1X10—3s—1的K。ff速率常数(均由表面等离子体激元共振测定)与人TNFa解离，并在标准体外L929检测中以不高于1X10—7M的IC5。中和人TNFa细胞毒性。该分离人抗体或其抗原结合部分更优选地以不高于5X10—4s—^甚至更优选地以不高于1X10—V—1的K。ff与人TNFa解离。该分离人抗体或其抗原结合部分更优选地在标准体外L929检测中以不高于1X1Q—8M、甚至更优选地以不高于1X10—9M、再更优选地以不高于5X10—"M的ICs。中和人TNFa细胞毒性。在一个最佳实施方案中，该抗体是分离人重组抗体或其抗原结合部分。在另一最佳实施方案中，如用标准体外检测进行TNFa诱导的ELAM-1在人脐静脉内皮细胞(HUVEC)上表达所评价的，该抗体亦中和TNFa诱导的细胞激活。可以按照实施例1所述，进行测定Kd和K。ff的表面等离子体激元共振分析。在实施例4的A小节中描述了测定IC5。值的标准体外L929检测。在实施例4的C小节中描述了TNFa诱导的ELAM-1在人脐静脉内皮细胞(HUVEC)上表达的标准体外检测。符合或预期符合上述动力学和中和标准的重组人抗体的例子包括具有下述[VH/VL]对的抗体，其序列示于图1A、1B、2A和2B(有关动力学和中和分析亦可参见实施例2、3和4):[D2E7VH/D2E7VL];[HD2E7*.Al/D2E7vL]，[HD2E7*.A2/D2E7VL]，[HD2E7*.A3/D2E7VL]，[HD2E7*.A4/D2E7VL]，[HD2E7*.A5/D2E7VL]，[HD2E7*.A6/D2E7VL]，[HD2E7*.A7/D2E7VL]，[HD2E7*.A8/D2E7VL]，[HD2E7承.A9/D2E7VU，[D2E7VH/lD2E7承.Al]，[D2E7VH/U)2E7承.A4]，[D2E7VH/U)2E7承.A5]，[D2E7VH/1D2E7承.A7]，[D2E7VH/U)2E7承.A8]，[HD2E7承.A9/U)2E7承.Al]，[VH1—D2/L0E7]，[VH1-D2.N/L0E7.T]，[VH1-D2.Y/L0E7.A]，[VH1-D2.N/L0E7.A]，[VH1-D2/EPB12]和[3C-H2/L0E7]。本领域众所周知抗体重链和轻链CDR3域在抗体与抗原结合的特异性/亲和性方面起重要作用。因此，在另一方面，本发明涉及具有与hTNFa结合的低解离动力学并具有与D2E7的CDR3域在结构上相同或相关的轻链和重链CDR3域的人抗体。正如实施例3中证明的，D2E7VLCDR3的位置9可以被Ala或Thr占据而基本上不影响K。ff。因此，D2E7VLCDR3的共有基序包含以下氨基酸序列Q-R-Y-N-R-A-P-Y-(T/A)(SEQIDNO:3)。另外，D2E7VHCDR3的位置12可以被Tyr或Asn占据而基本上不影响K。ff。D2E7VHCDR3的共有基序包含以下氨基酸序列V-S-Y-L-S-T-A-S-S-L-D-(Y/N)(SEQIDNO:4)。另外，正如在实施例2中证明的，D2E7重链和轻链的CDR3域可以经受用一个单丙氨酸残基置换(在该VLCDR3内的1、4、5、7或8位，或在该VHCDR3内的2、3、4、5、6、8、9、10或11位)而基本上不影响该K。f"另外，技术人员会理解，已知D2E7VL和VH的CDR3域对丙氨酸置换的经受性，则在仍然保持该抗体的低解离速率常数时在所述CDR3域内的其它氨基酸置换也是可能的，特别是用保守氨基酸置换。本文使用的"保守氨基酸置换"是指其中一个氨基酸残基被另一个具有类似侧链的氨基酸取代。具有类似侧链的氨基酸残基的家族已在本领域中定义，它们包括碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、无电荷极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、P分枝侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。优选在D2E7VL和/或VH的CDR3域内制造不超过1至5个保守氨基酸置换。更优选在D2E7VL和/或VHCDR3域内制造不超过1至3个保守氨基酸置换。另外，不应在对与hTNFa结合的关键氨基酸位置进行保守氨基酸置换。如实施例3所示，看来该D2E7VLCDR3的位置2和5以及该D2E7VHCDR3的位置1和7对与hTNFa相互作用是关键的，因此最好不在这些位置进行保守氨基酸置换(尽管在该D2E7VLCDR3的位置5的丙氨酸置换是可以接受的，如上所述)。因此，在另一实施方案中，本发明提供具有以下特征的分离人抗体或其抗原结合部分a)以不高于1X10—3s—1的K。ff速率常数(由表面等离子体激元共振测定)与人TNFa解离；b)具有的轻链CDR3域，该域包含SEQIDNO:3的氨基酸序列，或通过于位置1、4、5、7或8的单丙氨酸置换或通过于位置1、3、4、6、7、8和/或9的1至5个保守氨基酸置换从SEQIDNO:3修饰的氨基酸序列。c)具有重链CDR3域，该域包含SEQIDNO:4的氨基酸序列，或通过于位置2、3、4、5、6、8、9、10或11的单丙氨酸置换或通过于位置2、3、4、5、6、8、9、10、11和/或12的1至5个保守氨基酸置换从SEQIDN0:4修饰的氨基酸序列。更优选地是，该抗体或其抗原结合部分以不高于5X10—4s—1的K。ff与人TNFa解离。甚至更优选地是，该抗体或其抗原结合部分以不高于IX10—4s—1的K。ff与人TNFa解离。在再一实施方案中，本发明提供分离人抗体或其抗原结合部分，其轻链可变区(LCVR)具有的CDR3域包含SEQIDNO:3的氨基酸序列、或通过于位置1、4、5、7或8的单丙氨酸置换从SEQIDN0:3修饰的氨基酸序列，其重链可变区(HCVR)具有的CDR3域包含SEQIDNO:4的氨基酸序列、或通过于位置2、3、4、5、6、8、9、10或11的单丙氨酸置换从SEQIDNO:4修饰的氨基酸序列。优选地是，该LCVR另外具有包含SEQIDNO:5的氨基酸序列的CDR2域(即D2E7VLCDR2)，并且i亥HCVR另外具有包含SEQIDNO:6的氨基酸序列的CDR2域(即D2E7VHCDR2)。甚至更优选地是，该LCVR另外具有包含SEQIDNO:7的氨基酸序列的CDR1域(即D2E7VLCDR1)，并且该HCVR具有包含SEQIDNO:8的氨基酸序列的CDR1域(即D2E7VHCDR1)。VL的框架区优选来自VKI人种系家族，更优选来自A20人种系Vk基因，最优选来自示于图IA和IB的该D2E7VL框架序列。VH的框架区优选来自VH3人种系家族，更优选来自DP-31人种系VH基因，最优选来自示于图2A和2B的该D2E7VH框架序列。在又一实施方案中，本发明提供具有包含SEQIDNO:1的氨基酸序列(即D2E7VL)的轻链可变区(LCVR)和包含SEQIDNO:2的氨基酸序列(即D2E7VH)的重链可变区(HCVR)的分离人抗体或其抗原结合部分。在某些实施方案中，该抗体包含一重链恒定区，例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区。优选地是，该重链恒定区是IgGl重链恒定区或IgG4重链恒定区。另外，该抗体可以包含一轻链恒定区，或者k轻链恒定区或者A轻链恒定区。最好是，该抗体包含k轻链恒定区。另一方面，该抗体部分可以是例如一Fab片段或一单链Fv片段。在另一些实施方案中，本发明提供具有D2E7相关VL和VH的CDR3域的分离人抗体或其抗原结合部分，例如，其轻链可变区(LCVR)具有包含选自以下氨基酸序列的CDR3域的抗体或其抗原结合部分SEQIDNO:3、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25和SEQIDNO:26或其重链可变区(HCVR)具有包含选自以下氨基酸序列的CDR3域SEQIDN0:4、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29、SEQIDNO:30、SEQIDNO:31、SEQIDNO:32、SEQIDNO:33、SEQIDNO:34禾卩SEQIDNO:35。在另一实施方案中，本发明提供中和人TNFa而非人TNFP活性的重组人抗体或其抗原结合部分。最好是抗体或其抗原结合部分亦中和黑猩猩TNFa和选自以下的至少一种其它灵长类TNFa的活性狒狒TNFa、狨TNFa、猕猴TNFa和恒河猴TNFa。该抗体或其抗原结合部分在标准体外L929检测中中和人、黑猩猩和/或另一灵长类TNFa时的IC5。优选为不高于1X10—8M，更优选为不高于1X10—9M，甚至更优选为不高于5X10—1QM。在一个分实施方案中，该抗体亦中和犬TNFa的活性，它在标准体外L929检测中的IC5。优选为不高于1X10—7M，更优选为不高于1X10—8M，甚至更优选为不高于5X10—9M。在另一分实施方案中，该抗体亦中和猪TNFa的活性，其ICs。优选为不高于1X10—5M，更优选为不高于1X10—6M，甚至更优选为不高于5X10—7M。在再一分实施方案中，该抗体亦中和小鼠TNFa的活性，其ICs。优选为不高于1X10—、，更优选为不高于1X10—5M，甚至更优选为不高于5X10—6M。可以将本发明的抗体或抗体部分衍生为或连接至另一功能分子(例如另一肽或蛋白)。因此，本发明的抗体和抗体部分包括本文描述的人抗hTNFa抗体的衍生的和其它修饰的形式，包括免疫粘附分子。例如，本发明的抗体或抗体部分可以功能性地连接(通过化学偶联、遗传融合、非共价结合或其它)至一个或多个其它分子实体，例如另一抗体(例如双特异性抗体或双抗体)、可检测药剂、细胞毒药剂、药用药剂和/或可以介导该抗体或抗体部分与另一分子结合的蛋白或肽(例如抗生蛋白链菌素核心区或多组氨酸标记)。—种类型的衍生抗体是通过交联二个或多个抗体(同一类型或不同类型，例如创17造双特异性抗体)制备。适当的交联剂包括那些杂双官能的、具有二个由适当隔离物分隔的独特反应基团(例如邻马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯)或同双官能的(例如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)。可以从PierceChemicalCompany,Rockford，IL得到这些接头。可以用于衍生本发明抗体或抗体部分的可检测剂包括荧光化合物。典型的荧光可检测剂包括荧光素、异硫氰酸荧光素、若丹明、5_二甲基氨基-1-萘磺酰氯、藻红蛋白等等。亦可以用可检测酶衍生抗体，所述酶为例如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、葡糖氧化酶等等。当用可检测酶衍生抗体时，通过加入该酶用于产生可检测反应产物的另外的试剂检测该抗体。例如，当有可检测剂辣根过氧化物酶时，加入过氧化氢和二氨基联苯胺产生可检测的有色反应产物。亦可以用生物素衍生抗体，并通过间接测定抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素结合检测。II.抗体表达可以通过在宿主细胞中重组表达免疫球蛋白轻链和重链制备本发明的抗体或抗体部分。为重组表达抗体，用携带编码该抗体免疫球蛋白轻链和重链的DNA片段的一个或多个重组表达载体转染宿主细胞，使所述轻链和重链在该宿主细胞中表达并最好分泌至培养所述宿主细胞的培养基中，可以从该培养基回收所述抗体。使用了诸如Sambrook，Fritsch和Maniatis(编辑)，分子克隆实验室手册，第二版，冷泉港，纽约，(1989)，Ausubel，F.M.等(编辑)分子生物学现行方法，GreenePublishingAssociates,(1989)和Boss等的美国专利4，816，397号描述的标准重组DNA方法，以获得抗体重链和轻链基因、将这些基因加入重组表达载体并将所述载体导入宿主细胞。为表达D2E7或D2E7相关抗体，首先获得编码所述轻链和重链可变区的DNA片段。可以通过使用聚合酶链式反应(PCR)扩增和修饰种系轻链和重链可变序列制备这些DNA。本领域已知道人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列(参见例如"Vbase"人禾中系序列数据库；亦可参见Kabat，E.A.等(1991)SequencesofProteinsofImmunologicallnterest,第五片反，U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,NIHPublicationNo.91-3242;Tomlinson，I.M.等(1992)"人种系VH序列的所有组成部分揭示约50组具有不同超变环的VH区段"J.Mol.Biol.^1:776-798;和Cox，J.P.L.等(1994)"人种系VK区段的目录揭示在其使用中的强偏差"Eur.J.Immunol.M:827-836;其内容通过引用结合到本文中)。为获得编码该D2E7或D2E7相关抗体的重链可变区的DNA片段，通过标准PCR扩增人种系VH基因的VH3家族的一员。最优选地是，扩增DP-31VH种系序列。为获得编码D2E7或D2E7相关抗体的轻链可变区的DNA片段，通过标准PCR扩增人种系VL基因的VKl家族的一员。最优选地，扩增A20VL种系序列。可以使用标准方法、根据上述引用参考文献中公开的核苷酸序列，设计用于扩增DP-31种系VH和A20种系VL序列的适当PCR引物。—旦得到所述种系VH和VL片段后，可以使这些序列突变以编码本文公开的所述D2E7或D2E7相关氨基酸序列。首先将由种系VH和VLDNA序列编码的氨基酸序列与所述D2E7或D2E7相关VH和VL氨基酸序列比较，以鉴别在所述D2E7或D2E7相关序列中与种系不同的氨基酸残基。然后，使用遗传密码确定应改变的核苷酸，将所述种系DNA序列的适当核苷酸突变，使得该突变种系序列编码该D2E7或D2E7相关氨基酸序列。通过标准方法例18如PCR介导的诱变(其中将所述突变核苷酸加入所述PCR引物，使得所述PCR产物含有所述突变)或定点诱变进行所述种系序列的诱变。另外，应注意如果该通过PCR扩增得到的"种系"序列在框架区编码的氨基酸与真正的种系构型不同(即例如由于体细胞突变，与真正的种系序列相比扩增序列中有差异)，可能最好将这些氨基酸差异变回真正的种系序列(即框架残基"回复突变"至该种系构型)。—旦得到编码D2E7或D2E7相关VH和VL片段的DNA片段(按上述，通过扩增和诱变种系VH和VL基因)，可以通过标准重组DNA技术进一步操作这些DNA片段，例如，将所述可变区基因转变为全长抗体链基因、Fab片段基因或scFv基因。在这些操作中，将VL或VH编码DNA片段可操作地连接至编码另一蛋白(例如抗体恒定区或挠性接头)的另一DNA片段。本文使用的术语"可操作地连接"是指连接这二个DNA片段使得由这二个DNA片段编码的氨基酸序列保持在框架中。通过可操作地将该VH编码DNA连接至另一编码重链恒定区(CH1、CH2和CH3)的DNA分子，可以将编码该VH区的分离DNA转变为全长重链基因。本领域已知道人重链恒定区基因序列(参见例如Kabat，E.A.等(1991)SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第五片反，U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,NIHPublicationNO.91-3242)，并且可以通过标准PCR扩增获得包含这些区的DNA片段。该重链恒定区可以是IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区，但最好是IgGl或IgG4恒定区。关于Fab片段重链基因，可以将该VH编码DNA可操作地连接至仅编码该重链CHI恒定区的另一DNA分子。通过可操作地将该VL编码DNA连接至另一编码该轻链恒定区CL的DNA分子，可以将编码该VL区的分离DNA转变为全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。本领域已知道人轻链恒定区基因序列(参见例如Kabat，E.A.等(1991)SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第五片反，U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,NIHPublicationNO.91-3242)，并且可以通过标准PCR扩增获得包含这些区的DNA片段。该轻链恒定区可以是k或A恒定区，但最好是k恒定区。为制备scFv基因，将所述VH和VL编码DNA片段可操作地连接至编码挠性接头(例如编码氨基酸序列(Gly4-Ser)3)的另一片段，使得该VH和VL序列做为相连单链蛋白表达，由该挠性接头连接所述VL和VH区(参见例如Bird等(1988)Science，:423-426;Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA祖5879-5883;McCafferty等，Nature(1990)逃552-554)。为表达本发明的抗体或抗体部分，将上述得到的编码部分或全长轻链和重链的DNA插入表达载体，使得所述基因可操作地连接至转录和转译控制序列。在本文中，术语"可操作地连接"是指抗体基因连接至载体中，使得该载体内的转录和转译控制序列发挥它们调节该抗体基因转录和转译的既定功能。选择该表达载体和表达控制序列使之与所用的表达宿主细胞相容。可以将该抗体轻链和该抗体重链插入单独的载体中，或更常用的是将这两个基因插入同一载体中。通过标准方法(例如连接该抗体基因片段和载体上的互补限制位点、或如果没有限制位点就进行平端连接)将所述抗体基因插入该表达载体。在插入该D2E7或D2E7相关轻链或重链序列之前，该表达载体可以已经携带抗体恒定区序列。例如，将该D2E7或D2E7相关序列转变为全长抗体基因的一个方法是，将它们分别插入已经编码重链恒定区和轻链恒定区的表达载体，使得该VH区段可操作地连接至该载体内的CH区段并使该VL区段可操作地连接至该载体内的CL区段。另外或二者择一地，该重组表达载体可以编码便于该抗体链从宿主细胞分泌的信号肽。可以将该抗体链基因克隆入该载体，使得该信号肽在框架内连接至该抗体链基因的氨基末端。该信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即来自非免疫球蛋白的信号肽)。除所述抗体链基因之外，本发明的重组表达载体还携带控制所述抗体链基因在宿主细胞中表达的调节序列。术语"调节序列"包括启动子、增强子和控制所述抗体链基因转录或转译的其它表达控制元件(例如多腺苷酸化信号)。这种调节序列例如描述于Goeddel;GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185，AcademicPress,SanDiego，CA(1990)。本领域技术人员会理解该表达载体的设计(包括选择调节序列)可以取决于种种因素，例如选择欲转化的宿主细胞、所需蛋白的表达水平等。优选的哺乳动物细胞表达调节序列包括指导在哺乳动物细胞中高水平蛋白表达的病毒元件，例如来自巨细胞病毒(CMV)(例如CMV启动子/增强子)、猿猴病毒40(SV40)(例如SV40启动子/增强子)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期启动子(AdMLP)和多形瘤的启动子和/或增强子。有关病毒调节元件及其序列的进一步描述，参见例如Stinski的美国专利5，168，062号、Bel1等的美国专利4，510，245号和Schaffner等的美国专利4，968，615号。除所述抗体链基因和调节序列之外，本发明的重组表达载体还可以携带其它序列，例如在宿主细胞中调节该载体复制的序列(例如复制起点)和选择标记基因。该选择标记基因便于选择已导入该载体的宿主细胞(参见例如Axel等的美国专利4，399，216、4，634，665和5，179，017号)。例如，一般该选择标记基因赋予已导入该载体的宿主细胞对药物(例如G418、潮霉素或氨甲蝶呤)的抗性。优选的选择标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于dhfr—宿主细胞用氨甲蝶呤选择/扩增)和neo基因(用于G418选择)。为表达所述轻链和重链，将编码所述重链和轻链的表达载体通过标准技术转染入宿主细胞。术语"转染"的各种形式涵盖了众多的各种用于将外源基因导入原核或真核宿主细胞的常用技术，例如电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE葡聚糖转染等等。尽管理论上可以在或者原核宿主细胞或者真核宿主细胞中表达本发明的抗体，但最优选在真核细胞中、最优选在哺乳动物细胞中表达抗体，因为这种真核细胞、特别是哺乳动物细胞比原核细胞更有可能装配和分泌正确折叠和具免疫活性的抗体。据报道抗体基因原核表达在活性抗体的高产率生产方面是低效的(Boss，M.A.和Wood，C.R.(1985)ImmunologyToday6:12-13)。优选的表达本发明重组抗体的哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠子宫(CH0)细胞(包括dhfr—CHO细胞，描述于Urlaub和Chasin，(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USAII:4216-4220，与DHFR选择标记一起使用，例如描述于R.J.Kaufman和P.A.Sharp(1982)Mol.Biol.:601-621)、NS0骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。将编码抗体基因的重组表达载体导入哺乳动物宿主细胞时，通过培养所述宿主细胞足够时间以在所述宿主细胞中表达该抗体，或更优选地将该抗体分泌到所述宿主细胞生长的培养基中生产所述抗体。使用标准蛋白纯化方法可以从该培养基中回收抗体。亦可以用宿主细胞生产完整抗体的部分，例如Fab片段或scFv分子。应理解上述方法的变化亦属于本发明的范围。例如，可能最好用编码本发明抗体的或者轻链或者重链(但不是两者)的DNA转染宿主细胞。亦可以用重组DNA技术除去编码对与hTNFa结合非必需的或者轻链或者重链或者这二者的一些或全部DNA。本发明的抗体亦包括从这种截短的DNA分子表达的分子。另外，通过用标准化学交联方法交联本发明的抗体和第二抗体，可以生产双功能抗体，其中一条重链和一条轻链是本发明的抗体，另一条重链和另一条轻链对非hTNFa的抗原具特异性。在一重组表达本发明抗体或其抗原结合部分的推荐系统中，通过磷酸钙介导的转染将既编码该抗体重链又编码该抗体轻链的重组表达载体导入dhfr—CH0细胞。在该重组表达载体中，所述抗体重链和轻链基因都可操作地连接至增强子/启动子调节元件(例如来自SV40、CMV、腺病毒等等的，例如CMV增强子/AdMLP启动子调节元件或SV40增强子/AdMLP启动子调节元件)以驱动所述基因的高水平转录。该重组表达载体亦携带DHFR基因，它使得可以用氨甲蝶呤选择/扩增选择已用该载体转染的CHO细胞。培养该选出的转化体宿主细胞以表达所述抗体重链和轻链，并从该培养基中回收完整抗体。使用标准分子生物学方法制备该重组表达载体、转染所述宿主细胞、选择转化体、培养所述宿主细胞并从该培养基中回收该抗体。鉴于前述，本发明的另一方面涉及可以用于重组表达本发明抗体和抗体部分的核酸、载体和宿主细胞组合。编码该D2E7轻链可变区的核苷酸序列示于图7和SEQIDNO:36。该LCVR的CDRl域包括核苷酸70-102，该CDR2域包括核苷酸148-168，而该CDR3域包括核苷酸265-291。编码该D2E7重链可变区的核苷酸序列示于图8和SEQIDNO:37。该HCVR的CDRl域包括核苷酸91-105，该CDR2域包括核苷酸148-198，而该CDR3域包括核苷酸295-330。技术人员会理解，使用遗传密码和标准分子生物学技术可以从编码该D2E7LCVR和HCVR的核苷酸序列衍生编码D2E7相关抗体或其部分(例如诸如CDR3域的CDR域)的核苷酸序列。在一个实施方案中，本发明提供编码轻链CDR3域的分离核酸，该CDR3域包含SEQIDNO:3的氨基酸序列(即D2E7VLCDR3)、或包含通过于位置1、4、5、7或8的单丙氨酸置换或通过于位置1、3、4、6、7、8和/或9的一至五个保守氨基酸置换从SEQIDN0:3修饰的氨基酸序列。该核酸可以仅编码该CDR3区，或更优选编码整个抗体轻链可变区(LCVR)。例如，该核酸可以编码一个具有包含SEQIDNO:5的氨基酸序列的CDR2域(即D2E7VLCDR2)和包含SEQIDNO:7的氨基酸序列的CDRl域(即D2E7VLCDRl)的LCVR。在另一实施方案中，本发明提供编码重链CDR3域的分离核酸，该CDR3域包含SEQIDNO:4的氨基酸序列(即D2E7VHCDR3)、或包含通过于位置2、3、4、5、6、8、9、10或11的单丙氨酸置换或通过于位置2、3、4、5、6、8、9、10、ll和/或12的一至五个保守氨基酸置换从SEQIDN0:4修饰的氨基酸序列。该核酸可以仅编码该CDR3区，或更优选编码整个抗体重链可变区(HCVR)。例如，该核酸可以编码一个具有包含SEQIDNO:6的氨基酸序列的CDR2域(即D2E7VHCDR2)和包含SEQIDNO:8的氨基酸序列的CDRl域(即D2E7VHCDRl)的HCVR。在再一实施方案中，本发明提供编码D2E7相关CDR3域的分离核酸，该CDR3域例如包含选自以下的氨基酸序列:SEQIDN0:3、SEQIDNO:4、SEQIDN0:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29、SEQIDNO:30、SEQIDNO:31、SEQIDNO:32、SEQIDNO:33、SEQIDNO:34和SEQIDNO:35。在又一实施方案中，本发明提供编码包含SEQIDNO:1的氨基酸序列的抗体轻链可变区(即D2E7LCVR)的分离核酸。该核酸最好包含SEQIDNO:36的核苷酸序列，尽管技术人员会理解由于遗传密码的简并性，其它核苷酸序列可以编码SEQIDNO:l的氨基酸序列。该核酸可以仅编码该LCVR或亦可以编码可操作地连接至该LCVR的抗体轻链恒定区。在一个实施方案中，该核酸存在于一个重组表达载体中。在又一实施方案中，本发明提供编码包含SEQIDN0:2的氨基酸序列的抗体重链可变区(即D2E7HCVR)的分离核酸。该核酸最好包含SEQIDNO:37的核苷酸序列，尽管技术人员会理解由于遗传密码的简并性，其它核苷酸序列可以编码SEQIDN0:2的氨基酸序列。该核酸可以仅编码该HCVR或亦编码可操作地连接至该HCVR的重链恒定区。例如，该核酸可以包含IgGl或IgG4恒定区。在一个实施方案中，该核酸存在于一个重组表达载体中。本发明亦提供既编码抗体重链又编码抗体轻链的重组表达载体。例如，在一个实施方案中，本发明提供编码以下的重组表达载体(a)具有包含SEQIDNO:1的氨基酸序列的可变区的抗体轻链(即D2E7LCVR);和(b)具有包含SEQIDNO:2的氨基酸序列的可变区的抗体重链(即D2E7HCVR)。本发明亦提供已导入一个或多个本发明重组表达载体的宿主细胞。该宿主细胞优选是哺乳动物宿主细胞，该宿主细胞更优选是CHO细胞、NSO细胞或COS细胞。另外本发明提供合成本发明重组人抗体的方法，即通过在适当培养基中培养本发明的宿主细胞直至合成本发明的重组人抗体。该方法还包括从该培养基中分离该重组人抗体。III.选择重组人抗体可以通过筛选重组联合抗体文库、最好是从得自人淋巴细胞的mRNA制备的人VL和VHcDNA制备的scFv噬菌体呈现文库分离除本文公开的该D2E7或D2E7相关抗体之外的本发明重组人抗体。本领域已知道制备和筛选这种文库的方法学。除市售制备噬菌体呈现文库的药盒(例如Pharmacia的重组噬菌体抗体系统，目录号27-9400-01;和StratageneSurfZAP噬菌体呈现药盒，目录号240612)之外，可以在以下文献中找到特别适用于制备和筛选抗体呈现文库的方法和试剂例如Ladner等的美国专利5，223，409号；Kang等的PCT说明书W092/18619号；Dower等的PCT说明书WO91/17271号；Winter等的PCT说明书WO92/20791号；Markland等的PCT说明书WO92/15679号；Breitling等的PCT说明书WO93/01288号；McCafferty等的PCT说明书WO92/01047号；Garrard等的PCT说明书WO92/09690号;Fuchs等(1991)Bio/Technology豆1370-1372;Hay等(1992)HumAntibodHybridomas2:81-85;Huse等(1989)Science246:1275-1281:McCafferty等，Nature(1990)348:552-554;Griffiths等(1993)EMBOJ11:725-734;Hawkins等(1992)JMolBiol226:889-896;Clackson等(1991)Nature352:624-628;Gram等(1992)PNAS巡3576-3580;Garrad等(1991)Bio/Technology2:1373-1377;Hoogenboom等(1991)NucAcidRes旦4133-4137;和Barbas等(1991)PNAS坚7978-7982。在一个最佳实施方案中，为分离对hTNFa具有高亲和性和低解离速率常数的人抗体，首先用对hTNFa具有高亲和性和低解离速率常数的鼠抗hTNFa抗体(例如MAK195，保藏号为ECACC87050801的杂交瘤)、采用描述于Hoogenboom等的PCT说明书WO93/06213号的表位印记或导向选择方法，选择具有对hTNFa类似的结合活性的人重链和轻链序列。在该方法中使用的抗体文库最好是按照McCafferty等的PCT说明书W092/01047号，McCafferty等，Nature(1990)348:552-554;和Griffiths等，(1993)EMB0JE:725-734所述制备和筛选的scFv文库。最好用重组人TNFa做为抗原筛选所述scFv抗体文库。—旦选择出最初的人VL和VH区段，就进行"混合和配对"实验，在该实验中对最初选择的VL和VH区段的不同配对进行hTNFa结合筛选，以选择优选的VL/VH对组合。另外，为进一步提高对hTNFa结合的亲和性和/或降低hTNFa结合的解离速率常数，可以对优选的VL/VH对的VL和VH区段进行随机突变，该突变最好在VH和/或VL的CDR3区进行，突变过程与造成在自然免疫应答中抗体亲和性成熟的体内体细胞突变过程相似。可以使用与VHCDR3或VLCDR3分别互补的PCR引物，通过扩增VH和VL区完成这种体外亲和性成熟，所述引物已用四种核苷酸碱基的随机混合物于某些位置"钉入"，使得该得到的PCR产物编码已在VH和/或VLCDR3区中导入随机突变的VH和VL区段。可以再次筛选这些随机突变VH和VL区段的hTNFa结合性，可以选择出展示对hTNFa结合有高亲和性和低解离速率的序列。可以将选择的抗体重链和轻链的氨基酸序列与种系重链和轻链氨基酸序列比较。在该选择的VL和/或VH链的某些框架残基不同于种系构型时(例如由于用于制备该噬菌体文库的免疫球蛋白基因的体细胞突变的结果)，可能需要将所述选定抗体的改变的框架残基"回复突变"为该种系构型(即改变该选定抗体的框架氨基酸序列，使它们与所述种系框架氨基酸序列相同)。框架残基的这种"回复突变"(或"种系化")可以通过用于导入特异性突变的标准分子生物学方法(例如定点诱变；PCR介导的诱变等等)完成。在从重组免疫球蛋白呈现文库筛选和分离本发明的抗hTNFa抗体之后，可以从该呈现包装物(例如从该噬菌体基因组)回收编码该选择抗体的核酸并通过标准重组DNA技术将其亚克隆入其它表达载体。如果需要，可以进一步操作该核酸以创造本发明的其它抗体形式(例如连接至编码另外免疫球蛋白结构域的核酸，例如其它恒定区)。为表达通过联合文库筛选分离的重组人抗体，如上述II节详述，将编码该抗体的DNA克隆入重组表达载体并导入哺乳动物宿主细胞。IV.药用组合物和给药可以将本发明的抗体和抗体部分加入适于给与受治疗者的药用组合物中。通常，该药用组合物包含本发明的抗体或抗体部分和药学上可接受的载体。本文使用的"药学上可接受的载体"包括任何和所有的生理适用的溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等等。药学上可接受载体的例子包括一种或多种的水、盐水、磷酸缓冲盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等等及其组合物。在许多情况下，在该组合物中最好包括等渗剂，例如，糖、诸如甘露醇、山梨醇的多元醇、或氯化钠。药学上可接受载体还可以包含少量的辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲液，它们增强了该抗体或抗体部分的有效期或效力。23本发明的组合物可以有各种形式。这些形式包括例如液体、半固体和固体剂量形式，例如液体溶液(例如注射液和输注液)、分散液或悬液、片剂、丸剂、粉剂、脂质体和栓剂。推荐的形式取决于给药方式和治疗用途。典型的推荐组合物是注射液或输注液的形式，例如与用其它抗体对人进行被动免疫所用的组合物类似的组合物。推荐的给药方式是非肠道的(例如静脉内、皮下、腹膜内、肌内)。在一个最佳实施方案中，通过静脉内输液或注射给与该抗体。在另一最佳实施方案中，通过肌内注射或皮下注射给与该抗体。治疗组合物一般必须无菌且在生产储存条件下稳定。可以将该组合物配制成溶液、微乳液、分散液、脂质体或其它适于高药物浓度的有序结构。通过将所需量的该活性化合物(即抗体或抗体部分)与所需上述成分的一种或组合一起加入适当的溶剂中并接着进行除菌过滤制备无菌注射液。一般而言，通过将该活性化合物加入含有基本分散介质和所需的上述其它成分的无菌溶媒中制备分散液。在用于制备无菌注射液的无菌粉剂的情况下，推荐的制备方法是真空干燥和冷冻干燥产生该活性成分与任何其它来自先前除菌过滤溶液的所需成分的粉剂。例如通过诸如卵磷脂的包衣、在分散液的情况下通过保持所需颗粒大小和通过使用表面活性剂，可以保持溶液的适当流动性。通过在该组合物中包括延迟吸收的药剂(例如单硬脂酸盐和明胶)可以达到注射组合物的延长吸收。本发明的抗体和抗体部分可以用本领域已知的各种方法给药，尽管在许多治疗用途中推荐的给药途径/给药方式是静脉内注射或输液。技术人员会理解给药途径和/或给药方式随所需的结果而变化。在某些实施方案中，该活性化合物可以与保护该化合物免于快速释放的载体一同制备，例如控释制剂，包括移植物、透皮贴和微囊传递系统。可以使用生物可降解的、生物相容性聚合物，例如乙烯乙酸乙酯、聚酐、聚羟基乙酸、胶原蛋白、聚正酯和聚乳酸。制备这种制剂的许多方法均已申请专利或一般为本领域技术人员所知。参见例如SustainedandControlledReleaseDrugDeliverySystems,J.R.Robinson编车茸，MarcelDekker，Inc.，纽约，1978。在某些实施方案中，本发明的抗体或抗体部分可以与例如惰性稀释剂或可同化的食用载体一同口服。该化合物(和其它成分，如果需要)亦可以包于硬或软壳明胶胶囊、压制成片剂或直接加入受治疗者的膳食中。关于口服治疗给药，可以将所述化合物与赋形剂一起加入并以可食片剂、颊含片剂、锭剂、胶囊、酏剂、悬液、糖浆、糯米纸囊剂等等形式使用。为了以非肠道给药之外给与本发明的化合物，可能需要用防止其失活的材料对该化合物包衣或与该化合物一同给与。亦可以将补充的活性化合物加入该组合物中。在某些实施方案中，将本发明的抗体或抗体部分与一种或多种可以用于治疗hTNFa活性为有害的疾病的其它治疗药物共配制和/或共给与。例如，本发明的抗体或抗体部分可以与一种或多种结合其它靶的抗体(例如结合其它细胞因子的抗体或结合细胞表面分子的抗体)、一种或多种细胞因子、可溶性TNFa受体(参见例如PCT说明书WO94/06476号)和/或一种或多种抑制hTNFa产生或活性的化学药剂(例如PCT说明书W093/19751号中描述的亚环己烷基衍生物)共配制和/或共给与。另外，可以将一种或多种本发明的抗体与二种或多种前述治疗药物联用。这种联合治疗可以优越地利用较低剂量的该给与的治疗药物，因此避免可能的毒性或与各种单一疗法相关的并发症。可以与本发明的抗体或抗体部分联用的类风湿性关节炎治疗药物的非限制性例子包括以下非类固醇抗炎药(NSAID);细胞因子抑制抗炎药(CSAID);CDP-571/BAY-10-3356(人化抗TNFa抗体；Celltech/Bayer);cA2(嵌合抗TNFa抗体；Centocor);75kdTNFR_IgG(75kDTNF受体-IgG融合蛋白；Immunex;参见例如Arthritis&Rheumatism(1994)Vol.^!，S295;J.Invest.Med.(1996)Vol.M，235A);55kdTNFR-IgG(5kDTNF受体-IgG融合蛋白；Hoffmann-LaRoche);IDEC_CE9.1/SB210396(无缺失灵长类化抗CD4抗体；IDEC/SmithKline;参见例如Arthritis&Rheumatism(1995)Vol.巡，S185);DAB486-IL-2和/或DAB389-IL-2(IL-2融合蛋白;Seragen;参见例如Arthritis&Rheumatism(1993)Vol.巡，1223);抗Tac(人化抗IL-2Ra;ProteinDesignLabs/Roche);IL-4(抗炎细胞因子；DNAX/Schering);IL-10(SCH52000;重组IL-IO，抗炎细胞因子；DNAX/Schering);IL_4;IL-IO和/或IL-4激动剂(例如激动剂抗体);IL-1RA(IL-1受体拮抗剂；Synergen/Amgen);TNF-bp/s-TNFR(可溶性TNF结合蛋白；参见例如Arthritis&Rheumatism(1996)Vol.巡，第9期(增刊)，S284;Amer.J.Physiol.-HeartandCirculatoryPhysiology(1995)Vol.墨，第37-42页);R973401(磷酸二酯酶IV型抑制齐U;参见例如Arthritis&Rheumatism(1996)Vol.巡，第9期(增刊)，S282);MK-966(C0X-2抑制剂；参见例如Arthritis&Rheumatism(1996)Vol.巡，第9期(增刊)，S81);Iloprost(参见例如Arthritis&Rheumatism(1996)Vol.巡，第9期(增刊)，S82);氨甲蝶呤；酞胺哌啶酮(参见例如Arthritis&Rheumatism(1996)Vol.巡，第9期(增刊)，S282)和酞胺哌啶酮相关药物(例如Celgen);leflunomide(抗炎和细胞因子抑制剂；参见例如Arthritis&Rheumatism(1996)Vol.巡，第9期(增刊)，S131;InflammationResearch(1996)Vol.M，第103-107页)；凝血酸(血纤维蛋白溶酶原激活抑制剂；参见例如Arthritis&Rheumatism(1996)Vol.巡，第9期(增刊)，S284);T_614(细胞因子抑制剂；参见例如Arthritis&Rheumatism(1996)Vol.巡，第9期(增刊)，S282);前列腺素El(参见例如Arthritis&Rheumatism(1996)Vol.巡，第9期(增刊)，S282);Tenid即(非类固醇抗炎药；参见例如Arthritis&Rheumatism(1996)Vol.巡，第9期(增刊)，S280);萘普生(非类固醇抗炎药；参见例如NeuroR印ort(1996)Vol.Z，第1209-1213页)；Meloxicam(非类固醇抗炎药)；布洛芬(非类固醇抗炎药)；吡罗昔康(非类固醇抗炎药)；双氯芬酸(非类固醇抗炎药)；消炎痛(非类固醇抗炎药)；柳氮磺胺吡啶(参见例如Arthritis&Rheumatism(l996)Vol.巡，第9期(增刊)，SMI);硫唑嘌呤(参见例如Arthritis&1^6咖&廿8111(1996)￥01.巡，第9期(增干lj)，S281);ICE抑制剂(白介素-iP转化酶抑制剂)；z即-70和/或lck抑制剂(酪氨酸激酶z即-70或lck抑制剂)；VEGF抑制剂和/或VEGF-R抑制剂(血管内皮细胞生长因子或血管内皮细胞生长因子受体抑制剂；血管发生抑制剂)；皮质类固醇抗炎药(例如SB203580);TNF-转化酶抑制剂；抗IL-12抗体；白介素-11(参见例如Arthritis&Rheumatism(1996)Vol.盖，第9期(增刊)，S296);白介素-13(参见例如Arthritis&Rheumatism(1996)Vol.盖，第9期(增刊)，S308);白介素-17抑制剂(参见例如Arthritis&Rheumatism(1996)Vol.巡，第9期(增干lj)，S120);金；青霉胺；氯喹；羟氯喹；苯丁酸氮芥；环磷酰胺；环孢菌素；全淋巴照射；抗胸腺细胞球蛋白；抗CD4抗体；CD-5毒素；口服肽和胶原蛋白；lobenzaritdisodium;细胞因子调节剂(CRA)HP228和HP466(HoughtenPharmaceuticals,Inc.);ICAM-1反义硫代磷酸酯寡脱氧核苷酸(ISIS2302;IsisPharmaceuticals,Inc.);可溶性补体受体1(TP10;TCellSciences,25Inc.);强的松；肝蛋白；葡糖胺聚糖多硫酸盐；二甲胺四环素；抗IL2R抗体；海洋和植物脂质(鱼类和植物种子脂肪酸；参见例如DeLuca等(1995)Rheum.Dis.Clin.NorthAm.且759-777);金诺芬；保泰松；甲氯芬那酸；氟芬那酸；静注免疫球蛋白；zileuton;霉酚酸(RS-61443);tacrolimus(FK-506);sirolimus(雷巾白霉素)；amiprilose(therafectin);cladribine(2-氯脱氧腺苷)；和阿扎立平。可以与本发明的抗体或抗体部分联用的炎症性肠病治疗药物的非限制性例子包括以下budenoside;表皮生长因子；皮质类固醇；环孢菌素；柳氮磺胺吡啶；氨基水杨酸盐；6-巯基嘌呤；硫唑嘌呤；甲硝唑；脂氧合酶抑制剂；氨水杨酸；奥沙拉秦；balsalazide;抗氧化剂；凝血噁烷抑制剂；IL-1受体拮抗剂；抗IL_1P单克隆抗体；抗IL_6单克隆抗体；生长因子；弹性蛋白酶抑制剂；吡啶基_咪唑化合物；CDP-571/BAY-10_3356(人化抗TNFa抗体；Celltech/Bayer);cA2(嵌合抗TNFa抗体；Centocor);75kdTNFR-IgG(75kDTNF受体-IgG融合蛋白；Immunex;参见例如Arthritis&Rheumatism(1994)Vol.^1，S295;J.Invest.Med.(1996)Vol.勉，235A);55kdTNFR-IgG(55kDTNF受体-IgG融合蛋白；Hoffmann-LaRoche);白介素_10(SCH52000;ScheringPlough);IL-4;IL-IO和/或IL-4激动剂(例如激动剂抗体)；白介素-ll;强的松龙、地塞米松或budesonide的葡糖苷酸或葡聚糖结合前体药物；ICAM-1反义硫代磷酸酯寡聚脱氧核苷酸(ISIS2302;IsisPharmaceuticals,Inc.);可溶性补体受体1(TP10;TCellSciences，Inc.);缓释氨水杨酸；氨甲蝶呤；血小板激活因子(PAF)拮抗剂；环丙沙星；和利多卡因。可以与本发明的抗体或抗体部分联用的多发性硬化治疗药物的非限制性例子包括以下皮质类固醇；强的松龙；甲基强的松龙；硫唑嘌呤；环磷酰胺；环孢菌素；氨甲蝶呤；4-氨基吡啶；tizanidine;干扰素_Pla(Avonex;Biogen);干扰素_Plb(Betaseron;Chiron/Berlex);Copolymer1(Cop-l;Copaxone;TevaPharmaceuticallndustries，Inc.);高压氧；静注免疫球蛋白；clabribine;CDP-571/BAY-10-3356(人化抗TNFa抗体；Celltech/Bayer);cA2(嵌合抗TNFa抗体；Centocor);75kdTNFR_IgG(75kDTNF受体-IgG融合蛋白；Immunex;参见例如Arthritis&Rheumatism(1994)Vol.M，S295;J.Invest.Med.(1996)Vol.ii，235A);55kdTNFR-IgG(55kDTNF受体-IgG融合蛋白；Hoffmann-LaRoche);IL-IO;IL-4;和IL-10和/或IL-4激动剂(例如激动剂抗体)。可以与本发明的抗体或抗体部分联用的脓毒症治疗药物的非限制性例子包括以下高渗盐溶液；抗生素；静注Y球蛋白；连续性滤血；carb即enems(例如meropenem);诸如TNFa、IL-1P、IL-6和/或IL-8的细胞因子的拮抗剂；CDP-571/BAY-10_3356(人化抗TNFa抗体；Celltech/Bayer);cA2(嵌合抗TNFa抗体；Centocor);75kdTNFR-IgG(75kDTNF受体-IgG融合蛋白；Immunex;参见例如Arthritis&Rheumatism(1994)Vol.^，S295;J.Invest.Med.(1996)Vol.勉，235A);55kdTNFR_IgG(55kDTNF受体-IgG融合蛋白；Hoffmann-LaRoche);细胞因子调节剂(CRA)HP228和HP466(HoughtenPharmaceuticals,Inc.);SK&F107647(低分子肽；SmithKlineBeechem);四价脒基腙CNI-1493(PicowerInstitute);组织因子通道抑制剂(TFPI;Chiron);PHP(化学修饰血红蛋白；APEXBioscience);铁螯合剂和螯合物，包括五乙酸二乙三胺_铁(III)络合物(DPTA铁(III);MolichemMedicines);lisofylline(合成小分子甲基黄嘌呤；CellTherapeutics，Inc.);PGG-葡聚糖(水溶性131，3葡聚糖；Alpha-BetaTechnology);用脂类重建的载脂蛋白A_l;手性异羟肟酸(抑制脂A生物合成的合成抗菌剂)；抗内毒素抗体；E5531(合成脂A拮抗剂；EisaiAmerica，Inc.);rBPI21(人杀菌剂/透过性增强蛋白的重组N末端片段)；和合成抗内毒素月太(SAEP;BiosYnthResearchLaboratories);可以与本发明的抗体或抗体部分联用的成人呼吸窘迫综合症(ARDS)治疗药物的非限制性例子包括以下抗IL-8抗体；表面活性剂置换疗法；CDP-571/BAY-10-3356(人化抗TNFa抗体；Celltech/Bayer);cA2(嵌合抗TNFa抗体；Centocor);75kdTNFR-IgG(75kDTNF受体-IgG融合蛋白；Immunex;参见例如Arthritis&Rheumatism(1994)Vol.^，S295;J.Invest.Med.(1996)Vol.勉，235A);和55kdTNFR_IgG(55kDTNF受体-IgG融合蛋白；Hoffmann-LaRoche)。在IV小节中进一步讨论将本发明的抗体或抗体部分与其它治疗药物联用的用途。本发明的药用组合物可以包括"治疗有效量"或"预防有效量"的本发明抗体或抗体部分。"治疗有效量"是指在必要的剂量和时间下有效达到所需治疗效果的量。抗体或抗体部分的治疗有效量可以根据诸如个体的病况、年龄、性别和体重以及该抗体和抗体部分在该个体引起所需反应的能力等因素而变化。治疗有效量亦指该抗体或抗体部分的有益治疗效果超过其任何毒性或有害效果的量。"预防有效量"是指在必要剂量和时间下有效达到所需预防效果的量。因为预防剂量用于患病前或疾病早期的受治疗者，预防有效量通常小于治疗有效量。可以调整剂量制度以提供最佳所需反映(例如治疗或预防应答)。例如，可以单次大团给药，可以在一段时间内给与几个均分量或根据治疗情况的迫切性按比例降低或增加剂量。配制易于给药和剂量统一的剂量单位形式的非肠道组合物尤其有利。本文使用的剂量单位形式指适于欲治疗的哺乳动物受治疗者的单元剂量的物理分离单位；每个单位含有预定量的计算用于与所需药用载体一同产生所需治疗效果的活性化合物。本发明的剂量单位形式的规格由以下确定并直接取决于以下(a)该活性化合物的独特特征和欲达到的特定治疗或预防效果，和(b)在混合这种用于治疗个体敏感性活性化合物的技术中的内在限制。本发明的抗体或抗体部分的治疗或预防有效量的典型的非限制性范围是0.l-20mg/kg，更优选为l-10mg/kg。应注意剂量值将根据欲减轻的疾病类型和严重性变化。另外应理解对于任何特定受治疗者，应随着时间根据个体需要和给与或监督给与所述组合物的人的专业判断调整特定剂量制度，并且本文设定的剂量范围仅为例证性的，并不会限制要求保护的组合物的范围或实践。IV.本发明抗体的用途已知本发明的抗hTNFa抗体或其部分结合hTNFa的能力，可以将其用于在诸如酶联免疫吸附检测(ELISA)、放射免疫检测(RIA)或组织免疫组织化学的常规免疫检测中检测hTNFa(例如在诸如血清或血桨的生物样品中)。本发明提供在生物样品中检测hTNFa的方法，该方法包括用本发明的抗体或抗体部分接触生物样品并检测或者结合至hTNFa的抗体(或抗体部分)或者未结合抗体(或抗体部分)，由此检测该生物样品中的hTNFa。用便于检测结合或未结合抗体，用可检测物质直接或间接标记该抗体。合适的可检测物质包括各种酶、辅基、荧光物质、发光物质和放射性物质。合适的酶的例子包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、e-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合体例子包括抗生蛋白链菌素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合适的荧光物质的例子包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、若丹明、二氯三嗪胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光物质的例子包括鲁米诺；而合适的放射性物质的例子包括125I、mI、35S或3H。与标记该抗体二者择一地，利用用可检测物质标记的rhTNFa标准和未标记抗hTNFa抗体，通过竞争免疫检测可以在生物流体中检测hTNFa。在该检测中，将该生物样品、该标记rhTNFa标准和该抗hTNFa抗体混合并测定与该未标记抗体结合的标记rhTNFa标准的量。该生物样品中的hTNFa量与结合至该抗hTNFa抗体的标记rhTNFa标准的量成反比。亦可以用本发明的D2E7抗体检测来自除人类之外的其它物种的TNFa，特别是来自灵长类(例如黑猩猩、狒狒、狨、猕猴和恒河猴)、猪和小鼠的TNFa，因为D2E7可以与这些TNFa的每一种结合(在实施方案4的E小节中进一步讨论)。本发明的抗体和抗体部分能够在体外和体内中和hTNFa活性(参见实施方案4)。另外，至少一些本发明抗体(例如D2E7)可以中和来自其它物种的TNFa。因此，本发明的抗体和抗体部分可以用于例如在含有hTNFa的细胞培养物、在人类受治疗者或在其它具有本发明的抗体可以交叉反应的TNFa的哺乳动物受治疗者(例如黑猩猩、狒狒、狨、猕猴和恒河猴、猪或小鼠)中抑制TNFa活性。在一个实施方案中，本发明提供抑制TNFa活性的方法，该方法包括用本发明的抗体或抗体部分接触TNFa使得TNFa活性被抑制。该TNFa最好是人TNFa。例如，可以在含有或怀疑含有hTNFa的细胞培养物的培养基中加入本发明的抗体或抗体部分，以抑制该培养物中的hTNFa活性。在另一实施方案中，本发明提供在患病的受治疗者中抑制TNFa的方法，在该病中TNFa活性是有害的。已提出TNFa参与许多的各种紊乱的病理生理学(参见例如Moeller，A.等(1990)Cytokine^:162-169;授予Moeller等的美国专利5，231，024;Moeller，A.等的欧洲专利公开260610B1号)。本发明提供在患这种紊乱的受治疗者中有关TNFa活性的方法，该方法包括给与该受治疗者本发明的抗体或抗体部分，使得该受治疗者中的TNFa活性被抑制。最好是，该TNFa是人TNFa并且该受治疗者是人。二者择一地，该受治疗者可以是表达本发明抗体交叉反应的TNFa的哺乳动物。另外的该受治疗者可以是已经导入hTNFa的哺乳动物(例如通过给与hTNFa或通过表达hTNFa转基因)。可以将本发明的抗体以治疗目的给与人受治疗者(以下进一步讨论)。另外，可以将本发明的抗体给与表达该抗体交叉反应的TNFa的非人类哺乳动物(例如灵长类、猪或小鼠)，以达到兽医目的或做为人类疾病的动物模型。有关后者，这种动物模型可以用于评价本发明抗体的治疗效力(例如测试给药的剂量和时间过程)。本文使用的术语"其中TNFa活性是有害的紊乱"包括疾病和其它紊乱，其中在患该素乱的受治疗者中TNFa的存在已显示出或被怀疑或者对该病的病理生理学负责或是造成该病加重的因子。因此，其中TNFa是有害的紊乱是这样一种紊乱，其中TNFa活性的抑制预期将减轻该紊乱的症状和/或进程。这种紊乱可以通过例如患该病的受治疗者的生物流体中TNFa浓度的增加(例如在该受治疗者的血清、血浆、滑液等中TNFa浓度增加)而证实，这可以用上述抗TNFa抗体检测。有许多其中TNFa是有害的紊乱的例子。以下28进一步讨论本发明的抗体和抗体部分在治疗具体紊乱中的用途A.脓毒症肿瘤坏死因子在脓毒症病理生理学中已有确定地位，其生物学效应包括低血压、心肌抑制、血管漏出综合症、器官坏死、剌激释放毒性次级介质和激活凝血级联(参见例如Moeller，A.等(1990)Cytokine^:162-169;授予Moeller等的美国专利5，231，024号；Moeller，A.等的欧洲专利公告260610B1号;Tracery,K.J.和Cerami，A.(1994)A匪.Rev.Med.^:491-503;Russell，D禾口Thompson,R.C.(1993)Curr.Opin.Biotech.4:714-721)。因此，本发明的人抗体和抗体部分可以用于治疗任何临床背景中的脓毒症，包括脓毒症性休克、内毒素性休克、革兰氏阴性脓毒症和毒性休克综合症。另外，为治疗脓毒症，可以将本发明的抗hTNFa抗体或抗体部分与一种或多种可以另外减轻脓毒症的其它治疗药物共给药，所述其他治疗药物为例如白介素-l抑制剂(诸如在PCT说明书W092/16221和W092/17583号中描述的)、细胞因子白介素_6(参见例如PCT说明书WO93/11793号)或血小板激活因子的拮抗剂(参见例如欧洲专利申请公告EP374510号)。在小节III中进一步讨论治疗脓毒症的其它组合疗法。另外，在一个最佳实施方案中，将本发明的抗hTNFa抗体或抗体部分给与一脓毒症病人小组的人受治疗者，这些病人的治疗时的血清或血浆IL-6浓度超过500pg/ml，更优选地超过1000pg/ml(参见DaumL.等的PCT说明书WO95/20978号)。B.自身免疫疾病已发现肿瘤坏死因子在各种自身免疫疾病的病理生理学中起作用。例如，已发现TNFa参与激活组织炎症并引起类风湿性关节炎中的关节破坏(参见例如Moeller，A.等(1990)Cytokine^:162-169;授予Moeller等的美国专利5，231，024号；Moeller，A.等的欧洲专利公开260610B1号；Tracery，K.J.和Cerami，见上述；Arend，W.P.和Dayer，J-M.(1995)Arth.Rheum.巡151-160;Fava，R.A.等(1993)Clin.Exp.Immunol.M:261-266)。亦发现TNFa在糖尿病中参与促进胰岛细胞死亡和介导胰岛素抗性(参见例如Tracery,K.J.和Cerami，见上述；PCT说明书W094/08609号)。亦发现TNFa在多发性硬化中参与介导对少突神经胶质细胞的细胞毒和诱导炎症斑(参见例如Tracey和Cerami，见上述)。已经进行了嵌合和人化鼠抗hTNFa抗体治疗类风湿性关节炎的临床试验(参见例如Elliott,M.J.等(1994)Lancet344:1125-1127:Elliot，M.J.等(1994)Lancet344:1105-1110;Rankin，E.C.等(1995)Br.J.Rheumatol.M:334-342)。本发明的人抗体和抗体部分可以用于治疗自身免疫疾病，特别是那些与炎症有关的自身免疫疾病，包括类风湿性关节炎、类风湿性脊椎炎、骨关节炎和痛风性关节炎、变态反应、多发性硬化症、自身免疫性糖尿病、自身免疫性眼色素层炎和肾病综合症。典型地，系统性给与该抗体或抗体部分，尽管对某些紊乱而言在炎症位点局部给与该抗体或抗体部分是有益的(例如单独或与PCT说明书WO93/19751号描述的环己烷-ylidene衍生物联用，在类风湿性关节炎的关节处局部给与或在糖尿病性溃疡表面涂药)。本发明的抗体或抗体部分亦可以与在III小节中进一步讨论的用于治疗自身免疫疾病的一或多种治疗药物一同给与。C.传染病已发现肿瘤坏死因子参与介导在各种传染病中观察到的生物学效应。例如，已发29现TNFa介导疟疾中的大脑炎症和毛细管血栓形成和梗塞。亦发现TNFa参与介导大脑炎症，诱导脑膜炎中的血脑屏障崩溃、触发脓毒症性休克综合症和激活静脉梗塞。亦发现TNFa在获得性免疫缺陷综合症(AIDS)中参与诱导恶病质、剌激病毒增殖和介导中枢神经系统损伤。因此，可以用本发明的抗体和抗体部分治疗传染病，包括细菌性脑膜炎(参见例如欧洲专利申请公告EP585705号)、脑型症、AIDS和AIDS相关综合症(ARC)(参见例如欧洲专利申请公告EP230574号)、以及移植继发的巨细胞病毒感染(参见例如Fietze，E.等(1994)Transplantation58:675-680)。本发明的抗体和抗体部分亦可以用于减轻与传染病有关的症状，包括因感染(例如流感)引起的发烧和肌痛和感染继发的恶病质(例如AIDS或ARC继发的)。D.移植已发现肿瘤坏死因子可能是同种移植排斥和移植物抗宿主病(GVHD)的关键介质并参与介导在用导向T细胞受体CD3复合物的大鼠抗体0KT3抑制肾移植排斥时观察到的负反应(参见例如Eason，瓜等(1995)Transplantation巡300-305;Suthanthi屋，M.和Strom，T.B.(1994)NewEngl.J.Med.m:365-375)。因此，可以用本发明的抗体和抗体部分抑制移植排斥，包括同种移植和异种移植排斥和抑制GVHD。尽管可以单独使用该抗体或抗体部分，但更优选地将其与一种或多种抑制抗同种移植的免疫应答或抑制GVHD的其它药剂联用。例如，在一个实施方案中，将本发明的抗体或抗体部分与0KT3联用，以抑制OKT3诱导的反应。在另一实施方案中，将本发明的抗体或抗体部分与一或多种导向参与调节免疫应答的其它靶的抗体联用，这些靶例如为细胞表面分子CD25(白介素_2受体-a)、CDlla(LFA-l)、CD54(ICAM-1)、CD4、CD45、CD28/CTLA4、CD80(B7-1)和/或CD86(B7-2)。在再一实施方案中，将本发明的抗体或抗体部分与诸如环孢菌素A或FK506的一或多种一般性免疫抑制剂联用。E.恶性肿瘤已发现肿瘤坏死因子在恶性肿瘤中参与诱导恶病质、剌激肿瘤生长、增强转移潜力和介导细胞毒性。因此，可以使用本发明的抗体和抗体部分治疗恶性肿瘤，抑制肿瘤生长或转移和/或减轻恶性肿瘤继发的恶病质。可以将该抗体或抗体部分系统性给药或局部给与该肿瘤部位。F.肺功能紊乱已知肿瘤坏死因子参与成人呼吸窘迫综合症(ARDS)的病理生理学，包括剌激白细胞-内皮细胞激活、细胞毒性导向肺细胞和诱导血管漏出综合症。因此，可以用本发明的抗体和抗体部分治疗肺功能紊乱，包括成人呼吸窘迫综合症(参见例如PCT说明书WO91/04054号)、休克肺、慢性肺炎、肺结节病、肺纤维化和硅肺。可以将该抗体或抗体部分系统性给药或局部地给与肺表面，例如做为气溶胶。亦可以将本发明的抗体或抗体部分与一种或多种用于治疗肺功能紊乱的其它治疗药物(在III小节中进一步讨论)一同给与。G.肠功能紊乱已发现肿瘤坏死因子参与炎症性肠功能紊乱的病理生理学(参见例如Tracy，K.J.等(1986)Science234:470-474:Sun，X-M.等(1988)J.Clin.Invest.虹1328-1331;MacDonald，T.T.等(1990)Clin.Exp.Immunol.虹301-305)。已进行嵌合鼠抗hTNFa抗体治疗局限性回肠炎的临床试验(vanDullemen，H.M.等(1995)Gastroenterology109:30129-135)。亦可以使用本发明的人抗体和抗体部分治疗肠功能紊乱，例如特发性炎症性肠病，该病包括二种综合症，即局限性回肠炎和溃疡性结肠炎。亦可以将本发明的抗体或抗体部分与一或多种用于治疗肠功能紊乱的治疗药物(在III小节中进一步讨论)一同使用。H.心脏功能紊乱亦可以用本发明的抗体和抗体部分治疗各种心脏功能紊乱，包括心脏局部缺血(参见例如欧洲专利申请公告EP453898号)和心脏功能不全(心肌虚弱)(参见例如PCT说明书WO94/20139号)。I.其它亦可以用本发明的抗体和抗体部分治疗各种其中TNFa活性是有害的其它紊乱。已发现TNFa活性参与其病理生理学并因此可以用本发明抗体或抗体部分治疗的其它疾病和紊乱的例子包括炎症性骨病和骨吸收(参见例如Bertolini，D.R.等(1986)Nature319:516-518;Konig，A.等(1988)J.BoneMiner.Res.2:621-627;Lemer，U.H.和Ohlin，A.(1993)J.BoneMiner.Res.§:147—155;和Shankar，G.和Stem,P.H.(1993)Boneii:871-876)、肝炎，包括酒精性肝炎(参见例如McClain，C.J.和Cohen，D.A.(1989)H印atology豆349—351;Felver，M.E.等(1990)Alcohol.Clin.Exp.Res.ii:255—259;和Hansen,J.等(1994)H印atology巡461-474)、病毒性肝炎(Sheron，N.等(1991)J.H印atol.i^:241-245;和Hussain，M.J.等(1994)J.Clin.Pathol.il:1112-1115)和爆发性肝炎；凝结紊乱(参见例如vanderPoll，T.等(1990)N.Engl.J.Med.322:1622—1627;和vanderPoll，T.等(1991)Prog.Clin.Biol.Res.367:55-60)，烧伤(参见例如Giror，B.P.等(1994)Am.J.Physiol.267:Hl18-124:和Liu，X.S.等(1994)Burns巡40—44)，再灌注损伤(参见例如Scales,W.E.等(1994)Am.J.Physiol.■:Gl122-1127;Serrick，C.等(1994)Transplantation^:1158-1162;禾PYao，Y.M.，等(1995)Resuscitation里157-168)，瘢痕疙瘩形成(参见例如McCauley，R.L.等(1992)J.Clin.Immunol.E:300-308)，瘢痕组织形成；发热；牙周病；肥胖和放射毒性。通过以下实施例进一步描述本发明，这些实施例并不限制本发明。本申请引用的所有参考文献、专利和公开的专利申请通过引用结合到本文中。实施例1:人抗体与hTNFa结合的动力学分析使用BIAcore系统(PharmaciaBiosensor,Piscataway，NJ)通过表面等离子体激元共振(SPR)检测配体(生物素化的重组人TNFa(rhTNFa)，固定于生物传感器基质上)与分析物(溶液中的抗体)之间的实时结合反应。该系统利用SPR的光学特性检测葡聚糖生物传感器基质中蛋白浓度的改变。以已知浓度将蛋白共价结合至该葡聚糖基质。将抗体注射通过该葡聚糖基质，注射抗体和固定化配体之间的特异性结合导致基质蛋白浓度增加并导致SPR信号变化。SPR信号的变化以共振单位(则记录并沿着传感图的y轴随时间显示。为便于将生物素化rhTNFa固定于生物传感器基质上，通过首先用lOOmMN-羟基柠檬酰亚胺(NHS)和400mM盐酸N-乙基-N'-(3-二乙基氨丙基)碳二亚胺(EDC)激活基质上的羧基，将抗生蛋白链菌素通过游离氨基共价连接至该葡聚糖基质。下一步，将抗生蛋白链菌素通过该活化基质注射。将稀释于乙酸钠PH4.5的35微升抗生蛋白链菌素(25yg/ml)注射通过该活化的生物传感器，该蛋白上的游离胺直接结合至该活化的羧基。通过注射1M的乙醇胺失活未反应的基质EDC-酯。抗生蛋白链菌素偶联的生物传感器芯片亦有市售(PharmaciaBR_1000_16，PharmaciaBiosensor,Piscataway，NJ)。通过首先溶解5.0mg生物素(D-生物素_e_氨基己酸N_羟基柠檬酰亚胺酯；BoehringerMannheim目录号1008960)于500y1二甲基亚砜以制备10mg/ml溶液，制备生物素化rhTNFa。每毫升rhTNFa(2.65mg/ml)加入10微升生物素以使生物素与rhTNFa摩尔比为2:1。温和搅拌反应物并于黑暗处于室温保温2小时。用25ml冷PBS平衡装有S印hadexG-25M(Pharmacia目录号17-0851-01)的PD-10柱，并以每根柱2mlrhTNFa-生物素上柱。用10X1ml冷PBS洗脱该柱。收集分部收集液并于0D280读数(1.OOD=1.25mg/ml)。合并适当的分部并储存于-8(TC直至使用。生物素化rhTNFa亦有市售(R&DSystems目录号FTAOO，Minne即olis，MN)。将欲通过抗生蛋白链菌素固定化于该基质上的生物素化rhTNFa稀释于PBS流动缓冲液(Gibco目录号14190-144，GibcoBRL，Grandlsland，NY)，该缓冲液添加了0.05%(BIAcore)表面活性齐UP20(PharmaciaBR_1000_54，PharmaciaBiosensor,Piscataway,NJ)。为测定rhTNFa特异性抗体结合固定化rhTNFa的能力，按下述进行结合检测。以5iU/min的流速将数等份的生物素化rhTNFa(25nM;10等份)注射通过该偶联了抗生蛋白链菌素的葡聚糖基质。在注射该蛋白之前和刚注射完时，仅使PBS缓冲液流过每个流动池。基线和生物素化rhTNFa注射完成后约30秒钟的信号的净差值做为结合值(约500RU)。测定了rhTNFa特异性抗体与固定化生物素化rhTNFa的直接结合。在PBS流动缓冲液中稀释抗体(20g/ml)，并将251的等份以5y1/min的流速注射通过所述固定化蛋白基质。在注射抗体之前和刚注射完时，仅使PBS缓冲液流过每个流动池。基线信号和抗体注射完成后的信号的净差值做为该特定样品的结合值。在注射下一个样品之前用lOOmMHC1再生生物传感器基质。为确定解离速率(K。ff)、结合速率(K。》、结合速率(Ka)和解离速率(Kd)常数，使用了BIAcore动力学评价软件(2.1版)。D2E7(IgG4全长抗体)与生物素化rhTNFa结合的代表性结果以及与之比较的鼠mAbMAK195(F(ab')2片段)，均示于以下表1中。表1:D2E7IgG4或MAK195与生物素化rhTNFa的结合<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>表3:D2E7和生物素化rhTNF之间相互作用的表观结合速率常数<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>表4:D2E7和牛物素化rhTNF的表观动力学谏率常数和亲和件常数<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>用BIA分析软件通过分析该传感图的解离区和结合区计算解离和结合速率常数。以常规化学反应动力学假设D2E7与生物素化rhTNF分子之间的相互作用零阶解离和一阶结合动力学。为了分析的原因，在选择分析该动力学数据的分子模型时仅考虑该二价D2E7抗体的一个臂与该三聚体生物素化rhTNF的一个单位之间的相互作用。进行了三次独立的实验并分别分析其结果。D2E7与生物素化rhTNF之间相互作用的平均表观解离速率常数(Kd)是8.81±1.06X10—5s—、平均表观结合速率常数Ka是1.91±1.26X105M—、—、然后用公式Kd=Kd/Ka计算表观内在解离常数(Kd)。因此，得自动力学参数的D2E7抗体对rhTNF的平均Kd是6.09±3.42X10—1QM。未将D2E7的IgGl形式的动力学值(示于表2、3和4中)和D2E7的IgG4形式的动力学值(示于表1和实施例2和3中)的较小的差别认为是由或者IgGl恒定区或IgG4恒定区的存在产生的真正差别，而认为是由于将更精确的抗体浓度测定用于IgGl动力学分析而造成。因此，认为本文提出的D2E7的IgGl形式的动力学值是该D2E7抗体最精确的动力学参数。实施例2:D2E7CDR3域的丙氨酸扫描诱变通过标准方法沿着D2E7VL区和D2E7VH区的CDR3域导入一系列单丙氨酸突变。所述轻链突变示于图1B(LD2E7*.Al、LD2E7*.A3，LD2E7*.A4、LD2E7*.A5、LD2E7*.A7和LD2E7*.A8，分别于该D2E7VLCDR3的位置1、3、4、5、7或8具有一个丙氨酸突变)。所述重链突变示于图2B(HD2E7*.Al、HD2E7*.A2、HD2E7*.A3、HD2E7*.A4、HD2E7*.A5、HD2E7*.A6、HD2E7*.A7、HD2E7*.A8和HD2E7*.A9，分别于该D2E7VHCDR3域的位置2、3、4、5、6、8、9、10或ll具有一个丙氨酸突变)。将rhTNFa与由野生型D2E7VL和D2E7VH组成的抗体相互作用的动力学与下述组成的抗体的动力学比较1)野生型D2E7VL与丙氨酸置换的D2E7VH配对；2)野生型D2E7VH与丙氨酸置换的D2E7VL配对；或3)丙氨酸置换的D2E7VL与丙氨酸置换的D2E7VH配对。所有的抗体都做为全长IgG4分子进行试验。按照实施例l所述通过表面等离子体激元共振测定抗体与rhTNFa相互作用的动力学。不同VH/VL配对的K。ff速率概括于以下表5中表5:D2E7丙氨酸扫描突变体与生物素化rhTNFa的结合<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>这些结果证明该D2E7VL区和VH区的CDR3域的大多数位置可以经受用单丙氨酸残基置换。与野生型亲本D2E7抗体相比，于该D2E7VLCDR3域的1、4、5或7位或于该D2E7VHCDR3域的2、5、6、8、9或10位的单丙氨酸置换未显著影响hTNFa结合的解离速率。于该D2E7VLCDR3的位置8或于该D2E7VHCDR3的位置3的丙氨酸置换给出了快四倍的K。ff，于D2E7VHCDR3的4或11位的丙氨酸置换给出了快八倍的K。ff，表明这些位点对与hTNFa结合更为关键。然而，于该D2E7VLCDR3域的1、4、5、7或8位或于该D2E7VHCDR3域的2、3、4、5、6、8、9、10或11位的单丙氨酸置换仍然产生一个具有不高于1X10—3的K。ff的抗hTNFa抗体。实施例3:D2E7相关抗体的结合分析按照实施例1所述通过表面等离子体激元共振，分析与D2E7相比的其序列与D2E7相关的一系列抗体。测试的VL区的氨基酸系列示于图1A和1B中。测试的VH区的氨基酸序列示于图2A和2B中。各种VH/VL配对(在所示的形式中，或者做为全长IgGl或IgG4抗体或做为scFv)的K。ff速率概括于以下表6中表6:D2E7相关抗体与生物素化rhTNFa的结合<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>具有选自D2E7、L0E7、L0E7.T和L0E7.A的VL(它们在位置9或者有一个苏氨酸或有丙氨酸)的全长抗体(即IgG形式)的慢解离速率(即K。ff《1X10—4sec—O，表明该D2E7VLCDR3的位置9可以由这二种残基之一占据而大致不影响K。FF。因此，该D2E7VLCDR3的共有基序包含氨基酸序列:Q-R+N-R-A-P-Y-(T/A)(SEQIDNO:3)。另夕卜，具有选自D2E7、VH1-D2.N和VH1-D2.Y的VH(它们在位置12或者有酪氨酸或有天冬酰胺)的抗体的慢解离速率(即K。ff《1X10—4sec—"，表明该D2E7VHCDR3的位置12可以由这二种残基之一占据而大致不影响K。ff。因此，该D2E7VHCDR3的共有基序包含氨基酸序列V-S-Y-L-S-T-A-S-S-L-D(Y/N)(SEQIDNO:4)。示于表6中的结果证明，在scFv形式下，与含有该D2E7VL或VHCDR3区的抗体相比，含有2SD4VL或VHCDR3区的抗体表现出更快的K。ff(即K。ff>IX10—3sec—0。在该VLCDR3内，2SD4在2、5和9位与D2E7不同。然而，如上述讨论，9位可以由Ala(如在2SD4中)或Thr(如在D2E7中)占据而基本不影响K。ff。因此，通过比较2SD4和D2E7，可以鉴定出该D2E7VLCDR3的2和5位(都是精氨酸)对该抗体与hTNFa结合是关键的。这些残基可以做为该抗体结合位点的接触残基直接参与或可以对保持在该区抗体分子的支架结构起关键作用。关于位置2的重要性，用Lys(在EPB12中)取代Arg(在L0E7中，它与D2E7具有相同的VLCDR3)以2倍系数加速解离速率。关于位置5的重要性，如实施例2所述，用Ala(在LD2E7承A5)取代Arg(在D2E7中)亦加速解离速率2倍。另外，在2和5位均无Arg时(在2SD4中)，解离速率快5倍。然而，应注意尽管位置5对增强与hTNFa结合是重要的，但此位置的变化可以由其它位置的变化抵消，如在VLL0E4、VLL0H1或VLO.1H8中观察到的。在该VHCDR3中，2SD4在1、7和12位与D2E7不同。然而，如上述讨论，12位可以由Asn(如在2SD4中)或Tyr(如在D2E7中)占据而基本不影响K。ff。因此，通过比较2SD4和D2E7，可以鉴定出该D2E7VHCDR3的l和7位对与hTNFa结合是关键的。如上述讨论，这些残基可以做为该抗体结合位点的接触残基直接参与或可以对保持在该区抗体分子的支架结构起关键作用。这二个位置对与hTNFa结合都是重要的，因为使用3C-H2VHCDR3(它相对于D2E7VHCDR3而言，在位置1有一个缬氨酸变为丙氨酸的变化)时，该scFv的解离速率比用D2E7VHCDR3时快3倍，但该解离速率仍然比使用2SD4VHCDR3时慢4倍(它相对于D2E7VHCDR3而言在位置1和7都有变化)。实施例4:D2E7的功能活性为检查D2E7的功能活性，将该抗体用于几个或者体外或者体内测定该抗体抑制hTNFa活性的能力的检测之中。A.在L929细胞中中和TNFa诱导的细胞毒性在培育18-24小时后，人重组TNFa(rhTNFa)引起对鼠L929细胞的细胞毒性。如下述通过共温育抗体与rhTNFa和所述细胞，在L929检测中评价人抗hTNFa抗体。将含有100iil抗hTNFaAbs的96孔微滴定板用含有10%胎牛血清(FBS)的RPMI培养基沿着该板双份进行1/3连续稀释。加入50iUrhTNFa使每个样品孔的最终浓度为500pg/ml。然后将所述板于室温温育30分钟。接着，加入含有1yg/ml放线菌素D的50ii1TNFa敏感型L929小鼠成纤维细胞，使最终浓度为每孔5X104细胞。对照包括培养基加细胞和rhTNFa加细胞。这些对照和范围为2ng/ml至8.2pg/ml的一个TNFa标准曲线用于测定该检测的质量并提供一个中和窗口。然后将这些板于37t:在5%C02中培育过夜(18-24小时)。从每个孔中取出100ill培养基，并加入50ii1PBS中的5mg/ml溴化3，(4，4_二甲基噻唑-2-基)2，5-二苯基-四唑鎗(MTT;可从SigmaChemicalCo.，St.Louis，MO购得)。然后将这些板于37t:培育4小时。然后加入50ill的20%十二烷基硫酸钠(SDS)至每个孔中，并将这些板于37t:培育过夜。测定570/630nm的光密度，为每个样品绘制曲线并通过标准方法确定IC5。。与鼠MAK195mAb的相比，具有各种VL和VH配对的人抗体的代表性的结果示于图3和下表7中。表7:中和TNFa诱导的L929细胞毒性<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table><formula>formulaseeoriginaldocumentpage41</formula>该系列实验证明，全长IgGl形式的D2E7以平均IC5。[M]为1.25±0.01X10—w中和TNFa诱导的L929细胞毒性。B.抑制TNFa与U_937细胞上的TNFa受体结合使用表达hTNFa受体的人组织细胞系U_937细胞系(ATCCNo.CRL1593)检测人抗hTNFa抗体抑制hTNFa与细胞表面hTNFa受体结合的能力。将U_937生长于RPMI1640培养基中，该培养基添加了10%胎牛血清(HycloneA-llll，HycloneLaboratories,Logan，UT)、L_谷氨酰胺(4nM)、HEPES缓冲液(10mM)、青霉素(100yg/ml)和链霉素(100iil/ml)。为检测全长IgG抗体的活性，用添加了lmg/ml人IgG(SigmaI-4506，SigmaChemicalCo.，St.Louis,M0)的PBS在冰上预培养U-937细胞45分钟，然后用结合缓冲液清洗细胞三次。为进行受体结合检测，将U-937细胞(5X106细胞/孔)在96孔微滴定板(Costar3799，CostarCorp.，Cambridge,MA)中的结合缓冲液(PBS，添加了0.2%牛血清白蛋白)与125I标记的rhTNFa(3X10—10M;25iiCi/ml;得自NENResearchProducts,Wilmington,DE)、加或不加抗hTNFa抗体、总体积为0.2ml中温育。将该板在冰上培养1.5小时。然后，将各75iU的样品转移至含有邻苯二甲酸二丁酯(SigmaD_2270，SigmaChemicalCo.，St.Louis，M0)和邻苯二甲酸二癸酯(ICN210733，ICN，Irvine,CA)的1.0mli式管(Sarstedt72.700，SarstedtCorp.，Princeton,NJ)。所述试管分别含有体积比为2:1的邻苯二甲酸二丁酯和邻苯二甲酸二癸酯的3001混合物。通过微量离心5分钟除去游离的(即未结合的)1251标记的rhTNFa。然后，借助微试管剪刀(Bel-Art210180001，Bel-ArtProducts,Pequannock,NJ)剪下每个含有细胞沉淀的试管末端。该细胞沉淀含有与p60或p80TNFa受体结合的125I标记的rhTNFa，而油混合物上的水相则含有多余的游离125I标记的rhTNFa。将所有的细胞沉淀收集于计数管(Falcon2052，BectonDickinsonLabware，LincolnPark,NJ)并于闪烁计数器中计数。代表性的结果示于图4。在这些实验中，D2E7对hTNFa与U_937细胞上的hTNFa受体结合的抑制的ICs。值为约3X10—1QM。这些结果证明该D2E7人抗hTNFa抗体以与鼠抗hTNFamAbMAK195基本相同的浓度抑制rhTNFa与U-937细胞上的hTNFa受体结合。在另一系列实验中，按照上述检测了D2E7的IgGl形式抑制rhTNFa与U-937细胞上的hTNFa受体结合的能力。在以下表9中概括了三个独立实验的结果及其平均值表9:D2E7IgGl抑制U-937细胞上TNF受体结合实验IC50[M]11.70X10—1021.49X10—1041<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>该系列实验证明，全长IgGl形式的D2E7以平均IC5。[M]为1.56±0.12X10—"抑制U-937细胞上TNF受体结合。为研究D2E7对125I_rhTNF与单个p55和p75受体结合抑制的能力，进行固相放射免疫检测。为测定D2E7对独立TNF受体的IC5。值，将各种浓度的该抗体与3X10-10浓度的125I-hTNF—同培育。然后以剂量依赖性方式在含有或者p55TNF受体或者p75TNF受体的独立平板上检测该混合物。结果概括于下表10:表10:D2E7IgGl对TNF受体与p55和p75TNFR结合的抑制<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>由D2E7对125I_rhTNF与U937细胞上的p55和p75TNF受体的结合抑制遵循简单的S形曲线，表明每个受体的ICs。值相似。在用重组TNF受体的固相放射免疫检测(RIA)实验中，D2E7对125I-rhTNF与所述p55和p75受体结合抑制的IC5。值分别计算为1.47X10—9和1.26X10—9M。在固相中IC5。值的降低可能是因为在该RIA形式中受体密度较高，而未标记rhTNFa亦以类似IC5。值进行抑制。未标记rhTNF对125I_rhTNF与p55和p75受体结合抑制的IC5。值分别为2.31X10—9和2.70X10—9。C.抑制ELAM-1在HUVEC上表汰通过用rhTNFa处理，可以诱导人脐静脉内皮细胞(HUVEC)在其表面表达内皮细胞白细胞粘附分子(ELAM-1)，通过用鼠抗人ELAM-1抗体与rhTNFa处理的HUVEC反应可以检测到该分子。如下述检测人抗hTNFa抗体抑制该TNFa诱导的ELAM-1在HUVEC上表达的能力将HUVEC(ATCCNo.CRL1730)平板接种于96孔平板(5X104细胞/孔)并于37t:培养过夜。第二天，以20-100iig/ml抗体为起点，在微滴定板中进行人抗hTNFa抗体的连续稀释(1:10)。制备4.5ng/ml的rhTNFa贮液，将等份的rhTNFa加入每个含有抗体的孔中，并彻底混合内容物。对照包括培养基自身、培养基加抗hTNFa抗体和培养基加rhTNFa。将HUVEC平板从其37。C过夜培养中移出，并温和地从每个孔中吸出培养基。向所述HUVEC平板的每个孔中转移200ill的该抗体-rhTNFa混合物。然后将所述HUVEC平板在37t:再培育4小时。接着，将鼠抗ELAM-1抗体贮液在RPMI中稀释1:1000。从该HUVEC平板的每个孔中温和地吸出培养基，加入50ii1/孔的该抗ELAM-1抗体溶液并于室温将所述HUVEC平板培育60分钟。在RPMI中制备125I标记的抗鼠Ig抗体溶液(约50，OOOcpm/50y1)。将所述HUVEC平板的每个孔中的培养基温和地吸出，用RPMI清洗这些孔二次，然后向每个孔中加入50iU的125I标记的抗鼠Ig溶液。将所述平板于室温培育1小时，然后用RPMI清洗每个孔三次。向每个孔中加入180ill的5%SDS以裂解所述细胞。将每个孔中的溶胞物转移至试管中并于闪烁计数器中计数。代表性结果示于图5中。在这些实验中，D2E7对hTNFa诱导的ELAM-1在HUVEC上表达的抑制的ICs。值为约6X10—"M。这些结果证明该D2E7人抗hTNFa抗体以与鼠抗hTNFamAbMAK195基本相同的浓度抑制hTNFa诱导的ELAM-1在HUVEC上的表达。在另一系列实验中，按照上述检测了D2E7的IgGl形式抑制hTNFa诱导的ELAM-l在HUVEC上的表达的能力。在以下表11中概括了三个独立实验的结果及其平均值表11:D2E7IgGl受体抑制TNFa诱导的ELAM-1表达<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>该系列实验证明，全长IgGl形式的D2E7以平均IC5。[M]为1.85±0.14X10—10抑制TNFa诱导的ELAM-1在HUVEC上的表达。亦检测了D2E7IgGl对rhTNF诱导的其它二种粘附分子ICAM-1和VCAM-1的表达的中和能力。因为于16小时的ICAM-1表达的rhTNF效价曲线与ELAM-1表达的曲线非常相似，因此在该抗体中和实验中使用了同样浓度的rhTNF。在各种浓度的D2E7存在下，将HUVEC与rhTNF于37°CC02培养箱中培养16小时，通过鼠抗ICAM-1抗体后加125I标记的羊抗鼠抗体测定ICAM-1的表达。进行二次独立的实验并计算ICs。值。一种不相关人IgGl抗体没有抑制该ICAM-1表达。测试VCAM-1表达抑制的实验程序与用于ELAM-1表达的程序相同，但是使用了抗VCAM-lMAb代替抗ELAM-lMAb。进行了三次独立的实验并计算IC5。值。一种不相关人IgGl抗体没有抑制该VCAM-1表达。结果概括于下表12中表12:D2E7IgGl抑制ICAM-1和VCAM-1表汰<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>这些实验证明用rhTNF处理原代人脐静脉内皮细胞导致粘附分子的最佳表达ELAM-IH和VCAM-l在第4小时，ICAM-l的最大向上调节表达在第16小时。D2E7能够以剂量依赖性方式抑制这三种粘附分子的表达。抑制ELAM-l、ICAM-l和VCAM-l的IC5。值分别是1.85X10—1Q、2.17X10—"和1.01X10—1QM。这些值非常相似，表明诱导ELAM_1、ICAM_1和VCAM-l表达对rhTNF激活信号剂量的要求相似。有意义的是，D2E7在该ICAM-l表达的较长久的抑制检测中有相似效力。该ICAM-l抑制检测需要将rhTNF和D2E7与HUVEC共培育16小时，与之相反，ELAM-l和VCAM-l抑制检测需要4小时。因为D2E7对rhTNF有慢解离速率，可以相信在该16小时共培育期间在HUVEC上的TNF受体没有显著竞争。D.体内中和hTNFa使用了三种不同的体内系统以证明D2E7有效地在体内抑制hTNFa活性。I.在D-半乳糖胺致敏的小鼠中抑制TNF诱导的致死件给D-半乳糖胺致敏的小鼠注射重组人TNFa(rhTNFa)导致在24小时内的致死性。已表明TNFa中和剂可以在此模型中防止致死性。为检测人抗hTFa抗体在此模型中体内中和hTNFa的能力，用PBS中的各种浓度的D2E7_IgGl或对照蛋白腹膜内注射C57B1/6小鼠。30分钟后，用PBS中的liigrhTNFa和20mgD_半乳糖胺腹膜内注射攻击小鼠，并于24小时后观察。已预先确定这些量的rhTNFa和D_半乳糖胺在这些小鼠中达到80-90%的致死性。代表性结果以存活百分比对抗体浓度做成柱状图表示于图6中。实心柱代表D2E7，而空心柱代表MAK195。每只小鼠注射2.5_25ygD2E7抗体保护这些动物不受TNFa诱导的致死性影响。EDs。值约为1-2.5yg/小鼠。阳性对照抗体MAK195在保护能力方面相似。在没有rhTNFa的情况下注射D2E7对小鼠没有任何有害影B向。注射非特异性人IgGl抗体没有提供任何免于TNFa诱导的致死性的保护。在第二个实验中，将49只小鼠分成7个相等的组。每组在接受LD8。剂量的rhTNF/D-半乳糖胺混合物(1.0i！grhTNF和20mgD_半乳糖胺/小鼠)的30分钟之前接受了各种剂量的D2E7。对照组7接受了25yg/小鼠剂量的正常人IgGlk抗体。24小时后检查小鼠。各组的存活率概括于下表13中。表13:用D2E7处理24小时后的存活率<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>11抑制TNF诱导的兔发热检测了D2E7抑制rhTNF诱导的兔发热反应的效力。用D2E7、rhTNF和D2E7与rhTNF的免疫复合物静脉注射三只一组重约2.5kg的每一只NZW雌兔。用Kaye热记录仪的热敏电阻探头测定每分钟的直肠温度约4小时。在注射后约45分钟，盐水中的以5iig/g注射的重组人TNF导致温度上升超过0.4°C。直至注射后140分钟，溶于盐水并以138yg/kg剂量单独的抗体制剂没有导致兔子温度上升。在所有的进一步实验中，将D2E7或对照试剂(人IgGl或盐水载体)静脉注射给兔子。并于15分钟后静脉注射盐水中5g/kg的rhTNF。几个实验的代表性结果概括于下表14:表14:用D2E7在兔子中抑制rh-TNF诱导的发热<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>*=峰值温度**=抑制百分比=(1-{使用rhTNF和D2E7时的温度上升/仅使用rhTNF时的温度上升1)X100与仅用盐水预治疗的兔子相比，用14g/kg的剂量的D2E7静脉预治疗部分地抑制该热原反应。以137iig/kg给与的D2E7在同一实验中完全抑制了rhTNF的热原反应。在第二个实验中，与仅用盐水预治疗的兔子相比，以24yg/kg给与的D2E7亦部分地抑制该热原反应。在这个实验中，D2E7与rhTNF的摩尔比是1/6:1。在第三个实验中，与盐水中的30iig/kg的对照人IgGl预治疗的兔子相比，以48iig/kg(摩尔比D2E7:rhTNF=3.3:1)静脉注射的D2E7完全抑制了该热原反应。在最后一个实验中，用很高D2E7:rhTNF(55:1)摩尔比的D2E7(792yg/kg)预治疗的兔予在直至观察的4个小时内的任何时刻体温都升高。用将D2E7和rhTNF的混合物(摩尔比55:1)于37。C培育1小时制备的免疫复合物治疗兔子亦未引起在同一实验中的任何温度上升。III.在Tgl97转基因小鼠中预防多关节炎在转基因鼠关节炎模型中研究D2E7对疾病发展的影响。已制备表达人野生型TNF(在所述编码序列的3'区内修饰)的转基因小鼠(Tgl97)，并且这些小鼠在4-7周龄时100%发生慢性多关节炎(参见EMBOJ.(1991)盖4025-4031有关多关节炎Tgl97模型的进一步描述)。通过PCR在年龄为三天时识别转基因动物。将一窝转基因小鼠分成六组。在年龄为15天时通过槽印迹杂交分析确认转基因小鼠。按下述程序治疗这六个组1组=未治疗；2组=盐水(载体)；3组=1.5iig/g的D2E7;4组=15yg/g的D2E7;5组=30yg/g的D2E7;和6组=30iig/g的IgGl同种型对照。将一窝非转基因小鼠亦包括于本研究中做为对照(7组-非转基因；未治疗)。每组每周接受指明的治疗的三次腹膜内注射。注射持续10周。每周，记录每个动物的关节形态的宏观变化。第10周时，处死所有的小鼠并将小鼠组织收集于福尔马林中。对该组织进行显微镜检查。在每周开始时记录每只小鼠的动物重量克数。同时记录测定的关节尺寸(mm)以做为疾病严重性的尺度。用测微仪三次测定后右踝的平均值做为关节尺寸。每周按照下述记录关节分数0=无关节炎，(正常外观和弯曲)；+=轻微关节炎(关节变形)；++=中等关节炎(肿胀，关节变形)和+++=严重关节炎(在屈曲检测到关节强硬和严重运动受损)。根据关节切片的苏木精/曙红染色的组织病理学计分按下述进行0=未检测到疾病；1=滑膜增生；2=严重滑液加厚；3=软骨破坏和骨侵蚀。D2E7治疗对该Tgl97转基因关节炎小鼠的平均关节尺寸的影响示于图9的曲线图中。11周龄时该Tgl97转基因小鼠的组织病理学和关节炎计分概括于下表15中表15:D2E7对Tgl97小鼠组织病理学和关节炎计分的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>该实验证明D2E7抗体对表达野生型人TNF的转基因小鼠(Tgl97)具有明确有益效果，在本研究时期后没有可证实的关节炎。E.D2E7中和来自其它物种的TNFa利用L929细胞毒性检测(如上述实施例4A小节所述)，通过检测D2E7中和来自各种灵长类物种和来自小鼠的肿瘤坏死因子检测其结合特异性。结果概括于下表16中表16:D2E7在L929检测中中和来自不同物种TNF的能力TNFa承<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>表16中的结果证明，D2E7可以以约等于人TNFa的情况中和五种灵长类TNFa的活性，而且可以中和犬TNFa(约比人TNFa差10倍)、猪和鼠TNFa(约比人TFa差IOOO倍)。另外，D2E7与溶液相rhTNFa的结合未受其它细胞因子(例如淋巴细胞毒素(TFP)、IL-la、IL-lP、IL-2、IL_4、IL_6、IL_8、IFNy和TGFP)抑制，表明D2E7对其配体TNFa具有非常的特异性。F.用D2E7培育的人全血缺乏细朐闵子释放在该实施例中，检测了D2E7本身诱导正常人血液细胞分泌细胞因子或排出细胞表面分子的能力。将D2E7与来自三个不同正常献血者的稀释全血于不同浓度培育24小时。同时进行LPS阳性对照，其浓度已预先确定可以剌激免疫活性血细胞分泌细胞因子。收集上清液并在有10种可溶性细胞因子、受体和粘附分子(IL-la、IL-l13、IL-l受体拮抗剂、IL-6、IL-8、TNFa、可溶性TNFa受体1、可溶性TNFa受体11、可溶性ICAM-1和可溶性E-selectin)的ELISA药盒嵌板中检测。直至浓度为343yg/ml，由于D2E7抗体共培育的结果，没有检测到显著数量的细胞因子或排出细胞表面分子。未加入该抗体的对照培养物亦未产生可检测量的细胞因子，而LPS共培养对照产生了pg至ng范围的较高的值。这些结果表明D2E7没有诱导全血细胞离体培养中分泌高出正常水平的细胞因子或排出细胞表面蛋白。所附的顺序表构成了本说明书的一部分，该表的内容概括于下表中<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>等价物仅仅使用常规实验，本领域技术人员将会识别或能够确定许多与本文描述的本发明的具体实施方案的等价物。这种等价物包括于下列权利要求之内。序列表(1)—般资料(i)申请人(A)收信人BASFAktiengesellschaft(B)街道Carl-BoschStr.38(C)城市67056Ludwigshafen(D)州Rheinland-Pfalz(E)国家德意志联邦共和国(ii)发明名称结合人TNFa的人抗体(iii)序列数37(iv)通信地址(A)收信人LAHIVE&COCKFIELD(B)街道60StateStreet,suite510(C)城市波士顿(D)州麻省(E)国家美国(F)邮政编码02109-1875(v)计算机可读形式(A)媒体类型软盘(B)计算机IBMPC兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentInRelease#l.0，版本#1.25(vi)当前申请数据(A)申请号(B)提交日期(C)分类(vii)在先申请数据(A)申请号US08/599，22650(B)提交日期1996年2月9日(vii)在先申请数据(A)申请号US60/031，476(B)提交日期1996年11月25日(viii)代理律师/代理人资料(A)姓名DeConti，GiulioA.，Jr.(B)注册号31,503(C)参考/档案号BBI-043CPPC(ix)电讯资料(A)电i舌:(617)227-7400(B)传真(617)227-5941(2)SEQIDNO:1的信息:(i)顺序特征:(A)长度107个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(V)片段类型内部(xi)顺序描述:SEQIDNO:1:AsplieGinMetThrGinSerProSer1AspArgVal5lieThrLeuAlaTyrSer65GluAla50GlyTrp35AlaThr20TyrGinGinSerThrLeuCysArgAla25LysProGly40GinSerGly55PheThrLeuSer10SerLeuSerGinGlyLysAlaProValProSerGlyThrAsp70TyrTyrCysGinAspValAlaThr85GlyThrPheGlyGin100(2)SEQIDNO:2的信息(i)顺序特征:(A)长度121个(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽ThrLysValGlu105ThrArg90lielie75TyrLysSer60SerAsnAlaSerVal15lieArgAsn30LysLeuLeu45ArgPheSerSerLeuGinArgAlaPro95GlyTyrlieGlyPro80Tyr(v)片段类型:内部(xi)顺序描述:SEQIDNO:2:GluValGinLeuValGluSerGlyGlyGly1510SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGly2025AlaMetHisTrpValArgGinAlaProGly3540SerAlalieThrTrpAsnSerGlyHislie5055GluGlyArgPheThrlieSerArgAspAsn6570LeuGinMetAsnSerLeuArgAlaGluAsp8590AlaLysValSerTyrLeuSerThrAlaSer100105GinGlyThrLeuValThrValSerSer115120(2)SEQIDNC>:3的信息(i)顺序特征(A)长度:9个氨基酸(B)类型:氨基酸(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(v)片段类型:内部(ix)特征:(A)名称/关键词修饰位点(B)位置:9(D)其它信息:/注释="Xaa为Thr或Ala"(xi)顺序描述SEQIDNO:3:GinArgTyrAsnArgAlaProTyrx朋15(2)SEQIDNC>:4的信息(i)顺序特征(A)长度:12个氨基酸(B)类型:氨基酸(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(v)片段类型:内部LeuValGinProGlyArg15PheThrPheAspAspTyr30LysGlyLeuGluTrpVal45AspTyrAlaAspSerVal60AlaLysAsnSerLeuTyr7580ThrAlaValTyrTyrCys95SerLeuAspTyrTrpGly110(ix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置12(D)其它信息/注释="Xaa为Tyr或Asn"(xi)顺序描述SEQIDNO:4:ValSerTyrLeuSerThrAlaSerSerLeuAspxaa1510(2)SEQIDNO:5的信息:(i)顺序特征(A)长度7个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(V)片段类型内部(xi)顺序描述SEQIDNO:5:AlaAlaSerThrLeuGinSer15(2)SEQIDNO:6的信息:(i)顺序特征(A)长度17个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(V)片段类型内部(xi)顺序描述SEQIDNO:6:AlalieThrTrpAsnSerGlyHislieAspTyrAlaAspSerValGlu151015Gly(2)SEQIDNO:7的信息:(i)顺序特征(A)长度ll个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(V)片段类型内部(xi)顺序描述SEQIDNO:7:ArgAlaSerGinGlylieArgAsnTyrLeuAla1510(2)SEQIDNO:8的信息:(i)顺序特征(A)长度5个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(V)片段类型内部(xi)顺序描述:SEQIDNO:8:AspTyrAlaMetHis15(2)SEQIDNO:9的信息:(i)顺序特征(A)长度107个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(V)片段类型内部(xi)顺序描述:SEQIDNO:9:AsplieGinMetThrGinSerProSerSerLeuSerAlaSerlie151015AspArgValThrlieThrCysArgAlaSerGinGlylieArgAsn202530LeuAlaTrpTyrGinGinLysProGlyLysAlaProLysLeuLeu354045TyrAlaAlaSerThrLeuGinSerGlyValProSerArgPheSer505560SerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrlieSerSerLeuGin657075GluAspValAlaThrTyrTyrCysGinLysTyrAsnSerAlaPro859095AlaPheGlyGinGlyThrLysValGlulieLys100105(2)SEQIDNO:10的信息:(i)顺序特征(A)长度121个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(V)片段类型内部(xi)顺序描述:SEQIDNO:10:47/55页GlyTyrlieGlyPro80TyrGinValGinLeuValGluSerGlyGlyGlyLeuValGinProGlyArg151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheAspAspTyr202530AlaMetHisTrpValArgGinAlaProGlyLysGlyLeuAspTrpVal354045SerAlalieThrTrpAsnSerGlyHislieAspTyrAlaAspSerVal505560GluGlyArgPheAlaValSerArgAspAsnAlaLysAsnAlaLeuTyr65707580LeuGinMetAsnSerLeuArgProGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095ThrLysAlaSerTyrLeuSerThrSerSerSerLeuAspAsnTrpGly100105110GinGlyThrLeuValThrValSerSer115120(2)SEQIDNO:11的信息(i)顺序特征(A)长度9个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(V)片段类型内部(xi)顺序描述:SEQIDNO:11:GinLysTyrAsnSerAlaProryrAla15(2)SEQIDNO:12的信息(i)顺序特征(A)长度9个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(V)片段类型内部(xi)顺序描述:SEQIDNO:12:GinLysTyrAsnArgAlaProTyrAla15(2)SEQIDNO:13的信息(i)顺序特征(A)长度9个氨基酸[O478](B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(V)片段类型内部(xi)顺序描述SEQIDNO:13:GinLysTyrGinArgAlaProTyrThr15(2)SEQIDNO:14的信息:(i)顺序特征(A)长度9个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(V)片段类型内部(xi)顺序描述SEQIDNO:14:GinLysTyrSerSerAlaProTyrThr15(2)SEQIDNO:15的信息:(i)顺序特征(A)长度9个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(V)片段类型内部(xi)顺序描述SEQIDNO:15:GinLysTyrAsnSerAlaProTyrThr15(2)SEQIDNO:16的信息:(i)顺序特征(A)长度9个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(V)片段类型内部(xi)顺序描述SEQIDNO:16:GinLysTyrAsnArgAlaProTyrThr15(2)SEQIDNO:17的信息:(i)顺序特征[O517](A)长度9个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(V)片段类型内部(xi)顺序描述SEQIDNO:17:GinLysTyrAsnSerAlaProTyrTyr15(2)SEQIDNO:18的信息:(i)顺序特征(A)长度9个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(V)片段类型内部(xi)顺序描述SEQIDNO:18:GinLysTyrAsnSerAlaProTyrAsn15(2)SEQIDNO:19的信息:(i)顺序特征(A)长度9个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(V)片段类型内部(xi)顺序描述SEQIDNO:19:GinLysTyrThrSerAlaProTyrThr15(2)SEQIDNO:20的信息:(i)顺序特征(A)长度9个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(V)片段类型内部(xi)顺序描述SEQIDNO:20:GinLysTyrAsnArgAlaProTyrAsn15(A)长度9个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(V)片段类型内部(xi)顺序描述SEQIDNO:21:GinLysTyrAsnSerAlaAlaTyrSer15(2)SEQIDNO:22的信息:(i)顺序特征(A)长度9个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(V)片段类型内部(xi)顺序描述SEQIDNO:22:GinGinTyrAsnSerAlaProAspThr15(2)SEQIDNO:23的信息:(i)顺序特征(A)长度9个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(V)片段类型内部(xi)顺序描述SEQIDNO:23:GinLysTyrAsnSerAspProTyrThr15(2)SEQIDNO:24的信息:(i)顺序特征(A)长度9个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(V)片段类型内部(xi)顺序描述SEQIDNO:24:GinLysTyrlieSerAlaProTyrThr15(2)SEQIDNO:25的信息:(i)顺序特征(A)长度9个氨基酸(b)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(V)片段类型内部(xi)顺序描述SEQIDNO:25:GinLysTyrAsnArgProProTyrThr15(2)SEQIDNO:26的信息:(i)顺序特征(A)长度9个氨基酸(b)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(V)片段类型内部(xi)顺序描述SEQIDNO:26:GinArgTyrAsnArgAlaProTyrAla15(2)SEQIDNO:27的信息:(i)顺序特征(A)长度12个氨基酸(b)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(V)片段类型内部(xi)顺序描述SEQIDNO:27:AlaSerTyrLeuSerThrSerSerSerLeuAspAsn1510(2)SEQIDNO:28的信息:(i)顺序特征(A)长度12个氨基酸(b)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(V)片段类型内部(xi)顺序描述SEQIDNO:28:AlaSerTyrLeuSerThrSerSerSerLeuAspLys1510(2)SEQIDNO:29的信息:(i)顺序特征(A)长度12个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(V)片段类型内部(xi)顺序描述SEQIDNO:29:AlaSerTyrLeuSerThrSerSerSerLeuAspTyr1510(2)SEQIDNO:30的信息:(i)顺序特征(A)长度12个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(V)片段类型内部(xi)顺序描述SEQIDNO:30:AlaSerTyrLeuSerThrSerSerSerLeuAspAsp1510(2)SEQIDNO:31的信息:(i)顺序特征(A)长度12个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(V)片段类型内部(xi)顺序描述SEQIDNO:31:AlaSerTyrLeuSerThrSerPheSerLeuAspTyr1510(2)SEQIDNO:32的信息:(i)顺序特征(A)长度12个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(V)片段类型内部(xi)顺序描述SEQIDNO:32:AlaSerTyrLeuSerThrSerSerSerLeuHisTyr1510(2)SEQIDNO:33的信息:(i)顺序特征(A)长度12个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(V)片段类型内部(xi)顺序描述SEQIDNO:33:AlaSerPheLeuSerThrSerSerSerLeuGluTyr1510(2)SEQIDNO:34的信息:(i)顺序特征(A)长度12个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(V)片段类型内部(xi)顺序描述SEQIDNO:34:AlaSerTyrLeuSerThrAlaSerSerLeuGluTyr1510(2)SEQIDNO:35的信息:(i)顺序特征(A)长度12个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(V)片段类型内部(xi)顺序描述SEQIDNO:35:ValSerTyrLeuSerThrAlaSerSerLeuAspAsn1510(2)SEQIDNO:36的信息:(i)顺序特征(A)长度321个核苷酸(B)类型核酸(C)类型双链(D)拓扑学线性61(ii)分子类型:cDNA(xi)顺序描述SEQIDNO:31:GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCATCACTTGTCGGGCMGTCAGGGCATCAGAGGGAMGCCCCTMGCTCCTGATCTATGCTCGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATGMGATGTTGCMCTTATTACTGTCAMGGGGGACCMGGTGGAMTCMA(2)SEQIDNO:37的信息:(i)顺序特征:(A)长度363个核苷酸(B)类型核酸(C)类型双链(D)拓扑学线性(ii)分子类型:cDNA(xi)顺序描述SEQIDNO:31:GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTCCTGTGCGGCCTCTGGATTCACCTTTGATCCAGGGMGGGCCTGGMTGGGTCTCAGCTGCGGACTCTGTGGAGGGCCGATTCACCATCCTGCAMTGAACAGTCTGAGAGCTGAGGATTACCTTAGCACCGCGTCCTCCCTTGACTATAGTCTGTCTGCATCTGTAGGGGAMTTACTTAGCCTGGTATCAGCATCCACTTTGCMTCAGGTTCACTCTCACCATCAGCAGTATMCCGTGCACCGTATACTTGGTACAGCGATTATGCCAATCACTTGGATCCAGAGACAACGGCCGTATTGGGGCCMGCAGAGTCACCGCAMMCCAGGTCCCATCTCCTACAGCCTTTTTGGCCAGCCGGCAGGTCTGCACTGGGTATAGTGGTCAACGCCMGMATTACTGTGCGTACCCTGGTCCTGAGACTCCCGGCMGCTCATAGACTATCTCCCTGTATGAMGTCTCGCACCGTCTCG60120180240300321601201802403003603636权利要求被至少一个功能性分子衍生化或连接的分离的人抗体或其抗原结合部分，其中所述的人抗体以不高于1×10-8M的Kd和不高于1×10-3s-1的Koff速率常数与人TNFα解离，其中所述常数都是由表面等离子体激元共振测定，并在标准的体外L929检测中以不高于1×10-7M的IC50中和人TNFα细胞毒性。2.被至少一个功能性分子衍生化或连接的分离的人抗体或其抗原结合部分，其中所述的人抗体具有以下特征a)根据表面等离子体激元共振测定，它以不高于1X10—3s—1的K。ff速率常数与人TNFa解离；b)具有轻链CDR3域，其中所述CDR3域包含SEQIDNO:3的氨基酸序列，或通过对SEQIDNO:3位置1、4、5、7或8进行单丙氨酸置换修饰得到的氨基酸序列，或通过对SEQIDNO:3位置1、3、4、6、7、8和/或9进行1_5个氨基酸的保守替换修饰得到的氨基酸序列；c)具有重链CDR3域，其中所述CDR3域包含SEQIDNO:4的氨基酸序列，或通过对SEQIDNO:4位置2、3、4、5、6、8、9、10或11进行单丙氨基酸置换修饰得到的氨基酸序列，或通过对SEQIDNO:4位置2、3、4、5、6、8、9、10、11和/或12进行1_5个氨基酸的保守替换修饰得到的氨基酸序列。3.被至少一个功能性分子衍生化或连接的分离的人抗体或其抗原结合部分，其中所述的人抗体具有含有一个CDR3域的轻链可变区和含有一个CDR3域的重链可变区，其中所述轻链的CDR3域包含SEQIDNO:3的氨基酸序列、或通过对SEQIDNO:3位置1、4、5、7或8进行单丙氨酸置换修饰得到的氨基酸序列，其中所述重链的CDR3域包含SEQIDNO:4的氨基酸序列、或通过对SEQIDN0:4位置2、3、4、5、6、8、9、10或ll进行单丙氨基酸置换修饰得到的氨基酸序列。4.被至少一个功能性分子衍生化或连接的分离的人抗体或其抗原结合部分，其中所述的人抗体包括含有SEQIDNO:l的氨基酸序列的轻链可变区和含有SEQIDNO:2的氨基酸序列的重链可变区。5.被至少一种功能性分子衍生化或连接的D2E7抗体或其抗原结合部分。6.权利要求l-5任一项的抗体或其抗原结合部分，其中所述功能性分子选自第二抗体、可检测性试剂、细胞毒性剂、药物以及能够介导所述抗体或抗体部分与另外一个分子结合的蛋白质或肽。7.权利要求6的抗体或其抗原结合部分，其中所述可检测性试剂选自荧光化合物、可检测酶和生物素。8.权利要求7的抗体或其抗原结合部分，其中所述荧光化合物选自荧光素、异硫氰酸荧光素、若丹明、5_二甲基氨基-1-萘磺酰氯和藻红蛋白。9.权利要求6的抗体或其抗原结合部分，其中所述的可检测酶选自碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶和葡萄糖氧化酶。10.分离的人抗体的F(ab'h片段，其中所述的抗体以不高于lX10—8M的Kd和不高于1X10—S—1的K。ff速率常数与人TNFa解离，其中所述常数都是由表面等离子体激元共振测定，并在标准的体外L929检测中以不高于1X10—7M的IC5。中和人TNFa细胞毒性。11.分离的人抗体的F(ab')2片段，其中所述的人抗体具有以下特征a)根据表面等离子体激元共振测定，它以不高于1X10—3s—1的K。ff速率常数与人TNFa解离；b)具有轻链CDR3域，其中所述的CDR3域包含SEQIDNO:3的氨基酸序列，或通过对SEQIDNO:3位置1、4、5、7或8进行单丙氨酸置换修饰得到的氨基酸序列，或通过对SEQIDNO:3位置1、3、4、6、7、8禾P/或9进行1-5个氨基酸的保守替换修饰得到的氨基酸序列；c)具有重链CDR3域，其中所述的CDR3域包含SEQIDNO:4的氨基酸序列，或通过对SEQIDN0:4位置2、3、4、5、6、8、9、10或ll进行单丙氨基酸置换修饰得到的氨基酸序列，或通过对SEQIDNO:4位置2、3、4、5、6、8、9、10、ll和/或12进行1-5个氨基酸的保守替换修饰得到的氨基酸序列。12.分离的人抗体或其抗原结合部分的F(ab'h片段，其中所述的人抗体具有含有一个CDR3域的轻链可变区和含有一个CDR3域的重链可变区，其中所述轻链的CDR3域包含SEQIDNO:3的氨基酸序列、或通过对SEQIDNO:3位置1、4、5、7或8进行单丙氨酸置换修饰得到的氨基酸序列，其中所述重链的CDR3域包含SEQIDNO:4的氨基酸序列、或通过对SEQIDNO:4位置2、3、4、5、6、8、9、10或11进行单丙氨基酸置换修饰得到的氨基酸序列。13.分离的人抗体的F(ab')2片段，其中所述的人抗体包括含有SEQIDNO:1的氨基酸序列的轻链可变区和含有SEQIDN0:2的氨基酸序列的重链可变区。14.D2E7抗体的F(ab')2片段。15.分离的人抗体或其抗原结合部分，其以不高于IX10—8M的Kd和不高于IX10—3s—1的K。ff速率常数与人TNFa解离，其中所述常数都是由表面等离子体激元共振测定，并在标准的体外检测试验中中和TNFa诱导的细胞活化，其中所述检测试验是对TNFa诱导人脐带静脉上皮细胞上ELAM-1表达的检测试验。16.分离的人抗体或其抗原结合部分，其以不高于IX10—8M的Kd和不高于IX10—3s—1的K。ff速率常数与人TNFa解离，其中所述常数都是由表面等离子体激元共振测定，并且其抑制人TNFa与p55和p75人TNFa受体的结合。17.分离的人抗体或其抗原结合部分，其具有含有SEQIDNO:9的氨基酸序列的轻链可变区和含有SEQIDNO:10的氨基酸序列的重链可变区。18.权利要求15-17任意一项的分离的人抗体或其抗原结合部分，其含有一个IgGl重链恒定区。19.权利要求15-17任意一项的分离的人抗体或其抗原结合部分，其含有一个IgG4重链恒定区。20.权利要求15-17任意一项的分离的人抗体或其抗原结合部分，其选自Fab片段、Fd和F(ab')2片段。21.权利要求15-17任意一项的分离的人抗体或其抗原结合部分，它是一个单链Fv片段。22.—种药用组合物，它包括权利要求1-21任一项的抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的载体。23.权利要求22的药用组合物，它还包含至少一种用于治疗其中TNFa活性有害的紊乱的其它治疗剂。24.权利要求23的药用组合物，其中所述其它治疗剂选自非类固醇抗炎药、细胞因子抑制抗炎药、CDP-571/BAY-10-3356、cA2、75kdTNFR-IgG、55kdTNFR-IgG、IDEC-CE9.1/SB210396、DAB486-IL-2、DAB389-IL-2、抗Tac、IL_4、IL-IO、IL-4激动剂、IL-10激动剂、IL-IRA、TNF-bp/s-TNFR、S284、R97340KMK-966、伊洛前列素、氨甲蝶呤、酞胺哌啶酮、酞胺哌啶酮相关药物、来氟米特、凝血酸、T-614、前列腺素E1、替尼达普、萘普生、美洛昔康、吡罗昔康、双氯芬酸、消炎痛、柳氮磺胺吡啶、硫唑嘌呤、ICE抑制剂、zap-70抑制剂、lck抑制齐IJ、VEGF抑制剂、VEGF-R抑制剂、皮质类固醇、TNF-转化酶抑制剂、抗IL-12抗体、白介素-11、白介素-13、白介素-17抑制剂、金、青霉胺、氯喹、羟氯喹、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、环孢菌素、抗胸腺细胞珠蛋白、抗CD4抗体、CD-5毒素、口服肽、胶原蛋白、氯苯扎利二钠、细胞因子调节剂HP228和HP466、ICAM-1反义硫代磷酸酯寡脱氧核苷酸、可溶性补体受体1、强的松、肝蛋白、葡糖胺聚糖多硫酸盐、二甲胺四环素、抗IL2R抗体、海洋生物脂、植物脂、金诺芬、保泰松、甲氯芬那酸、氟芬那酸、静注用免疫球蛋白、齐留通、霉酚酸、他克莫司、西罗莫司、氨普立糖、克拉屈滨、阿扎立平、budenoside、表皮生长因子、氨基水杨酸盐、6-巯基嘌呤、甲硝唑、脂氧合酶抑制剂、氨水杨酸、奥沙拉秦、巴柳氮、抗氧化剂、凝血噁烷抑制剂、IL-1受体拮抗剂、抗IL-113单克隆抗体、抗IL-6单克隆抗体、生长因子、弹性蛋白酶抑制剂、吡啶基咪唑化合物、强的松龙的葡糖苷酸结合前体药物、地塞米松的葡糖苷酸结合前体药物或budesonide的葡糖苷酸结合前体药物、强的松龙的葡聚糖结合前体药物、地塞米松的葡聚糖结合前体药物或budesonide的葡聚糖结合前体药物、可溶性补体受体1、缓释氨水杨酸、血小板激活因子PAF拮抗剂、环丙沙星、利多卡因、强的松龙、甲基强的松龙、环磷酰胺、4-氨基吡啶、替扎尼定、干扰素-|3la、干扰素-Plb、Copolymer-l、高压氧、静注用>免疫球蛋白、克拉屈滨、高渗盐溶液、抗生素、连续性滤血、碳青霉烯、细胞因子拮抗剂如TNFa、IL-1P、IL-6和/或IL-8拮抗剂、SK&F107647、四价脒基腙CNI-1493、组织因子通道抑制剂、PHP、包括二乙三胺五乙酸-铁(III)络合物的铁螯合剂和螯合物、lisofylline、PGG-葡聚糖、用脂类重构的载脂蛋白A-l、手性羟基肟酸、抗内毒素抗体、E5531、rBPI^合成抗内毒素肽、表面活性剂置换疗法、抗IL-8抗体。25.权利要求l-21任一项的抗体或其抗原结合部分在制备用于治疗其中TNFa活性是有害的紊乱的药物中的用途。26.权利要求25的用途，其中该紊乱是脓毒症。27.权利要求26的用途，其中所述药物还含有细胞因子白介素-6。28.权利要求25的用途，其中该紊乱是自身免疫疾病。29.权利要求28的用途，其中该自身免疫疾病选自类风湿性关节炎、类风湿性脊椎炎、骨关节炎和痛风性关节炎。30.权利要求28的用途，其中该自身免疫疾病选自变态反应、多发性硬化症、自身免疫性糖尿病、自身免疫性眼色素层炎和肾病综合症。31.权利要求25的用途，其中该紊乱是传染病。32.权利要求31的用途，其中该传染病选自脑膜炎、恶病质、AIDS和细菌性脑膜炎。33.权利要求25的用途，其中该紊乱是移植排斥或移植物抗宿主病。34.权利要求25的用途，其中该紊乱是恶性肿瘤。35.权利要求25的用途，其中该紊乱是肺功能紊乱。36.权利要求35的用途，其中该肺功能紊乱选自成人呼吸窘迫综合征、休克肺、慢性肺炎性疾病、肺结节病、肺纤维化和硅肺。37.权利要求25的用途，其中该紊乱是肠功能紊乱。38.权利要求37的用途，其中该肠功能紊乱选自炎症性肠病、特发性炎症性肠病、局限性回肠炎和溃疡性结肠炎。39.权利要求25的用途，其中该紊乱是心脏功能紊乱。40.权利要求39的用途，其中该心脏功能紊乱是心脏局部缺血或心脏功能不全。41.权利要求25的用途，其中该紊乱选自炎症性骨病、骨吸收疾病、酒精性肝炎、病毒性肝炎、爆发性肝炎、凝结紊乱、烧伤、再灌注损伤、瘢痕疙瘩形成、瘢痕组织形成、发热、牙周炎、肥胖、脓毒症性休克、内毒素性休克、革兰氏阴性脓毒症、毒性休克综合征、疟疾、AIDS相关综合征ARC和放射毒性。42.权利要求25的用途，其中该紊乱选自移植继发的巨细胞病毒感染、因感染引起的发烧和肌痛、感染继发的恶病质和同种移植排斥。43.权利要求25的用途，其中该紊乱选自在恶性肿瘤中剌激肿瘤生长、增强转移潜力和介导细胞毒性，以及抑制肿瘤生长或转移。44.权利要求25-43任意一项的用途，其中所述的药物被设计为和其它治疗剂一起施用。45.权利要求44的用途，其中所述的其它治疗剂选自非类固醇抗炎药、细胞因子抑制抗炎药、CDP-571/BAY-10-3356、cA2、75kdTNFR-IgG、55kdTNFR-IgG、IDEC-CE9.1/SB210396、DAB486-IL-2、DAB389_IL_2、抗Tac、IL_4、IL-IO、IL-4激动剂、IL-10激动剂、IL-1RA、TNF-bp/s-TNFR、S284、R973401、MK-966、伊洛前列素、氨甲蝶呤、酞胺哌啶酮、酞胺哌啶酮相关药物、来氟米特、凝血酸、T-614、前列腺素E1、替尼达普、萘普生、美洛昔康、吡罗昔康、双氯芬酸、消炎痛、柳氮磺胺吡啶、硫唑嘌呤、ICE抑制剂、z即-70抑制剂、lck抑制剂、VEGF抑制剂、VEGF-R抑制剂、皮质类固醇、TNF-转化酶抑制剂、抗IL-12抗体、白介素-11、白介素-13、白介素-17抑制剂、金、青霉胺、氯喹、羟氯喹、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、环孢菌素、抗胸腺细胞珠蛋白、抗CD4抗体、CD-5毒素、口服肽、胶原蛋白、氯苯扎利二钠、细胞因子调节剂HP228和HP466、ICAM-1反义硫代磷酸酯寡脱氧核苷酸、可溶性补体受体1、强的松、肝蛋白、葡糖胺聚糖多硫酸盐、二甲胺四环素、抗IL2R抗体、海洋生物脂、植物脂、金诺芬、保泰松、甲氯芬那酸、氟芬那酸、静注用免疫球蛋白、齐留通、霉酚酸、他克莫司、西罗莫司、氨普立糖、克拉屈滨、阿扎立平、budenoside、表皮生长因子、氨基水杨酸盐、6-巯基嘌呤、甲硝唑、脂氧合酶抑制剂、氨水杨酸、奥沙拉秦、巴柳氮、抗氧化剂、凝血噁烷抑制剂、IL-1受体拮抗剂、抗IL-113单克隆抗体、抗IL-6单克隆抗体、生长因子、弹性蛋白酶抑制剂、吡啶基咪唑化合物、强的松龙的葡糖苷酸结合前体药物、地塞米松的葡糖苷酸结合前体药物或budesonide的葡糖苷酸结合前体药物、强的松龙的葡聚糖结合前体药物、地塞米松的葡聚糖结合前体药物或budesonide的葡聚糖结合前体药物、可溶性补体受体1、缓释氨水杨酸、血小板激活因子PAF拮抗剂、环丙沙星、利多卡因、强的松龙、甲基强的松龙、环磷酰胺、4-氨基吡啶、替扎尼定、干扰素-|3la、干扰素-Plb、Copolymer-l、高压氧、静注用免疫球蛋白、克拉屈滨、高渗盐溶液、抗生素、连续性滤血、碳青霉烯、细胞因子的拮抗剂如TNFa、IL-1P、IL-6和/或IL-8的抑制剂、SK&F107647、四价脒基腙CNI-1493、组织因子通道抑制剂、PHP、包括二乙三胺五乙酸-铁(III)络合物的铁螯合剂和螯合物、lisofylline、PGG-葡聚糖、用脂类重构的载脂蛋白A-l、手性羟基肟酸、抗内毒素抗体、E5531、rBPI^合成抗内毒素肽、表面活性剂置换疗法、抗IL-8抗体。46.—种分离的编码抗体轻链可变区的核酸，其中所述抗体轻链可变区包括SEQIDN0:9的氨基酸序列。47.—种分离的编码抗体重链可变区的核酸，其中所述抗体重链可变区包括SEQIDNO:10的氨基酸序列。48.—种重组人抗体或其抗原结合部分，它中和人TNFa而不是人TNFP的活性。49.权利要求48的重组人抗体或其抗原结合部分，它亦中和黑猩猩TNFa和选自以下的至少一种其它灵长类TNFa的活性狒狒TNFa、狨TNFa、猕猴TNFa和恒河猴TNFa。50.权利要求49的重组人抗体或其抗原结合部分，它亦中和犬TNFa的活性。51.权利要求49的重组人抗体或其抗原结合部分，它亦中和猪TNFa的活性。52.分离的人抗体的Fd片段，其特征在于具有以下特征a)根据表面等离子体激元共振测定，它以不高于1X10—3s—1的K。ff速率常数与人TNFa解离；b)具有重链CDR3域，其中所述的CDR3域包含SEQIDNO:4的氨基酸序列、或通过对SEQIDNO:4位置2、3、4、5、6、8、9、10或ll进行单丙氨酸置换修饰得到的氨基酸序列、或通过对SEQIDNO:4位置2、3、4、5、6、8、9、10、11和/或12进行1-5个氨基酸的保守替换修饰得到的氨基酸序列。53.分离的人抗体或其抗原结合部分的Fd片段，其中所述的人抗体包括含有一个CDR3域的重链可变区，其中所述重链的CDR3域包含SEQIDNO:4的氨基酸序列、或通过对SEQIDNO:4位置2、3、4、5、6、8、9、10或ll进行单丙氨酸置换修饰得到的氨基酸序列。54.分离的人抗体的Fd片段，其中所述的人抗体包括含有SEQIDN0:2的氨基酸序列的重链可变区。55.包含含有SEQIDNO:36的核酸的表达载体。56.包含权利要求55的表达载体的宿主细胞。57.合成结合人TNFa的人抗体的方法，包括在培养基中培养权利要求56的宿主细胞，直至该细胞合成结合人TNFa的人抗体。58.包含含有SEQIDNO:37的核酸的表达载体。59.包含权利要求58的表达载体的宿主细胞。60.合成结合人TNFa的人抗体的方法，包括在培养基中培养权利要求59的宿主细胞，直至该细胞合成结合人TNFa的人抗体。61.—种分离的核酸，其编码具有包含SEQIDN0:1的氨基酸序列的可变区的抗体轻链。62.包含权利要求61的核酸的表达载体。63.包含权利要求62的表达载体的宿主细胞。64.合成结合人TNFa的人抗体的方法，包括在培养基中培养权利要求63的宿主细胞，直至该细胞合成结合人TNFa的人抗体。65.—种分离的核酸，其编码具有包含SEQIDNO:2的氨基酸序列的可变区的抗体重链。66.包含权利要求65的核酸的表达载体。67.包含权利要求66的表达载体的宿主细胞。68.合成结合人TNFa的人抗体的方法，包括在培养基中培养权利要求67的宿主细胞，直至该细胞合成结合人TNFa的人抗体。69.编码以下的重组表达载体a)具有包含SEQIDNO:1的氨基酸序列的可变区的抗体轻链；b)具有包含SEQIDNO:2的氨基酸序列的可变区的抗体重链。70.包含权利要求69的表达载体的宿主细胞。71.合成结合人TNFa的人抗体的方法，包括在培养基中培养权利要求70的宿主细胞，直至该细胞合成结合人TNFa的人抗体。全文摘要公开了特异性与人肿瘤坏死因子α(hTNFα)结合的人抗体，最好为重组人抗体。这些抗体对hTNFα具有高亲和性(例如，Kd不高于1x10-8M)和低解离速率(例如，Koff不高于1x10-3s-1)并在体外和体内中和hTNFα活性。本发明的抗体可以是全长抗体或是其抗原结合部分。本发明的抗体或抗体部分可以用于检测hTNFα并例如在患有其中hTNFα活性是有害的紊乱的人类受治疗者中抑制hTNFα活性。本发明亦包括表达本发明重组人抗体的核酸、载体和宿主细胞、以及合成所述重组人抗体的方法。文档编号A61K31/675GK101712720SQ200910225399公开日2010年5月26日申请日期1997年2月10日优先权日1996年2月9日发明者A·J·维尔顿,A·J·罗伯茨,B·T·麦圭内斯,B·拉布科夫斯基,D·J·阿伦,D·舍恩豪特,H·R·J·M·霍根布姆,J·A·曼克维,J·G·萨菲尔德,M·怀特,P·萨克拉法斯,T·J·沃汉,Z·凯马克卡兰申请人:艾博特生物技术有限公司