专利名称：一种乳腺癌抑癌蛋白的鉴定及其应用的利记博彩app
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及到一种乳腺癌抑癌蛋白PIASl (proteininhibitor of activated STAT 1)的鉴定，及其在乳腺癌基因治疗中的应用。
背景技术：
乳腺癌是发生于乳腺腺体及导管的恶性肿瘤，是女性发病率最高的癌症，是当今 世界人类疾病中最常见的发病和死亡原因之一，严重威胁着人类的生命和健康。因此乳腺 癌的防治已是世界性的保健问题，是世界卫生组织重点防治的疾病。根据美国癌症协会ACS 的数据，在美国，10万人中乳腺癌发病率约为113. 3人，在我国，乳腺癌的发病率正逐年上 升，在许多大城市已高居女性肿瘤的首位，给社会和家庭带来巨大的财产损失和精神痛苦。目前，乳腺癌的发病机理还不完全清楚，尚无有效预防措施。众所周知，大多数癌 症包括乳腺癌的发生、发展是一个长时间的，慢性的病理变化过程，目前所用乳腺癌的诊断 方法只能诊断出瘤体已长到一定体积的癌症，这在许多情况下，已为时过晚。当前乳腺癌的 治疗仍以药物治疗、放疗以及手术切除为主，但至今还没有一种行之有效的诊断和治疗方 法。手术虽然切除了肿瘤病灶，但也部分甚至全部切除了相应的组织器官，丧失了其正常的 功能；而放疗在放射线杀伤肿瘤细胞的同时，也对机体正常组织细胞产生了损伤作用，很大 程度限制了肿瘤治疗；药物治疗由于疗效不强和具有较强的毒副作用，而给患者遭成极大 的身体和心里创伤。和其他癌症一样，乳腺癌的有效预防和治疗也有待于弄清和阐明乳腺 癌的发病机理，因此基因疗法就显得尤为重要。AIB “amplified in breast cancer 1)是一种癌蛋白，它的 mRNA 的高水平往往 伴随着乳腺癌的发生、发展，并导致病人存活率的下降；人类AIBl转基因过表达的小鼠，则 伴随着乳腺的异常增生和乳腺癌的发生；AIBl和表皮生长因子受体酪氨酸激酶HER2的过 表达会伴随着对药物它莫西芬(Tamoxifen)治疗抗性的产生，导致治疗失效。此外，AIBl作 为转录辅激活因子，促进了转录因子如雌激素受体(ERa)等的转录激活，进一步促进乳腺 癌的发生、发展。癌蛋白AIBl能增强乳腺癌多条信号转导通路的能力表明，AIBl是乳腺癌 治疗的一个潜在靶标。针对乳腺癌细胞，通过一定的方式抑制AIBl的活性，是预防和治疗乳腺癌的一 种策略。而蛋白质的活性是受蛋白质的化学修饰所调控的，其中蛋白质的SUM0(Small ubiquitin-like modifier)化修饰是重要的调控方式之一。SUMO化修饰是SUMO小分子在 ATP存在的情况下，经一系列酶如SUMO活化酶(El) ,SUMO结合酶(E2)、SUM0连接酶(E3)的 催化作用，最终与靶蛋白底物结合。SUMO化修饰在信号转导、核质运输、转录活性抑制等方 面均发挥着重要的作用。我们研究证明AIBl的SUMO化修饰可以抑制AIBl的转录活性，并 鉴定出 PIASl (protein inhibitor of activated STAT 1)蛋白是 AIBl 发生 SUMO 化修饰 的E3连接酶。以前对PIAS蛋白家族的研究，大多表明其作为蛋白质之间相互作用的构架 蛋白，参与包括 STAT (Signal transducer and activator oftranscription)、Wnt、TGF β、 NF- κ B等在内的细胞信号转导通路，而PIASl作为AIBl发生SUMO化修饰的Ε3连接酶还没有报道。因此，通过蛋白质的SUMO化修饰来调控癌蛋白AIBl的活性，将对乳腺癌的抑制产 生良好的效果，可应用于乳腺癌的基因治疗当中。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种乳腺癌的抑癌蛋白PIASl的鉴定方法。 PIASl蛋白能和癌蛋白AIBl发生相互作用，PIASl蛋白是癌蛋白AIBl发生SUMO化修饰的 E3连接酶，并能有效地抑制乳腺癌细胞MCF-7的生长和增殖。本发明的技术方案是从研究癌蛋白AIBl的SUMO化修饰入手，采用生物技术，首 先证明出PIASl蛋白和癌蛋白AIBl发生相互作用；进而鉴定出PIASl蛋白是AIBl发生 SUMO化修饰的E3连接酶，并使癌蛋白AIBl的转录活性得到抑制；最后通过动物实验证明， 将表达PIASl蛋白的质粒pcMV5-Flag-PIASl转入MCF-7细胞，再将这种过表达PIASl的 MCF-7细胞注射入裸鼠(BALB/c，Charles River,Beijing,China)双侧乳房的脂肪中，能有 效地抑制乳腺癌细胞MCF-7的生长和增殖。本发明的效果和益处是将PIASl基因在乳腺癌细胞中过表达，从而起到预防和 治疗乳腺癌的作用，这种基因治疗的新方法将克服传统的药物治疗、放疗以及手术切除等 方法所给病人带来的精神上和肉体上的痛苦，使乳腺癌的防治更为安全有效。恶性肿瘤如 乳腺癌是世界卫生组织重点防治的疾病，它给社会和每个家庭带来巨大的财产损失和精神 痛苦，攻克乳腺癌这一难题必将会带来巨大的社会效益和经济效益。
图1是证明抑癌蛋白PIASl和癌蛋白AIBl在体内存在相互作用的免疫共沉淀 实验结果图。图1中A和B实验均采用人乳腺癌MCF-7细胞系。图1中A实验采用兔源 anti-AIBl抗体，图左是阴性对照，首先沉降内源性的AIBl蛋白，用鼠源anti-PIASl抗 体检测内源PIASl蛋白，箭头指示的是目的条带PIASl蛋白，其分子量约75kDa。图1中 B实验采用兔源anti-PIASl抗体，图左作为阴性对照，同样首先沉降PIASl蛋白，再用鼠 源anti-AIBl检测内源AIBl蛋白，箭头指示的是目的条带AIBl蛋白的位置，其分子量约 160kDao实验结果证明了抑癌蛋白PIASl与癌蛋白AIBl在MCF-7细胞内存在着相互作用。图2是证明抑癌蛋白PIASl的过表达能促进癌蛋白AIBl的SUMO化修饰的实验 结果图。实验采用的是乳腺癌MCF-7细胞系，图中自左向右依次转入pcMV5空载体(阴 性对照)、pcMV5-Flag-PIASl、丧失E3连接酶活性的pcMV5_Flag_PIASl (M)突变体，即 PIASl的351位的半胱氨酸(C)突变成丝氨酸(S)。经过兔源anti-AIB 1抗体沉降，鼠源 anti-SUMO-Ι抗体检测，我们在相应位置，箭头指示处，可以看到SUM0-1化修饰的AIBl条 带，并且发现过表达野生型PIASl蛋白能增强癌蛋白AIBl的SUMO化修饰，而过表达SUMO 连接酶E3功能丧失的PIASl (C351S)突变体则没有这种现象。图3是证明抑癌PIASl抑制癌蛋白AIBl转录活性的荧光素酶报告基因的 实验结果图。图3中纵轴表示荧光素酶活性的相对值，横轴表示转入5组不同质粒 的细胞样品。将Gal4-Luc质粒分别和pcDNA3. 1空载体、pcDNA3. l-Gal4_DBD_AIBl、 pcMV5-Flag-PIASl按照一定比例转入C0S-7细胞系。测定报告基因的活性，可以看出，过表 达pcDNA3. 1-Gal4-DBD-AIB1能增强报告基因的转录活性，但AIBl的转录活性受PIASl的抑制，并且这种抑制作用随着PIASl表达量的增加，呈现出一定的剂量依赖性。图4是动物实验证明过表达抑癌蛋白PIASl能抑制乳腺癌的结果图。图4中A 是转染pcMV5空载体的乳腺癌MCF-7细胞注射入雌性裸鼠的实验结果；而图4中B是转染 pcMV5-Flag-PIASl质粒的乳腺癌MCF-7细胞注射入雌性裸鼠的实验结果，椭圆线的部分， 图中B和图中A相比，过表达PIAS1蛋白的裸鼠肿块明显被抑制了。
具体实施例方式以下结合技术方案和附图详细叙述本发明的具体实施方式
。1.证明抑癌蛋白PIASl和癌蛋白AIBl在体内存在相互作用的免疫共沉淀实验IOcm培养板接种人类乳腺癌MCF-7细胞系，于37°C 5% CO2条件下，采用含10% 胎牛血清(Hyclone公司)的DMEM细胞培养液(Gibco公司)培养48小时后，冰冷PBS缓 冲液清洗细胞后，加裂解液(50mM Tris-HCl, pH 8. 0,150mM NaCl, 1% Nonidet P-40 和 0. 5% sodium deoxycholate，以及 1 100稀释的蛋白酶抑制剂(Roche Applied Science, Indianapolis, IN))裂解细胞，4°C 12000转，离心10分钟后取上清。图1中A实验是上清加兔源anti-AIBl抗体；B实验是上清加兔源anti_PIASl 抗体(santa cruz 公司)，于 4°C孵育过夜后，加 Protein A-Sepharose 4B 50ul 于 4°C孵 育 4 小时。40C 5000 转离心 10 分钟，用洗液(20mM Tris-HCl, pH 7. 5,800mM NaCl,0. 5% Nonidet P_40，and 0. 05% sodium deoxycholate)清洗 4 次后，去除上清。加 6XSDS 上样 缓冲液和DDT后煮沸5分钟，跑8% SDS-聚丙烯酰胺电泳，将蛋白采用电转仪(Pall Corp) 在100V条件下电转90分钟到醋酸纤维素膜(Millipore公司)上。10%的脱脂牛奶封闭 膜2小时后，依次用一抗图1中A实验加鼠源anti-PIASl抗体；B实验加鼠源anti-AIBl 抗体(santa cruz公司)，和二抗HRP标记的羊抗鼠抗体(Roch公司)孵育，再用化学发光 试剂(Amersham Biosciences)发光，并在胶片上曝光，相显色出条带。2.证明PIASl过表达促进AIBl的SUMO化修饰实验IOcm培养板接种人乳腺癌MCF-7细胞，培养40小时后，用 Lipofectamine2000 (Invitrogen)按照产品说明，分别将pcMV5空载体、 pcMV5-Flag-PIASl、丧失E3连接酶活性的pcMV5_Flag_PIASl (M)突变体质粒，各24 μ g转 染进细胞中。转染4小时后，换10%胎牛血清的DMEM培养24小时。冰冷PBS缓冲液清洗 细胞3次后，加裂解液裂解细胞，4°C 12000转离心10分钟，取上清。上清加兔源anti-AIB 1抗体于4°C孵育过夜后加Protein A-Sepharose 4B 50ul于4°C孵育2-4小时。4°C 5000 转离心 10 分钟，用洗液(20mM Tris-HCl, pH 7. 5,800mMNaCl,0. 5 % Nonidet P-40，and 0. 05% sodium deoxycholate)清洗4次后去除上清。加6XSDS上样缓冲液和DDT后煮沸 5分钟，用8% SDS-聚丙烯酰胺电泳，将蛋白电转到醋酸纤维素膜上。5%脱脂牛奶封闭膜 2小时后，依次用一抗鼠源anti-SUMO-Ι抗体(santa cruz公司)，和二抗HRP标记的羊 抗鼠抗体(Roch公司)孵育，再用化学发光试剂发光，并在胶片上曝光显出条带。3.证明PIASl抑制AIBl转录活性的荧光素酶报告基因实验24孔培养板接种C0S-7细胞系，于37°C 5% CO2条件下采用含10%胎牛血清 (Hyclone公司)的DMEM细胞培养液(Gibco公司)在37 °C 5 % CO2条件下培养14小 时后，采用Lipofectamine 2000 (Invitrogen公司)按照产品说明进行哺乳动物瞬时转染实验，将 pcDNA3. 1 空载体、pcDNA3. l-Gal4_DBD_AIBl、pcMV5_Flag_PIASl 分别和 pcDNA3. 1-Gal4-Luc按照一定比例转入C0S-7细胞系中。转染4小时后，细胞的培养液由 无酚红无血清的培养液转换为含10%胎牛血清的DMEM培养液，培养24小时后，用冰冷PBS 清洗，收集裂解细胞，再用荧光素酶报告基因试剂盒(Promega公司)来检测转录活性。4.证明过表达PIASl能抑制乳腺癌的实验IOcm培养板接种人乳腺癌MCF-7细胞，培养40小时后，用 Lipofectamine2000 (Invitrogen)按照产品说明，将 pcMV5 空载体和 pcMV5_Flag_PIASl 分 别转染进不同的MCF-7细胞中，4小时后，换10%胎牛血清的DMEM培养24小时。收获生 长状态良好的细胞，按约110个细胞/0. Iml注射入4周大小的雌性裸鼠(BALB/c，Charles River, Beijing, China)双侧乳房的脂肪中。第21周处死裸鼠，并用游标卡尺测量肿瘤的
大小。
序列表
<110>大连理工大学环境与生命学院
<120> 一种乳腺癌抑癌蛋白的鉴定及其应用
<130> 一种乳腺癌抑癌蛋白的鉴定及其应用
<160>2
<170>Patent in version 3. 3
<210>1
<211>516
<212>DNA
<223>pcMV5-Flag-PIASl 质粒中 PIASl 的基因序列
PIASl 的基因编号NCBI Reference Sequence :NM_019663. 3
SEQ ID NO 1
atggcggacagtgcggaactaaagcaaatggttatgagccttagagtttctgaactccaagtactgttg
ggctacgctgggaggaacaagcacggacgcaaacacgaacttcttacaaaagccctgcatttgttaaaggctggctgtagtcctgctgtacaaatgaaaattaaag aactctacaggaggcggttccctcagaaaattatgacgcctgcggacttgtctatccccaacgtacattcaagtcctatgcctccgactctttctccatccaccattccac agetcacttatgatggccaccctgcatcatccccactactccctgtttctcttctgggacccaaacatgaactggaactcccacatctcacgtcagcgctgcacccagtccac ccggacataaagctgcagaagctaccattctatgacctgttggatgaactgatcaagcccaccagtctagcttcagacaacagccagcgctttcgggaaacctgttttgc atttgccttgacaccacaacaggtgcagcagatcagcagctccatggatatttctgggaccaaatgtgacttcacagtgcaggtccaattaaggttttgtttatcaga aaccagttgtccacaagaagatcacttcccacccaacctttgtgtaaaagtgaatacaaaaccttgcagccttccaggttaccttccacctactaaaaacggtgtggaaccaa agcgacctagccgaccaattaatatcacctcacttgtccgattgtccacgacagtaccaaataccattgttgtttcttggactgcagaaattggaagaacctattccatg gcagtatatcttgtaaaacagttgtcctcaacagttcttcttcag
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权利要求
一种乳腺癌抑癌蛋白的鉴定，其特征在于在乳腺癌MCF 7细胞系中，PIAS1蛋白和AIB1发生相互作用，PIAS1蛋白是癌蛋白AIB1发生SUMO化修饰的E3连接酶，并且能使癌蛋白AIB1的转录活性得到抑制。
2.一种乳腺癌抑癌蛋白的应用，其特征还在于将表达PIASl蛋白的质粒 pcMV5-Flag-PIASl转入MCF-7细胞中，能有效地抑制乳腺癌细胞MCF-7的生长和增殖，用于 乳腺癌的基因治疗。
全文摘要
一种乳腺癌抑癌蛋白的鉴定及其应用，属于生物技术领域。提供一种乳腺癌抑癌蛋白的鉴定，其特征在于筛选出PIAS1(protein inhibitor of activated STAT 1)蛋白和AIB1(amplified in breast cancer 1)发生相互作用，PIAS1蛋白是癌蛋白AIB1发生SUMO化修饰的E3连接酶，并且能使癌蛋白AIB1的转录活性得到抑制；其特征还在于将表达PIAS1蛋白的质粒pcMV5-Flag-PIAS1转入MCF-7细胞中，动物实验证明能有效地抑制乳腺癌细胞MCF-7的生长和增殖。本发明的效果和益处是这种基因治疗的新方法用于乳腺癌患者，将克服传统的药物治疗、放疗以及手术切除等方法所给病人带来的精神上和肉体上的痛苦，并将带来巨大的社会效益和经济效益。
文档编号A61P15/14GK101923095SQ200910220338
公开日2010年12月22日 申请日期2009年11月27日 优先权日2009年11月27日
发明者伍会健, 刘文栋, 洪永德, 过倩萍 申请人:大连理工大学