适合人治疗的分化细胞的利记博彩app

专利名称：适合人治疗的分化细胞的利记博彩app
技术领域：
本发明总体上涉及胚胎细胞的细胞生物学领域和启动子控制的病毒载体的分子 生物学。更具体地，本发明描述了采用选择性表达的裂解载体，从多能干细胞的群中除去未 分化细胞的技术。参考相关的申请本申请要求2000年11月27日提交的美国专利申请60/253，443和60/253，357 (待 批申请)和2001年2月13日提交的09/783，203 (待批申请)的优先权。为了在美国履行 本申请的目的，以上优先权文本内容全部纳入本文作为参考。背景前体细胞已成为医学研究重要的对象。机体中许多组织拥有可代替衰老或因损伤 或疾病遭到损害的细胞的前体细胞支援。最近已作出很大的努力来分离许多不同组织的前 体细胞用于再生性医学。美国专利5，750, 397 (Tsukamoto 等，Systemix)报道了人血干细胞 Thy-I+, CD34+的分离和培养，该细胞能分化为淋巴样、红细胞样和髓性单核细胞谱系。美国专利 5，736，396 (Bruder等)报道采用合适的生物活性因子对分离的人间充质干细胞进行谱系 定向分化的方法。然后将衍生的细胞输入宿主用于间充质组织再生或修复。美国专利5，716，411 (Orgill等)提出采用上皮自体移植在烧伤或创伤部位再生 皮肤。美国专利5，766，948 (F. Gage)报道从动物脑组织产生成神经细胞的方法。美国专利 5，672，499 (Anderson等)报道从胚胎组织获得神经脊干细胞。美国专利5，851，832 (Weiss 等，Neurospheres)报道从8_12周龄人胎儿中分离推定的神经干细胞。美国专利 5，968，829 (M. Carpenter)报道衍生自原代中枢神经系统组织的人神经干细胞。美国专利5，082，670 (F. Gage)报道移植遗传修饰的细胞治疗中枢神经系统的缺 陷、疾病或损伤。Auerbach等(Eur. J. Meurosci. 12 =1696,2000)报道将多能中枢神系统 (CNS)细胞植入动物脑内形成电活性和功能上连接的神经元。Brustle等(Science285 754，1999)报道衍生自胚胎干细胞的前体细胞与宿主神经元的相互作用，且有效地在脑和 脊髓中长出髓的轴突。胚胎干细胞的开发已引起人们相当大的兴趣，认为它们具有分化成为多细胞类型 的潜力。在小鼠中进行了胚胎干细胞的早期工作。可以从早期胚胎细胞和胚组织分离得到 小鼠干细胞。多能干细胞的理想特征是它们能以非分化状态在体外增殖，维持正常的核型， 并保持分化为所有三种胚层(内胚层、中胚层和外胚层)的衍生细胞的潜力。人多能干细胞制剂的开发大大落后于小鼠细胞的工作。Thomson等增殖了低等 灵长类动物的(美国专利 5，843，780 ；Proc. Natl. Acad. Sci. USA92 :7844，1995)然后是人
4(Science 282 =114,1998)的多能干细胞。Gearhart及其同事从胚胎性腺组织衍生了人 胚芽(hEG)细胞系(Shamblott 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA95 :13726，1998 ；和美国专利 6，090，622)。hES和hEG细胞具有长期追求的多能干细胞特征它们能在体外生长，而不分化； 它们具有正常的核型和它们保持了产生众多不同类型细胞的能力。用克隆方法产生的人 胚胎干细胞系在延长培养期中保持了多能性和增殖潜力(Amit等，Dev. Biol. 227 -.271, 2000)。这些细胞有很大的希望用于人类治疗，作为因受遗传异常、创伤或疾病损害的几乎 任何组织再生的储存库。国际专利出版物W099/20741 (Geron公司)涉及培养灵长类动物衍生的原始干细 胞的方法和材料。在一个实施例中，为培养基本上处于未非化状态的灵长类原始干细胞，提 供了一种细胞培养基，具有低渗透压和低内毒素水平。该基础培养基与营养血清联合有效 地支持了灵长类原始干细胞的生长和提供了饲养细胞的底物或饲养细胞产生的胞外基质 成分。该培养基可进一步包括非必需氨基酸、抗氧化剂和核苷或丙酮酸盐生长因子。干细胞用于治疗的一个重要问题是控制其生长和分化成为治疗病人各人所需的 特定组织类型。美国专禾Ij 4，959，313 (M. taketo, Jackson Labs)提供了一种特殊的增强子序列， 可引起通常在未分化的细胞中不表达的基因的伴随启动子的侧接外源性或重组基因的表 达，。美国专利5，639，618(D.A.Gay，PlUri0n公司)提出体外分离谱系特异性干细胞的方 法，采用一种构建物转染多能胚胎干细胞，该构建物中谱系特异性基因元件操作性连接了 一报道基因，在细胞分化的条件下培养细胞，然后从其它细胞中分离得到表达报道基因的 细胞。美国专禾Ij 6，087，168 (Levesque等，Cedars Sinai医学中心)涉及将表皮细胞转 分化入活的神经元用于细胞治疗和基因治疗。用一种神经原性转录因子转染皮肤细胞，在 含有相当神经元分化负调节剂的反义核苷酸的培养基中培养。国际专利出版物W097/32025(MclVOr等，明尼苏达大学)提出移植药物抗性造血 干细胞的方法。在干细胞中有功能的启动子控制下，药物抗性基因(例如氨甲蝶吟抗性二 氢叶酸还原酶)促进了移植物中细胞的生长。将这些细胞给予哺乳动物，然后用该药物治 疗以增加转基因细胞相对于非转基因细胞的移植。国际专利出版物W098/39427(Steir等；麻萨诸塞大学)涉及在分化的细胞(如骨 骼组织)中表达外源基因的方法。使干细胞(如来源于骨髓)与一核酸接触，该核酸中的 基因与控制分化细胞表达的一元件连接，元件的例子是大鼠骨钙蛋白启动子。国际专利出 版物W099/10535(Liu等；耶鲁大学)提出研究干细胞中基因表达变化的方法，制作了干细 胞群的基因表达图，然后比较分化细胞的基因表达图。国际专利出版物W099/19469 (Braetscher等；Biotransplant)涉及培养猪多能胚 胎干细胞的方法。将一种可选择的标记基因插入ES细胞以使其受到启动子序列的控制，例 子是猪0CT-4启动子。国际专利出版物W000/15764(Smith等；爱丁堡大学)涉及胚胎干细胞的增殖和衍 生。在一种选择性抑制细胞(除了 ES细胞)增殖或存活的化合物存在时，通过对分化细胞 增殖必需的信号通路的抑制培养细胞。例子是抑制SHP-2、MEK或ras/MAPK级联反应的化
5合物。Klug等(J. Clin. Invest. 98 216，1996)提出用遗传方法从分化的小鼠胚胎干细 胞选出心肌细胞的方法；将含有α-心肌球蛋白重链启动子和编码氨基糖苷磷酸转移酶 DNA的融合基因稳定地转染入ES细胞，使所得到的细胞系体外分化并用G418选择。据报道 选出的心肌细胞培养物是高度分化的。当植回小鼠时，移植后长达7周仍可检测到ES-衍 生的心肌细胞移植物。Schuldiner 等(Proc. Natl. Acad. Sci. USA97 11307,2000)报道 8 种生长因子对 人胚胎干细胞的细胞分化的影响。通过胚胎样小体形成启动分化后，在bFGF、TGF-β 1、活 化素-A、BMP-4、HGF、EGF、β NGF或视黄酸存在时培养细胞。各生长因子对分化途径都有其 独特的作用，但生长因子之中无论那一种都不会使分化定向为一种细胞类型。需要一种新的方法产生适合于人施用的分化的细胞群。
发明概要本发明提供一种从异质性细胞群中消除相对未分化细胞的系统，例如可通过干细 胞的分化获得该系统。采用一种能使基因在未分化的细胞亚群中以较高水平表达的基因元 件控制下，赋予致死或可能致死效应基因的载体处理细胞群。这产生了相对富集的成熟细 胞群，且适用于再生性医学。本发明的一个实施例是从活体外培养的干细胞分化的细胞群，基本上没有未分化 细胞。例子是灵长类的多能干细胞，如人胚胎干细胞。细胞群中可包含用含P-X结构的多 核苷酸衍生的细胞，此处χ是在细胞中表达时对该细胞有致死作用或使该细胞易遭受外来 药剂致死作用的一种核酸序列；P是使X优先在未分化细胞中表达的转录控制元件。P-X中 的连接线表明此遗传元件操作性相连接，不管它们在核酸分子中是否相毗邻。在以下说明中χ指一种效应序列。X可以编码诱导或介导细胞调亡的毒素、蛋白 质或能将前药(如更昔洛韦)转化为对表达X的细胞有致死作用的化合物的酶(如胸苷激 酶)。其它例子在本公开中后面提供。在某些实施例中，P-X是一种引入的异源分子，意指经含有P-X的载体遗传上改变 的细胞或其祖先。在其它实施例中，为内源性转录控制元件控制下用接入X的载体遗传上 改变的细胞或其祖先。转染后，X可以在细胞群的未分化细胞中瞬时表达，或P-X可以在未 分化的子代细胞中遗传和表达。对于P的非限制性例子包括0CT-4启动子和端粒酶逆转录 酶(TERT)的启动子。细胞还可含有在P控制下的药物抗性基因Y，本文称为Ρ-Χ-Υ，表明当 P调节X和T转录时与该序列中用此方式功能上连接的任何取向元件的功能关系。本发明的另一实施例是用遗传方法改变而含有P-X结构核酸的干细胞，如已描述 的那样。本发明还提供了适合以此方式遗传上改变干细胞的多核苷酸载体。本发明的另一实施例是产生分化细胞群的方法。细胞群中包括含有P-X结构核酸 分子的未分化干细胞，经此种处理可至少使细胞群中的一些未分化细胞分化。本发明的另一实施例是从一细胞群中消除未分化干细胞的方法。用遗传方法改变 细胞群中的干细胞，使它们含有上述P-X结构的核酸分子。这样，就将在细胞中表达时对该 细胞有致死作用的，或使该细胞易遭受外来药物致死作用的基因，置于转录控制元件的控 制下，导致使基因优先在未分化细胞中表达。当细胞群主要是未分化(引起分化之前)或
6当其已主要包括分化细胞时，可用遗传方法改变此细胞群。如果X对细胞有致死作用，可简单地在表达X的条件下培养细胞群来消除未分化 干细胞。如果X使细胞对外来药物(如药物或前药)的致死作用敏感，可通过细胞与外来 试剂结合来消除未分化干细胞。这可通过组织培养使细胞与药物体外接触，或同时或依次 将细胞与外来药物给与受试者来完成。本发明的试剂和技术可以对含有任何类型干细胞的细胞群产生影响。它们尤其适 合应用于灵长类多能干细胞，如人胚胎干细胞。本发明的其它实施例将在以下说明书中描述。


附图的简要说明图1提供用常规培养基(RM)或条件培养基(CM)含饲养细胞(mEF)或胞外基质 (Matrigel 或层粘连蛋白)培养的hES细胞中0CT-4和hTERT表达的分析。上图是通过 RT-PCR显示0CT-4和hTERT在mRNA水平表达的凝胶的拷贝。下图是条图，包括在不同底物 上生长的细胞的表达水平，以0CT-4或TERT对185标准品的比例表示。在条件培养基中层 粘连蛋白和Matrigel 上生长的hES细胞具有的表达模式与在饲养层上生长的细胞类似。图2是凝胶的半色调复制，显示TRAP活性试验测定的培养的hES细胞中端粒酶活 性。所有的培养条件显示无饲养细胞培养中40天后端粒酶活性阳性。图3是半色调复制，显示逆转录病毒转导然后分化的hES细胞中GFP报道基因的 表达。将hES细胞转移到悬浮培养形成胚胎样子体，再培养4天，再接种到包被明胶的载玻 片上，培养1周，然后固定和荧光下摄影观察GFP表达。左图显示亮视野照明；右图显示由 于GFP表达产生的荧光。图4显示研究结果，该研究中采用脂转染法在无饲养细胞的培养中用遗传方法瞬 时改变hES细胞。A图是光学显微摄影的半色调复制，显示转染后，层粘连蛋白上的hES细 胞的形态学。B图是荧光显微摄影的半色调复制，显示同一集落中表达的GFP。C图是条图， 显示在不同条件下表达GFP的细胞的百分比。图5是命名为pGRN376的TPAC载体图。这是7185碱基对的腺病毒载体，包括在 取自端粒酶逆转录酶(hTERT)的人基因的上游序列的启动子控制下的单纯疱疹胸苷激酶 (tK)基因。在表hTERT的细胞(如未分化的胚胎干细胞)中促进了 tK的表达。图6是两幅线条图，显示TPAC胸苷激酶载体对未分化hES细胞的影响。再接种后 48小时，用TPAC载体以30或100感染复数(MOI)转导或模拟转导(不加载体)细胞。4 小时后，细胞转换入含有前药更昔洛韦(GCV)的新鲜培养基中。第3天时，用和对照孔一样 多的8%细胞所含的TPAC载体+GCV处理各孔。图7是显示在TPAC载体处理的hES细胞中GCV滴定的条图。用此载体转导后4 小时，新鲜培养基中加入所示浓度的GCV。在测试的条件下-20 μ M GCV是最佳的。图8是两幅条线图，显示在TPC载体转导和模拟转导的两种不同细胞株的hES细 胞中GCV的滴定。在用TPAC载体处理后，两种细胞株均对GCV敏感。图9显示TPAC+GCV对hES细胞分化得到的混合细胞群的影响。每天用条件培养 基饲喂细胞以维持未分化状态，或者用500nM视黄酸或0. 5% DMSO诱导细胞分化成为混合
7表型的定型细胞。7天后，它们用TPAC载体以30感染复数加20 μ mGCV感染。上图是显示培养物中存活细胞数的条图。在各种条件下用TPAC+GCV处理消除了 培养的细胞。在每种情况下，存活细胞的培养物养生了高度分化和基本上没有未分化形态 学的细胞群。下图是显示存活细胞的RT-PCR分析的凝胶半色调复制。用条件培养基(mEF-CM) 或DMSO培养那些细胞具有不可检测的0CT-4表达，而用视黄酸(RA)处理的4个样品中有 2个显示与很低水平的0CT-4表达相一致的扩增产物。图10是hES细胞系的复制显微摄影，hES细胞已通过与对照腺病毒载体(a图) 或pGRN376(b图)联合转导，这些细胞含有在TERT启动子控制下的tK基因。在含有更昔 洛韦的培养基中培养两种转导细胞孔3天。在对照孔中看到正常hES培养物的典型未分化 集落。在用PGRN376处理的孔中，大多数或所有未分化的ES细胞集落已不再存在，仅保留 分化的细胞。图11是2幅线条图，显示含有端粒酶启动子驱动的胸苷激酸基因(TPAC)的未分 化细胞的药物敏感性。上图和下图分别显示对前药更昔洛韦(GCV)和(E)-5-(2-溴乙烯 基)-2’_脱氧尿苷(BVDU)的敏感性。低达2.5μπι浓度的更昔洛韦在 4天内实际上杀死 了所有未分化的TPACES细胞。图12㈧和⑶包括分化的ES细胞的荧光显微摄影的黑白复制。细胞系 H9-376m-18、H9-376m_62 和 H9-376m_6 含有 TPAC 基因；H9-pGK-neo_l 是仅用药物选择质 粒转染的对照细胞系。稳定的转染细胞分化成为胚胎样小体，接种用于免疫细胞化学分析。 至少3种含有TPAC的干细胞系显示了肌肉特异性肌动蛋白、用α-胎球蛋白、微管蛋 白和心肌钙蛋白的染色区域，代表了所有3种胚胎的胚层的特征。发明详述不同种类的干细胞已成为再生医学中极其引人注目的用药方式。它们可以在培养 中增殖，然后体外或原位分化成为治疗所需的细胞类型。最近，已证明人胚胎干细胞持续表 达高水平的端粒酶，使它们维持端粒长度和几乎无限地在培养中生长。迄今，分化干细胞所作的努力已主要针对鉴定能促使具有再生医学所需组织类型 表型特征的细胞群长得更快的培养条件。Schuldiner等(同上)报道了生长因子对人胚 胎干细胞分化的影响。在美国专利5，639，613中，用操作性连接一报道基因的谱系特系性 基因转染干细胞，然后选择表达该报道物的细胞。在W097/32025中，通过药物抗性基因增 加了造血干细胞，然后移植入受试者。给予哺乳动物这种细胞，然后用药物处理以增加转基 因细胞的移植。Klug等(同上)采用一种构建物，其中α-心肌球蛋白重链启动子控制着 氨基糖苷磷酸转移酶的表达，采用G418选择转染的分化细胞，从而产生了心肌细胞样细胞 系。这是一种阳性选择方法，该方法采用了所需组织类型的基因表达模式，使分化的组织优 先存活。本发明假设采用适合的培养物和阳性选择方法产生的一些分化细胞群，对用于人 的治疗将基亚优。在一些情况下，细胞群中的未分化细胞可能损害细胞的体内移植或功能。 未分化的细胞也可能在治疗的移植物部位或通过移植细胞的迁移，增加恶性肿瘤或其它肿 瘤形成的可能性。本发明的目标是一种方法，该方法可将分化细胞群中残留的未分化细胞消除。这 可以用遗传方法改变细胞来实现，即将在细胞中表达时对该细胞有致死作用或使该细胞对外来药物的致死作用敏感的基因，置于能使该基因在细胞群未分化细胞中优先表达的转录 控制基因元件的控制下。这是一种阴性选择方法，设计用来将未分化细胞的比例减到最低 程度。有可能将此技术与不同种类的阳性选择技术结合以获得相对纯的基本上没有未分化 细胞的所需组织类型的细胞群。作为本发明的非限制性验证，已用腺病毒载体(TPAC)转导了人胚胎干细胞 (hES)，TPAC中疱疹病毒胸苷激酶基因置于人端粒酶逆转录酶(hTERT)的启动子序列控制 下。hES细胞组成型表达hTERT，但此能力在分化后丧失。实施例10(图6-8)表明用TPAC 载体转导hES细胞，使未分化细胞对前药更昔洛韦(一种胸苷激酶的底物)在 20 μ m浓 度产生的致死作用敏感。实施例11 (图9)表明当用TPAC载体转导hES细胞，然后用DMSO 分化时，不存在具有可检测的0CT-4表达(一种未分化细胞的表型)的存活细胞。设计的本发明技术部分用于提供具有改进的人体治疗特征的细胞群。在消除未分 化细胞后，期望分化的细胞群具有较好的功能和移植特性，并减少接受治疗者产生不良组 织结构和恶性的危险。此外，消除了未分化细胞的细胞群是更均一的，为非治疗性应用(如 产生抗体、cDNA文库和筛选候选药物)提供了明显的优点。定义原型“灵长类多能干细胞”(pPS细胞)是受精后任何时间前胚胎组织、胚胎或胎儿 组织衍生的多能细胞，具有在合适条件下能够产生几种不同类型细胞子代的特征。根据本 领域所接受的标准试验，例如在8-12周龄SCID小鼠中形成畸胎瘤的能力，不同类型的细胞 是所有3种胚层(内胚层、中胚层和外胚层)的衍生细胞。在pPS细胞的定义中包括各种类型的胚胎细胞，例于有Thomson等(Science282 1145，1998)描述的人胚胎干细胞(hES)；其它灵长类的胚胎干细胞(如恒河猴干细胞) (Thomson 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA92 :7844，1995)，獾干细胞(Thomson 等；Biol Reprod. 55 :254，1996)和人胚芽(hEG)细胞(Samblott 等；Proc. Natl. Acad. Sci. USA95 13726,1998)。其它类型的多能细胞也包括在此术语中。能产生子代的灵长类来源的任何 细胞包括所有3个胚层的衍生细胞，不管它们是否衍生自胚胎组织、胎儿组织或其它来源。 本发明涉及的PPS细胞不是从恶性来源衍生的。最好是(但不总是必需的)细胞在核型上 是正常的。当显著比例的干细胞及其衍生细胞在细胞群中显示未分化细胞的形态特征时， PPS培养物被描述为“未分化的”，将它们和胚胎或成人来源的分化细胞清楚地区别开。未 分化的PPS细胞易被本领域熟练技术人员识别，且一般在显微镜视野的两维以具有高的细 胞核/细胞质比例和突出的核仁的形式出现。已了解群体内的本分化细胞的集荷常被分化 的邻近细胞包围。然而，在合适条件下，当群体被培养或被传代时未分化的细胞继续存在， 单独的未分化细胞构成显著比例的细胞群。大体上未分化的培养物含有至少20%未分化的 PPS细胞，且按照渐增的优先次序含有至少40%、60%或80%，无论什么时候本公开中的一 种培养物或细胞群是指增值的“没有分化”，意指根据前面的定义，增值后组合物基本上未 分化。术语“饲养细胞”用来描述与另一种类型的细胞共培养一种类型的细胞，以提供第 二种类型的细胞能生长的环境。饲养细胞任选自不同的种类作为它们支持的细胞。例如，如 本公开以后所述，原代小鼠胚胎成纤维细胞、无限增值化小鼠胚胎成纤维细胞或以hES细胞分化的人成纤维细胞样细胞可以支持某种类型的PPS细胞。据说PPS细胞群“基本上没 有”饲养细胞，如果在断裂后通过至少一轮细胞已经生长，其中不加入新鲜的饲养细胞以 支持PPS的生长。基本上没有饲养细胞的培养物含有低于约5%饲养细胞。无论什么时候 本公开中的一种培养物或细胞群是指“饲养细胞”，意指根据前面的定义组合物基本上没有 饲养细胞，仅仅需要进一步清楚地约束主题。术语“胚胎样小体”是与“聚集体”同义的术语。该术语指当PPS细胞在单层培养 中过度生长或维持在悬浮培养物中时，呈现为分化细胞和未分化细胞的聚集体。胚胎样小 体是不同类型细胞的一种混合物，一般来自几种胚层，可通过形态学标准加以区别。术语“定型前体细胞”，“谱系限制性前体细胞”和“限制性发育的谱系细胞”均指 能够增殖和分化成为几种不同类型细胞的细胞，其范围通常比能产生所有3种胚层子代的 胚胎来源的多能干细胞更局限。定型前体细胞的非限制例子包括各种血细胞的多能造血细 胞；胆管上皮细胞和肝细胞的多能肝细胞祖先细胞和间充质干细胞。另一例子是限制性神 经细胞，该细胞可以产生神经胶质细胞的前体细胞，其发展成为少突胶质细胞和星形细胞， 和发展成为神经元的神经元前体细胞。为了本说明书的目的，术语“干细胞”如以上定义的那样可以指多能干细胞或定型 的前体细胞。最低限度讲，干细胞具有增殖和形成一种以上不同表型细胞的能力，还能自我 更新——作为相同培养的一部分或在不同条件下培养时。胚胎干细胞可以鉴定为端粒酶阳 性。如本文所使用的那样，相关术语“分化的”和“未分化的”取决于它们使用的范围。 具体指特定类型的自我更新的干细胞时，术语“未分化的”回指相同的自我更新的干细胞， 而术语“分化的”指干细胞可产生的一种或多种相对成熟的表型，可采用形态学标准、抗原 标志和它们产生的基因转录物辨别。未分化的pPS细胞具有分化成为所有3种胚层的能力。 采用形态学标准本领域熟练技术不难人员识别它们有无产生分化细胞。术语“多核苷酸”和“核酸分子”指任何长度的核苷酸聚合物，包括基因和基因片 段、mRNA、tRNA、rRNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、分离的DNA和 RNA、核酸探针和引物。如本文中使用的那样，术语“多核苷酸”可互换指双链分子和单链分 子。除非另有规定或要求，本发明的任何实施例是，一种多核苷酸包括双链形式，和已知或 预计组成该双链形式的两个互补单链形式之一。包括核酸类似物，如氨基磷酸酯和硫代磷 酸酯。当使用任何合适的人工操作方法将一多核苷酸转移入某细胞时，就说该细胞是 “遗传改变的”、“转染的”或“遗传转化的”细胞，或者该细胞是继承了此多核苷酸的原先已 改变的细胞的子代。多核苷酸常包含编码感兴趣蛋白质的可转录序列，使细胞能以提高水 平表达该蛋白质。如果改变的细胞的子代具有相同的改变，这种遗传改变称为“可遗传的”。“控制元件”或“控制序列”是一种参与分子相互作用的核苷酸序列，该序列有助于 多核苷酸的功能调节，例如多核苷酸的复制、重复、转录、剪接、翻译或降解。转录控制元件 包括启动子、增强子和阻遇子。称为启动子的特定的基因序列，像“TERT启动子”或“0CT-4启动子”是与能促进可 操作性连接的基因表达产物的转录有关的基因衍生的多核苷酸序列。已认识到上游和内含 子非翻译基因序列的不同部分在一些情况下有助于启动子活性，和这些部分的所有或任何亚组可存在于遗传工程的构建物中。启动子可基于具有基因的任何种类动物的基因序列， 除非明确地受到限制，可引入任何所需的添加，取代或缺失，只要能在靶组织中促进转录。 为人类治疗而设计的遗传构建物通常包括与人基因的启动子序列至少90%相同的区段。例 如通过与一报道基因操作性连接可测试特定序列的活性和特异性(实施例9)。如果诸遗传元件在结构关系中，允许它们以预期的能发挥功能的方式工作就这些 遗传元件是“操作性连接的”。例如，如果一启动子能帮助启动编码序列的转录，可认为该编 码序列与启动子操作性相连(或在启动子控制下)。在启动子和编码区之间可能有间插序 列，只要维持这种功能关系就行。就编码序列、启动子和其它遗传元件而言，术语“异源的”表明该元件衍生自基因 型与作比较的其余实体截然不同的实体。例如，采用遗传工程技术将一启动子或基因引入 不同种类的动物就说是引入了一种异源多核苷酸。“内源的”遗传元件是在天然染色体中处 于相同位置的一种元件，虽然可以人工引入其它元件邻近的位置。在本文中可互换使用的术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”指任何长度的氨基酸聚合 物。该聚合物可包含修饰的氨基酸，它可以是直链或支链的，且它可以被非氨基酸间隔。一般技术为了进一步详细描述用于实施本发明的一般技术，专业人员可参考细胞生物 学、组织培养和胚胎学的标准教科书和综述，包括《畸胎癌和胚胎干细胞实用方法》 (Teratocarcinoma and embryonic stem cells :A Practical Approach)(E. J. Robertson 编，IRL出版公司，1987)；《小鼠发育的技术指南》(Guide to Techniques in Mouse Development) (P. M. Wasserman 等编，Academic 出版社，1993)；“胚胎干细胞体外分 化，，(Embryonic stem Cell Differentiation in Vitro) (Μ. V. Wiles, Meth. Enzymol. 225 900，1993)；“胚胎干细胞的特性和用途人类生物学和基因治疗应用的展望”(Properties and use of Embryonic stem cells Prospects for Application toHuman Biology and Gene Therapy) (P. D. Rathjen 等，Reprod. Fertil. Dev. 10 :31，1998)。Robertson 综述了干 细胞的分化Meth. Cell Biol. 75 :173，1997 ；和Pedersen，IteprodFertil. Dev 10 :31，1998。—般在最近版本的刊物中描述了分子遗传学和遗传工程的方法，包括《分子克 隆实验室手册》(Molecular Cloning :A Laboratory Manual) (Sambrook 等)，《寡核苷 酸合成》(Ologonucleotide Synthesis) (Μ. J. Gait 编)，《动物细胞培养》(AnimalCell Culture) (R. I. Freshney编)，《哺乳动物细胞的基因转移载体》(Gene TransferVectors for Mammalian Cells) (Miller&Calos 编)，《新编分子生物学》(CurrentProtocols in Molecular Biology)和《精编分子生物学》(Short Protocols in MoleculorBiology)第 3 版(F. Μ. Ausubel 等编)，和《重组 DNA 方法学》(Recombinant DNAMethodology) (R. Wu 编， Academic出版社)。本文中涉及的遗传操作用的试剂，克隆载体和试剂盒购自供应商如 BioRad, Stratagene, Invitrogen 禾口 ClonTech0在“大规模哺乳动物细胞培养”(LargeScale Mammalian Cell Culture) (Hu 等， Curr· Opin. Biotechnol. 8 :148，1997)，“无血清培养基” (K. Kitano. Biotechnologyl7 73. 1991)，“大规模哺乳动物细胞培养”(Large Scale Mammalian CellCulture) (Cur. Opin. Biotechnol. 2 :375，1991)，和“哺乳动物的悬浮培养” (SuspensionCulture of Mammalian Cells) (Birch等，Bioprocess Technol. 19 -.251,1990)中概述了细胞培养和培养基保藏的一般技术。Marshall Mcluhan和Fred Allen已就培养基及其对培养环境的影响作了其它 的观察。干细胞和来源本发明可采用不同类型的干细胞来实施，包括下列非限制性例子。美国专利5，851，832报道从脑组织得到多能神经干细胞。美国专利5，766，948报 道从新生大脑半球产生成神经细胞。美国专利5，654，183和5，849，553报道采用哺乳动物 神经脊干细胞。美国专利6，040，180报道从哺乳动物多能CNS干细胞的培养物体外产生分 化的神经元。W098/50526和W099/01159报道神经上皮干细胞、少突胶质细胞一星形细胞 前体和谱系限制性神经元前体细胞的产生和分离。美国专利5，968，829报道从胚胎前脑得 到神经干细胞和用含葡萄糖、运铁蛋白、胰岛素、硒、孕酮和其它几种生长因子的培养基培 养。用适当组合的胶原酶和透明质酸酶进行灌注可以从人活检或手术切除的组织得到原代 肝细胞培养物。另一方面，EP0953633AI报道通过制备切碎的人肝组织，在生长养基中重悬 浓缩的组织细胞和在培养中扩展细胞来分离肝细胞。该生长培养基含有葡萄糖、胰岛素、运 铁蛋白、T3、FCS和使肝细胞生长但不发生恶性转化的各种组织提取物。据认为肝脏中的细 胞含有特殊化的细胞，包括肝实质细胞、枯否(Kupffer)细胞、窦状隙内皮和胆管上皮以及 还有前体细胞(称为“成肝细胞”或“卵形细胞”)，该细胞具有分化成为成熟肝细胞或胆上 皮细胞的能力(L. E. Rogler, Am. J. Pathol. 150 :591，1997 ；M. Alison Current Opin Cell Biol. 10 710,1998 ；Lazaro 等，Cancer Res. 58 :514，1998)。美国专利5，192，553报道分离人新生儿或胎儿造血干细胞或祖细胞的方法。美 国专利5，716，827报道人造血细胞是Thy-I阳性祖细胞，和合适的生长培养基使它们在体 外再生。美国专利5，635，387报道培养造血细胞及其前体细胞的方法和装置。美国专利 6，015，554描述了重建人淋巴样细胞和树状细胞的方法。美国专利5，486，359报道人间充质干细胞的同源群体可分化成为一种以上结缔 组织类型的细胞，如骨、软骨、腱、韧带和真皮。它们可从骨髓或骨膜得到。还报道了用于 扩展间充质干细胞的培养条件。W099/01145报道从用生长因子(如G-CSF或GM-SCF)治 疗的个体外周血中分离人间充质干细胞。W000/53795报道脂肪组织衍生的干细胞和网络 (Lattice)，基本上没有脂肪细胞和红细胞。可对报道的这些细胞进行扩展和培养以产生激 素和条件培养基。本发明可使用任何脊椎动物的干细胞来实施。包括人的干细胞以及非人灵长动 物、家畜、牲畜和其它非人哺乳动物。在适合用于本发明的干细胞中，非限制性例子是胚胎干细胞的原代培养物或已建 立的细胞系。培养基和饲养细胞分离和增殖pPS细胞的培养基可以有几种不同的配方，只要获得的细胞具有所 需的特征并可进一步增殖。合适的来源如下Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM)， Gibco#l 1965-092，Knockout Dulbecco 改进的 Eagle 培养基(KODMEM)，Gibco#10829-018, 200mM L-谷氨酸胺，Gibco#15039-027 ；非必需氨基酸溶液，Gibco#11140-050, β -巯基 乙醇，Sigma#M7522，人重组碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，Gibco#13256_029。用80% DMEM(通常是KO DMEM)、20%未加热灭活的胎牛血清(FBS)品，0. ImM非必需氨基酸，ImM
12L-谷氨酰胺和0，. ImM β-巯基乙醇制备示范性的含血清ES培养基。过滤此培养基，贮存 于4°C不超过2周。用80%K0 DMEM，20%血清代用品、0. ImM非必需氨基酸，ImM L-谷氨酰 胺和0. ImM β-巯基乙醇制备无血清ES培养基。有效的血清代用品是Gibco#10828-028。 过滤此培养基，贮存于4°C不超过2周。使用前加入bFGF至最终浓度4ng/ml (Bodnar等， Geron公司，国际专利出版物WO 99/20741)。在含90% DMEM(Gibco#l 1965-092)，10% FBS (Hyclone#30071-03)和 2mM 谷氨酰 胺的mEF培养基中增殖饲养细胞。在T150瓶(COrning#4308250)中增殖mEF，每隔一天用胰 蛋白酶1 2断裂细胞，使细胞保持亚铺满状态。为了制备饲养细胞层，以抑制增殖但允许 合成支持hES细胞的重要因子的剂量照射细胞，( 400拉德伽马照射)。用Iml 0.5%明 胶/孔37°C包被6孔培养板(如FalCOn#304)过夜，每孔接种375，000个经过照射的mEF。 饲养细胞层接种后一般可用5小时到4天。在接种pPS细胞前，培养基用新鲜hES培养基 代替。培养其它干细胞的条件是已知的，可根据细胞类型适当地最佳化。本文前部分章 节涉及的特定细胞类型的培养基和培养技术在列出的参考文献中有所提供。胚胎干细胞可以从灵长动物成员的胚泡中分离得到胚胎干细胞(Thomsn等；Proc. Natl. Acad Sci. USA 92:7844,1995)。使用 Thomson 等(美国专利 5，843，780 ;Science 282:1145， 1998 ；Curr. Top Dev. Biol. 38 :133，1988)和 Reubinoff 等，NatureBiotech, 18:399，2000 描述的技术可从人胚泡细胞制备人胚胎干细胞(hES)。增殖未分化状态的pPS细胞采用促进增殖而不促进分化的培养条件的组合，可以在培养中连续增殖pPS细 胞。传统上，在饲养细胞一般是成纤维细胞型细胞层上培养pPS细胞，通常衍生自胚 胎或胎儿组织。接种该细胞系至接近汇合，通常予以照射以防止增殖，然后用来支持PPS细 胞培养物。在一个说明中，pPS细胞先衍生自原代胚胎成纤维细胞并在其上获得支持。可以 从远交繁殖的CFI小鼠(SASCO)或其它合适的品系得到小鼠胚胎成纤维细胞。用70%乙 醇擦净妊娠第13天小鼠腹部，将蜕膜移入磷酸缓冲盐水(PBS)。收集胚胎，除去胎盘、胎膜 和软组织；尸体用PBS洗涤两次。然后将它们转到含有2ml胰蛋白酶/EDTA的新的IOcm细 菌平皿中，并细致地切碎。37°C培育5分钟后，用含有10%牛血清的5mlDMEM灭活胰蛋白 酶，混合液转到15ml锥形管，并解离。碎片沉淀2分钟，上清液配成最终体积10ml，并接种 在IOcm组织培养板上或T75瓶中。在置换培养基后培养瓶静止培养24小时。当培养瓶达到汇合(2-3天)时，将它们1 2分到新的瓶中。Geron公司的科学家发现即使没有饲养细胞，hPS细胞可以维持在未分化状态。无 饲养细胞培养的环境包括合适的培养底物，特别是胞外基质，如可衍自生基底膜或可形成 部分的粘附分子受体一配体偶联。一种合适的制备物购自BectonDickenson公司，商品名 Matrigel 。其它胞外基质成分和成分混合物适合作为选择对象。视增殖的细胞类型而定， 这可包括层粘连蛋白、纤连蛋白、蛋白聚糖、巢蛋白、硫酸乙酰肝素等等，单独或以不同的组 合。层粘连蛋白是脊椎动物中所有基底层的主要成分，它与整联蛋白异二聚体如α6β1和
13α6β4(对层粘接蛋白特异)和其它异二聚体(与其它基质交叉反应)相互反应。将多能干细胞以适当的分布接种在此底物上，在促进细胞生存的培养基 存在时，细胞增殖并保留所需的特征。已发现接种密度至少15000细胞cm_2 (—般 90，000cm_2-170，OOOcnT2)促进存活和限制分化。在缺乏饲养细胞时，pPS细胞的传代受益 于以小细胞团形式制备的PPS细胞。一般在细胞完全分散之前停止酶消化(用IV型胶原 酶大约5分钟)然后将10 2000个细胞的小团直接接种在该底物上不必进一步分散。或 者，原代PS细胞可作为更精制的细胞悬液在无饲养细胞的培养物之间传代，如果选择了合 适的酶和培养基时。此接种密度足够高。为了说明起见，用0.05%重量/体积胰蛋白酶 (Gibco)和0. 053mMEDTA溶液37°C培育5_15分钟，从平板中取出无饲养细胞培养的汇合的 人胚胎干细胞。用移液管除去平板中的剩余细胞，用移液管捣碎这些细胞直到分散成为含 有单个细胞和一些小团的悬浮液。然后以50，000-200, 000细胞/cm2密度接种以促进存活 和限制分化。采用此技术传代的ES细胞表型类似于经胶原消化细胞成为小团收获时观察 到的情况。作为另一种选，在平板达到汇合之前可不用酶收获细胞。细胞在0.5mMEDTA(单 在PBS中)溶液中培养5分钟，从培养容器中洗下细胞，然后不作进一步分散接种于新培养 液中。在无新鲜饲养细胞时接种的pPS细胞从营养培养基的培养中受益。该培养基通常 含有常见的成分以增加细胞存活，包括等渗缓冲液、必需矿物质和血清或一些种类的血清 代用品。通过培养照射过的原代小鼠胚胎成纤维细胞(或另一种合适的细胞制备物)，在无 血清培养基(如KO DMEM补充20%血清代用品和4ng/ml碱性成纤维细胞生长因子)中以 5-6X IO4CnT2密度可以制备条件培养基。于37°C1天后收获培养物上清液。作为原代小鼠成纤维细胞培养物的选择方法，可以从适当地测试过产生条件培养 基的能力的胚胎成纤维细胞系制备条件培养基。这种细胞系可任选地用端粒酶逆转录酶转 染以提高它们的复制能力。另一对可能的来源是具有成纤维细胞形态特性的分化的PPS细 胞。在采用非粘附细胞培养平板(2 X IO6细胞/9. 6cm2)的分化培养基中悬浮培养pPS细胞 成为聚集物。2天后将此聚集物转移到明胶包被的平板中，11天后成纤维细胞样细胞在混 合细胞群中以100-1000细胞的小团形式出现。胶原酶简单处理后，在显微镜下可收集到成 纤维样细胞，在mEF培养基中传代，测试它们产生条件ES培养基的能力。1-2天的条件培养 基一般用来支持PPS细胞培养1-2天，然后互换。如果需要，使用前此条件培养基可添加有 利于PPS细胞培养的附加生长因子。对于hES，可使用生长因子bFGF或FGF-4。对于hEG， 培养基可添加生长因子bFGF，( 一种gP130的诱导剂)，如LIF或抑癌蛋白-M，或许一种能 提高环化AMP水平的因子，如毛喉素。未分化的pPS细胞的特征在二维标准显微镜图像中，hES细胞在图像平面中具有核/胞质高比例、突出的核 仁和形成紧密的集落，细胞连接不易分辨。采用标准的G-显带技术(可在提供常规核型分 析服务的许多临床诊断实验室获得，如Cytogenetics实验室，OaklandCA)可核型分析诸细 胞系，并与已发表的人核型比较。也可采用表达的细胞标记物特征鉴定hES和hEG细胞。通常采用合适的免疫技术 一如用于膜结合标志的流式细胞术，用于胞内标志的免疫组织化学和用于分泌入培养基标 志物的酶联免疫试验来检测本文讨论的组织特异性标志。采用标志特异性引物经逆转录酶-PCR也可在mRNA水平检测蛋白质标志物的表达。进一步细节参见美国专利5，843，780。时期特异的胚胎抗原(SSEA)是某些胚胎细胞类型的特征。SSEA标志物的抗体购
(The Developmental Studies Hybridoma Bank，BethesdgiMD) 。 MM 称为Tra-1-60和Tra-1-81的抗体可检测其它有用的标志物(Andrews等，Cell Lines From Human Germ Cell Tumors, in E. J. Robertson，1987，参见上文)。hES 细胞一般是 SSEA-1 阴 性和SSEA-4阳性。hEG细胞一般是SSEA-I阳性，pPS细胞体外分化导致SSEA-4、Tra-1-60 和Tra-1-81表达丧失，和增加了 SSEA-I的表达。也可通过碱性磷酸酶活性的存在特征鉴 定PPS细胞，用4%低聚甲醛固定细胞可检测碱性磷酸酶活性，然后用Vector红作为底物显 影，如制造商(Vector Laboratories, Burlingame CA)所述。胚胎干细胞也一般是端粒酶阳性和0CT-4阳性。采用TRAP活性试验(Kim等， Science 266 :2011，1997)，采用市售的试剂盒(TRAPeze XK端粒酶检测试剂盒，目录 号 S7707 ； Intergen 公司，Purchase NY ；或 TeloTAGGG 端粒酶 PCR ELISA Plus，目录号 2, 013, 89 ；Roche Diagnostics, Indianapolis)可检测端粒酶活性。通过 RT-PCR 也可在 mRNA水平评价hTERT的表达。Light Cygcler TeloTAGGG hTERT定量试剂盒(目录号 3,012, 344 ；Roche Diagnostics)市场上可购到用于研究目的。分化的pPS细胞首先形成的胚胎样小体可启动pPS细胞的分化。在0’ Shea的解剖学记录中报道 了培养胚样小体的一般原理(New Anat. 257 :323，1999)。以一种允许聚集物形成的方式培 养pPS细胞，对此可得到许多选择例如通过供体pPS细胞培养的过度生长或通过在具有 低粘附特性(使得能形成EB)的底物的培养容器中培养pPS细胞。也可在悬浮培养中制备 胚胎样小体。用胶原酶简单消化收集PPS细胞，解剂成小团，接种在非粘附细胞培养板上。 每隔几天喂饲细胞聚集物，在合适的时间后收集，一般4-8天。然后可以在促进富集特定 谱系细胞的培养基和/或底物上培养细胞。底物可包含基质成分，如Matngel (Becton Dickenson)、层粘连蛋白、胶原、明胶或预先培养能产生基质的细胞系，(如成纤维细胞，或 内皮细胞系)产生的基质，然后裂解和洗涤，这样使基质仍附着于容器的表面。胚胎样小体 包含异源细胞群，可能具有内胚层的外部和中胚层及外胚层的内部。Geron公司的科学家发现pPS细胞可分化成为定型前体细胞，或最终分化细胞不 形成胚胎样小体或聚集物作为中间步骤。简单地说，制备未分化的PPS细胞悬浮液，然后接 种在能促进分化的固体表面上。合适的底物(包括玻璃或塑料表面)是可粘附性的。例如， 可用聚阳离子物质(如聚胺类聚赖氨酸、聚鸟氨酸)或其它均一的或混合的多肽或具有优 势阳电荷的其它聚合物来包被玻璃盖玻片。然后在合适的营养培养基中培养细胞，此培养 基适合促进向所需的细胞谱系分化。在一些情况下，取消培养基中的血清或血清代用品进一步促进了分化。这可以 用无血清或血清代用品的培养基来实现，例如在再接种时。在本发明某些实施例中，取消 促进未分化细胞生长或起分化抑制剂作用的一种或多种培养基成分，促进了分化。这种成 分的例子包括某些生长因子、促有丝分裂原、白细胞抑制因子(LIF)和碱性成纤维细胞生 长因子。添加能促进向所需细胞谱系分化的培养基成分，或抑制具有不需要特征的细胞 生长也可促进分化。例如，为了产生定向分化为神经或胶质细胞谱系的细胞，培养基可 以包括有效组合的以下因子或培养基成分之一脑衍生神经营养因子(BDNF)、神经营养蛋
15白-3(NT-3)、NT-4、表皮生长因子(EGF)、睫状神经营养因子(CNTF)、神经生长因子(NGF)、 视黄酸(RA)、超声尿酸铵、FGF-8、抗坏血酸、毛喉素、胎牛血清(FBS)和骨形态发生蛋白 (BMP)。在Pederson(Reprod. Fertil. Dev. 6 :543，1994)和美国专利 6，090，622 中综述 了从多能干细胞获得组织细胞一般原理。其它感兴趣的出版物包括以下对于神经祖细 胞，神经限制性细胞和胶质细胞前体，参见Bain等；Biochem. Biophys. Res. Commun. 200 1252，1994 ；Trojanowski 等；Exp. Neurol. 144:92，1997 ；Wojcik 等；Proc.Natl. Acad. Sci. USA90 1305-130 ；和美国专利 5，851，832，5，928，947，5，766，948 和 5,849,553。对 于心肌和心肌细胞，参见Chen等；Den等；Dev. Dynamics 197 :217，1993和Wobus等； Differentiation 48 173，1991.对于造血祖细胞，参见 Burkert 等；NewBiol. 3 :698，1991 和Biesecker等，Exp. Hematol. 21 :774，1993.美国专利5，773，255涉及分泌葡萄糖反应性 胰岛素的胰β细胞系。美国专利5，789，246涉及肝细胞前体细胞。其它感兴趣的祖细胞 包括但不限于软骨细胞、成骨细胞；视网膜色素上皮细胞、成纤维细胞、皮肤细胞如角质形 成细胞、树突状细胞、毛囊细胞、输尿管上皮细胞、平滑肌和骨骼肌细胞、睾丸祖细胞和血管 内皮细胞。Geron公司的科学家发现在能结合生长因子受体的配体存在下，培养pPS细胞成 胚胎样小体细胞促了进神经前体细胞的富集。其生长环境可以含有一种神经细胞支持性胞 外基质，如纤连蛋白。合适的生长因子包括但不限于EGF、bFGF、PDGF、IGF-I和针对这些配 体的受体的抗体。根据它们是否表达一种标志(如A2B5)可任选地分离培养的细胞。在合 适的情况下，富集的表达A2B5标志的细胞群可能具有产生神经元细胞(包括成熟的神经 元)和胶质细胞(包括星形细胞和少突胶质细胞)的能力。任选地，使该细胞群进一步分 化，例如通过在含有cAMP激活剂的培养基中培养。Geron公司的科学家发现在一种肝细胞分化剂存在下，培养pPS细胞或胚胎样小 体细胞促进了肝细胞样细胞的富集。生长环境可含有肝细胞支持性胞外基质，如胶原或 Matrigel 。合适的分化剂包括丁酸的各种异构体和它们的类似物，以正丁酸为例子。培养 的细胞可任选地同时或依次用肝细胞成熟因子(如有机溶剂二甲基亚砜)、成熟辅因子(如 视黄酸)、或细胞因子或激素(如糖皮质素)、表皮生长因子(EGF)、胰岛素、TGF-α ,TGF-β、 成纤维细胞生长因子(FGF)、肝素、肝细胞生长因子(HGF)、IL-U IL-6、IGF-U IGF-II和 HBGF-I 培养。Geron公司的科学家发现将hPS细胞分化成为含心肌细胞或心肌细胞前体的高 度富集的细胞群也是可能的。例如，在含有能影响DNA-甲基化的心营养因子(以5-氮杂 胞苷为例)的生长环境中分化hES细胞可获得心肌细胞谱系细胞。例如通过密度离心可以 从细胞群中的其它细胞分离得到自发收缩的细胞。进一步的加工步骤可包括在含有肌酸、 肉(毒)碱或牛磺酸的培养基中培养细胞。或者，有可能将hPS细胞分化成为含表达骨钙 蛋白和胶原-1的骨祖细胞或成骨细胞的高度富集的细胞群。取出PPS衍生的间充质细胞 并在含有骨形态蛋白(特别是81^-4)，人16 -0受体的配体或人维生素D受体的配体的培 养基中，使它们分化可以获得细胞。分化细胞的特征细胞可根掘一些表型标准作特征鉴定。这些标准包括但不限于形态特征的鉴定，
16表达的细胞标志物和酶活性的检测或定量以及体内细胞功能特性的测定。对神经细胞感兴趣的标志包括β-微管蛋白III或神经丝，神经元的特征，胶质原 纤维酸性蛋白(GFAP)，在星形细胞中存在；半乳糖脑苷酯(Galc)或髓鞘碱性蛋白(MBP)少 突胶质细胞的特征；0CT-4未分化hES细胞的特征；巢蛋白(Nestin)，神经前体细胞和其它 细胞的特征。A2B5和NCAM分别是胶质祖细胞和神经祖细胞的特征。也可以测试细胞分泌 的特征性生物活性物质。例如，通过产生谷氨酸脱羧酶或GABA可以鉴定GABA分泌性神经 元。通过产生多巴脱羧酶，多巴胺或酪氨酸羟化酶可以鉴定多巴胺能神经元。肝细胞感兴趣的标志包括甲-胎蛋白(肝祖细胞)；白蛋白、α -抗胰蛋白酶， 葡萄糖-6-磷酸酶，细胞色素Ρ450活性，运铁蛋白，脱唾液酸糖蛋白受体和糖原贮积(肝 细胞)；CK7，CK19和r-谷氨酰转移酶(胆管上皮)。已报道肝细胞分化需要转录因子 HNF-4 α (Li等，Gene Dev. 14 =464,2000) 不依赖HNF-4 α表达的标志包括α 1_抗胰蛋白 酶，甲-胎蛋白，apoE，葡萄糖激酶，胰岛素生长因子1和2，IGF-I受体，胰岛素受体和瘦蛋 白(Ieptin) 依赖HNF_4a 表达的标志包括白蛋白、apoAI、apoAII、apoB、apoCIII、apoCII、 醛缩酶B、苯丙氨酸羟化酶、L型脂肪酸结合蛋白、运铁蛋白、视黄醇结合蛋白和红细胞生成 素(EPO)。通过特征性形态和它们表达的标志可以识别衍生自pPS细胞的混合细胞群中 的细胞类型。对于骨骼肌细胞标志有myOD、肌细胞生成素和myf-5。对于内皮细胞有 PECAM(血小板内皮细胞粘附分子)、FIK-1、tie-1、tie_2、血管内皮(VE)、钙粘着蛋白、 MECA-32和MEC-14. 7。对于平滑肌细胞有特异性肌球蛋白重链。对于心肌细胞有GATA_4、 NKX2. 5、心肌钙蛋白I、α -肌球蛋白重链和ANF。对于胰腺细胞有pdx和胰岛素分泌。对 于造血细胞及其祖细胞有=GATA-I、⑶34、AC133、β-主要球蛋白和β-主要球蛋白样基因 β Hl ο用免疫技术-如细胞表面标志的流式免疫细胞化学、细胞内或细胞表面标志的免 疫组织化学(如固定的细胞或组织切片)，细胞提取物的Western印迹分析和细胞提取物或 分泌入培养基的产物的酶联免疫试验，可以检测本文中列出的或本领域已知的某些组织特 异性标志。采用Northern印迹分析，斑点印迹杂交分析或采用标准扩增方法中的序列特异 性引物作逆转录酶引起的聚合酶链反应(RT-PCR)，也可在mRNA水平检测组织特异性基因 产物的表达。可从公布的数据库如GenBank (URL www. ncbi. nlm. nih. gov :80/entrez)得到 本文中列出的用于特定标志的序列资料。制备基本上无未分化细胞的细胞群按照本发明，通过在使基因在未分化细胞中优先表达的转录控制元件的控制下， 表达对细胞有致死作用或使细胞易遭受对外来药物的致死作用的基因，消除分化细胞群中 相对未分化的细胞。为了实现此目的，在将细胞分化成为治疗所需谱系细胞的过程之前或之后，用遗 传方法改变细胞，这样将适合负选择未分化细胞的效应基因置于具有所需特性的转录控制 元件的控制下。驱动负选择的转录控制元件选择控制元件的着眼点为细胞群中未分化和分化细胞的蛋白质表达模式。可通过比较两种不同的细胞群一种相对富集的分化细胞，另一种相对富集的未分化细胞，在转录、翻译或功能水平的表达，可以鉴定具有所需表达模式的基因。合适的比较方法包括cDNA文库的扣除杂交和mRNA水平的微阵列分析。一旦鉴定 到具有合适表达模式的转录物，其相应基因的启动子或增强子可用于构建阴性选择载体。采用基因微系统(Genetic Microsystem)阵列发生器和Axon GenePix 进行了合 适的微阵列分析。在96或384孔格式中扩增cDNA，制备微阵列，然后直接点在玻璃载玻片 上。为了比较两种细胞群的mRNA制备物，将一种制备物转化为Cy3-标志的cDNA，而另一种 转化为Cy-5-标记的cDNA。这两种cDNA制备物同时杂交到微阵列载玻片，然后洗涤除去非 特异性结合。阵列上任何给定的点结合每一种cDNA产物与两个初始的mRNA制备物中转 录物的丰度成比例。然后将载玻片以适合各标记物的波长扫描，测定mRNA的相对丰度。优 选，与分化细胞相比未分化细胞中效应基因的表达水平至少高5倍甚至25倍。为了消除多能胚胎细胞，示范性的控制元件是端粒酶逆转录酶(TERT)的 启动子。以下提供了人TERT基因的序列(包括上游启动子序列)。读者还可参 考英国专利GB2321642B (Cech等，Geron公司和科罗拉多大学)、国际专利出版物 W000/46355(Morin 等，Geron 公司)，Bayer Aktiengesellschaft), W099/33998(Hagen, 等 Bayer Aktiengessellschaf)和 Horilawa, I 等(Cancer Res. ，59 :826，1999)。在 W099/27113 (Morin,等Geron公司)中提供了小鼠TERT基因的序列。从ATCC登记号98505 获得含有hTERT编码序列上游的 13，500碱基的λ噬菌体克隆，称为λ6Φ5。实施例9 说明了载体表达系统中TERT启动子序列(SEQ. ID No. 1)的测试和使用。另一个示范性控制元件是八聚体结合转录因子4(0CT_4)，转录因子POU家族的 一个成员。0CT-4转录在发育中胚胎的4和80细胞阶段之间激活，它在扩展的胚泡中高 表达，然后在卵圆柱体的多能细胞中高表达。转录随着原始外胚层分化形成中胚层而下 调，至交配后8. 5天转录限于迁移性原始胚芽细胞。在多能胚胎癌和胚胎干细胞系中还观 察到高水平0CT-4基因表达，当这些细胞受诱导分化时其表达下调。在国际专利出版物 W09919469 (Biotransplant公司)中提供了猪、小鼠和人0CT-4启动子序列。从引起细胞群中未分化细胞(但不是分化细胞)的特征性标志表达的基因，可得 到其它合适的控制元件。例如，SSEA-3、SSEA-4、Tra-l-60和Tra-l_81是各种类型的未分化 多能胚胎干细胞的特征，引起SSEA-4合成的酶可能包含具所需表达特异性的转录控制元 件。一个最新的例子是Rexl蛋白的启动子，该蛋白是一种视黄酸调节的锌指蛋白，在移植 前胚胎中表达。已表明小鼠Rexl启动子可作为未分化胚胎干细胞的有效转录标记(Eiges 等，Current Biol. 11 514,2001)。通过基因转录表达分析，如微阵列分析可评估特定元件的适合性。可采用已鉴定 的细胞特异性基因的启动子或增强子序列控制报道基因的转录，如绿荧光蛋白、分泌的碱 性磷酸酶、β “葡糖醛酸或β “半乳糖苷酶，检测分化和未分化细胞中有合适特异性的报道 基因构建物。在实施例9中说明了采用报道基因构建物测试启动基因特异性。获得负选择的效应基因将一种具有合适特异性的转录调节元件操作性地连接于一产物的编码区，以直接 消除表达此产物的细胞或使该细胞对其它无害的外来药物敏感。合适的效应基因包括编肽毒素的那些效应基因一如篦麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、 白喉毒素、白树毒素、假单胞菌外毒素Α、响尾蛇毒素。Hughes等，Hum Exp. Toxicol, 15
18443,1996 ；Rosenblum 等.,Cancer Immunol. Immunther. 42 115,1996 ；Rodriguez 等。 Prostate 34 :259，1998 ；Mauceri 等·，Cancer Res. 56 :4311，1996。诱导或介导细胞调亡的基因也是合适的，如半胱氨酸蛋白酶的ICE家族、蛋白质 的 Bcl-2 家族、Bax> bclxs 禾口 caspase (Favrot 等.，Gene Ther. 5 :728，1998 ；McGill 等.， Front Biosci. 2 :D353，1997 ;McDonnell 等·，Semin，Cancer Biol 6:53，1995)。另一种潜 在的抗肿瘤剂是细胞凋亡蛋白(Apoptin)，即使在小药物化疗失败时该蛋白也诱导细胞凋 亡(Pietersen 等·，Adv Exp. Med. Biol 465 153，2000) · Koge 等.(Hu. GeneTher. 11 :397， 2000)提出采用连接于细胞凋亡基因Caspase-8 (FLICE)的hTERT基因启动子的端粒酶特异 性基因治疗。Gu等，(Canacer Res. 60 =5359,2000)报道了通过hTERT启动子诱导Bax表 达的二元腺病系统。他们发现调亡基因诱发体外肿瘤特异性细胞凋亡和抑制裸鼠的肿瘤生 长。还感兴趣的是存在于裂解装置中的酶，该装置将细胞毒性T淋巴细胞或LAK细胞 输送给它们的靶细胞。一种孔形成蛋白穿孔素(Perforin)和Fas配体是这些细胞中的主 要细胞毒性分子(Brandav 等·，Clin Cancer Res. 6 3729,2000 ；Cruz 等·，Bry. J. Cancer 81 :881，1999)。CTLS还表达名命为颗粒酶(granzyme)的至少11个丝氨酸蛋白酶家族，它 具有四个主要底物特异性(Kam等.，Biochim. Biophys, Actal474 =307,2000)。低浓度的链 球菌溶血素0和肺炎球菌溶血素可促进颗粒酶B依赖的细胞凋亡(Browne等.，Mol. Cell Biol,19 8604,1999)。其它合适效应基因编码的多肽具有的活性本身对细胞无毒，但使细胞对其它无毒 性化合物敏感——通过代谢改变细胞或者将无毒性前药改变成致死性药物。仅在前药存在 时才显现对未分化表型的子代细胞有致死性。因此，细胞在体外分化、扩展或维持时，这种 前药可以与细胞混合，使具有未分化表型的细胞比例减到最低程度。读者不难理解这种前 药还可以给与用该细胞治疗的患者，或与治疗同时或在后来的时间，以最大程度地减少体 内具有未分化表型的子代细胞。具有此特性的示范性效应基因编码胸苷激酶(tk)，例如可以衍生自单纯疱疹病毒 和催化能力相等的变体。HSV tk能将抗疱疹药物更昔洛韦(GCV)转化为干扰增殖细胞DNA 复制的毒性产物。美国专利5，631，236(Baylor医学院)概述了含有HSV tk基因的腺病毒载 体，其操作性地连接于能在癌细胞中表达tk的一启动子。美国专利5，997，859和 EP702084B1 (Chiron)涉及复制缺损型重组逆转录病毒，其携带有指导HSV tk基因表达的 载体构建物，可将其它的惰性化合物转化为细胞毒性形式。EP415731A1 EP 657540A1，和 EP657541A1 (Wellcome基金会)提出编码一种酶(如VZV tk、羧肽酶G2、碱性磷酸酶，青霉 素V酰化酶和胞嘧啶脱氨酶)的逆转录载体，用于将前药转化为对癌细胞有毒性的药物。国 际专利出版物W098/14593和W000/46355 (Geron公司)描述了包含在hTERT启动子序列控 制下的HSVtk的构建物。人HSVtk基因序列与其用来靶向细胞表达TERT的说明在以下提供(SEQ IDNOS 2 和3)。该基因在靶细胞中的同时或随后的表达，在培养环境中加入一种可转化的前药(如 更昔洛韦)以影响靶细胞的消除。使细胞对其它非毒性剂敏感的另一类型的效应基因，是在细胞膜上引起外源性抗
19原呈递的基因。呈递的物质可以是同种抗原、异种抗原或非哺乳动物的抗原，已经有了它们 的特异性抗体。该基因表达导致抗原在未分化细胞上呈递，然后经合适的免疫分离，如免疫 亲和(例如淘选)、荧光激活细胞分选或补体介导的裂解可用来影响未分化细胞的消除。当转导剂是病毒载体时，效应基因可以是病毒复制所需的病毒基因。用于腺病毒 复制的必需基因包括E4、Ela, E16和E2区域。用于HSV-I复制的必需基因包括ICP6和 ICP4。将这些基因置于特异性启动子的制控下，用来转导分化细胞群中的细胞。然后该病毒 在未分化细胞中特异地复制，引起它们破裂。参见国际专利出版物W000/46355(Morin等.， Geron公司)描述的能在表达TERT的细胞中复制的裂解载体。编码膜蛋白的另一类型的效应基因序列含有特异性抗体识别的表位。膜蛋白可以 是在同一种动物在其它类型细胞中表达的蛋白质，但一般从另一种动物中得到，或是一种 人工序列。在此情况中，抗原对衍生干细胞的该种动物是外源性的，在同种动物中制备的抗 体与细胞上的其它抗原无交叉反应。另一方面，靶抗原可能是细胞表面的糖类或脂质成分。在此情况中，该效应基因序 列将编码参与抗原合成的酶。尤其感兴趣的是哺乳动物或非哺乳动物的糖基转移酶，其合 成糖类分化抗原、同种抗原、异种抗原或抗体可检测的新决定簇。例子包括标志SSEA-1、编 码相应的岩藻糖基转移酶的效应基因序列；大多数哺乳动物(除人和古时的猴子之外)的 内皮组织上存在着Gala (l，3)Gal连接键，由a (1,3)半乳糖基转移酶(al，3GT)形成； 和在大多数人细胞上存在的ABO组织血型抗原，其编码序列是相应的ABO转移酶。参见 GenBank 登记号 S71333，J05175 和 AF134414。Gala (1，3) Gal 和 ABO 决定簇均对受试者中 天然存在的抗体介导的裂解敏感，这些受试者不具有作为自身抗原的决定簇。另一种可能的效应基因序列基于RNA-干扰(RNAi)技术。细胞中对应于成熟mRNA 部分的双链或发夹RNA(如基因转录物)可引起靶mRNA受到破坏(Sharp等.,Gene Dev. 13 139，1999 ;Wianny 等，Nat. Cell Biol 2:70，2000)。例如，含有能驱动发夹 RNA 表达的启 动子的质粒(将取自细胞基因的编码区的反向重复组成的转录物通过一短接头序列分开， 由此产生含有双链区域的合成RNA)已用来诱导C. elegans中的稳定和可遗传的RNA ；效应 (Tavernarakio 等.，Nat. Genet. 24 180,2000)。在本发明某些实施例中，将未分化细胞(或表达TERT的细胞)的驱动转录的控制 元件操作性连接于发夹RNAi的编码序列，此发夹RNAi可靶向一种特定的基因转录物。选 择靶基因对细胞生存力是必需的例如，碱性转录或翻译因子，tRNA基因、核糖体RNA亚基 或DNA或RNA聚合酶。在一个例子中，hTERT启动子驱动的RNAi，可使嘌呤补救途径中其基 因失活。在药物(如氨基蝶呤)存在下，嘌呤的从头合成被阻止，因为次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸 核糖转移酶(HGPRT)和胸苷激酶(TK)的活性受到抑制。在氨基蝶呤存在下，具有HGPRT和 TK的细胞存活，只要培养基添加了次黄嘌呤和胸苷(HAT培养基)。用HAT培养基培育可从 细胞群中除去残余的未分化细胞。采用其它类型的效应基因序列，如反义多核苷酸、核酶或 缺乏功能性催化域的显性失活类似物的编码序列，也可以靶向必需基因(如，HGPRT和TK) 的转录。可以构建用于本发明的载体的效应基因区，以便受到分子开关的功能控制。诸受 体的配体结合域之间的融合，导致分子中天然蛋白的正常功能在缺乏配体一结合域识别的 激素情况下受到抑制，这样配体的融合导致分子中天然蛋白的正常功能受到抑制。构建的融合蛋白含偶联于效应基因域的开关分子结合域，这样配体(如小分子半抗原)与结合域 的结合不掩蔽或激活效应基因域。合适的配体结合域可取自于受体(如雌激素)或抗体。 效应结构域可以是已列出的对细胞有致死作用的任何蛋白质，如肽毒素、内切核酸酶(大 核酸酶如标准的限制性内切酶的1-sce-l或人源化形式)或细胞凋亡的介质。效应基因的 致死功能是静止的，除非配体存在。这提供了另一个系统，在此系统中效应基因使细胞对外 来药物的毒性作用敏感(在此例子中是配体)，可以随意给与以控制培养中的或体内的未 分化细胞的消除。用于本发明的载体构建物还可含有正选择标记，例如也是在特异性启动子控制下 的抗生素抗性基因。例子是一种具有构象hTERT启动子-tk基因-IRES-neo的载体。目的 是使自杀效应基因和药物抗性基因均在TERT启动子的控制下表达。内部核糖体进入位点 (IRES)序列使tk基因和neo基因无在hTERT启动子的转录控制下。翻译后切割位点如2A 序列(Felipe等；Gene Ther 6:198，1999)可用于相似的作用。在未分化细胞中药物抗性 基因的活动促进了稳定整合了这种构建物的hES细胞系的产生和选择。此方法优于采用不 同启动子控制下的药物抗性基因共转染法，因为药物抗性基因不在分化细胞中表达。这避 免了宿主对移植细胞中该基因产物的不需要的免疫反应。消除未分化细胞的选择技术为了消除分化细胞群中的未分化细胞，使效应基因在未分化细胞中选择性表达。这可以用几种方法来实现。在一个实施例中，采用一种载体以遗传方法改变细胞 群，此载体中合适特异性的转录控制元件操作性地连接于该效应基因。遗传改变可以是瞬 时性的(例如采用腺病毒载体)，意味着随着细胞分裂表达水平减少。这适合于产生分化的 细胞群，此细胞群在治病时无异源基因。遗传改变也可以永久的(例如采用逆转录病毒)， 意味着这种改变初最初改变的细胞的子代所继承。这适合于产生分化的细胞群，此细胞群 具有正在进行的校正作用，随着它们在体外或体内的增殖可消除细胞群中产生的未分化或 去分化细胞。可采用任何合适的表达载体。可采用市售的病毒组分制备本发明能产生改变的 干细胞的合适病毒载体系统。在本文最后章节引用的出版物中一般描述了包含效应基 因的病毒载体。另一方面，采用电穿孔或采用脂质/DNA复合物，如美国专利5，578，475、 5，627，175,5, 705，308,5, 744，335,5, 976，567,6, 020，202 和 6，051，429 所述，可将载 体质粒引入细胞。例子是试剂脂质转染胺(LipofectamineUOOO ，购自Gibco/Life Technologies另一种示范性试剂是FuGENE 6转染试剂，非脂质体形式的脂质和含80%乙 醇的其它化合物的混合物，可从Roche Diagnostics公司得到。在另一个实施例中，将效应基因置于内源转录控制元件如hTERT或0CT-4启动子 的控制下。例如，这可通过同源重组来实施，采用的载体含有效应基因编码序列，此序列一 侧为转录控制元件和其它上游基因组序列，另一侧为下游靶基因的基因组序列。美国专 利5，464，764和5，631，153描述了双选择方法，在此方法中两个与基因靶类似的序列侧面 相接一个正选择标记，负选择标记连接于第二个侧接区的3’末端。美国专利5，789，215 报道采用的源重组靶向载体修饰小鼠胚胎干细胞的细胞基因组。在美国专利5，589，369、 5，776，774和5，789，215中可获得对同源重组靶向感兴趣的其它信息。如果效应基因能直接引起细胞裂解或凋亡，将细胞培养在预计控制元件会此起效
21应基因转录的条件下后将消除细胞群中的未分化细胞。然而，如果效应基因不直接致死，但 使细胞对外来药物的致死作用敏感，那么消除将延迟直到提供外来药物。例如，当效应基因 是一种转化酶的前药时，将细胞置于含有前药的环境中后才发生消除。当效应基因是一种 抗体靶子，则将细胞置于含有特异性抗体加补体的环境中才发生消除。环境可以是一种培 养容器，在此容器中的培养基中可加必需浓度的该药物。此外，可以在体内进行消除，给与 受试者此种细胞群，如果药物不是已经使用的话，可同时或依次给与该药物。可按照这些步骤用遗传方法修饰细胞群中的大多数分化细胞。或者，可按照这些 步骤用遗传方法修饰相对未分化细胞的前细胞群。在这种情况下，较典型的是使用在表达 后不立即杀死细胞的效应基因，但使细胞对一些外来药物的致死作用敏感。在一个例子中， 培养液中生长的未分化PPS细胞用逆转录病毒载体转导，此载体中疱疹胸苷激酶基因处在 hTERT启动子的控制下。或通过在该构建物中掺入可选择的标记，或通过测定转导基因的表 达和培养物中的增殖，选出转导阳性的细胞。当分化细胞是所需的时，使该细胞群通过一分 化步骤(例如制备肝细胞或神经元前体细胞，如前面所述)。在更昔洛韦存在下，将它们在 允许tk基因表达的条件下培养。作为一个例子，当RNAi是效应基因序列时，用由两个盒组成的构建物稳定地转染 hES细胞(例如用脂质转染法)，这两个盒一个盒中PGK启动子驱动新霉素磷酸转移酶基因 (导致对毒性新霉素同类物如遗传霉素的抗性)；另一个盒中hTERT启动子驱动含有HGPRT 或TK双链区的RNAi的编码区。在含有遗传霉素和氮鸟嘌呤或6-巯基嘌呤的培养基(以 选择HGPRT阴性细胞)中，或在含有遗传霉素和5-溴脱氧尿昔的培养基(以选择TK阴性 细胞)中，分离稳定修饰的克隆。或者，可只用RNAi试剂盒完成转染，此试剂盒中从培养基 中省去了遗传霉素。分离存活的克隆后，诱导这些细胞系分化成为所需的细胞类型，使其与 HAT培养基接触以杀死任何残余的干细胞。采用这些“消除”未分化细胞的技术得到的细胞群，表明存在的未分化细胞比例显 著减少。此步骤实施后，未分化细胞的比例可减少50%，甚至90%。取决于所选择的控制 元件和效应基因，可能获得“基本没有”未分化细胞的分化细胞群。这意味着此细胞群总体 上含有不到1 %的具有未化表型的细胞。含有少于0. 2%、0. 05%、0. 01%,20ppm或5ppm的 未分化细胞的细胞群是越来越优选的。对于PPS细胞，采用FACS分析计数表达SSEA-4的 细胞或采用荧光原位杂交计数表达TERT或0CT-4的细胞，可以测定未分化细胞的存在。分化细胞的用途按照本发明制备的细胞可用于各种商业上重要的研究、诊断和治疗的目的。因为本发明的细胞群消除了未分化细胞，所以它们可用来制备对分化表型特异 性的抗体和cDNA文库。在《实验免疫学手册》(Hand book of ExporimentImmunology) (ffei&Blackwell H ) ； ((fr lie ^ i^)) (Current protocol in Immunology) (Coligan φ 编)；禾口《免疫分析方法》(Methods of Immunological Analysis) (masseyeff 等编； Weinheim =VCH Verlags GmbH)中描述了用于产生、纯化和修饰抗体的一般技术以及它 们在免疫试验和免疫分离方法中的用途。在《RNA方法学分离和特征鉴定的实验室指 南〉〉(RNA Methodologies :A Laboratory Guide for Isolation andCharacterization) (R. E. Farrel 1, Academi 出版社，1998)；《cDNA 文库方案》(cDNALibrary Protocols) (Cowell&Austin 编，Humana 出版社)和《功能性基因组》(Functional Genomics)
22(Hunt&Livesy编；2000)中描述了涉及mRNA和cDNA文库制备的一般技术。相对均一的细胞群尤其适用于药物筛选和治疗应用。药物筛选本发明的分化pPS细胞可用来筛选因子(如溶剂、小分子药物、肽、多核苷酸等) 或影响分化细胞特征的环境条件(如培养条件或操作)。在一些用途中，分化细胞用来筛选能促进成熟或促进增殖和维持细胞长期培养的 因子。例如，将这些因子加到不同孔的PPS细胞中测试候选成熟因子或生长因子，然后确定 是否导致表型变化，按照所需标准进一步培养和使用这些细胞。本发明的具体筛选应用涉及在药物研究中测试药物化合物。读者一般可参考标 准教科书《药物研究的体夕卜方法》(In vitro methodo in pharmaceu—ticalResearch)， Academic出版社，1997和美国专利5，030, 015。评估候选药物化合物的活性，通常包括将本 发明的分化细胞与该候选化合物混合，确定由该化合物引起的细胞形态、标志表型或代谢 活性的变化(与未处理细胞或用惰性化合物处理的细胞比较)。然后将化合物的效果与观 察的结果相关联。可以进行筛选，例如或者因为设计的化合物对某些类型细胞有药理作用，或者因 为设计的化合物有效果但也有出乎意料的副作用。可联合测试两种或多种药物(或者同时 或者依次地与细胞混合)以检测可能的药物一药物相互作用效果。在一些应用中，先筛 选有潜在毒性的化合物(castell等；375-410页《药物研究的体外方法》。Academic出版 社，1997)。首先可通过对细胞生存力、存活、形态和某些标志的表达或释放、受体或酶的作 用来测定细胞毒性。可通过测定DNA合成或修复来确定药物对染色体DNA的作用。尤其 在细胞周期中不定时间当掺入的[3H]胸苷或BrdU超过细胞复制所需的水平与药物作用一 致。不需要的作用还可包括通过中期扩散测定的异常的姐妹染色单体交换率。读者可参考 A. Vickers (375-410页《药物研究的体外方法》，Academic出版社，1997)中的详尽细节。治疗用途本发明的分化细胞在需要时还可用于人患者的组织重建和再生。以允许移植到预 期的组织部位的方式给与这类细胞，重建或再生功能有缺陷的区域。在一个实施例中，根据治疗的疾病，将神经干细胞直接移植到中枢神经系统的实 质或鞘内部位。采用单细胞悬浮液或密度25，000-500，000细胞/μ 1的小聚集物进行移植 (美国专利5，968，829)。如McDonald等所述(Nat. Med. 5 :1410，1999)，可在脊椎急性损伤 的大鼠模型中评估神经细胞移植的效果。一个成功的移植将显示2 5周后在病灶中存在 表明移植物衍生的细胞，并分化成为星形细胞、少突胶质细胞和/或神经元，并从损伤端沿 神径索移动，门控、协调和重量承受有所改善。设计本发明的某些神经祖细胞来治疗神经系统的急性或慢性损伤。例如，兴奋毒 性牵涉到各种状况，包括癫痫、中风、局部缺血、哼廷顿病、帕金森病和阿尔茨海默病。本发 明的某些分化细胞还适合治疗髓鞘异常的疾病，如佩利措伊斯梅茨巴赫病、多发性硬化、脑 白质营养不良、神经炎和神经病。适合这些目的的是富含少突胶质细胞和少突胶质细胞前 体细胞的细胞培养物以促进髓鞘再形成。可以在动物模型中评估根据本发明制备的肝细胞和肝细胞前体细胞修复肝损伤 的能力。一个例子是腹膜内注射D-半乳糖胺引起损伤(Dabeva等；Am. J. Pathol. 143
231606，1993)。用免疫组织化学染色肝细胞标记可测定治疗的效果，显微镜确定在生长的组 织内是否形成小管结构和治疗恢复肝特异性蛋白质合成的能力。肝细胞可通过直接给与用 于治疗，或作为生物辅助装置，当患者暴发性肝衰竭后肝组织自身再生时提供暂时的肝功 能。可以在心脏冷冻损伤的动物模型中评估根据本发明制备的心肌细胞的效果，心脏 冷冻损伤使55%的左心室壁组织成为不能治疗的瘢痕组织(Li等；Arm. Thorac. Surg. 62 654,1996 ；Sakai 等；Ann. Thorac. Surg. 8 2074,1999, Sakai 等;J> Thorac> Cardiovasc> Surg. 118 :715，1999)。成功的治疗缩小了瘢痕面积，限制了瘢痕扩展，并通过收缩压、舒张 压和产生的压力测定心脏功能的改善。采用左前降支动脉远端部分中的一个栓塞性圈也可 以模拟心脏损伤(Watanabe等，Cell Transplant。7 :239，1998)，可通过组织学和心功能评 估治疗的效果。本发明的心肌细胞制备物可用于治疗以再生心肌和治疗心功能不全(美国 专利 5，919，449 和 W099/03973)。以下提供实施例作一步的说明，不意味着对本发明的权利要求的实施作任何限 制。
实施例实施例1 :hES细胞的无饲养细胞传代在此实验中，收获在原代小鼠胚胎饲养细胞上维持的未分化hES细胞，然后在缺 少饲养细胞的情况下维持。培养孔用Matrigel ^!被，在条件营养培养基中培养细胞，从 经照射的原代成纤维细胞的培养物获得此条件营养培养基。从原代小鼠胚胎成纤维细胞(mEF)制备条件培养基(CM)用无Ca+7Mg++PBS洗涤T150瓶一次，从中收获成纤维细胞，在1. 5_2ml胰蛋白 酶/EDTA(Gibco)中培养约5分钟。从瓶中取出脱落的成纤维细胞后，收集在mEF培养基 (DMEM+10% FBS)中。以4000拉德照射细胞(在Torrex 发生器中508秒，140KV 搁板设 置6)，计数，以每平方厘米约55，000细胞接种在mEF培养基(525，000细胞/孔的6孔平 板)中。至少4小时后用含有ES培养基(含bFGF)的Sr更换培养基，采用3_4ml/9. 6cm 孔的6孔平板。每天收集条件培养液喂养hES培养物。或者，用接种在培养瓶中的mEF制 备培养基，每天以0. 3-0. 4ml/cm_2更换培养基。加到hES培养物之前，给该条件培养基补充 4mng/ml的人bFGF(Bibco)。在此系统中，成纤维细胞培养物使用约1周，然后用新配制的 细胞代替。Matrigel 包被生长因子减少的Matrigel 或常规的 Matrigel (Becton-Dickinson，Bedford ΜΑ)于 4°C融化。Matrigel 用冷KODMEM作 1 10-1 500(—般 1 30)稀释。每9. 6cm2 孔加入0. 7-1. Oml溶液，于室温培育1小时。在加细胞之前包被孔用冷KODMEM洗涤一次。 包被后2小时内使用培养板或4°C贮存在DMEM中和，1周内使用。人ES培养物从饲养细胞上的hES培养物中收获未分化hES集落如下将培养物在 200单位/ ml胶原酶IV中37°C培育约5分钟，在显微镜下用20 μ 1移液管尖头挑取单个集落收获诸集 落，或者在条件培养基中刮取和解剖集落成为小团。然后将这些细胞以15个集落/9. 6cm2
24孔接种在条件培养基中的Matrigel 上(如果1个集落是 10，000个细胞，接种密度是 15，000 个细胞 cm_2)。在Matrigel —上接种后1天，可见hES细胞像小集落( 100-2，000细胞)，集落
之间的单个细胞看似分化或干燥的细胞。随着hES细胞增值，集落变得相当大，且很紧密， 占据了培养皿的大部分表面区域。集落中的hES细胞具有核与胞质高比例和突出的核仁， 与饲养细胞上维持的hES细胞相似。在汇合时，集落之间分化细胞代表培养的低于10%的 细胞。接种后6天，培养物几乎铺满。在Iml KO DMEM (含200单位/ml胶原酶IV溶液) 中37°C培育 5分钟来分离培养物。吸出胶原酶溶液，每孔加2mlhES培养基，用移液管从 平皿中刮下hES细胞。将细胞悬浮液转移到15ml锥形管，使体积为6ml，将细胞缓慢捣碎 并分解成10-2000个细胞的小团。同上将细胞再接种在包被Matrigel 的CM平板上。以 1 30或1 6比例接种细胞，每平方厘米约90，000-170, 000个细胞，体积为3ml/孔。每 天更换培养基，在初次接种后的第13天和第19天分离细胞和再传代。在初次接种后第19天，收获细胞，采用对细胞表面标志特异性标记抗体，作免疫 荧光细胞计量术评估表面标志的表达。对于在缺少饲养细胞时维持的hES细胞，高百分比 表达了 SSEA-4、Tra-1-60或Tra_l_81。这3种标志在未分化的维持在饲养细胞上的人ES 细胞上也有表达。(Thomson等.，1998)。此外，SSEA-I的表达很少，SSEA-I这是一种在未 分化ES细胞上不表达(或低水平表达)的糖脂。SSEA-4、Tra-l-60和Tra-1-81的免疫组 织化学评估表明，这些标记的表达定位于ES集落，集落之间的分化细胞不表达。初次接种后，在缺少饲养细胞的情况下hES细胞的培养物已生长180天，在增殖能 力或表型方面没有明显的变化。在mEF条件基Matrigel 上维持的人ES细胞具有约3-33 小时的倍增时间，与在mEF饲养细胞上生长的hES细胞的增殖率相似。无饲养细胞培养64 天后，Hl细胞显示正常的核型。实施例2 无饲养细胞培养中的hES细胞的表型标志未分化hES 细胞表达 SSEA-4、Tra-1-60, Tra-1-8U 0CT-4 和 hTERT。分化后这些 标志的表达减少。为了评估在无饲养条件中维持的细胞是否保留这些标志，用免疫染色，逆 转录酶PCR扩增和端粒酶活性测定评估细胞。为了进行荧光激活细胞分选分析，在含0. 5mMEDTA的PBS中解剖hES细胞，并重 悬于含0.1% BSA的50 μ IPBS稀释液中至约5X IO5细胞。为了分析表面标志表达，在第 一抗体中40°C培育细胞30分钟，包括IgG同种型对照(0. 5 μ g/试验)、IgM同种型对照 (1 10)、SSEA-1(1 10)、SSEA-4(1 20),Tra-1-60(1 40)和 Tra_l_81(1 80)，以 稀释液稀释。用稀释液洗涤后，与偶联PE (Becton Dickinson, San Jose, CA)的大鼠抗-小 鼠K链抗体4°C培育细胞30分钟。洗涤细胞，采用CellQuest 软件在FACScalibur 流式 细胞仪(Becton Dickinson, San Jose, CA)上分析。与饲养细胞上的hES细胞相似，Matrigel 、层粘连蛋白、纤连蛋白或胶原IV上的 细胞表达了 SSEA-4、Tra-1-60和Tra-1-81。SSEA-1的表达很少，它是一种不被未分化hES 细胞表达的糖脂。为了进行免疫细胞化学分析，用第一抗体37°C培育细胞30分钟，包括SSEA-I/ (1 10)、SSEA-4(1 20) ,Tra-1-60 (1 40)和 Tra-1-81 (1 80)，以敲除 DMEM 液稀释。
25然后用温热的敲除DMEM液洗涤细胞，在2%低聚甲醛中固定15分钟。用PBS洗涤后，用含 5%山羊血清的PBS室温培育细胞30分钟，接着用FITC偶联的山羊抗小鼠抗体(1 125) (Sigma)室温培育30分钟。洗涤细胞，用DAPI染色，并固定。传代后染色一般进行 2天。 还检测细胞的碱性磷酸酶(一种未分化ES细胞的标志)的表达。方法如下培育小室载 玻片上的细胞，用4%低聚甲醛固定15分钟，然后用PBS洗涤。用碱性磷酸酶底物(Vector Laboratories, Inc.，Burlingame，CA)室温黑暗培育细胞1小时。固定前，用100%乙醇淋 洗载玻片2-5分钟。结果显示，在Matrigel 或层粘连蛋白上的hES集落表达了 SSEA-4、Tra-1-60、 Tra-1-81和碱性磷酸酶，如在饲养细胞上的细胞所见那样，但集落之间的分化细胞不表达。图1显示在饲养细胞上和饲养细胞外的Hl细胞表达了 0CT-4和hTERT，如用逆 转录酶PCR扩增检测的那样。为了对各个基因产物进行放射活性相对定量，根据制造商的 说明采用QuantumRNA 相间18S内标引物(Ambio，Austin TX, USA)。简言之，测量了特定 引物对的扩增线性范围，然后与相间18S引物竞争物的合适混合物共扩增，产生具有相符 的线性范围的PCR产物。根据制造商的说明在PCR反应中加入AmpliTaqTM(R0Che)前，用 TaqStart 抗体(Promega)预培育酶。在5 %非变性聚丙烯酰胺凝胶上分析放射性PCR反 应，干燥，并暴光磷显象屏(Molecular Dynamics) 1 小时。用 Molecular Dynamics Storm 860扫描该屏，采用Image Quant 软件定量条带强度。结果表示为掺入hTERT或0CT-4条 带的放射活性比率，按掺入18s条带的放射活性标准化。特定标志的引物和扩增条件如下:0CT-4 有义(SEQ，IDN0. 4) 5，-CTTGCTGCAG AAGTGGGTGG AGGAA-3，反义(SEQ. ID N0. 5)。5，-CTGCAGTGTG GGTTTCGGGCA-3，；相间 18S 竞争物为 1 4;19 循环(94° 30 秒; 60° 30 秒；72° 30 秒)。HTERT 有义(SEQ. ID N0. 6) 5，-CGGAAGAGTGTCTGGAGCAA-3 ‘反义 (SEQ. ID No. 7)5，-GGATGAAGCG GAGTCTGGA-3，；相间 18 竞争物为12 ；34 循环(94° 30 秒； 60° 30 秒；72° 30 秒)。除Matrigel 和常规培养基外，在所有培养条件中的看到hTER和0CT-4表达。此 外，细胞与视黄酸或二甲亚砜接触后，促进细胞分化，hTERT表达的因子显著地减少。图2显示用TRAP活性试验测定端粒酶活性(Kim等·，Science 266 :2011，1997 ； Weinrich 等.，Nature Genetics 17:498,1997)。在 mEF 条件培养基中，在 Matrigel 、层 粘连蛋白、纤连蛋白或胶原酶IV上40天后，所有的培养条件显示阳性端粒酶活性。实施例3 :hES细胞的分化在此实验中，采用聚集物形成的标准方法分析分化与直接分化技术进行比较。对于聚集物分化技术，在胶原膜IV中培育5-20分钟收获恒河猴和人ES细胞系的 单层培养物，从平板中刮下细胞。然后分解细胞并接种含FBS培养基的非粘附细胞培养平 板上。平板放入37°C培养箱，在有些例子中，采用振摇器有利于在悬浮液中维持聚集物。在 悬液中培养4 8天后，形成聚集物小体，接种在底物上使进一步分化。对于直接分化技术，以相似方法制备恒河猴和人ES细胞的悬浮液。捣碎分离细胞 成为50-100个细胞的小团，接种在用聚-鸟氨酸处理的盖玻片上。在分析前，细胞在含血 清培养基或限定培养基中维持7-10天。固定两种制备物的细胞，并测试对β-微管蛋白III和ΜΑΡ_2(是神经元的特征)
26和胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)(是星形细胞的特征)的免疫反应性。结果见表1所示。表IhPS分化方法的比较 采用聚集物或直接分化技术将恒河猴和人ES细胞系分化成为携带神经元和星形 细胞标志的细胞。在恒河猴培养物中，含有神经元聚集物的百分比范围从40%到93%。在 检测的人细胞系中，含有神经元聚集物的百分比范围从60%到80%。GABA和β-微管蛋白 的双重标记表明一种神经细胞亚群表达了抑制性神经递质GABA。此外，鉴定到星形细胞和 少突胶质细胞分别具有GFAP免疫反应和Galc免疫反应性。因此，在中枢神经系统中人和 恒河猴ES细胞系具有形成所有三种主要细胞表型的能力。检测了神经营养生长因子家族的几个成员的作用。用胶原酶收获分化的hES细 胞分离和重新接种在包被聚鸟氨酸的盖玻片上。细胞接种在DMEM/F12+N2+10% FBS中过 夜。次日，从培养基中去除血清，用lOng/ml人bFGF和已测试的生长因子代替。24小时 后，从培养基中去除bFGF。每隔一天喂饲这些培养物，分化7天后固定并免疫染色进行分 析。计数β-微管蛋白阳性的细胞评估神经元的数目。在lOng/ml脑衍生的神经营养因子 (BDNF)存在下维持的培养物形成了比对照培养物多大约3倍的神经元，维持在神经营养蛋 白-3(lng/ml)中的培养物形成的神经元比对照培养物约多2倍。在后续实验中，从亲代细胞系H9和两个亚克隆细胞系制备人ES细胞的悬浮液。采 用胶原酶儿收获细胞，然而再接种在包被聚鸟氨酸的玻璃载玻片上(在含20% FBS的培养 基中)。然后每隔一天喂饲培养物共7-10天。固定细胞作免疫染色。从这些细胞系的每个 系中，许多分化细胞肌肉特异性肌动蛋白染色阳性(抗体购自Dako)但心肌钙蛋白1阴性。 若干片细胞甲胎蛋白阳性染色，表明存在骨胚层细胞。实施例4 直接分化与通过胚胎样小体分化的比较为了诱导直接分化，收获未分化hES细胞，并直接重接种在分化条件中。接种后相 当多的细胞死亡是明显的，但许多细胞粘着并开始增殖和/或分化。在采用含血清条件的 分化细胞培养中，培养物继续增殖，在5-10天内达到铺满。此时培养物含有显示许多不同 形态的不均一细胞群。采用分别针对微管蛋白III.肌特异性肌动蛋白和甲胎蛋白的
27抗体，作免疫细胞化学揭示，有外胚层、中胚层和内胚层谱系细胞。在有时十分致密的小块 中呈现对所有这些类型细胞染色阳性，因此难以精确地定量每种类型细胞的百分率。为了增加神经元的百比率，将hES细胞接种在包被聚鸟氨酸的玻璃盖玻片上，在 限定培养基中培养。虽然这些数据表明可衍生出所有三种胚层的细胞但并不产生EB，没有 鉴定到心肌细胞。为了比较，通过产生胚胎样小体诱导hES细胞分化。在这些实验中，收获ES细胞 并再接种在悬浮培养液中。虽然最初观察到明显数量的细胞死亡，但2-3天后维持细胞形 成了聚集物。在培养中维持EB多达16天，接种后仍存活并形成许多结构。后阶段人EBs 常显示囊样形态，有时形成跳动的EB。为了评估心肌细胞形成，在悬浮培养4天后将EB转移到包被明胶的平板或小室载 玻片。接种后EB附着表面，增殖和分化成不同类型的细胞。在分化第8天培养物的不同区 域中观察到自发性收缩细胞，跳动区(beating regions)数目增加直到约第10天。在一些 例子中，75%以上EB有收缩区域。跳动细胞的形态学与小鼠ES细胞衍生的跳动心肌胞类 似。此外，采用免疫细胞化学在分化第15天检测心特异性标志心肌钙蛋白I的表达。在培 养物固定前，对分化培养物中的各个收缩点照相，以记录收缩区，然后评估培养物的心cTnl 表达和与原先照片匹配以测定收缩区的百分率，收缩区为cTnl染色阳性。在这些培养物 中，100%收缩区域显示阳性免疫反应性，而在非跳动细胞中观察到最小免疫反应性。采用针对cTnl的单克隆抗体，对分化EB的培养物进行Western印迹分析。此试 验得出强的31Kda蛋白信号，与纯化的天然人心Tnl的大小相符。在含收缩细胞的分化人 EB细胞中检测到cTnl，但在粉化EB细胞或无收缩细胞的分化培养物中没测到，提示这是心 肌细胞的特异性检测。作为一个对照，此印迹用肌动蛋白抗体重探测，证实在所有样品 中存在相似量的蛋白质。在其它实验中，EB培养8或16天，并作为粘附培养物再维持10天。制备分化的 人ES细胞RNA，并进行半定量RT-PCR以检测内胚层特异性产物α 1_抗-胰蛋白酶、AFP和 白蛋白的相对表达。在未分化培养物中检测到低水平的α 抗胰蛋白酶和AFP，少或没有 白蛋白。分化后检测到非常高水平的到所有3种标志物。在8天胚胎样小体衍生的培养物 中，所有3种内胚层标志物的表达比16天胚胎样小体高。实施例5 在原代mEF饲养层上维持的ES细胞的转染和转导在由80% KODMEM(Gibco)和20%血清代用品(Gibco)补充1 %非必需氨基酸、ImM 谷氨酰胺、0. ImlM β-巯基乙醇和4ng/mlhbFGF (Gibco)组成的生长培养基中维持hES培养 物。加入细胞前，用0. 5%明胶(Signa)溶液包被平板37°C过夜。在标准mEF培养基中培养 原代mEF，每2天1分为2分直到5次分种。用胰蛋白酶脱落mEF的亚汇合培养物，重悬于 IOml培养基中，用TorrxTM150DX光发生器以累积剂量3500-4000拉德照射。以400Xg离心 5分钟沉淀经照射的细胞，以1. 25 X IO5细胞/ml重悬于标准mEF培养基中。用3. 75 X IO5 照射过的细胞/孔接种6孔平板的每个孔，用75000照射过的mEF细胞/孔，接种24孔平 板的每个孔。转染如下进行用胶原酶( 200单位/ml)37°C，7_10分钟从饲养层取出接种在 6孔板中的hES细胞。当集落开始脱落时，从每孔中吸弃胶原酶并用2ml/孔标准hES生长 培养基代替。用5ml移液管刮擦每个孔的表面取下hES细胞并转移到50ml锥形管中。加
28入另外的hES生长培养基至最终体积10ml。用IOml移液管捣碎细胞悬液10-12次，加入另 外的8ml标准hES生长培养基。6孔平板的每孔中加入3ml该细胞悬液，如上所述此6孔平 板已用明胶和mEF饲养层预包被(即6孔平板的1孔足够接种新平板的6孔。用许多不同的转染系统测试再接种的hES细胞以确定是否能获得遗传改变的 hES细胞而不引起分化。测试的系统包括如下哺乳动物转染试剂盒(CaP04和DEAE试 剂)，Stratagene 目录号 #200285. TranslT-LTl Mirus (Panvers)目录号 #MIR2310 ； Polybrene(Sigma)；聚 赖 M 酸(Sigma) :Supertect (Qiagen ；Effectene (Qiagen) Lipofectin (Life Techno logies)Lipofectamine(同 于 Lipofectamine2000 ) (Life Technologies) ；DMRIE-C(Life Technologies) ；Lipofectamine 2000 (LifeTechnologies) 和采用BioRad 基因脉冲发生器的电穿冲法。在所用的条件下，Lipofectamine2000 (Gtibco Life Technologies 目录号 #11668019，待批专利)和FuGENE (Fugent L. L. C的商标，脂质和其它成分的有专利权的混 合物，购自Roche Diagnostic公司，目录号#1814443)均取得良好的转染效果。如果再接 种后 48小时使这些试剂与的hES细胞接触效果通常最佳。采用Lipofectamine 2000 进行转染如下质粒 DNA(3_5ug PEG FP-CI，ClonTech,目录号#6084-1)用水稀释到最终体积100 μ 1。在预实验中， 5-30 μ ICipofectamine 2000 (Gibco,目录号 #11668-019)用 0ptiMEM (Gibco，目录号 #11-58-021)稀释到最终体积100 μ 1。然后将此DNA溶液缓慢加入Lipofectamine 2000 溶液，并温和地混合。室温培育此混合物20-30分钟后添加800 μ 1 OptiMEM 。用3ml预 热的OptiMEM 洗涤细胞，在每孔(9. 6cm2) 0. 5-lmlDNA/脂质混合液中37°C培育4小时。在 一些实验中，在4小时除去复合物然后加入4mlmEF条件培养基；在另一实验中，加入足够的 mEF条件培养基到孔中达到最终体积3. 5ml，混合液留置在细胞上过夜。在其它实验中，在 含足够mEF条件培养基的孔中加入DNA/脂质混合液使最终体积为3. 5ml，在此混合液中培 育细胞过夜。采用FuGENE 进行转染如下如制造商的说明书所述，用10 μ g DNA和 FuGENE 6 (Roche Dignostics公司)转染每个孔，FuGENE 试剂与DNA的比例为3 2。在 转染中采用OptiMEM 无血清培养基。在“老方案”中，加入FuGENEtm-DNA复合物4小时后， 每个转染孔加入2.5ml标准的hES生长培养基。在更新方案中(“3 2L”)不再用标准 hES生长培养基喂饲转染的孔。转染24小时后，用流式细胞仪评估GFP表达。转染前48小时，如上所述将hES细胞接种在已包被明胶和mEF饲养层的6孔板上。 按照制造商说明书采用FuGENE 6(Roche)或Lipofectamine 2000 转染hES细胞。转染后 24小时，在荧光显微镜下检查或流式细胞仪评估细胞的GFP表达。在图1所示实验中，比较 了三种方法标准Lipofectamine 2000 方案、标准FuGENE 方案和变化的FuGENE 方案 (DNA/脂质混合留置在细胞上过夜)。结果表明Lipofectamine 2000 —致地产生较高百 分率的GFP表达细胞，变化的FuGENE 方案产生具有较高平均荧光强度的GFP表达细胞。采用腺病毒载体进行瞬时转导如下载体Ad5CMV5_GFP (本文称为Ad5GFP)含有 在CMV启动子控制下的绿荧光蛋白编码区，此载体购自QuantumBiotechologies，目录号 #ADV0030。如上所述转导前72小时，将hES细胞接种在已包被明胶和mEF饲养层的24孔 板上。转导前，于37°C用0.05%胰蛋白酶/5mMEDTA(Sigma)溶液脱下3孔的hES细胞，重
29悬于500 μ 1标准mEF生长培养基中，并用血细胞计计数(从每孔中减去75，000个mEF饲 养细胞，以在转染前建立细胞数量。临用前在冰上融化腺病毒贮存液。对于用Ad5GFP转染，从含hES细胞的孔中吸出生长培养基，并用加有9 μ lAd5GFP 贮存液(40感梁复数)的ImlhES生长培养基代替。2小时后，用Iml/孔hES生长培养基 代替含病毒的培养基。每24小时每个转导孔中再加入Iml新鲜hES生长培养基。用流式 细胞仪评估GFP表达。典型实验的结果表明，转导24小时后表达最高，但低水平至少持续 8天(在后来的时间点，由于hES细胞过度生长出现了广范的分化)。实施例6 无限增殖饲养细胞系NH190的制备在此实施例中，建立了一种永久的小鼠细胞系适合于制备用于培养灵长类多能 干(pPS)细胞的条件培养基。NHG190细胞系是一种无限增殖的小鼠胚胎成纤维细胞，具有 三种药物抗性和表达绿荧光蛋白(GFP)的端粒酶。从Jackson实验室(Bar Harbor Maine)获得2株小鼠，其具有对新霉素或 潮毒素抗性的转基因。购自Jackson实验室的C57BL/6J-TgN (pPGKneobpA) 3Ems小鼠 和C57BL/6J-TgN(pPWL512hyg) IEms小鼠是杂交小鼠。按照制备饲养层的小鼠胚胎成 纤维细胞(mEF)的标准方案，在妊娠后第13. 5天解剖新霉素抗性和潮霉素抗性的胚胎 (E. J. Robertson, 71-112 页，《畸胎癌和胚干细胞系》，E. J. Robertson 编，Oxford =IRL 出版 社，1987)将衍生的mEF细胞冷冻贮存。在含20% 胎牛血清(Hyclone). 2mML_ 谷氨酰胺(Gibco/BRL). 80 % DMEM(Gibco/ BRL)的生长培养基中融化mEF。采用一分为二，扩展此细胞，4次传代)。电穿孔前4小时， 给达到 75%汇合的2个烧瓶加新鲜培养基。以0. 5%胰蛋白酶/500mMEDTA(GibcO/BRL) 的烧瓶中取出细胞，以400Xg室温离心5分钟沉淀，并以4X IO6细胞/ml浓度重悬于生长
培养基中。将细胞悬液分成两个500μ 1等分，并转移到两个0.4cm狭缝电穿孔样品池 (BioRad)。一个样品池接受5 μ g对照质粒(pBS212，由SV40早期增强子/启动子驱动的 嘌呤霉素抗性基因)；另一个接受5yg PGRN190，包含MPSV启动子驱动的小鼠端粒酶逆转 录酶(mTERT)编码区加SV4早期增强子/启子驱动的嘌呤霉素抗性基因。手工混合细胞和 DNA,采用装有BioRad电容扩充器的BioRad基因脉冲仪，设定300V，960 μ F，进行电穿孔。将每等分细胞转移到含25ml生长培养基的各个150cm平板。第二天更换平板上 的培养基，次日生长培养基用加有0. 5 μ g/ml嘌呤霉素的生长培养基代替。每48小时用含 嘌呤霉素的新鲜培养基更换平板上的培养基直到电穿孔后的第29天。此时，在pBS212-和 PGRN190-电穿孔的平板上有明显的嘌呤霉素抗性细胞的大的单个集落。用克隆圆筒分离得 到对照平板的10个集落和PGRN190电穿孔平板的12个集落，将每个集落转移到48孔平板 的1个孔中(1个孔/集落)。—周后，将48孔板中扩展达到汇合的所有存活集落(3个对照集落，1个 PGRN190-电穿孔集落)单个地转移到24孔板的孔中。6天后，只有一个继续扩展的集落衍 生自pGRN190-电穿孔平板，后来命名为NH190。细胞在加0. 5 μ g/ml嘌呤霉素的生长培养 基中维持。采用TRAP试验分析端粒酶活性(Kim等.，NuleicAcids Res. 25 :2595，1997)表 明，NH190细胞表达了功能性端粒酶活性。为了有利于监测混合的培养群中的细胞和体内监测，NH190细胞进一步用表达绿
30荧光蛋白(GFP)的逆转录病毒构建物感染。质粒PEGFP-I的强化GTP序列是一种Living Colour 荧光蛋白载体，从Clon Tech公司获得。它含有强化的GFP编码区，具有改变限制 性酶切割位点的变化，和转变编码蛋白的激发光和发射光波长。将EGFP-I序列克隆入载体 PMSCV. neo，Clon Tech目录号#K1062_1。ΝΗ190细胞用工程载体转导，采用FACS分选分离 GFP阳性细胞。GFP表达细胞系称为NHG190。培养物中已携带这些细胞3个多月。实施例7 在NHG190饲养细胞上维持的hES细胞的遗传修饰。NHG190细胞在加有20%胎牛血清(Hy Clone)和5mM谷氨酰胺的DMEM(Gibco)中 培养。每3天细胞1 10分种。用胰蛋白酶脱下亚汇合培养物，悬浮于IOml培养基中，用 Torrex 150D-X光发生器，以3500拉德累积剂量照射。照射过细胞以400Xg离心5分钟使 其沉淀，以1. 25 X IO5细胞/ml重悬于NHG190培养基或标准hES培养基中。在包被明胶的平板上，以4. 08 X IO4CnT1接种NHG190细胞制备条件培养基。接种后 18-24小时用加有4ng/ml加bFGF的标准hES培养基更换培养基。细胞在条件培养基中生 长、18-24小时，收获，另加入4ng/mlbFGF。培养基用来支持hES细胞培养物，同一天收集。 照射过的NHG190细胞可用于制备条件培养基7-10天。转染hES细胞如下采用胶原酶( 200单位/毫升)37°C，7-10分钟从饲养层取 出细胞，并转移到50ml锥形管。加入hES生长培养基至最终体积IOml ；用IOml移液管捣 碎悬浮液10-12次，加入另外8mlhES培养基。在预包被Matrigel 和NHG190饲养细胞的 6孔平板的每孔中加入3ml细胞悬液。接种后48小时，根据制造商的OptiMEM 无血清培养基方案，用含 FuGENE 6 (Roche)的10 μ g DNA孔转染hES。该DNA是含有驱动neoro的PGK启动子的质 粒。4小时后转染的每孔加入3ml NHG190条件培养基。每天用3ml条件培养基再饲喂细 胞。转染后48小时，细胞用含200 μ g/ml遗传霉素(Sigma)的NHG190条件培养基铺层，此 后每天更换。选择后3天，再加照射过的NH4190饲养细胞(在hES培养基中1.25X 105细 胞/孔)。24小时后，再用含200 μ g/ml遗传霉素的NHG190条件培养基更换，每天更换。分离单个集落并通过另一轮选择扩展。再5天后，用显微镜鉴定各个集落并在平 皿外侧作记号。除去培养基，用胶原酶( 200单位/ml)代替。用P20移液管尖头挑取 单个集落，转移到含有2mlNHG190条件培养基(没有遗传霉素)的每个管中。捣碎悬浮液 5次使集落解聚集，将每管的内含物转移到包被明胶和照射过的NHG190细胞的12孔平板 的1个孔(1.875X 105细胞/孔)。24小时后，用2ml新鲜培养基喂饲细胞。接种后2天， 细胞用含200 μ g/ml遗传霉素的2ml条件培养基铺层，每天更换连续5天。当每个孔达到 50-75%铺满时，用胶原酶脱下细胞，转移到6ml条件培养基中，捣碎10-12次。在包被明胶 和照射过的NHG190细胞的6孔平板的2个孔中各加3ml细胞悬液(3. 75 X IO5细胞/孔)； 用3ml条件培养基饲喂细胞24小时，用含遗传霉素的3ml条件培养基选择细胞5天，并如 前一样一分为六。采用逆转录病毒进行稳定的转导如下采用购自Clone Teck(目录号#K1062_I) 的PMSCVneo载体Geron公司构建了逆转录病毒载体命名为GRN354。从MSCVLTR的下游插 入eGFP编码区。LTR驱动GFP的表达，该载体还含有小鼠PGK启动子驱动的neoro基因。 用0. 5%明胶和HG190饲养细胞包被平板(24孔平板，Iml NHG190培养基中为7. 5 X IO4个 细胞；6孔平板，3ml培养基中为3. 75 X IO5个细胞)。在hES培养基制备的24孔平板上接
31种hES系H7细胞(lml/孔)。48小时后，用0. 05%胰蛋白酶/5mMEDTA (Sigma) 37°C脱下3 个孔的hES细胞，重悬于500 μ 1NHG190培养基，并计数，临用前，在冰上融化逆转录病毒构 建物PGRN354的贮存液。从孔中吸出生长培养基，并用加有8ul逆转录病毒(10个感染复 数)和4 μ 18mg/ml多聚溴化季胺阳离子溶液(Sigma)的400 μ 1 hES培养基更换。2小时 后，每孔加入800 μ 1 hES生长培养基。每24小时每个转导孔中加Iml新鲜hES培养基饲 喂。转导后4天，用含200 μ g/ml遗传霉素的ImlhES生长培养基更换培养基。遗传霉 素选择3天后，用胶原酶脱下细胞，捣碎，重悬于3ml hES培养基中，再接种入包被明胶和 NHG190饲养细胞的6孔平板的1个孔中，24小时后用hES培养基再喂饲。然后再用含遗传 霉素的hES培养基更换培养基，每24小时再喂饲。经选择未分化集落已存活和维持3个多 目。FACS分析表明50-65%的选出细胞表达GFP，虽然水平低，细胞的核型正常。图3显示用逆转录病毒转导的hES细胞表达GFP，和然后的分化。将hES细胞系 H7细胞接种在药物抗性(NHG190)饲养层上，用GRN354感染，并选择对药物G418的抗性。 在G418选择下，转导的细胞扩展和维持，多次传代。转移细胞作悬浮培养以形成胚胎样小 体，使其分化4天，然后接种在20% FBS培养基上1周。出现广范分化后，培养物用4%低 聚甲醛固定，在荧光下摄影观察FGP表达。许多分化细胞表达GFP的水平高于未分化的转 染hES系，与不同细胞类型中MESV-LTR的差异性激活相符。实施例8 无饲养hES细胞的转染在此实施例中，用携带受CMV启动子驱动的绿荧光蛋白的质粒转染，来遗传修饰 维持在无饲养培养中的hES细胞，此培养在含层粘连蛋白的条件培养基中进行。如前面所述制备mEF条件培养基。照射mEF，并以约5. 7 X IO4细胞/cm2接种。至 少16小时后，用含4ng/ml hbGFG的hES培养基更换培养基。每天收集条件培养液饲喂hES 培养物。加入hES培养物之前，此培养基再补允4ng/mlhbFGF。在需要选择稳定的转染子 时，mEF条件培养基补充200ug/ml遗传霉素(Sigma，目录号#G5013)。用 200单位/ml胶原酶37°C培育10分钟，从培养物中收获维持在mEF饲养层上 的H9hES细胞。脱下细胞重悬于常规hES培养基或mEF条件培养基中。然后将常规培养基 中的细胞再接种在mEF饲养层上，并将mEF条件培养基中的细胞接种在matrigel 或层粘 连蛋白上。所有培养物的接种密度为大约4X IO4细胞/cm2。饲养层上的细胞维持在常规 培养基中。而以mEF条件培养基维持基质上的细胞1天或2天然后转染。每24小时更换 条件培养基。如上所述，用Lipofectamine 2000 转染hES细胞培养物。GFP表达的FACS分析 进行如下用含0. 5mMEDTA的PBS收获hES细胞，并以约IX IO6细胞/试验重悬。用含2% FBS,0. 叠氮钠和2mMEDTA的PBS溶液洗涤细胞。采用从发育研究杂交瘤库(衣阿华大 学，衣阿华市)得到的抗体(1 15稀释)，在相同缓冲液中进行SSEA-4染色。从Sigma(St. Louis Mo. USA)得到同种型匹配的对照。用最终体积IOOul的抗体4°C培育细胞30分钟，洗 涤，用偶联PE (Becton Dickinson, San Jose, CA)的大鼠抗小鼠K链抗体4°C培育30分钟。 如前洗涤样品，采用CellQuest 软件，在FACS calibur 流式细胞仪(Becton Dickinson, San Jose, CA)上分析 GFP 和 SSEA-4 表达。接种后24或48小时，用携带受CMV启动子驱动的GFP的质粒转染维持在层粘
32连蛋白上的mEF条件培养基中的H9系的hES细胞。最初的实验采用5ug质粒和12ul Lipofectamine 2000 的混合物。添加3mlmEF条件培养基前，接受ImlDNA/脂质复合物的 细胞37°C培育4小时，转染后监测GPF表达。图4显示该实验的结果。A图在层粘连蛋白上维持的H9细胞的形态。B图a图 显示的同一集落中观察到的GFP-阳性细胞。C图在SSEA-4高表达细胞群(未分化细胞) 中0A GFP-阳性细胞的FACS分析。接种后，24小时(条1和2)或48小时(条3和4)细 胞的转染，层粘连蛋白上未分化ES集落的紧密区域中观察到亮绿细胞(A和B图)。最初 接种后48小时转染产生最高效果转染后24小时经FACS分析检测到38%细胞为GFP阳 性。下一实验将在含mEF条件培养基的Matrigel 或层粘连蛋白包被的平板上维持 的H9细胞的转染效果，与维持在mEF饲养层上的细胞作比较。维持在常规培养基中的饲养 层上的细胞用作对照。接种后1或2天观察到饲养层上细胞和饲养层外细胞之间存在形态 差异。饲养层上的集落比饲养层外维持的细胞更紧密，无饲养培养中的单个hES细胞紧密 少，且变平。层粘连蛋白上的细胞和Matrigel上的细胞之间没有显著的细胞或集落形态学 差异。接种后2天后用CMV启动子驱动的表达GFP的质粒转染这些细胞。转染后24小时， 在荧光显微镜下检测细胞GFP表达。在mEF饲养细胞上以常规培养基(mEF/RM)，层粘连蛋白上以条件培养基 (Laminin/CM)或在Matrigel 上以条件培养基(Matrigel/CM)维持细胞生长。在无饲养 细胞培养的未分化hES集落中观察到亮绿细胞。相反，在饲养细胞层上的集落中很少发现 绿细胞。FACS分析表明在SSEA-4高表达细胞群中Matrgel 上16%细胞和层粘连蛋白上 14%细胞为GFP阳性。而饲养细胞上仅有5%细胞为阳性。这些结果表明采用无饲养细胞 条件明显提高了转染效果。下一个实验评估了 1)DNA 脂质之比的效果；2)在添加mEF条件培养基之前4小时 细胞中加入DNA/脂质复合物，与在mEF条件培养基存在下细胞中加入该复合物的效果；3) Lipofectamine 2000 与 FUGENE 的使用效果。以上描述了使用Lipofectamine 2000 进行转染。用F0GENE 进行转染如下用 水将质粒DNA(5-10 μ g pEGFP-Cl,Clon Tech目录号#6084-1)稀释到最终体积IOOul。在 预实验中，将5-30ul FuGENE 加到足够的OptiMEM 溶液中至最终体积100 μ 1，将该DNA 溶液缓缓加入FoGENE 液中并轻轻混合。补充800 μ 1 OptiMEM 前，混合液室温培育30分 钟。用3ml预温的OptiMEM 洗涤细胞，在Iml DNA/脂质混合液中37°C培育4小时。在一 些实验中，在4小时各孔中再加2ml mEF条件培养基，其它实验中在含2ml mEF条件培养基 的孔中加入DNA/脂质混合液，在此混合液中培育细胞过液。在下列条件下得到最高效果条1 = 5 μ g质粒加12 μ 1 Lipofectamine 2000 的 混合液，加Iml DNA/脂质混合液到含2.5ml mEF条件培养液的孔中在此混合液中培育细胞 过夜。条2和3 = 10 μ g质粒加15 μ 1 FuGENE 的混合液，在添加2. 5ml mEF条件培养基 前，在Iml DNA/脂质混合液中培育细胞4小时。L = Lipofectamine 2000 ；F = FuGENE 。为了研究无饲养细胞的hES细胞是否经历稳定的遗传修饰，用携带受EFla启动 子驱动的β -半乳糖苷酶的7. 5 μ g质粒和携带驱动新磷酸转移酶基因的PGK启动子的 2. 5yg质粒，共转染维持在Matrigel 上的Hl hES细胞。细胞转染后48小时接种在mEF
33条件培养基Matrigel 上。将10 μ g质粒加15 μ 1 FuGENE 与Iml细胞培育4小时，然后 加入7. 5ml mEF条件培养基。48小时后，用补充200 μ g/ml遗传霉素的mEF条件培养基更 换培养基。在含遗传霉素的培养基中维持培养物，每天更换培养基连续21天。所有模拟转 染的培养物(即接受与水混合的FuGENE 而不是质粒的培养物)在48-72小时内死亡。在 用FuGENE 和质粒转染的孔中产生药物抗性集落，频率约1/105最初转染的细胞。这些集 落维持在含遗传霉素的mEF条件培养基中，并扩展。实施例9 制备其中胸苷激酶基因在hTERT启动子序动控制下的载体含有hTER启动子的λ克隆命名为λ6Φ5存放在美国典型培养物保藏中心 (ATCC), 10801University Blvd. Manassas, VI 20110，USA 登记号 98505，λ6Φ5 含有 15. 3kbp插入片段包括来自hTERT编码序列上游的约13500碱基。将含有hTERT启动子序列的Notl片段亚克隆入PUC衍生质粒的Notl位点，此质 粒称为PGRN142。对含有9kb Ncol片段(具有hTERT基因序列和约4_5kb λ载体序列)的 亚克隆(质粒“PGRN140)作部分测序以确定插入物的取向，用Sail消化pGRN140取出入载 体序列，得到的质粒称为PGRN144。然后对pGRN144插入物测序。SEQ. ID N 1是所得到的序列数据表。核苷酸1-43和15376-15418是质粒序列。 因此，此基因组插入片段始于残基44，结束于残基15375。克隆的cDNA片段的起始外相应 于残基13490。Alu序列元件位于1700碱基对上游。现在可从GenBank(http//www. ncbi. nlm. nih. gor/)获得 pGRN142 的 hTERT 插入片段的序列，登记号 pGRN142，INS AF121948。 根据本领域中的标准实践，在以下说明书中质粒的hTERT残基的编号从翻译起始密码子开 始。hTERT ATG密码子(翻译起始位点)始于SEQ ID NO. 1的残基13545。因此，第一位 (第一个上游残基)相应于SEQ. IDN0. 1中的核苷酸13544。用包含各种hTERT上游和内含子序列的报道基因构建物进行了表达研究。消化 pGRN 144 (上述)的 Bglll-Eco47111 片段，并克隆入 pSEAP2Basic(Clone Tech, SanDiego, CA)的Bglll-Nrul位点。产生质粒称为pGRN148。将pGRN144的Bglll-Fspl片段插入 PSEAP2的Bglll-Nrul位点制备第二个报道基因-启动子质粒pGRN150。质粒pGRN173采 用pGRN144的EcoRV-Stul (-1445至-2982)片段构建。这产生了含有hTERT的启动子区域 的启动子报道质粒，从hTERT开放读框的起始处上游的2. 5kb到刚好在编码区内的第一个 内含子之后，hTERT开放读框的起始Met密码子变成Leu。用APAI (Klenow平端)-SRFl消 化，并重连接PGRN150以删除大部分hTERT上游制备质粒pGRN75的基因组序列。这产生了 一种启动子/报道子质粒，它利用hTERT上游序列(从-36位至-117位)的80个核苷酸。 通过PML1-SRF1连接pGRN150制备了质粒pGRN176以删除大部分hTERT上游序列。这产生 了一种动子/报道子质粒，它利用hTERT上游序列(从-36位到-239位)的204个核苷 酸。采用化学发光底物CSPDTM(Clon Trech)检测了分泌胎盘碱性磷酸酶(SEAP)的活 性的水平。发现在培养基中检测到的SEAP活性与SEAPmRNA的胞内浓度变化成正比。将 PGRN148和pGNA 150质粒(hTERT启动子-报道子基因)及pSEAP2质粒(阳性对照，含有 SV40早期启动子和增强子)转染入测试的细胞系中。pGRN148和pGRA150构建物驱动了 SEAP表达，与无限增值(肿瘤衍生的)细胞系中的PSEAP2 —样有效。在有限增殖细胞系中 只有pSEAP2对照产生可检测的活性。
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采用各种构建物测试了肿瘤细胞中hTERT启动子特异性驱动胸苷激酶(tk)基因 表达的能力。将一种含EcoRl-FselPCR片段与tk基因的的构建物(称为pGRN266)克隆 入pGRN263的EcoRl-Fsel位点。含约2. 5kbhTERT启动子序列的pGRN263与pGRN150相 似，但含新霉素基因作为选择标记。将含EcoRl-FselPCR片段与tk基因的的pGRN267克隆 入pGRN264的EcoRl-Fsel位点。含约210bphTERT启动子序列的pGRN264与pGRN176相 似，但含新霉素基因作为标记选择。将含EcoRl-Xbal PCR片段与tk基因的pGRN268克隆 人pGRN265的EcoRl-Ybal (未甲基化)位点。含约90bphTERT启动子序列的pGRN265与 PGRN175相似，但含新霉素基因作为选择标记。将这些hTERT启动子/tk构建物，pGRN266. pGRN267和pGRN268再引入哺乳动物 细胞中，并选择tk\+稳定的克隆(和/或大量细胞群)。更昔洛韦体外处理tk/+细胞导致 选择性破坏测试的所有肿瘤细胞系，包括143b、293、HT1080、Bxpc-3、DA0Y和NIH3T3。更昔 洛韦处理对正常BJ细胞无作用。图5是TPAC腺病毒载体pGRN376的图。它是将pQRN267的N0T1-BAMH1片段克隆 入pAdBN(Quantum Biotech)的N0T1-BGL2位点制备的。7185bp载体包含在中等长度hTERT 启动子序列的控制下的单纯疱疹胸苷激酶(TK)基因。实施例10 用胸苷激酶构建物转导hES细胞这些实验测试了前面实施例中所述的pGRN376载体对hES细胞的作用。该载体含 有在端粒酶逆转录酶控制下的疱疹病毒胸苷激酶基因。胸苷激酶基因在细胞中的表达应使 细胞对前药更苷洛韦的毒性敏感。将未分化Hl细胞接种在24孔板上(6孔板的1个铺满孔分种24孔平板的24个 孔)。48小时后，一些孔用TPAC载体(以30或100感染复数)感染。加入病毒载体4小 时后，用新的小鼠胚胎成纤维条件培养基(mEF-CM)更换培养基；有些孔加入补充30uM更昔 洛韦(GCV)的培养基。每天用含SOymGCV的mEF-CM再喂饲接触GCV的细胞连续4天。在 开始GCV处理后的第2、3和第4天，收获诸孔并用流式细胞仪分析以评估总细胞数和细胞 生存力的变化(用Pl排阻测定)。图6显示此实验的结果。在缺少GCV时，检测到以30感染复数总细胞数无变化， 但在缺炒GCV时48小时开始，以100感染复数总细胞数有些减少。检测了单用GCV的毒性 证掘；在第2天单用GCV的孔，象对照孔一样含有约55%细胞，到4天减少到40%。在GCV 存在时，以30或100感染复数培养接受GRN376的孔显示相同的结果第2天这些孔含有对 照孔的18%细胞，而第3天和第4天这些孔含有对照孔的6%和8%细胞。第4天，在缺少GCV时观察到以100感染复数有较轻微毒性(50%细胞在ES闸门 中对照细胞为83% )。第2天观察到单用GCV有一些毒性，75%细胞在ES闸门中(对照为 85% )0在GCV存在时，培养接受30或100感染复数GRN376的孔显示类似结果第2天这 些孔含有ES闸门中的24-28%细胞，第3天它们含有ES闸门中的19-22%细胞；第4天这 些孔含有ES孔中的12%细胞。因此，GRN376加GCV以低达30感染复数有效地杀死了未分 化hES细胞。滴定试验将未分化HI细胞接种24孔板(6孔板的1个铺满孔分种24孔板的24个孔)。48 小时后，一些孔用pGRN376(以30感染复数)感染。加入病毒载体4小时后，用新的mEF_CM
35更换培养基；一些孔加入补充5、10、20、30或4(^!11更昔洛韦(GCV)的培养基。每天用含 GCV的mEF-CM再喂饲接触GCV的细胞连续2天。在开始GCV处理后的第2天，收获诸孔并 用流式细胞仪分析以评估总细胞数和细胞生存力的变化(用PI排阻测定)。图7显示此实 验的结果。在测试的条件下 20 μ mGCV最佳。不同hES细胞系的比较未分化hES细胞系(称为Hl和H7)接种24孔板(6孔板的1个铺满孔分种24孔 板的24个孔)。48小时后，一些孔用pGRN376 (以30感染复数)感染。加入病毒载体4小 时后，用新的mEF-CM更换培养基；一些孔加入补充20 μ mGCV的培养基。每天用含GCV的 mEF-CM再喂饲接触GCV的细胞连续3天。在开始GCV处理后的第4天，收获诸孔并用流式 细胞仪分析以评估总细胞数的变化。图8显示结果。总细胞数表明TPAC载体处量后这两个细胞系的细胞数减少。H7 显示单用GCV引起的毒性比Hl小。因此，不同的hES细胞系均对TPAC载体起反应。在后 来的研究中，还发现TPAC载体处理后H9细胞系对GCV高度敏感。实施例11 分化细胞的选择在此实验中，hES细胞用视黄酸(RA)或二甲亚砜(DMSO)处理，用TPAC处理后分 析hTERT和0CT-4表达。将未分化H-I细胞接种24孔板(6孔平板的1个铺满孔分种24孔板的24个孔)。 24小时后，一些孔再加入含500nMRA或0. 5% DMSO的mEF-CM ；—些孔再加补充RA或DMSO 的培养基作为该实验的遗留物。用RA或DMSO处理7天后，细胞用GRN376 (以30感染复 数)感染。加入病毒载体后4小时，用mEF-CM(加适当的RA或DMS0)更换培养基；一些孔也 加入补充20 μ m更昔洛韦(GCV)的培养基。每天用含GCV的mEF-CM再喂饲接触GCV的细 胞连续3天。在开始GCV处理后的第3天，收获诸孔并用流式细胞仪分析以评估总细胞的 变化。其余的孔用于培养任何剩余的未分化干细胞；这些孔的培养基更换成mEF-CM(没有 RA. DMSO或GCV)。每天用mEF-CM再喂饲细胞连续7天，然后收获用于RNA的分离。用定量 RT-PCR分析这些样品的hTER和0CT-4表达。图9显示TPAC处理后细胞数减少。药物预处理接着TPAC加GCV7天后，所有孔含 有相似的细胞数。在经试培养存活的干细胞期间，这些孔为呈现高度分化的细胞所铺满；显 然没有未分化的hES细胞。含已用RA预处理的细胞的一些孔，与用未掺杂mEF-CM预处理 或用mEF-CM加DMS处理的细胞在外观上有所不同。RT-PCR分析(下图，非定量，35循环) 表明，用mEF-CM或DMSO处理的孔的存活细胞没有可检测的0CT-4表达；而4个RA预处理 样品中有2个产生很弱的0CT-4PCR产物。因此，TPAC处理随后在mEF-CM或mEF_CM加DMSO的孔中生长的培养物没有可检 测的未分化细胞存活。RA预处理导致在存活细胞中检测到低水平的0CT-4。不清楚这是否 反映了未分化干细胞的持久存在，或诱导了表达0CT-4的另一细胞类型。实施例12 含有TPAC构建物的稳定干细胞系为了有利于遗传改变的带有hTER启动子/胸苷激酶构建物产生稳定的细胞系， 修饰质粒pGRN376(实施例9)以删除大多数腺病毒序列。该质粒用Stul和Notl消化， 接着平端和再连接。剩余的载体含有hTERT启动子/胸苷激酶构建物，在其前加有转录阻
36断序列以避免基因组中整合位点上游的启动子序列促进tk基因表达，。修饰的载体称为 pGRN376mod。pGRN376-腺病毒 TPAC 载体
Ad5TRMPTERT 216bpHSV TKSV40PolyApGRN376mod-TPAC 质粒载体
TRMPTERT 216bpHSVTKSV40Poly A如前面所述，采用含有0. 5mMEDTA由PBS将H9hES细胞系的培养物1分4，接种 在6孔板中的无饲养细胞培养孔上。接种后24小时，如上所述采用FuGENE -6，用2μ g GRN376mod加0.5yg编码新霉素磷酸转移酶的质粒共转染细胞。转染后48h加入含 200 μ g/ml遗传霉素的培养基以挑选出转染的细胞。在含遗传霉素培养基中培养7-10天 后，从诸孔中挑出103个单集落，各自接种在24孔板上，培养7天进行扩展。筛选出90个 单集落对30 μ m浓度的前药更替洛韦敏感。鉴定了 10个克隆，其中在用更苷洛韦培养1-3 天内所有的未分化细胞基本死亡，仅留下在主要集落外边的分化的残余细胞。在另一实验中，在标准hES细胞培养基中，将hES细胞的Hl系(传代59) 1分6接 种到包被Matrigel 的24孔板中(0天；Iml/孔，含4ng/mlbFGF的MEF条件培养基)。次 日用新的标准培养基更换培养基。第3天，除去培养基并用200 μ 1/孔标准培养基(模拟 转染)或以标准hES培养类稀释的pGRN376病毒(以感染复数10)每孔200 μ 1代替。4小 时后，从所有孔中除去培养基，用11^/!111标准培养基(有或无3(^11更昔洛韦)代替。后 3天的每1天用新鲜培养基(有或无30 μ M更昔洛韦)更换各孔。图10是第6天细胞的显微镜摄影。在用对照载体转导的孔(Α图)中，hES集落 形成具有正常特征的集落。在用PGRN376病毒转导然后用更昔洛韦处理的孔(B图)中，大 多数或所有ES细胞集落消失了，仅留下分化的细胞。TPAC处理的孔含有的细胞比对照孔少 8倍。实施例13 稳定的TPAC胚胎干细胞系的进一步鉴定。将pGRN376mod和pGK-neo质粒共转染衍生的TPAC稳定克隆引入mEF条件培养基 中生长的hES细胞系H9，此条件培养基具有包被生长因子减少的Matrigel 平板上的碱性 FGF。在一个试验中，转染前采用0. 5mMEDTA传代H9系(P80) 6次。采用FugeneTM( —种 基于脂质的转染促进剂)=DNA (3 2)比率，2 μ g pGRN376m质粒和0. 5 μ g pGK-neo质粒 用来转染ES细胞6孔板的各孔。接种后24小时转染细胞，转染后24小时开始G418选择。 采用胶原酶挑取101个G418抗性集落。分离只受pGK-neo转染的细胞的集落作为共转染 的对照。采用0. 5mM EDTA扩展单个集落用于原代和次代GCV筛选。用30 μ mGCV进行原代筛 选(1周和2周)鉴定到10个GCV-敏感的克隆和20个部分GCV-敏感的克隆。用30 μ mGCV 进行次代筛选(2周和4周)确证了 9个GCV-敏感的克隆(包括命名为H9-376m-18， H9-376m-77和H9-376m_62的克隆)。次代GCV筛选后，采用0. 5mM EDTA将细胞扩展为较 大培养物，然后采用胶原酶传代。
37
在第二个试验中，采用0. 5mM EDTA再开始H9系(P24)的传代，然后如前一样转染。 在0天用胶原酶挑取62个G418抗性共转染的集落。用30 μ mGCV进行原代筛选(20、22和 26天)鉴定到1个GCV-敏感克隆和4个部分GCV-敏感克隆。原代GCV筛选后，用0. 5mM EDTA将细胞扩展为较大培养物，并逐步回到标准的胶原酶传代。用30 μ mGCV进行次代筛选 (57天)确证了 1个GCV-敏感的克隆(命名为H9-376m-6)。每次试验的GCV-敏感克隆在G418培养中作用一步选择，以确定它们的稳定性。 克隆 H9-376m-18 和 H9-376m_77 显示不稳定的 G418 抗性。克隆 H9-376m-62、H9-376m_6 和 H9-pGK-neo-l 显示 G418 抗性。图11(顶部)显示稳定的TPAC系对列昔洛韦(GCV)的敏感性。使各细胞系与渐减 量的GCV接触以确定产生以最小量毒性完全杀伤未分化ES细胞所需的最低GCV浓度。确 定杀伤未分化ES细胞的浓度低达0. 5 μ m与30 μ m类似，但具有显著较低的毒性。图11 (底部)显示TPAC对一种不同的前药(E)_5_(2_溴乙烯基_2’ -脱氧尿苷 (BVDU)的敏感性。虽然用所有测试的BVDU浓度观察到细胞计数明显减少，但未实际观察到 ES细胞杀伤。甚至在高浓度BVDU时产生的细胞数也没有隆低到空白对照的水平。为了验证在稳定的TPAC ES细胞系中HSV-TK的表达，采用HSV-TK或0CT-4特异 性引物对H9-376m-6，H9-376m_62和H9-pGK-neo_l培养物的未分化细胞进行RT-PCR。在 H9-376m-6，H9-376m_62样品中而不是在H9-pGK_neo样品中，检测到TK以高浓度RNA表达； 而在所有样品中均测到0CT-4表达。实施例14 未分化细胞的启动子特异性为了确定hTERT启动子对稳定的TPAC克隆的特异性，在每个TPAC克隆和pGK-neo 对照克隆分化后测定GCV敏感性。在含KODMEM加20% Hyclone FBS,无bFGF(分化条件)的包被生长因子减少的 Matrigel 平板上接种未分化细胞。培养物在分化条件中维持7天，传代并在分化条件下再 放置4天。此处理后，培养物中几乎不含有未分化细胞(经形态学观察)。此时在分化培养 物中加入30 μ mGCV培养4天。从TPAC 细胞系 H9-376m-6，H9-376m_62、H9-376m_18 或 H9-376m_77 ；或者从转染 对照细胞系H9-pGKneo中得到的分化培养物中，观察到对GCV无敏感性。因此，在该整合的 构建物中的hTERT启动子仅在未分化细胞中具有接通TK效应基固的合适特异性。实施例15 未分化TPACL细胞系中ES标志的表达用流式细胞仪测定了在稳定的TPACES细胞系上的ES标志表达。采用0. 5mMEDTA 从铺满的培养物中收获细胞，用针对人SSEA-4、SSEA-I、Tra-1-60、Tral-81、CD9、AC133的 单克隆抗体和合适的荧光染料偶联第二抗体培育。用FACSCalibur 测定表达的水平。用 合适的同种型匹配的阴性对照和存活力评估来测定非特异结合的水平。H9-376m-6,H9-376m-62和H9-pGK-neo_l细胞系表达所有测试的ES标志，与未转 染的H9细胞系相当。表2亲代hES细胞和稳定的TPAC细胞系上的标志
表型标志H9 P35H9-376m- 62H9 P25H9—pGK—ne οH9-376m- 6H9-376m- 62
38 表达标志的活细胞％。实施例16 =TPAC细胞系经历合适分化的能力测试了H9-376m-6，H9-376m-62、H9-376m-77、H9-376m-18 和 H9-pGK-neo_l 产生 3 种胚芽谱系细胞的能力。建立了各细胞系的胚胎样小体，用KO DMEM和20% Hyclone FBS 悬浮培养。培养4天后，将EB接种在包被明胶的小室载玻片上，使它们再生长8-10天。对 培养物中跳动(beating)细胞的存在进行评分和染色观察β _微管蛋白、AFP、肌肉特异性 肌动蛋白和心肌钙蛋白阳性细胞的存在。图12显示免疫细胞化学的代表性荧光显微摄影。结果如下H9-376m-18p80t20能产生大的胚胎样小体(1次试验)。观察到跳动区(与心肌 细胞_谱系细胞一致)。肌特异性肌动蛋白+++，甲胎蛋白+++ ； β _微管蛋白+++ ；心肌钙 蛋白1+。H9-376m-77p80+16仅产生小的胚胎样小本(1次试验)。未观察到跳动区。肌特 异性肌动蛋白+ ；甲胎蛋白+ ； β _微管蛋白_(未检测)；心肌钙蛋白ι-。H9-376m-62p80+16、p80+20、p80+21、p80+24(4 次试验)仅能产生小的胚胎样小 体。未观察到跳动区。肌特异性肌动蛋白++ ；甲胎蛋白+ ； β _微管蛋白+ ；心肌钙蛋白ι-。H9-376m-6p24+12、p24+13、p24+21(3次试验)能产生大的胚胎样小体。在所有试 验中观察到许多跳动区。肌特异性肌动蛋白++ ；甲胎蛋白++ ； β _微管蛋白+++ ；心肌钙蛋 白1+。H9-pGK-neo-lp24+9，p24+10，p24+13(3次试验)能产生大的胚胎样小体。在3次 试验中2次观察到跳动区。β-微管蛋白+++;心肌钙蛋白1+;肌特异性肌动蛋白+++;甲 胎蛋白++/实施例13-16的结果表明，含端粒酶启动子驱动的胸苷激酶基因的至少3种干细 胞系，能分化成三个胚层之一的细胞。这些细胞系的分化细胞含有对残余或再形成的未分 化细胞重要的暂时代替物。在4天内更昔洛韦以低达2. 5 μ m浓度实际上可杀伤所有如此 修饰的未分化的细胞。序列数据表3未公开中列出的序列
39 应认识到本领域熟练技术人员在不脱离以下权利要求中所体现的本发明的思路 下，可以有效地修改本说明与提供的组合物和步骤。序列表<110>杰龙公司(Geron Corporation)J.戈尔德(Gold, · Joseph)J.莱布罗斯激(Lebkowski，Jane)<120>适合人治疗的分化细胞<130)096/200<140>申请号待定<141>2001-11-26<150>US 09/783，203<151>2001-02-13<150>US 60/253, 443<151>2000-11-27<150>US 60/253，357<151>2000-11-27<160>7<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>15418<212>DNA<213> 智人(Homo sapiens)<400>1gcggccgcga gctctaatac gactcactat agggcgtcgagcattgccga agaaaagatt aatggatttg aacacacagcaaacacagga aaaaaaagat aaagaaacga aaagaaaaggaagttccatc ggccttacat atgtgtaagc agaggccctgaaatacttta agaaataatg tctaaaagtt tttcaaatatagatccaaga agctcaacaa aacaaagcac aagaaacaggacagtcaaat tgctgaaaac cagcaacaaa gagaatatctagattaatga caggccaaga aacaatgaaa acaatacaga
ctcgatcaatggaagatgag60aacagaaactacatgaagtg120gcatcagtgagcttcagcag180taggagcagaggcaggggga240gaggaaaaaccltclclclclCCclC300aagaaattaaaagttatatc360taagagtatcagaggaaaag420tttcttgtaggaaacacaag480
agaacatactttggggaaaagataatctcttcaataaatggtgctggaggaactggatat5220
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￡1￡1￡1￡ΙΟ ￡1￡1￡1￡1ataaagctaccatacagcaatcccattgctaggtatatactccaaaaaag5940
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43
gatgccagggactccccgcaggttgccccgcctgccccagcgctactggcaaatgcggcc14820
cctgtttctggagctgcttgggaaccacgcgcagtgcccctacggggtgctcctcaagac14880
gcactgcccgctgcgagctgcggtcaccccagcagccggtgtctgtgcccgggagaagcc14940
ccagggctctgtggcggcccccgaggaggaggacacagacCCCCgtCgCCtggtgcagct15000
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cgagggcccaggccccagagctgaatgcagtaggggctcagaaaagggggcaggcagagc15300
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gtggacacggtgatcgagtcgactccctttagtgagggttaattgagctcgcggccgc15418
<210>2
<211>2403
<212>DNA
<213>1型单纯疱疹病; <400>2gggtcctaggctccatggggaccgtatacgtggacaggctctggagcatcgcacgactgc60
gtgatattaccggagaccttctgcgggacgagccgggtcacgcggctgacggagcgtccg120
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agggtgagatatcggccggggacgcggcggtggtaatgacaagcgcccagataacaatgg900
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CCCCCgCggtcgccccccttaagggtctcttgcacaatccaaccgcctccgtgttgctgc2400
gtt2403<210>3<211>376<212>PRT<213>1型单纯疱疹病毒<400>3Met Ala Ser Tyr Pro Cys His15Ala Arg Ser Arg Gly His Ser20Arg Gln Gln Glu Ala Thr Glu35Leu Leu Arg Val Tyr lie Asp5055Thr Thr Gln Leu Leu Val Ala6570Val Pro Glu Pro Met Thr Tyr85
Gln His Ala 10 Arg
Asn Arg
25 Val Arg 40
Gly Pro His
Ser Ala Phe Asp Thr Ala Leu Leu Glu Gln
Leu Gly Trp Gln
Gly Met 60
Ser Arg Asp 75
Val Leu Gly 90
Lys
45
Gly
Arg
30
Met
Lys lie
Asp Ala Ser
Gln Ala 15
Pro Arg Pro Thr Thr
Thr
Val
Glu 95
Tyr
80
Thr
48
<213>人工PCR引物序列<400>4cttgctgcag aagtgggtgg aggaa25<210>5<211>21<212>DNA<213>人工PCR引物序列<400>5ctgcagtgtg ggtttcgggc a21<210>6<211>20<212>DNA<213>人工PCR引物序列<400>6cggaagagtg tctggagcaa20<210>7<211>19<212>DNA<213>人工PCR引物序列<400>7ggatgaagcg gagtctgga19
权利要求
一种细胞群，它包含由体外培养的已建立的灵长类多能干细胞系分化而成的细胞，其特征在于，其中的细胞含有包含P X结构的核酸分子，其中X是编码一种产物的核酸序列，这种产物对表达它的细胞是致死的，或者使表达它的细胞对外来试剂的致死作用敏感；以及P是使X在未分化细胞中优先表达的转录控制元件。
2.如权利要求1所述的细胞群，其中，X编码毒素，或者编码诱导或介导细胞调亡的蛋白。
3.如权利要求1所述的细胞群，其中，X编码可将前药转化为对表达X的细胞致死的化 合物的酶。
4.如权利要求3所述的细胞群，其中，X编码胸苷激酶。
5.如权利要求1-4任一所述的细胞群，其中，P-X是引入的异源分子。
6.如权利要求1-4任一所述的细胞群，其中，P是内源性转录控制元件。
7.如权利要求1-4任一所述的细胞群，其中，P是0CT-4启动子，或端粒酶逆转录酶的启动子。
8.如权利要求1所述的细胞群，其中，所述已建立的灵长类多能干细胞系是已建立的 人胚胎干细胞系。
9.一种从已建立的干细胞系制造分化细胞群的方法，它包括a)提供细胞群，该细胞群包含来自已建立干细胞系的未分化细胞，所述未分化细胞含 有包含P-X结构的核酸分子，其中X是编码一种产物的核酸序列，这种产物使表达它的细胞 对外来试剂的致死作用敏感，P是使X在未分化细胞中优先表达的转录控制元件；以及b)至少使来自已建立的干细胞系的细胞群中部分细胞分化。
10.如权要求9所述的方法，其特征在于，它还包括使细胞群与外来试剂混合。
11.一种遗传改变未分化干细胞的细胞群的方法，所述未分化的干细胞的细胞群获自 已建立的干细胞系，该方法包括用核酸分子转染所述获自已建立干细胞系的未分化干细 胞，所述核酸分子包含P-X结构，其中X是编码一种产物的核酸序列，这种产物对表达它的 细胞是致死的，或使表达它的细胞对外来试剂的致死作用敏感；P是使X在未分化细胞中优 先表达的转录控制元件。
12.如权利要求11所述的方法，其中，X编码毒素。
13.如权利要求11所述的方法，其中X编码一产物，该产物使表达它的细胞对外来试剂 的致死作用敏感。
14.如权利要求13所述的方法，其中X编码来自疱疹病毒的胸苷激酶。
15.一种消除未分化干细胞的细胞群的方法，所述未分化干细胞的细胞群获自已建立 的细胞系，该方法包括a)使获自已建立细胞系的未分化干细胞的至少部分分化；b)用核酸分子转染a)的细胞群，使受转染的细胞含有P-X结构，其中X是编码一种产 物的核酸序列，这种产物对表达它的细胞是致死的，P是使X在未分化细胞中优先表达的转 录控制元件；以及c)培养细胞使得X编码的产物被表达。
16.一种消除未分化干细胞的细胞群的方法，所述未分化干细胞的细胞群获自已建立的细胞系，该方法包括a)用核酸分子转染细胞群，该细胞群包含获自已建立细胞系的未分化干细胞，使受转 染的细胞含有P-X结构，其中X是编码一种产物的核酸序列，这种产物使表达它的细胞对外 来试剂的致死作用敏感，P是使X在未分化细胞中优先表达的转录控制元件；以及b)使获自a)所述的已建立细胞系的未分化干细胞群的至少部分细胞分化；c)培养细胞使得X编码的产物被表达；d)使c)的细胞与外来试剂接触。
17.如权利要求16所述的方法，其中，X编码将前药转化为对表达X的细胞致死的化合 物的酶。
18.如权利要求17所述的方法，其中，所述酶是胸苷激酶。
19.如权利要求16-18任一项所述的方法，其中，外来试剂是更昔洛韦。
20.如权利要求15-19任一所述的方法，其中P是内源性转录控制元件。
21.如权利要求15-19任一项所述的方法，其中P是外源性转录控制元件。
22.如权利要求15-19任一所述的方法，其中，X在细胞群中短暂表达。
23.如权要求15-19任一所述的方法，其中，P-X被此细胞群的子代细胞继承。
24.如权利要求15-19任一所述的方法，其中，P是0CT-4启动子，或端粒酶逆转录酶的 启动子。
25.如权利要求15-19任一所述的方法，其中，所述核酸结构还编码一分子的核酸，该 分子为细胞提供药物抗性。
26.如权利要求15-19任一所述的方法，其中，所述获自已建立细胞系的未分化干细胞 细胞群是获自已建立细胞系的人胚胎干细胞。
27.一种药物组合物，它包含前述任一项权利要求的细胞群。
28.前药在制备用于消除人体或动物体中未分化干细胞的药物中的应用，其中所述干 细胞获自已建立的干细胞系，所述未分化的干细胞包含p-X结构，其中X是编码一种产物的核酸分子，这种产物使表达它的细胞对外来试剂的致死作用敏感；以及P是使X在未分化细胞中优先表达的转录控制元件。
29.如权利要求28所述的应用，其中，前药是更昔洛韦。
全文摘要
本发明提供了适合人治疗的分化细胞和从干细胞群产生分化细胞的系统，用于任何需要相对均一细胞群的地方。这些细胞含有在转录控制元件(如TERT启动子)控制下的效应基因，使该基因在细胞群中相对未分化的细胞中表达。此效应基因的表达导致未分化细胞的消除，或一种可用来以后除去它们的标记的表达。合适的效应基因编码毒素或诱导细胞凋亡的蛋白质、编码细胞表面抗原或将前药转化为对细胞致死的一种酶(如胸苷激酶)。根据本公开产生的分化细胞群适合用于组织再生和非治疗性应用，如药物筛选。
文档编号A61P35/00GK101928692SQ200910224980
公开日2010年12月29日 申请日期2001年11月26日 优先权日2000年11月27日
发明者J·D·戈尔德, J·S·莱布罗斯激 申请人:杰龙公司