专利名称：内源性干扰素诱导物的注射液和纳米微囊化溶液的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种通过诱导内源性干扰素水平的提高，防治养殖动物病毒性感染的药物组合；具体涉及该组合用药物的制备及方便各种应用的制剂制备方法。
背景技术：
病毒性感染是引起养殖动物死亡、影响动物养殖经济效益的重要因素，随着国家 兽药质量标准的规范，取消了大批原地方标准的抗病毒药物，可选用的抗病毒药物的短缺 与兽医临床的需求矛盾日益突出。1967年，美国Merck药厂的Field等人发现了酶促合成的双链核酸(double strained RNA, dsRNA)具有诱生干扰素的能力，其中聚肌胞(Polyinosinic-polycytidylic Acid,PIC)的诱生能力最强，它可以刺激机体产生广谱的内源干扰素，进而激活蛋白激酶和 2’，5’ -寡聚腺苷酸合成酶、Mx蛋白等抗病毒因子，以降解进入细胞的病毒，达到抑制、治疗 病毒性感染的目的。PIC由寡聚肌苷酸与寡聚胞苷酸在合适的条件下按碱基配对的原则聚合而成。研 究表明，PIC分子量的大小、双链的紧密程度及其稳定性是决定其诱导干扰素活性高低的重 要影响因素。目前，国内虽然有寡聚肌苷酸及寡聚胞苷酸原料的生产，但尚缺乏对PIC双链 配对的合适条件、稳定性影响因素等的系统研究。关于内源性干扰素诱导剂方面的研究和应用，也有过一些报道。如专利申请号 为95111433. 6的发明专利“人白细胞干扰素口含片及其制备方法”，直接应用人白细胞 干扰素加辅料制成片剂，但该说明书表明该制剂具有激素特性，给人的应用带来潜在的 风险；再如，申请号为200310110892. 2的发明专利“复方干扰素诱生剂口含片”，以及申 请号为90101032. 4的发明专利“人体内诱导干扰素的制造方法”，利用新城疫减毒活疫 苗作为干扰素诱生剂，外源病毒的引入也会带来病毒重组、突变的潜在风险；申请号为 200810154198. 3的发明专利“一种用于宠物的聚肌胞滴丸及其制备方法”，以及申请号为 ZL93105862. 7的发明专利“聚肌胞复合物免疫佐剂及含有该佐剂的疫苗”，利用聚肌胞作为 抗病毒制剂或者免疫佐剂，但在制剂类型上，不方便集约化养殖饮水给药，更不方便于水产 养殖中通过药浴的方式给药。
发明内容
本发明的目的是提供一种内源性干扰素诱导物的注射液和纳米微囊化溶液的制 备方法，它应用内源性干扰素诱导技术，避免了干扰素制剂本身种属特异性强的缺陷，并且 可以通过多种方式给药，更方便于生产实践中应用，具有起效剂量极低，降解产物可直接进 入动物机体代谢池继续代谢等特点，对于有效控制养殖动物病毒性感染，降低药残危害具
有重要意义。为了解决背景技术所存在的问题，本发明是采用以下技术方案400ml-500ml注射用水中依次加入焦亚硫酸钠0. 7g-0. 9g、氯化钠1. 4-gl. 6g以及适量的磷酸二氢 钠与磷酸氢二钠，加热至20-60°C，进一步优选为30-50°C之间的某一特定温度，加入 2800mg—3000mg聚胞苷酸搅拌使溶解，保温10分钟，然后加入2800mg-3000mg聚肌苷酸搅 拌使溶解，保温配对15-30分钟，即得到聚肌胞苷酸母液。为进一步增强双链配对的紧密性，提高聚肌胞苷酸作为内源性干扰素诱导剂的使 用效果，并使之方便应用于小群体养殖的动物，按特定方法将聚肌胞苷酸制备成为稳定的 注射液制剂。基本过程为取聚肌胞苷酸母液200ml-300ml，加入CaCl2 0.46g，充分搅拌使 溶解，用注射用水定容至900ml-1000ml，0. 45um微孔滤膜过滤，安瓿瓶灌封，100°C流通蒸 汽灭菌30分钟，流水中迅速冷却，灯检，贴标，即得到聚肌胞苷酸注射液。该注射液可用于 宠物、小群体养殖的动物病毒性感染的防治。鉴于集约化养殖的动物群体，如肉鸡、肉鸭等，最方便的给药途径是通过饮水给 药；而对于水产养殖动物而言，便利的给杨方式为药浴或拌饵饲喂。但是，作为小分子RNA， 环境及消化道中存在很高的RNA酶的活性，非常容易降解。为解决这一问题，本发明利 用壳聚糖将聚肌胞苷酸包被成纳米微囊，按特定方法将聚肌胞苷酸制备成为可口服或药 浴使用的溶液制剂。其基本过程为取壳聚糖lg_2g，加入注射用水100ml-200ml及乙酸 lml-2ml，充分搅拌使溶解，放置12小时，使壳聚糖分子充分伸展；上述溶液中加入聚肌胞 母液300ml-400ml，充分搅拌6小时，使外表带有负电荷的聚肌胞苷酸(磷酸基)包裹于 带正电荷的壳聚糖的纳米微囊中。必要时，溶液中加入1.5g-1.6g NaCl以增加离子强度， 促进壳聚糖纳米微囊的形成。以激光笔照射溶液检验出现“丁达尔”现象，并且溶液形成 的“光路”没有明显闪亮的结晶体，则表明形成了稳定的壳聚糖纳米微囊。以纯化水定容至 900ml-1000ml,0. 22 μ m微孔滤膜法过滤除菌，分装，即得。该制剂可方便地应用于集约化养 殖的鸡、鸭等通过饮水线给药，也可方便地应用于水产养殖动物如鱼、虾、螃、海参等通过药 浴或拌饵给药。本发明具有以下有益效果应用内源性干扰素诱导技术，避免了干扰素制剂本身 种属特异性强的缺陷，并且可以通过多种方式给药，更方便于生产实践中应用，具有起效剂 量极低，降解产物可直接进入动物机体代谢池继续代谢等特点，对于有效控制养殖动物病 毒性感染，降低药残危害具有重要意义。
图1为本发明聚肌胞苷酸注射液对猪瘟病毒感染的保护试验示意图；图2为本发明聚肌胞苷酸溶液对雏鸡新城疫感染的保护试验示意图；图3为本发明聚肌胞苷酸溶液对传染性胰脏坏死症病毒感染的保护试验示意图。
具体实施例方式本具体实施方式
采用以下技术方案500ml注射用水中依次加入焦亚硫酸钠 0.9g、氯化钠1.6g以及适量的磷酸二氢钠与磷酸氢二钠，加热至20-60°C，进一步优选为 30-50°C之间的某一特定温度，加入3000mg聚胞苷酸搅拌使溶解，保温10分钟，然后加入 3000mg聚肌苷酸搅拌使溶解，保温配对15-30分钟，即得到聚肌胞苷酸母液。从该聚肌胞苷 酸母液出发，可进一步制备成注射液以及纳米微囊化的口服或药浴用溶液。
为进一步增强双链配对的紧密性，提高聚肌胞苷酸作为内源性干扰素诱导剂的使用效果，并使之方便应用于小群体养殖的动物，按特定方法将聚肌胞苷酸制备成为稳定的 注射液制剂。基本过程为取聚肌胞苷酸母液300ml，加入CaCl2 0. 46g，充分搅拌使溶解，用 注射用水定容至1000ml，0. 45um微孔滤膜过滤，安瓿瓶灌封，100°C流通蒸汽灭菌30分钟， 流水中迅速冷却，灯检，贴标，即得到聚肌胞苷酸注射液。该注射液可用于宠物、小群体养殖 的动物病毒性感染的防治。鉴于集约化养殖的动物群体，如肉鸡、肉鸭等，最方便的给药途径是通过饮水给 药；而对于水产养殖动物而言，便利的给杨方式为药浴或拌饵饲喂。但是，作为小分子RNA， 环境及消化道中存在很高的RNA酶的活性，非常容易降解。为解决这一问题，本发明利用 壳聚糖将聚肌胞苷酸包被成纳米微囊，按特定方法将聚肌胞苷酸制备成为可口服或药浴使 用的溶液制剂。其基本过程为取壳聚糖2g，加入注射用水200ml及乙酸2ml，充分搅拌使 溶解，放置12小时，使壳聚糖分子充分伸展；上述溶液中加入聚肌胞母液400ml，充分搅拌 6小时，使外表带有负电荷的聚肌胞苷酸(磷酸基)包裹于带正电荷的壳聚糖的纳米微囊 中。必要时，溶液中加入1.6g NaCl以增加离子强度，促进壳聚糖纳米微囊的形成。以激光 笔照射溶液检验出现“丁达尔”现象，并且溶液形成的“光路”没有明显闪亮的结晶体，则表 明形成了稳定的壳聚糖纳米微囊。以纯化水定容至1000ml，0. 22 μ m微孔滤膜法过滤除菌， 分装，即得。该制剂可方便地应用于集约化养殖的鸡、鸭等通过饮水线给药，也可方便地应 用于水产养殖动物如鱼、虾、螃、海参等通过药浴或拌饵给药。本具体实施方式
应用内源性干扰素诱导技术，避免了干扰素制剂本身种属特异性 强的缺陷，并且可以通过多种方式给药，更方便于生产实践中应用，具有起效剂量极低，降 解产物可直接进入动物机体代谢池继续代谢等特点，对于有效控制养殖动物病毒性感染， 降低药残危害具有重要意义。实施例1 选取出生日龄、体重接近的30头断奶仔猪，作为实验动物，检验聚肌胞 苷酸注射液对猪瘟病毒感染的防治效果。将实验动物随机分为3个试验组，每组10头。分 组及试验方法如下1组空白对照组(生理盐水组)；II组黄芪多糖药物对照组(黄芪多 糖注射液，按每千克体重20mg) ；III组聚肌胞苷酸药物对照组(聚肌胞苷酸注射液，按每 千克体重0.05mg)。将断奶仔猪按以上实验分组隔离饲养，饲养条件保持一致。饲养1周 后，各组分别进行猪瘟弱毒疫苗基础免疫。免疫21天，将各组按照分组计划进行药物处理， 12小时后进行攻毒(攻毒剂量为10倍LD5tl猪瘟强病毒)，攻毒后24小时给药组再次注射与 首次注射剂量相同的药物。试验过程中，每日观察2次，试验观察持续到猪瘟潜伏期结束。实验结果参看图1，表明聚肌胞苷酸注射液对猪病毒病的感染发病有明显的保护 率和较高的治愈率，能够抑制病毒在家畜体内的增殖，有效降低家畜病毒性感染的死亡率。实施例2 选取120只AA肉仔鸡为实验动物，检验聚肌胞苷酸溶液对新城疫病毒 感染的保护效果。实验用雏鸡出壳育雏至7日龄，进行新城疫弱毒疫苗点眼滴鼻基础免疫。 然后将试验用雏鸡随机分为3个试验组，每组40只。I组空白对照组(生理盐水组)；II 组黄芪多糖药物对照组(黄芪多糖口服液，按每千克体重40mg) ；III组聚肌胞苷酸溶液 试验组(聚肌胞苷酸溶液，按每千克体重0.05mg)；将以上雏鸡隔离笼养，饲养条件保持一 致。免疫后10d，将各组按照分组计划进行药物处理，12h后将进行攻毒(攻毒10倍LD5tl的 新城疫强毒)，攻毒后24h将各组再按照分组方案口服与首次用药剂量相同的药物观察，观察时间持续到新城疫潜伏期结束。实验结果参看图2，表明聚肌胞苷酸溶液对家禽新城疫病毒感染发病有明显的保 护率和高的治愈率。实施例3 将120条试验用虹鳟稚鱼随机均分为3个试验组进行试验，每组40条。 I组空白对照组(生理盐水组)；II组黄芪多糖药物对照组(黄芪多糖口服液，按每公斤 体重30mg) ；III组聚肌胞药物对照组(聚肌胞苷酸溶液，按每千克体重0. 05mg)。各组所 用药物以药浴的方式使用。将虹鳟稚鱼按以上实验分组隔离饲养于水族缸，饲养条件保持 一致。饲养一周后，各组按方案分组给药，药浴时，水族缸放出大部分水，加入药物，保持通 氧，药浴30分钟，然后加水至常量。12小时后各组水族缸中加入100倍LD5tl的传染性胰脏 坏死症病毒培养液，攻毒后24小时后，按各组方案再次药浴，观察结果。该实验结果参看图3，表明聚肌胞苷酸溶液可有效抑制水产鱼类病毒病增殖，从而达到对水产鱼类病毒病感染的治疗与预防作用。
权利要求
内源性干扰素诱导物的注射液和纳米微囊化溶液的制备方法，其特征在于它的制备过程为400ml-500ml注射用水中依次加入焦亚硫酸钠0.7g-0.9g、氯化钠1.4-g1.6g以及适量的磷酸二氢钠与磷酸氢二钠，加热至20-60℃，进一步优选为30-50℃之间的某一特定温度，加入2800mg-3000mg聚胞苷酸搅拌使溶解，保温10分钟，然后加入2800mg-3000mg聚肌苷酸搅拌使溶解，保温配对15-30分钟，即得到聚肌胞苷酸母液。
2.根据权利要求1所述的内源性干扰素诱导物的注射液和纳米微囊化溶液的制备方 法，其特征在于为进一步增强双链配对的紧密性，提高聚肌胞苷酸作为内源性干扰素诱导 剂的使用效果，并使之方便应用于小群体养殖的动物，按特定方法将聚肌胞苷酸制备成为 稳定的注射液制剂；基本过程为取聚肌胞苷酸母液200ml-300ml，加入CaCl2 0. 46g，充分 搅拌使溶解，用注射用水定容至900ml-1000ml，0. 45um微孔滤膜过滤，安瓿瓶灌封，100°C 流通蒸汽灭菌30分钟，流水中迅速冷却，灯检，贴标，即得到聚肌胞苷酸注射液；该注射液 可用于宠物、小群体养殖的动物病毒性感染的防治。
3.根据权利要求1所述的内源性干扰素诱导物的注射液和纳米微囊化溶液的制备方 法，其特征在于为方便权利要求书1所述干扰素诱导剂在群体养殖动物及水产养殖动物中 的应用，按特定方法将聚肌胞苷酸制备成为可口服或药浴使用的溶液制剂；其基本过程为 取壳聚糖lg_2g，加入注射用水100ml-200ml及乙酸lml_2ml，充分搅拌使溶解，放置12小 时，使壳聚糖分子充分伸展；上述溶液中加入聚肌胞母液300ml-400ml，充分搅拌6小时，使 外表带有负电荷的聚肌胞苷酸(磷酸基)包裹于带正电荷的壳聚糖的纳米微囊中；必要时， 溶液中加入1. 5g-l. 6g NaCl以增加离子强度，促进壳聚糖纳米微囊的形成；以激光笔照射 溶液检验出现“丁达尔”现象，并且溶液形成的“光路”没有明显闪亮的结晶体，则表明形成 了稳定的壳聚糖纳米微囊；以纯化水定容至900ml-1000ml，0. 22 μ m微孔滤膜法过滤除菌， 分装，即得。该制剂可方便地应用于群体饮水给药以及水产养殖动物通过拌饵、药浴等途径 给药。
全文摘要
内源性干扰素诱导物的注射液和纳米微囊化溶液的制备方法，它涉及一种通过诱导内源性干扰素水平的提高。应用内源性干扰素诱导技术，避免了干扰素制剂本身种属特异性强的缺陷，并且可以通过多种方式给药，更方便于生产实践中应用，具有起效剂量极低，降解产物可直接进入动物机体代谢池继续代谢等特点，对于有效控制养殖动物病毒性感染，降低药残危害具有重要意义。
文档编号A61P9/10GK101810638SQ20091021574
公开日2010年8月25日 申请日期2009年12月31日 优先权日2009年12月31日
发明者刘宗柱 申请人:青岛农业大学