专利名称：一种人胎盘提取液的病毒灭活方法
技术领域：
本发明涉及一种胎盘的消毒方法和由该方法制备的胎盘提取液，特别涉及一种应
用化学物质进行的消毒方法。
背景技术：
人类在战胜疾病和防止过早衰老的探索中，很早就发现了一种能够防止疾病和延缓衰老的特殊药物-一紫河车即胎盘。胎盘是母体与胎儿间进行物质交流的器官，是胚胎与母体组织的结合体。胎儿在母体内生长发育所需的营养物质全部来自胎盘，同时，母体的一些病毒如风疹、肝炎、爱滋病毒等也会通过胎盘传播给胎儿。所以，胎盘是一个营养和病毒可能同时存在的组织。 病毒(virus)是一类个体微小，无完整细胞结构，含单一核酸(DNA或RNA)型，必须在活细胞内寄生并复制的非细胞型微生物，由蛋白质和核酸组成。 病毒体积非常微小，结构极其简单，具有高度的寄生性，完全依赖宿主细胞的能量和代谢系统，获取生命活动所需的物质和能量，离开宿主细胞，它只是一个大的化学分子，停止活动，可制成蛋白质结晶，为一个非生命体，遇到宿主细胞它会通过吸附、进入、复制、装配、释放子代病毒而显示典型的生命体特征，所以病毒是介于生物与非生物的一种原始的生命体。 病毒虽然不具有完整的细胞结构，但是病毒同所有生物一样，具有遗传、复制、变异、进化等生命特征。病毒根据其遗传物质组成及其复制方式分为DNA病毒、RNA病毒、反转录病毒。其中DNA病毒很少，基本上都是RNA病毒。DNA病毒只要细胞表面有合适的受体，就能够通过胞吞或膜融合的方式进入细胞；RNA病毒的遗传信息保存在RNA上，因此复制过程通常发生在细胞质中。RNA病毒是用其自身的RNA复制酶来对基因组进行复制；反转录病毒基因组的复制是采用反转录的方式来完成的，即利用RNA模板来合成DNA。遗传物质为RNA的反转录病毒以DNA为中间物来复制其基因组，而遗传物质为DNA的反转录病毒则以RNA为中间物来复制。反转录病毒常常可以将通过反转录合成的DNA整合到宿主细胞的基因组中。 虽然胎盘具有抑制皮炎及抗过敏；溶解老化的角质、美化肌肤；修复受损的器官及皮肤组织；增强生理功能、提高免疫力，制造抗体；调节和平衡内分泌，延长青春期；增加微循环，提高新陈代谢水平等，被称为"神秘万能药"，对人类防治疾病，提高健康水平，消除亚健康状态，延长生命和提高生命(生活)质量等功能，但是由于胎盘中可能含有病毒，胎盘可能会对使用者的健康造成危害。因为胎盘在随胎儿离开母体的过程中，很可能会受到多种具有传染性的病毒的污染，艾滋病、梅毒、乙型肝炎等病毒都可以通过胎盘传播，而且有一些病毒在沸水中不能被杀死。因此对胎盘中可能存在的病毒进行灭活具有重要的意义。 国内外已研究开发出一些血液病毒灭活技术，如巴斯德液态加热法、有机溶剂，清洁剂法、光敏剂(如亚甲蓝)，光照法和紫外线/补骨脂法。但现有血液制品中病毒灭活技术，大多只能灭活脂包膜病毒等，而对非脂包膜病毒无效。世界上已发现了能在124t:的高
温度条件下生长的细菌，大量的实验结果表明DNA在10(TC的条件下不会断裂。世界上现有
的病毒灭活技术的原理，不是特异性地针对病毒核酸，因此对病毒核酸的作用较小。 因此，只有加强胎盘筛查与加强灭活病毒相结合，才能达到胎盘使用安全的目的。
鉴于目前灭活病毒的方法的局限性、胎盘中可能存在未知病毒、目前病毒灭活效果的评价
的不准确性等原因，寻求和开发一种理想的崭新的病毒灭活方法，就具有非常重要的意义。
发明内容
本发明的目的是针对上述现有问题提供一种人胎盘提取液中病毒灭活的方法和由该方法制备的病毒灭活的人胎盘提取液。本发明的人胎盘提取液病毒灭活方法中核酸酶与水不溶性大分子固体材料载体结合形成固定化酶，稳定性高，本发明的人胎盘提取液病毒灭活方法，高效、高选择性、催化反应条件温和、无污染、低成本、容易操作、酶可以反复利用。 为了实现本发明的目的，本发明一方面提高一种胎盘提取液的病毒灭活方法，包
括使胎盘提取液与固定化的核酸酶进行酶解反应。 其中，所述的核酸酶为牛胰腺核糖核酸酶A。 本发明另一方面提高一种胎盘提取液病毒灭活方法，包括如下顺序进行的步骤
1)采用Trizol RNA抽提试剂提取牛胰腺的总RNA ;
2)牛胰腺的总RNA的RT-PCR扩增； 3)将牛胰腺总RNA的RT-PCR扩增产物克隆到细菌中，制备牛核糖核酸酶A的表达细菌； 4)对牛核糖核酸酶A的表达细菌进行诱导处理，然后将细菌破碎细胞产生的核酸酶与水不溶性材料固定，获得固定化牛核糖核酸酶A ; 5)胎盘提取液病毒与固定化牛核糖核酸A进行酶解反应，而灭活。 其中，步骤1)中所述的牛胰腺总RNA按照如下步骤提取得到 A)向牛胰腺组织中加入Trizol RNA抽提试剂，反复吹打牛胰腺组织至液体中无
细胞团块，制得牛胰腺组织混合物； B)将牛胰腺组织混合物进行匀浆处理，向匀浆液中加入氯仿后进行离心处理，获得第一上清液； C)向第一上清液中加入异丁醇后进行离心处理，获得第二沉积物；
D)向第二沉积物中加入乙醇溶液，然后进行离心处理，获得牛胰腺总RNA。
特别是，步骤D)中所述乙醇溶液为体积质量百分比浓度为75X的DEPC水溶液，其中，DEPC水溶液的体积质量百分比浓度为1%。。 其中，步骤2)中所述牛胰腺总RNA的RT-PCR扩增反应包括如下进行的步骤
A)将牛胰腺总RNA与Oligo (dT) 15、dNTP、RNasin、M_MLV反转录酶混合，进行逆转录反应，获得逆转录RNA; B)向逆转录RNA中加入MgCl2、 dNTP、上游引物、下游引物、cDNA模板、Taq酶和水混合均匀后，进行所述的RT-PCR扩增反应，获得牛胰腺RNA的RT-PCR反应产物。
其中，步骤3)中所述牛核糖核酸酶A表达细菌按照如下步骤获得
A)用限制性核酸内切酶EcoRl、限制性核酸内切酶Hindi 11酶水解牛胰腺RNA的RT-PCR反应产物和pET28a质粒，获得牛胰腺RNA的PCR产物DNA片段和pET28a载体DNA片段； B)将T4 DNA连接酶加入到牛胰腺RNA的PCR产物DNA片段、pET28a载体DNA片段中，进行连接反应，获得牛胰腺DNA连接物； C)将牛胰腺DNA连接物置于于大肠杆菌的培养基中，进行大肠杆菌的培养，获得牛核糖核酸酶A的表达细菌。 其中，步骤4)中所述固定牛核糖核酸酶A包括如下步骤进行 A)在牛核糖核酸酶A表达细菌的对数生长中期，加入诱导剂异丙基-I3 -D-硫代半
乳糖苷，进行诱导处理，获得牛核糖核酸酶A表达细菌细胞； B)牛核糖核酸酶A表达细菌细胞进行超声处理，使细胞破碎后，进行离心处理，收集上清液，获得牛核糖核酸酶A粗酶液； D)将牛核糖核酸酶A粗酶液通过Ni-NTA柱，牛核糖核酸酶A固定于Ni-NTA柱上，获得固定化牛核糖核酸酶A。 其中，步骤5)中所述胎盘提取液病毒核酸酶解灭活为使胎盘提取液与固定化牛核糖核酸酶A接触，胎盘提取液中病毒的核酸被牛核糖核酸酶A酶解而灭活，制得病毒灭活胎盘提取液。 其中，所述胎盘提取液病毒灭活方法还包括将固定化牛核糖核酸酶A用生理盐水清洗，使固定化牛核糖核酸酶A再生。 本发明再一方面提高一种按照上述病毒灭活方法使胎盘提取液中病毒灭活的胎盘提取液。 本发明的胎盘提取液病毒灭活方法具有如下优点 1、本发明的胎盘提取液病毒灭活方法采用基因工程技术，克隆和高效表达RNA酶，使得核酸酶灭活病毒的效率高，选择性高、催化反应条件温和、无污染、低成本、容易操作、酶的稳定性提高，酶可以反复利用。 2、本发明的胎盘提取液病毒灭活方法用物理的或化学的方法，将核酸酶与水不溶性大分子固体材料载体结合，使得RNA酶固定化，提高了 RNA酶的稳定性，使得RNA酶能够反复利用，降低了胎盘提取液的生产成本。 3、本发明的胎盘提取液病毒灭活方法特异性地针对病毒核酸，能够高效、高选择性、完全消化RNA和DNA，催化反应条件温和、彻底排除病毒污染。 4、本发明的胎盘提取液病毒灭活方法中核酸酶固定后被限制在一定区域内，酶解反应完毕后酶不进入液相，易从反应系统中将酶分离出来，无任何酶残留。反应产物为小分子核酸，无污染，保证了酶反应的安全性。
具体实施例方式
— 、器具、试剂、缓冲液、凝胶、材料的准备
1、器具处理 1、塑料制品(包括移液枪枪头、EP管、匀浆管) 先将塑料制品逐个浸泡于体积百分比浓度为1%。的DEPC(焦碳酸二乙酯)水中，其中移液枪的小枪头用吸管打入DEPC水，浸泡过夜，然后加热升温至125°C ，保温处理30分钟。将高温处理后的塑料制品烤干，备用，其中实验前将枪头、EP管等放入吸头台，再于125t:下保温处理30分钟。 2、玻璃制品将剥离制品浸泡在体积百分比浓度为1%的稀盐酸溶液中，浸泡过夜，冲洗干净，再浸泡于体积百分比浓度为1。；的DEPC(焦碳酸二乙酯)水中过夜，然后加热升温至125t:，保温处理30分钟，最后蒙锡纸烤干备用。 3、匀浆器(剪刀、镊子)先清水洗净后，再加热升温至125°C ，保温处理30分钟。
2、试剂配制 1、DEPC水将lmlDEPC放入1000ml双蒸水中，配成体积百分比浓度为1%。的DEPC水，静置4小时备用。 2、75%乙醇将无水乙醇加入到1%。的DEPC水中，混合均匀，-2(TC保存，备用，其
中，无水乙醇与1%。的DEPC水的体积之比为75 : 100， 1%。的DEPC水为在125"下，保温处
理30分钟的灭菌水。 3、异丙醇放入棕色瓶中，备用 4、氯仿放入棕色瓶中，备用 5、琼脂糖 3、缓冲液配制 1、电泳缓冲液 5 X TBE (贮存液):将Tris-CL 54g，硼酸27. 5g， 0. 5M EDTA 20ml (pH8. 0)溶解到蒸溜水1000ml中，混匀。 再将5XTBE稀释10倍，制成0. 5XTBE在电泳时使用(即工作液浓度)，例如取50ml的5XTBE贮存液加入到450ml水中，制成500ml工作缓冲液，即为0. 5XTBE。
2、上样缓冲液 6X上样缓冲液将O. 25%溴酚蓝，0. 25%二甲苯青FF， 30%甘油混合均匀，在4°C保存，备用。 4、琼脂糖凝胶配制 1、配制1. 0%的琼脂糖凝胶 将琼脂糖加入到电泳缓冲液中，搅拌均匀，置于微波炉中，加热至沸腾，琼脂熔化，然后冷却至6(TC时加入10mg/ml的溴化乙锭溶液，充分混匀后倒入已置好梳子的胶膜中，在室温下放置30-45min，备用，其中，每100ml电泳缓冲液中加入1. Og的琼脂糖，每100ml电泳缓冲液中加入2. 5 iU的溴化乙锭。
2、1.5%的琼脂糖凝胶 除了琼脂糖的用量为1.5g之外，其余与配制1.0%的琼脂糖凝胶相同。
5、材料 Taq DNA聚合酶(含MgCl2缓冲液)200u， Promega公司 dNTP (即三磷酸脱氧核糖核苷)，dNTP包括dATP、 dGTP、 dTTP、 dCTP : 1支，Promega公司 oligo (dT) 15 (即寡聚脱氧胸苷酸):重量1. OOD， Promega公司
M-MLV反转录酶1支，Promega公司；
7[OO71]Rnasin(RNA酶抑制剂)1支，-20。C下贮存，Promega公司[OO72]DEPC(焦碳酸二乙酯)5g Promega公司 Trizol RNA抽提试剂100ml/l瓶，-4"C下贮存，Invitrogen Lifetechnologies公司 E. clli. DH5a大肠杆菌菌株；E. coli. ER2256大肠杆菌菌株，NEB公司。
pET28a质粒Invi trogen公司。 限制性核酸内切酶EcoRl、限制性核酸内切酶Pstl :NEB公司
T4 DNA连接酶大连TAKARA公司 核酸分子量标准物(核酸分子量Marker):大连TAKARA公司。 蛋白分子量标准物(蛋白质分子量Marker)包含了 14. 4kD、 18. 4kD、25. OkD、
35. 0kD、45. 0kD、66. 2kD、116kD共7种纯化的蛋白质:NEB公司。 6、弓|物，Invitrogen公司 上游弓l物5' -gaattcatgaggggcaccaggctgatg-3' 下游引物5' -aagcttTTATGTCAG CGTCACCTCC AC-3' 引物各合成重量50D，加1。；DEPC水稀释，使引物含量为10pmol/iU。 二、提取总RNA 1、向去皮，去除脂肪包膜的牛胰腺组织，加入Trizol RNA抽提试剂后，用加样器反复吹打去皮，去除脂肪包膜的牛胰腺组织，直到液体中无细胞团块，制得牛胰腺组织混合物； 2、向匀浆器中加入牛胰腺组织混合物，高速搅拌后制得牛胰腺组织匀浆液，接着将牛胰腺组织匀浆液转至EP管内，密闭后上下颠倒混匀，然后在2(TC的室温下放置5分；
3、向EP管内加入氯仿，密闭后上下颠倒混匀，然后在20°C的室温下放置5分；
4、将经过氯仿处理的牛胰腺组织匀浆液置于离心机中进行第一次离心分离处理，去除第一沉积物，获得第一上层清液，离心处理的温度为4t:转速为14000rpm，离心处理时间为15分钟； 5、向第一上清液中加入异丙醇混匀后，置于2(TC的室温放置10分钟，然后在4°C
下进行第二次离心分离处理，去除第二上清液，获得第二沉积物，其中，第一上层清液与异
丙醇的体积之比为1 : l，第二次离心处理的转速为14000rpm，时间为10分钟； 6、向第二沉积物中加入用1%。 DEPC水配成的75%乙醇混合均匀，然后在4。C下进
行第三次离心分离处理，去除第三上清液，获得第三沉积物(即牛胰腺总RNA)，其中，75X
的乙醇温度为4。C，第三次离心处理的转速为10000rpm，时间为5分钟； 7、将第三沉积物置于20°C的室温下放置，空气干燥5-10分钟后加入到1%。 DEPC
水中，溶解均匀，制得牛胰腺总RNA溶液。 三、逆转录反应 1、将牛胰腺总RNA溶液与浓度为0. 05ii g/iU的Oligo(dT) 15混匀后，加热至7(TC，在7(TC下加热处理5分钟，获得RNA-01igo溶液，其中牛胰腺总RNA溶液与浓度为0.05iig/ii1的01igo(dT)15的体积之比为23 : 4; 2、将装有RNA-01igo溶液的容器置于冰水中进行冰水浴，放置5分钟后加入M-MLV5XBuffer、 dNTP、 RNasin、 M-MLV反转录酶，混合均匀，获得逆转录混合液，其中M-MLV
85XBuffer、dNTP的浓度为10mM、Rnasin的浓度为40U/ y 1、M_MLV反转录酶的浓度为200U/ii 1， RNA-01 igo溶液、M-MLV 5XBuffer、 dNTP、 RNasin、 M-MLV反转录酶的体积之比为
27 : 8 : 2 : i : 2 ; 3、将逆转录混合液置于离心机中进行离心处理，获得逆转录混合物，离心处理的温度为4t:，转速为6000rpm，离心处理时间为1分钟； 4、将装有逆转录混合物的容器置于42°C的水中进行水浴，水浴60分钟后，置于温度为95°C的水中进行水浴，水浴10分钟，然后取出，获得逆转录RNA，逆转录RNA在4t:保存，备用。 四、PCR反应 1、向逆转录RNA中加入Taq 10XBuffer、浓度为25mM的MgCl"浓度为10mM的dNTP、浓度为10pmol/ii1的上游引物、浓度为10pmol/ii1的下游引物、cDNA模板、浓度为2. 5U/ ii 1的Taq酶和水混合均匀，获得PCR反应混合液； 2、将PCR反应混合液于97t:下保温处理10分钟，然后取出，立即置于冰水中进行冰水浴，冰水浴时间为2分钟； 3、将冰水浴处理后的PCR混合液置于PCR反应仪(Bio-Red公司)中，进行PVCR反应，获得PCR反应产物(即牛核糖核酸酶A的cDNA)，其中，PCR反应产物于4"C保存，PCR反应仪的设定条件为 预变性处理温度为95°C ，预变性处理时间为5分钟
变性处理温度为50°C ，变性处理时间为40秒钟
退火处理温度为50°C ，退火处理时间为40秒钟
延伸处理温度为50°C ，延伸处理时间为40秒钟
反应循环次数为40次
在72t:下进行终末延伸处理7分钟； 将PCR反应产物与溴芬兰混匀后，置于电泳仪中，进行电泳处理，其中电泳的电流为10mA，电源IOOV，电泳处理时间10分钟；检测PCR反应产物的浓度和分子量。
五、克隆 1、按照分子克隆II的方法提取pET28a质粒； 2 、用限制性核酸内切酶EcoRl 、限制性核酸内切酶Hindi 11分别酶水解RT-PCR反应产物和pET28a质粒，获得PCR产物DNA片段和pET28a载体DNA片段；
3、将PCR产物DNA片段与pET28a载体DNA片段混合后，加入T4DNA连接酶，进行连接反应，获得DNA连接物；4、将DNA连接物接种于E. coli ER 2566菌的培养基中，培养，DNA连接物转入E.coli ER 2566菌株中，培养获得牛核糖核酸酶A的表达细菌。
六、核酸酶固定 1、将重组表达细菌(即牛核糖核酸酶A表达细菌)接种到LB培养基中，于37t:下培养约10小时，到生长的对数中期，接着向培养液中加入摩尔浓度为0. 9mM的IPTG(异丙基-13 -D-硫代半乳糖苷)诱导剂进行诱导处理，诱导处理3. 5-4小时，然后将诱导处理后的培养液在4t:下进行离心处理，获得表达细菌细胞，其中离心处理转速为6000rpm，离心时间为10min ;
2、用50mM的PIPES缓冲液(pH7. 0)洗涤表达细菌细胞2次后，再将表达细菌细胞 加入到PIPES缓冲液(pH7. 0)中，制成悬浮细胞液； 3、将悬浮细胞液试管置于冰水中，接着放置到超声仪中，进行超声处理，使细胞破 碎，得到破碎的细菌细胞，其中，超声处理的输出功率250W、工作频率24KHz。
4、将破碎的细菌细胞进行离心处理，收集上清液，得到粗酶液，其中，离心处理转 速为10000rpm，离心时间30分钟; 5、分别依次用20mM Tris-HCl buffer(pH 8.0)、300mM NaCl禾P 10mM咪唑冲洗 Ni-NTA柱，平衡Ni-NTA柱； 6、将粗酶液过Ni-NTA柱，依次用20mM Tris-HCl buffer(pH 8.0)、300mM NaCl禾口 10mM咪唑进行洗脱，去除杂蛋白，获得RNA固定化酶； 7、采用浓度为12%的SDS-PAGE检查固定化酶的纯度，固定化酶的纯度为 90% -99%。 七、胎盘病毒灭活 1、将附着有RNA固定化酶的Ni-NTA的小颗粒固体填料，装入层析柱中，获得核酸 固定化酶柱； 2、将胎盘提取液缓慢通过固定化酶柱，柱上固定的核酸酶与病毒核酸相遇时，病 毒粒子的核酸被酶解成小核酸分子，将胎盘提取液中的病毒灭活，制得病毒灭活胎盘提取 液，其中胎盘提取液通过固定化酶柱的流速为l-100ml/min ;
用生理盐水清洗固定化酶柱，可让固定化酶再生。
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权利要求
一种胎盘提取液的病毒灭活方法，包括使胎盘提取液与固定化的核酸酶进行酶解反应。
2. —种胎盘提取液的病毒灭活方法，包括如下顺序进行的步骤1) 采用Trizol RNA抽提试剂提取牛胰腺的总RNA ;2) 牛胰腺的总RNA的RT-PCR扩增；3) 将牛胰腺总RNA的RT-PCR扩增产物克隆到细菌中，制备牛核糖核酸酶A的表达细菌；4) 对牛核糖核酸酶A的表达细菌进行诱导处理，然后将细菌破碎细胞产生的核酸酶与水不溶性材料固定，获得固定化牛核糖核酸酶A ;5) 胎盘提取液病毒与固定化牛核糖核酸A进行酶解反应，而灭活。
3. 如权利要求2所述的灭活方法，其特征是，步骤1)中牛胰腺总RNA按照如下步骤提取得到A) 向牛胰腺组织中加入Trizol RNA抽提试剂反复吹打牛胰腺组织至液体中无细胞团块，制得牛胰腺组织混合物；B) 将牛胰腺组织混合物进行匀浆处理，向匀浆液中加入氯仿，然后进行离心处理，获得第一上清液；C) 向第一上清液中加入异丁醇，然后进行离心处理，获得第二沉积物；D) 向第二沉积物中加入乙醇溶液，然后进行离心处理，获得牛胰腺总RNA。
4. 如权利要求3所述的灭活方法，其特征是步骤D)中所述乙醇溶液为体积质量百分比浓度为75%的DEPC水溶液，其中，DEPC水溶液的体积质量百分比浓度为1%。。
5. 如权利要求2或3所述的灭活方法，其特征是步骤2)中所述牛胰腺总RNA的RT-PCR扩增包括如下进行的步骤A) 将牛胰腺总RNA与Oligo(dT) 15、dNTP、RNasin、M-MLV反转录酶混合，进行逆转录反应，获得逆转录RNA;B) 向逆转录RNA中加入MgCl2、 dNTP、上游引物、下游引物、cDNA模板、Taq酶和水混合均匀后，进行所述的RT-PCR扩增反应，获得牛胰腺RNA的RT-PCR反应产物。
6. 如权利要求2或3所述的灭活方法，其特征是步骤3)中所述牛核糖核酸酶A表达细菌按照如下步骤获得A) 用限制性核酸内切酶EcoRl、限制性核酸内切酶Hindin酶水解牛胰腺RNA的RT-PCR反应产物和pET28a质粒，获得牛胰腺RNA的PCR产物DNA片段和pET28a载体DNA片段；B) 将T4DNA连接酶加入到牛胰腺RNA的PCR产物DNA片段、pET28a载体DNA片段中，进行连接反应，获得牛胰腺DNA连接物；C) 将牛胰腺DNA连接物置于于大肠杆菌的培养基中，进行大肠杆菌的培养，获得牛核糖核酸酶A的表达细菌。
7. 如权利要求2或3所述的灭活方法，其特征是步骤4)中所述固定牛核糖核酸酶A包括如下步骤进行A)在牛核糖核酸酶A表达细菌的对数生长中期，加入诱导剂异丙基-I3 -D-硫代半乳糖苷，进行诱导处理，获得牛核糖核酸酶A表达细菌细胞；B)牛核糖核酸酶A表达细菌细胞进行超声处理，使细胞破碎后，进行离心处理，收集上 清液，获得牛核糖核酸酶A粗酶液；D)将牛核糖核酸酶A粗酶液通过Ni-NTA柱，牛核糖核酸酶A固定于Ni-NTA柱上，获得 固定化牛核糖核酸酶A。
8. 如权利要求2或3所述的灭活方法，其特征是步骤5)中所述胎盘提取液病毒核酸酶 解灭活为使胎盘提取液与固定化牛核糖核酸酶A接触，胎盘提取液中病毒的核酸被牛核糖 核酸酶A酶解而灭活，制得病毒灭活胎盘提取液。
9. 如权利要求2或3所述的灭活方法，其特征是还包括将固定化牛核糖核酸酶A用生 理盐水清洗，使固定化牛核糖核酸酶A再生。
10. —种胎盘提取液，其特征是按照如权利要求1-9任一所述病毒灭活方法使胎盘提 取液中病毒灭活而成。
全文摘要
本发明公开了一种胎盘提取液病毒灭活方法，包括如下顺序进行的步骤1)采用Trizol RNA抽提试剂提取牛胰腺的总RNA；2)牛胰腺的总RNA的RT-PCR扩增；3)克隆制备牛核糖核酸酶A的表达细菌；4)牛核糖核酸酶A固定；5)胎盘提取液病毒核酸酶解灭活。本发明方法采用基因工程技术，克隆和高效表达RNA酶，并将RNA酶固定化，使胎盘提取液通过固定化RNA酶，使得胎盘提取液中的病毒粒子的核酸被特异性的酶解而失活，达到纯化胎盘提取液的目的，本发明方法高效、高选择性、催化反应条件温和、无污染、低成本、容易操作、酶可以反复利用，产品单一。
文档编号A61K35/48GK101716357SQ20091021033
公开日2010年6月2日 申请日期2009年10月30日 优先权日2009年10月30日
发明者葛龙海 申请人:葛龙海