耐受性肿瘤细胞抗原负载树突状细胞,其制法以及应用的利记博彩app

专利名称：：耐受性肿瘤细胞抗原负载树突状细胞,其制法以及应用的利记博彩app
技术领域：
：本发明涉及树突状细胞及其制备方法、该树突状细胞在制备抗癌症药物中的应用、制备该树突状细胞的疫苗。特别地，本发明涉及耐受性肿瘤细胞的制备方法和应用，以及其抗原负载的树突状细胞及其制备方法、该耐受性肿瘤细胞抗原负载的树突状细胞在制备抗癌症药物中的应用、制备该耐受性肿瘤细胞抗原负载的树突状细胞的疫苗。
背景技术：
：目前癌症的治疗方法包括手术治疗、放射治疗和化疗。但现有的癌症治疗方法不能根治癌症。主要原因是构成癌症的细胞中含耐受性肿瘤细胞，其具有细胞耐受性的生物学特性，例如对化疗药物的高耐药性及对》欠射治疗的高耐辐射性，纟及少数的肿瘤细力包还驱动胂瘤血管生成拟态的形成。因此耐受性肿瘤细胞是癌症发生和发展(癌症的生长、癌症产生耐受性、癌症复发和转移等)的真正元凶。现有技术已尝试使用树突状细胞免疫治疗方法来治疗癌症，即从患者癌症中将肿瘤细胞分离出来，通过裂解该肿瘤细胞得到抗原，并将该抗原负载到患者的树突状细胞上。如此得到的靶向肿瘤细胞的树突状细胞，可以用于治疗癌症。例如CN1686538A和CN1705489A中公开了将肿瘤细胞制备得到的抗原负载到树突状细胞上，并用所得树突状细胞治疗癌症的方法。现有技术仅公开了如何得到相关肿瘤细胞，但并未教导对获取的肿瘤细胞进行处理。并且，现有技术的上述方法虽然以肿瘤细胞为靶标，但是该方法仍然存在癌症在放疗和化疗后耐药性、复发率和转移率高的问题。
发明内容为了克服现有以普通肿瘤细胞为靶标的癌症免疫治疗方法仍然存在癌症在放疗和化疗后耐药、复发和转移的问题，本发明的目的是提供一种耐受性肿瘤细胞抗原负载的树突状细胞及其制备方法、该耐受性肿瘤细胞抗原负载的树突状细胞在制备抗癌症药物中的应用、制备该耐受性肿瘤细胞抗原负载的树突状细胞的疫苗。6现有技术认为经射线照射和/或与大剂量化疗药物接触后，肿瘤细胞会被全部杀死，但是本发明的发明人意外地发现，在一定范围内经射线照射和/或与大剂量化疗药物接触后，肿瘤细胞不但不会^^皮完全杀死，而且还会产生具有很强耐受性的肿瘤细胞。一般剂量的射线照射和/或化疗药物很难杀灭所述耐受性肿瘤细胞。本发明提供了一种耐受性肿瘤细胞抗原负载的树突状细胞的制备方法，该方法包括通过裂解耐受性肿瘤细胞得到肺瘤细胞抗原组合物，将树突状细胞与耐受性肿瘤细胞抗原组合物接触得到负载肿瘤抗原的抗癌树突状细胞，其中，所述耐受性肿瘤细胞通过以下方法制备，该方法包括对肿瘤细胞进行射线照射和/或化疗药物筛选的步骤，所述射线照射筛选通过将肿瘤细胞暴露于射线的照射源下完成，所述射线选自由a射线、p射线、X射线和Y射线所组成的组中，所述化疗药物筛选通过使肿瘤细胞与化疗药物接触完成，所述化疗药物由选自烷化剂化疗药物、亚硝脲化疗药物、抗代谢化疗药物、抗生素化疗药物、植物化疗药物、激素及内分泌药物化疗药物、抗体阻断剂化疗药物、植物化疗药物、抗体阻断剂化疗药物、轻基脲、卡铂、草酸铂、顺铂、丙亚胺门冬酰胺酶和氮烯咪胺所组成的组中。本发明还提供了由上述的方法得到的耐受性肿瘤细胞抗原负载的树突状细胞。本发明还提供了一种耐受性肿瘤细胞抗原负载的树突状细胞疫苗，所述树突状细胞疫苗包括树突状细胞，其特征在于，所述树突状细胞为本发明所述的耐受性胂瘤细胞抗原负载的树突状细胞。本发明还提供了本发明的耐受性肿瘤细胞抗原负载的树突状细胞疫苗在制备抗癌症药物中的应用。由于本发明的肿瘤细胞经过了射线照射和/或化疗药物的筛选，由此得到的胂瘤细胞产生了与肿瘤细胞不同的变化(比如特异表达了许多不同于胂瘤细胞的蛋白)，更接近接受过放疗和/或化疗的癌症内的肿瘤细胞，因此，由本发明提供的耐受性肿瘤细胞以及由该耐受性肿瘤细胞得到的抗原组合物制备的药物，能够在体内和体外杀死引起癌症复发的肿瘤细胞，从而为癌症的才艮治提供了可能。图1为制备例4的胃瘤细胞经y射线辐射筛选后的存活率曲线；图2为制备例2的肾细胞瘤细胞经y射线辐射筛选后的存活率曲线；图3为重复制备例4的胃癌细胞经9Gy的y射线辐射筛选后的存活率曲线；图4显示胃癌细胞经射线照射和化疗药物筛选后耐受性蛋白表达western印迹照片；图5耐受性肺癌细胞抗原负载树突状细胞，流式细胞仪4全测负载DC表型变化情况。图6显示了由表5所示经射线照射和化疗药物筛选后的制备例5和未经筛选的制备例5所得两种抗原组合物分别负载树突状细胞，得到两种细胞毒性T淋巴细胞(CTL),由该两种CTL细胞分别对经射线照射和化疗药物筛选的以及未经射线照射和化疗药物筛选的肺癌细胞产生的应答结果对比图。具体实施例方式本发明提供了一种耐受性肿瘤细胞的制备方法，其中，该方法包括对肿瘤细胞进行射线照射和/或化疗药物筛选的步骤，所述射线照射筛选通过将胂瘤细胞暴露于射线的照射源下完成，所述射线选自由oc射线、P射线、X射线和Y射线所组成的组中，所述化疗药物筛选通过使肿瘤细胞与化疗药物接触完成，所述化疗药物选自由烷化剂化疗药物、亚硝脲化疗药物、抗代谢化疗药物、抗生素化疗药物、植物化疗药物、激素及内分泌药物化疗药物、抗体阻断剂化疗药物、植物化疗药物、抗体阻断剂化疗药物、羟基脲、卡铂、草酸铂、顺铂、丙亚胺门冬酰胺酶和氮烯咪胺所组成的组中。其中，Gy为射线照射的总剂量单位，lGy=100rad，cGY为组织吸^lti丈射线的剂量单位lGy=100rad=100cGy。所述剂量率是指射线照射的速度，cGy/min为剂量率的单位。射线照射的时间=总剂量/剂量率。优选地，所述射线照射的照射源与肿瘤细胞的直线距离为5cm-3m,所述射线照射的总剂量为lGy-10Gy,所述射线照射的剂量率为0.5-2000cGy/min。更优选所述射线照射的照射源与肿瘤细胞的直线距离为10cm-lm,所述射线照射的总剂量为3Gy-9Gy,所述射线照射的剂量率为2-600cGy/min。优选地，本发明所述射线可以为X射线和/或Y射线。所述射线可以由各种常用的放射治疗同位素金属提供，例如Co60、Se75、Irl92、Cs-137及Am-241能够放出Y射线等。优选地，所述化疗药物在肿瘤细胞培养基中的终浓度范围可以为0.5-100mg/mL,所述化疗药物与肿瘤细胞接触的时间为6h-72h。更优选所述化疗药物在肿瘤细胞培养基中的终浓度范围为0.5-50mg/mL,所述化疗药物与肿瘤细胞接触的时间为12h-36h。接触时间过长或化疗药物剂量过大，会杀死所有肿瘤细胞，从而得不到具有耐受性的肿瘤细胞；反之，起不到筛选肿瘤细胞的作用。本发明可以使用现有的任何化疗药物完成对肿瘤细胞的筛选。优选所述抗代谢药化疗药物选自由氟尿脱氧核苷、环胞苷、曱氨喋呤、氟尿嘧啶、喃氟啶、优福啶、卡莫氟、脱氧氟尿苷、阿糖胞苷和双氟胞苷所组成的组中；所述烷化剂化疗药物选自由环磷酰胺、氮曱、苯丙氨酸氮芥、氮芥、异环磷酰胺和苯丁酸氮芥所组成的组中；所述亚硝脲类化疗药物选自由卡氮芥、环已亚硝脲、曱环亚硝脲、嘧啶亚硝脲、白消安和雌二醇氮芥所组成的组中；所述植物化疗药物选自由鬼臼乙叉甙、鬼臼噻吩甙、羟基喜树碱、长春新碱、长春花碱、长春地辛、长春瑞宾、伊立替康、托泊替康、紫杉醇、泰素帝、三尖杉酯》成和羟基紫杉醇所组成的组中；所述抗体阻断剂化疗药物选自由表皮生长因子抑制剂吉非替尼、厄洛替尼、西妥昔单抗和尼妥珠单抗所组成的组中，所述抗生素化疗药物选自由丝裂霉素、博来霉素、平阳霉素、阿霉素、吡喃阿霉素、去曱氧柔红霉素、表-阿毒素、放线菌素D和米托蒽醌所组成的组中；所述激素及内分泌药物化疗药物选自由托瑞米芬、雌激素受体拮抗剂、氨鲁米特、福美司坦、来曲哇地塞米+>、丙酸睾丸素、乙烯雌酚、氟硝丁酰胺、孕酮、曱地孕酮、他莫昔芬和促性腺激素释放激素拮抗剂所组成的组中。本发明提供的耐受性肿瘤细胞的制备方法可以仅包括对肿瘤细胞进行射线照射筛选的步骤，而不包括化疗药物筛选的步骤。在此情况下，所述射线照射的照射源与胂瘤细胞的直线距离优选为10cm-lm,所述射线照射的总剂量优选为3Gy-9Gy，所述射线照射的剂量率优选为2-600cGy/min;进一步优选所述射线照射的照射源与肿瘤细胞的直线距离为50cm-lm,所述射线照射的总剂量为6Gy-9Gy,所述射线照射的剂量率为2-200cGy/min。本发明提供的耐受性肿瘤细胞的制备方法可以仅包括对胂瘤细胞进行化疗药物筛选的步骤，而不包括射线照射筛选的步骤。在此情况下，优选所述化疗药物在肿瘤细胞培养基中的终浓度范围为0.5-50mg/mL,所述化疗药物与肿瘤细胞接触的时间为12-36h;进一步优选所述化疗药物在胂瘤细胞培养基中的终浓度范围为0.5-20mg/mL,所述化疗药物与肿瘤细胞接触的时间为12-24h。更优选地，本发明提供的耐受性肿瘤细胞的制备方法包括对肿瘤细胞进行射线照射和化疗药物筛选的步骤，在此情况下，所述射线照射的照射源与肺瘤细胞的直线距离为10cm-lm,所述射线照射的总剂量为3Gy-9Gy,所述射线照射的剂量率为2-600cGy/min，所述化疗药物在肿瘤细胞培养基中的终浓度范围为0.5-50mg/mL,所述化疗药物与肿瘤细胞接触的时间为12-36h;进一步优选所述射线照射的照射源与肿瘤细胞的直线距离为50cm-lm,所述射线照射的总剂量为6Gy-9Gy，所述射线照射的剂量率为2-200cGy/min，所述化疗药物在肿瘤细胞培养基中的终浓度范围为0.5-20mg/mL,所述化疗药物与肺瘤细胞接触的时间为12-24h。此外，进一步优选所述射线照射的照射源及所述化疗药物与患者接受的射线照射和/或化疗药物相同。本发明适用于所有能够从中分离出肿瘤细胞的各种癌症。例如，所述癌症可以选自由胃癌、肺癌、乳腺癌、胶质瘤、肝细胞癌、胰腺癌、脑癌、鼻咽癌、结肠癌、卵巢癌、黑素瘤、骨肉瘤、肾细胞癌、前列腺癌、转移瘤性癌、急性骨髓白血病和多发性骨髓瘤所组成的组中。所述方法还包括从离体癌症组织和/或肿瘤细胞系中分离胂瘤细胞。手术从患者体内取出的癌症组织，属于废弃的离体癌症组织。本发明可以适用常规的方法得到肿瘤细胞，并从中分离出肿瘤细胞。此外，由现有商业上能够买到的细胞系培养物也能从中得到相应的肿瘤细胞。本发明还提供了由上述的方法得到的肿瘤细胞。肿瘤细胞在经过本发明的筛选后，所述肿瘤细胞的所表达的蛋白发生了变化。例如，所述肿瘤细胞特异表达选自由表皮生长因子受体、P-糖蛋白、多药耐药相关蛋白、共济失调毛细血管扩张症突变基因编码的蛋白、共济失调毛细血管扩张症Rad3相关蛋白和低氧诱导因子所组成的组中的蛋白。反过来，通过检测这些蛋白的在筛选前后的变化，可以检测出所述筛选过程是否成功。肺瘤细胞通常借用正常细胞标志和/或肿瘤细胞标志进行检测。肿瘤细胞常表现出基因组不稳定性，经放射治疗和/或化疗药物后，尽管可消灭绝大多数肿瘤细胞，使瘤体变小甚至消失，但是残留的极少数胂瘤细胞可能已被赋予细胞样的生物学特性，易发生恶性突变，产生药物抵抗和放射抵抗。本发明还提供了一种肿瘤细胞抗原组合物的制备方法，该方法包括用生理盐水洗涤并重悬肺瘤细胞，然后裂解肿瘤细胞的步骤，其中，所述肿瘤细胞本发明的肿瘤细胞。所述生理盐水的洗涤次数可以通过测定洗出液中残留的培养基组分来决定。将本发明的肺瘤细胞抗原组合物在注射给患者时残留的培养基组分以及可能残留的化疗药物不会引起患者不适即可。裂解本发明的肿瘤细胞可以使用本领域常规的各种裂解方法实现。出于不在裂解肿瘤细胞后增加新的物质的考虑，优选所述裂解肿瘤细胞的步骤包括热休克和/或反复冻融；所述热休克裂解的条件包括在3t:下保持lh-4h,优选包括在3。C下保持lh-2h;所述反复冻融的次数为3-5次，每两次的间隔时间是10min-lh，优选为30min-lh，所述冷冻的温度范围是零下1。C画零下i96°c(可以使用液氮、干水等来实现)，优选零下rc-零下rc，所述融化的温度范围是1°C-3°C，优选为2°C-3°C。由于经热休克后，本发明的肿瘤细胞会产生热休克蛋白，裂解后仍然存在所述热休克蛋白。热休克蛋白10的存在有助于负载后的树突状细胞免疫应答。因此，更优选所述裂解肿瘤细胞的步骤包括热^f木克和反复冻融；所述热休克裂解的条件包括在37-4'C下保持lh-4h;所述反复冻融的次数为3-5次两次的间隔时间是10min-lh,所述冷冻的温度范围是零下rc-零下rc,所述融化的温度范围是i5°c-3°c。裂解完成后，通常通过离心和过滤的步骤除去裂解液中过大的细胞碎片，例如，通过800rpm离心lmin除去，然后上清用0.45pim滤膜过滤。所述组合物的基本成分包括生理盐水。裂解得到的本发明的抗原组合物可以在-80。C中保存。本发明还提供了本发明的耐受性肿瘤细胞以及本发明的肿瘤细胞抗原组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明还提供了一种抗癌树突状细胞的制备方法，该方法包括将正常树突状细胞与肿瘤细胞抗原组合物接触，得到负载肿瘤细胞抗原的树突状细胞，其中，所述肿瘤细胞抗原组合物为本发明所述的肿瘤细胞抗原组合物。优选所述正常树突状细胞与制备肿瘤细胞抗原组合物的肿瘤细胞来自同一个体。这样可以最大限度地避免由于免疫排斥反应而引起的副作用。其中在裂解肿瘤细胞制备被负载的所述抗原组合物前，所述肺瘤细胞经用于培养树突状细胞的培养基洗涤三次。所述树突状细胞负载肿瘤细胞抗原时，正常树突状细胞与肿瘤细胞抗原组合物接触的时间可以是本领域常M/f吏用的任意的接触时间，优选是l-24h,更优选是2-12小时。本发明还提供了由上述的方法得到的抗癌树突状细胞。本发明还提供了一种树突状细胞疫苗，所述树突状细胞疫苗包括树突状细胞，其中，所述树突状细胞为本发明的抗癌树突状细胞。在制备树突状细胞疫苗之前，用生理盐水洗涤并重悬所述抗癌树突状细胞。所述生理盐水的洗涤次^t可以通过测定洗出液中残留的培养基组分来决定。将本发明的树突状细胞疫苗在注射给患者时残留的培养基组分以及可能残留的化疗药物不会引起患者不适即可。所述组合物包括lxl()S到5xl(^个/mL本发明的抗癌树突状细胞；优选为5xl()S到lxl(f个/mL。所述组合物还包括人血白蛋白；其中，以所述组合物为基准，所述人血白蛋白的含量为1-5重量体积％,优选为2-3重量体积％。本发明还提供了本发明的抗癌树突状细胞在制备抗癌症药物中的应用。本发明还提供了一种治疗癌症的方法，其包括给患者施用选自由本发明的肿瘤细胞、本发明的肿瘤细胞抗原组合物、本发明的抗癌树突状细胞以及本发明的树突状细胞疫苗所组成的组中的药物。优选所述施用的方式为注射。具体地，施用肿瘤细胞抗原组合物的方式选自由癌症组织内注射、静脉注射、皮下注射和皮内注射中的一种或几种；施用所述树突状细胞疫苗的方式为在淋巴结部位皮下或皮内注射。优选施用所述树突状细胞疫苗的方式为在腹部沟或腋下进行皮下或皮内注射。所述肿瘤细胞抗原组合物优选来自细胞浓度为lxl()S到lxl()S细胞/mL的本发明的肿瘤细胞，其有效量为0.1mL-5mL/个体；所述树突状细胞疫苗优选包括"105到5xl(^个/mL本发明的抗癌树突状细胞，其有效量为0.1mL-2mL/个体。更优选所述肿瘤细胞抗原组合物优选来自细胞浓度为1xlo5到1xlo8细胞/mL的本发明的肿瘤细胞，其有效量为0.2mL-2mL/个体；所述树突状细胞疫苗优选包括lxl()S到5xl(^个/mL本发明的抗癌树突状细胞，其有效量为0.5mL-2mL/个体。以上所述肿瘤细胞抗原组合物和所述树突状细胞疫苗都是一次注射的剂量，一个疗程四次注射，间隔一到两周。两种组合物一般在注射完第一针后的第三天到第七天起效。所述有效的标准是起免疫促进的细胞因子如白介素2、白介素12、干扰素Y和肿瘤坏死因子a等的升高；起免疫抑制的细胞因子如白介素6、白介素IO、转化生长因子p和表皮细胞生长因子等的降低；以及T淋巴细胞亚群变化，即CD3、CD4、CD8的阳性率的升高或改善，CD16/56阳性率的升高，以及CD4Foxp3双阳性率的降低。一个疗程结束后，可以间隔三个月后继续给药，可以治疗两个或四个疗程；如有必要，间隔时间为六个月或1年还可继续再治疗。其中，所述有效标准还可以分为以下三个等级1.患者血液细胞因子检测起免疫促进的细胞因子如白介素2、白介素12、千扰素y和胂瘤坏死因子a等的升高；起免疫抑制的细胞因子如白介素6、白介素IO、转化生长因子(3和表皮细胞生长因子等的P争低；以及T淋巴细胞亚群变化，即CD3、CD4、CD8的阳性率的升高或改善，CD16/56阳性率的升高，以及CD4Foxp3双阳性率的降低等。2.患者肿瘤标志物^r测，如甲胎蛋白、癌胚抗原、糖蛋白等肿瘤特异抗原的表达的降低，主要是通过酶免和化学发光^^测等。3.影像学检测，如核磁共振、CT和B超检测，能检测到治疗前后肿瘤细胞缩小。优选所述肿瘤细胞和/或所述树突状细胞来自于同一患者，这样可以最大限度地避免免疫排斥反应造成的副作用。此外，本发明提及的细胞可以是商业上可供的细胞系。并且现有长期冷冻保藏细胞的技术已经非常成熟，比如在液氮(零下196°C)下冻存细胞，例如脐带血细胞保藏。本领域技术人员完成可以利用上述技术保藏本发明涉及的癌症组织、肿瘤细胞系和树突状细胞，树突状细胞可以来源外周血、骨髓和脐带血等。以下，对本发明的具体实施例进行说明，但本发明的技术范围不限于这些示例。制备例1-3:从肺癌细胞系A549中培养的乳腺癌细胞将购自美国ATCC的肿瘤细胞系的肺癌A549细胞，用添加了10%胎牛血清的RPMI1640培养基在37°C、5%002培养箱中培养3天。取1瓶培养到5代的肿瘤细胞，经胰酶消化，离心后细胞沉淀用lmL1xPBS重悬，计数。按上述方法分别制备肾细胞瘤和肝癌的肿瘤细胞。肾细胞瘤为A-498,使用DMEM低糖补充10%胎牛血清的培养基培养；肝癌为H22,使用RPMI1640补充10%胎牛血清的培养基培养。制备例4:胃癌组织中的肿瘤细胞的分离和培养经病理检查确诊为低分化胃癌的组织来自39岁男性患者，签署了知情同意书后，在进行手术时采集其癌症组织。用眼科剪将脑胶质瘤组织剪碎成为约lmm3的小块。所得剪碎的组织小块用0.25%胰酶溶液以2克2mL的重量体积比消化5分钟后，加入是胰酶溶液体积1/2的小牛血清(杭州四季青公司)终止，以1000rpm离心收集消化好的组织小块，倾去胰酶溶液上清和0.01%DNAse(DNA酶，北京宝生物)的PBS以1克lmL的重量体积比洗涤三次，所得离心沉淀用胰酶以1克lmL的体积比在37。C下混勻接触IO分钟，然后在1000rpm下离心5min收集细胞，用以1克lmL的重量体积比用RPMI1640培养基重悬。所得重悬液用40-mm分子筛(BD公司)过滤。用所述孔径的分子筛过滤，留下的是大片细胞碎片和未被消化的细胞团，滤出的是细胞悬液。收集剩余的所述细胞悬液后，向其中含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基(美国Gibco公司)使细胞悬液浓度被稀释为2xl05细胞/mL。然后将每5mL所得稀释的细胞悬液转移至25cr^灭菌塑料培养瓶中在3°C、5%(302培养箱中培养24h。取1瓶培养到5代的肿瘤细胞，经胰酶消化，离心后细胞沉淀用lmL1xPBS重悬，计数。制备例5-6按照制备例1的方法分别制备肺癌和大肠癌的肿瘤细胞。其中，不同点如下肺癌组织来自61岁女性患者，该患者经病理;险查确"〖t为肺癌。与该患者签署了知情同意书，在进行手术时采集其癌症组织。直肠癌组织来自59岁男性患者，该患者经病理检查确诊为中分化直肠腺癌。与该患者签署了知情同意书，在进行手术时采集其癌症组织。实施例1:经高浓度间歇诱导法化疗药物筛选的肿瘤细胞的制备取1瓶25cm2塑料培养瓶的培养有制备例6的直肠癌细胞，经胰酶消化，离心后细胞沉淀用lmLRPMI1640培养基重悬计数，得到2xl05细胞/mL的细胞悬液。1)将所述直肠癌细胞接种10mL于75crr^培养瓶中，生长至瓶底80°/0汇合时，加用RPMI1640培养基溶解的4-羟-环磷酰胺，直至终浓度5mg/mL,在3°C、5。/。C02条件下培养12h。倾去含4-羟-环磷酰胺的培养液，lxPBS洗2次，加含10%胎牛血清的RPMI1640培养基，在3°C、5%C02条件下培养直肠癌细胞生长至80%汇合。2)再加入RPMI1640培养基溶解的4-羟-环磷酰胺至终浓度5mg/mL，在3°C、C02条件下培养24h,倾去含4-羟-环磷酰胺的培养液，lxPBS洗2次。3)再重复上述步骤2)培养4次，由此获得经耐药性筛选的直肠癌细胞。按照上述直肠癌细胞的耐化疗药筛选制备例2、5的肿瘤细胞，不同之处如表1所示表1肿瘤细胞步骤1-3中的化疗药物步骤1-3中使用的终浓度制备例24-羟-环磷酰胺10mg/mL制备例5阿霉素10mg/mL实施例2:经药物浓度递增法化疗药物筛选的肿瘤细胞的制备取1瓶25cm2塑料培养瓶的培养有制备例4的胃癌细胞，经胰酶消化，离心后细胞沉淀用lmLRPMI1640培养基重悬计数，得到2xl05细胞/mL的细胞悬液。1)将所述胃癌细胞接种10mL于75ciT^培养瓶中，生长至瓶底80%汇合时，加入紫杉醇，直至终浓度lmg/mL,在3°C、5%C02条件下培养24h。倾去含紫杉醇的培养液，lxPBS洗2次，加含10%胎牛血清的RPMI1640培养基，在3°C、5%(302条件下培养胃癌细胞生长至80%汇合。2)重复步骤l)的操作4次，不同的是紫杉醇的终浓度分别为2mg/mL、4mg/mL、8mg/mL和10mg/mL。3)加入紫杉醇，直至终浓度10mg/mL，在3"C、5%0)2条件下培养24h。倾去含紫杉醇的培养液，lxPBS洗2次，加含10%胎牛血清的RPMI1640培养基，在3°C、5%0)2条件下培养胃癌细胞生长至80%汇合。4)重复上述步骤3)培养1次。5)加入紫杉醇，直至终浓度10mg/mL，在3°C、5%(302条件下培养24h。由此获得在终浓度10mg/mL紫杉醇中稳定生长的经耐药性筛选的胃癌细胞。14按照上述胃癌细胞的耐化疗药筛选下面的肿瘤细胞，不同之处如表2所示表2<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>此外，取1瓶培养制备例1的肺癌细胞。重复上述终浓度lmg/mL、2mg/mL、4mg/mL、8mg/mL和10mg/mL阿霉素筛选，所得结果见表4。实施例3:MTT检测经耐药筛选的肿瘤细胞的药物敏感性将实施例2和实施例3所得的肿瘤细胞以lxl0VmL细胞浓度分别接种于96孔培养板，所述培养的培养基为含10°/。胎牛血清的RPMI1640,在37。C、5%C02的条件下，培养24h后倾去培养液，分别按照下表3分别加入相应的化疗药物，所述药物以溶解在培养基中的形式加入表3<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>表3中每种细胞在每个梯度下重复3个孔，以每种未经化疗药物筛选的肿瘤细胞作为相应细胞的空白对照。继续培养48h，每孔加入终浓度5mg/mL的MTT的lxPBS溶液20(iL,4h后加入二甲基亚砜lOO(iL,振荡混匀15min,用酶标仪(K=570nm)测定每孔吸光度值(A值)，其中吸光度值与活细胞数成正比)，取3个孔的平均值，计算药物对肺瘤细胞的抑制率。肿瘤细胞的抑制率=(l-药物A值/对照A值)xl00%。采用对数计量作图法计算各种药物对细胞达50。/。抑制率时的药物浓度(IC50)，并计算相对耐药度(RF)。相对耐药度=1050经耐药筛选的肺瘤细胞/IC50未经化疗药物筛选的肺瘤细胞。测试结果如表4所示。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>实施例4:经耐放射筛选的胂瘤细胞的制备取8瓶25cm2塑料培养瓶，其中，每4瓶分别培养有制备例1和制备例5的肿瘤细胞。所述培养瓶中的细胞已生长到细胞贴壁融合80%左右。以照射总剂量分别为OGy、3Gy、5Gy和9Gy、照射源与肿瘤细胞照射距离在30cm、射线照射的剂量率为600cGy/min的Y射线照射所述培养瓶中的细胞。照射后更换为含10%胎牛血清的RPMI1640培养基，在37。C、5%(302培养箱培养20天，每3天更换一次所述培养基。培养结束后，经胰酶消化，离心得到的细胞沉淀用lmLRPMI1640重悬，计数。采用集落形成法测定细胞存活率，即用新鲜RPMI1640培养基加入0.6重量体积％的琼脂糖(熔点为40°0，制得培养基琼脂糖溶液，置40。C保温。每瓶取经上述筛选且消化重悬的0.5mL细胞悬液(4xl()S细胞/mL)与0.5mL所述培养基琼脂糖溶液混合均匀，立即倒入六孔细胞培养板的孔中，固化后，置3°C、5。/。C02的培养箱中培养1周。在显微镜下计数"mm的集落数目，计算集落形成存活率=(OGy集落数-3Gy、5Gy或9Gy的集落数)/0Gy集落数，从而检测肿瘤细胞在不同》文射剂量照射下的细胞存活率。以细胞存活率为纵坐标、以照射后的天数为横坐标绘制肿瘤细胞经y射线辐射筛选后的存活率曲线。如图1-2所示，肿瘤细胞在经3Gy、5Gy或9Gy的y射线照射筛选后，都有部分死亡，但培养一段时间后又能生长很好。其中在总剂量9Gy照射后，肿瘤细胞在照射后第15天存活率很低(小于20%),但继续培养，肺瘤细胞的存活率重新恢复，甚至存活率与未经照射的肿瘤细胞相当。并且，恢复后的肿瘤细胞的增殖速率远高于未经照射的肺瘤细胞。例如，经9Gy照射后15天的乳腺癌细胞增值速率为23%/天，而未经照射的乳腺癌细胞增值速率一直维持在1%/天。此外，取制备例4的胃癌细胞培养的3瓶细胞，所述培养瓶中的细胞已生长到细胞贴壁融合80%左右。重复上述9Gy的y射线照射筛选，所得存活率结果见图3与上述图1的结果类似。此外，分别取培养有制备例1-3和制备例5-6的肿瘤细胞，各4瓶25cm2塑料培养瓶。重复上述实验过程，得到类似的结果，即经3Gy、5Gy或9Gy照射后，肺瘤细胞在照射后第15天存活率^艮低(小于20%)，但继续培养，肿瘤细胞的存活率重新恢复，甚至存活率与未经照射的肿瘤细胞相当。实施例5:射线照射和化疗药物耐受筛选的肿瘤细胞的制备使用制备例的肿瘤细胞根据实施例l-3的描述，按照下表5将两种筛选过程并用表5<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>图4显示了制备例5肺细胞经射线照射和化疗药物筛选后耐受性蛋白表达western印迹照片，其中，P-肌动蛋白为检测内标，为细胞增殖时常表达蛋白；表皮生长因子受体(EGFR)为促进癌症增殖、新生血管发生、抑制肿瘤细胞凋亡的特异性表达蛋白，并且促进HIF-la表达，提高细胞对低氧的耐受。实施例6:经耐受篩选的肿瘤细胞的抗原组合物的制备取未经筛选的肿瘤细胞(上述制备例1-6)以及经筛选的肿瘤细胞(实施例1-3和5所得)，在液氮中和室温(2°C)下反复冻融5次，通过倒置显耀:镜才佥测到所述细胞完全裂解。所得裂解液在800rpm下离心lmin,收集上清用0.45pm滤膜过滤，收集滤液。所述裂解液即肿瘤细胞的抗原组合物，储存在-80。C中备用。此外，另取实施例1-3和5所得经筛选的肿瘤细胞在4'C水浴下热〗木克2小时后，再重复上述反复冻融步骤。用western印迹检测发现如此所得的肿瘤细胞抗原组合物中热休克蛋白的表达。实施例7:树突状细胞获取来自献血者的100mL外周血经Ficoll密度梯度离心，得到的外周血单个核细胞用RPMI1640培养基重悬，并加入6孔板中贴壁。在37°C、5°/。C02培养箱中孵育90min后，未贴壁细胞洗涤收集下来。贴壁细胞加入完全培养基RPMI1640谦导培养，含有5%的自体血清、1000IU/mL重组人粒细胞巨噬集落刺激因子和1000IU/mL白介素4。在培养到第三天时细胞更换新鲜培养基(含1000IU/mLGM-CSF和1000IU/mLIL-4)。培养到第五天收获未成熟DCs，成熟DCs采用完全RPMI1640培养基在诱导到第七天得到，含0.1吗/mL脂多糖和20ng/mL胂瘤坏死因子a。在第五天时添加特殊抗原(如肿瘤细胞抗原)，负载DCs。实施例8:耐受性肺瘤细胞抗原负载DCs3xl(^个未成熟DCs用实施例6所述的未经或经筛选的肿瘤细胞裂解抗原组合物(得自lxlO"中瘤细胞)在37。C、5。/。C02培养箱中负载17小时。抗原负载的DCs通过离心(10min，1000rpm)收获得到。所得DCs经生理盐水洗涤3次，后重悬到生理盐水中，至浓度为3xl(^成熟DC/mL,并添加终浓度为质量体积比5%的人血白蛋白，从而制备成肿瘤细胞裂解抗原组合物负载的DC疫苗。耐受性肺癌细月包抗原负载树突状细月包通过CD86-FITC、CD80-FITC、CD83-PE和CDllc-Percp染色，流式细胞仪检测负载后DC表型变化。从左到右，耐受性肺癌细胞抗原负载树突状细胞的比例为1:9、1:6和1:3，CDllc/CD83、CDllc/CD86和CDllc/CD80的双阳性率变化比较明显，如图5所示。效果实施例1:耐受性肿瘤细胞抗原负载DC疫苗体外杀瘤试验以含10%小牛血清的RPMI1640培养基，按上述抗原负载的成熟树突状细胞T细胞=1:20的比例混合上述抗原负载的成熟树突状细胞和T细胞，同时加入GM-CSF(终浓度为800U/mL)和IL-4(终浓度为20ng/mL),共培养7天，期间每隔1天均半量换液(含5%小牛血清、终浓度为800U/mL的18GM-CSF和终浓度为20ng/mL的IL-4的RPMI1640培养基)，得到CTL细胞。选择相应的肿瘤细胞作为輩巴细胞，用51Cr标记，即靶细胞(2xl06/mL)通过与300(iCi51Cr在RPMI1640培养基中3。C孵育2小时。标记好的耙细胞用lxPBS洗涤三次，并最终用RPMI1640(含10%小牛血清)重悬到2xl05的浓度。以每孔2xl(^个标记的靶细胞(0.1mL)添加到96孔板的孔中。将上述产生的CTL细胞(效应细胞)分别以2:1、4:1、10:1、20:1和50:1的效靶比加入对应的孔中，在3。C孵育4小时。孵育后，取上清75^L组分用Y放射计数器计数。特异的"Cr释放的百分比根据下述的公式进行计算。(检测的每分脉冲数)^(自发释放的每分脉冲数)0/0特异裂解率=-xiooo/o(最大释放的每分脉冲数H自发释放的每分脉冲数)其中，自发释放的每分脉冲数通过单独培养靶细胞(未加效应细胞)获得，最大释放的每分脉冲数是用终浓度2%NP-40(表面活性剂，上海生工)处理的单独培养靶细胞后获得的。检测的每分脉冲数通过添加效应细胞的耙细胞培养获得的。由表5所示经射线照射和化疗药物筛选后的制备例4、经总剂量为9Gy、剂量率为200cGy/min和距离为50cm的射线照射筛选的制备例5以及表4所示经化疗药物筛选后的制备例6所得抗原组合物负载树突状细胞，得到CTL细胞，由该CTL细胞产生的对相应肿瘤细胞的应答结果。随着效靶比不断提高，对肿瘤细胞产生的CTL应答也特异升高。并且由表5所示经射线照射和化疗药物筛选后的制备例4效果最佳。图6显示了由表5所示经射线照射和化疗药物筛选后的制备例5和未经筛选的制备例5所得两种抗原组合物分别负载树突状细胞，得到两种细胞毒性T淋巴细胞，由该两种CTL细胞分别对经射线照射和化疗药物筛选的以及未经射线照射和化疗药物筛选的肺癌细胞产生的应答结果对比图。其中，RLTC-DC1表示耐受性肺癌细胞抗原负载的树突状细胞对耐受性肺癌细胞的毒性活性，LTC-DC1表示未耐受性肺癌细胞抗原负栽的树突状细胞对耐受性肺癌细胞的毒性活性，RLTC-DC2表示耐受性肺癌细胞抗原负载的树突状细胞对未耐受性肺癌细胞的毒性活性，LTC-DC2表示未耐受性肺癌细胞抗原负载的树突状细胞对未耐受性肺癌细胞的毒性活性。如图6所示，耐受性肺癌细胞抗原负载的树突状细胞(RLTC-DC)对耐受性肺癌细胞和肺细胞的细胞毒性活性要分别高于肺癌细胞抗原负载的树突状细胞(LTC-DC)对耐受性肺癌细胞和乳腺细胞的细胞毒性活性。所述耐受性肺癌细胞按照实施例5表5制备。有关实施例1-3和5所得经筛选的肿瘤细胞的细胞毒性活性，远好于有关制备例l-6的未经筛选的胂瘤细胞的细胞毒性活性。此外有关热休克结合反复冻融裂解实施例1-3和5所得经筛选的肿瘤细胞的细胞毒性活性，远远好于有关单纯反复冻融裂解实施例1-3和5所得经筛选的肿瘤细胞的细胞毒性活性。效果实施例2:经筛选的肿瘤细胞在体内杀瘤实验中的作用以含5%小牛血清的RPMI1640为培养基，将3><106个的未成熟树突状细胞用上述实施例6所得的未经或经筛选的肺瘤细胞裂解抗原组合物(得自lxl0"中瘤细胞)在37。C、5。/oC02培养箱中负载4小时。抗原负载的成熟树突状细胞通过1000rpm离心10min得到。将所述抗原负载的成熟树突状细胞用生理盐水洗涤3次，然后重悬至lxl()S个/mL的浓度，4。C下保存备用。制备例5的肺癌细胞建立荷肺癌瘤鼠模型，随机分为A、B和C3组，每组IO只，A组为经耐受筛选的肺癌细胞抗原负载的树突状细胞治疗组，B组为未经耐受筛选的肺癌细胞抗原负载的树突状细胞为对比组(注射液制备方法与A组相同)，C组为同体积生理盐水空白组。A和B两组在第O天荷瘤鼠模型皮下输注0.5-2xl(^个/mL树突状细胞，各0.5mL，半个月后再同样剂量免疫l次。注射后分别于7、14、21、28、35d计算鼠;漠型荷瘤大小，C组于相同时间点在皮下注射0.5mL生理盐水并计算鼠模型荷瘤大小。耐受性肺癌细胞抗原负载的树突状细胞疫苗对荷瘤鼠模型的抑制生长情况(腿3，；s)见表9。表9组别肿瘤大小治疗后7d治疗后14d治疗后21d治疗后28d治疗后35d治疗组33.3±0.923.7±2.6*19.3±2.1*11.4±2.6#3.8±3.3#对比组31.9±1.827.2±1.5*22.5±1.2*19.2±2.2#10.5±2.6#空白组32.5±1.033.6±1.341.1±2.345.8±4.151.3±3.1注承空白组与树突状细胞治疗组相比P远小于0.01;#对比组与树突状细胞治疗组相比P〈0.01。此外，有关实施例l-3和5所得耐受性的肿瘤细胞的体内杀瘤活性，远远好于有关制备例l-6的未经筛选的肿瘤细胞的体内杀瘤活性。此外有关热休克结合反复冻融裂解实施例l-3和5所得经筛选的肺瘤细胞的体内杀瘤活性，远远好于有关单纯反复冻融裂解实施例1-3和5所得经筛选的肿瘤细胞的体内杀瘤活性。20权利要求1.一种耐受性肿瘤细胞抗原负载的树突状细胞的制备方法，该方法包括通过裂解耐受性肿瘤细胞得到肿瘤细胞抗原组合物，将树突状细胞负载耐受性肿瘤细胞抗原组合物得到抗癌的树突状细胞，其特征在于，所述肿瘤细胞通过以下方法制备，该方法包括对肿瘤细胞进行化疗药物和/或射线照射筛选的步骤，所述化疗药物筛选通过使肿瘤细胞与化疗药物接触完成，所述化疗药物选自由烷化剂化疗药物、亚硝脲化疗药物、抗代谢化疗药物、抗生素化疗药物、植物化疗药物、激素及内分泌药物化疗药物、抗体阻断剂化疗药物、植物化疗药物、抗体阻断剂化疗药物、羟基脲、卡铂、草酸铂、顺铂、丙亚胺门冬酰胺酶和氮烯咪胺所组成的组中。所述射线照射筛选通过将肿瘤细胞暴露于射线的照射源下完成，所述射线选自由α射线、β射线、X射线和γ射线所组成的组中，2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述射线为X射线和/或y射线。3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述化疗药物在肿瘤细胞培养基中的终浓度范围为0.5-100mg/mL，所述化疗药物与肿瘤细胞接触的时间为6h-72h。4.据权利要求3所述的方法，其中，所述化疗药物在肿瘤细胞培养基中的终浓度范围为0.5-50mg/mL,所述化疗药物与肿瘤细胞4妻触的时间为12h-36h。5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述抗代谢药化疗药物选自由氟尿脱氧核苷、环胞苷、甲氨喋呤、氟尿嘧啶、喃氟啶、优福啶、卡莫氟、脱氧氟尿苷、阿糖胞香和双氟胞苷所组成的组中；所述烷化剂化疗药物选自由环磷酰胺、氮甲、苯丙氨酸氮芥、氮芥、异环磷酰胺和苯丁酸氮芥所组成的组中；所述亚硝脲类化疗药物选自由卡氮齐、环已亚硝脲、甲环亚硝脲、嘧咬亚硝脲、白消安和雌二醇氮芥所组成的组中；所述植物化疗药物选自由鬼臼乙叉戒、鬼臼噻吩甙、羟基喜树碱、长春新碱、长春花碱、长春地辛、长春瑞宾、伊立替康、托泊替康、紫杉醇、泰素帝、三尖杉酯碱和羟基紫杉醇所组成的组中；所述抗体阻断剂化疗药物选自由表皮生长因子抑制剂吉非替尼、厄洛替尼、西妥>昔单抗和尼妥珠单抗所组成的组中，所述抗生素化疗药物选自由丝裂霉素、博来霉素、平阳霉素、阿霉素、吡喃阿霉素、去甲氧柔红霉素、表-阿毒素、放线菌素D和米托蒽醌所组成的组中；所述激素及内分泌药物化疗药物选自由托瑞米芬、雌激素受体拮抗剂、氨鲁米特、福美司坦、来曲唑地塞米;^、丙酸睾丸素、乙烯雌酚、氟硝丁酰胺、孕酮、甲地孕酮、他莫昔芬和促性腺激素释放激素拮抗剂所组成的组中。6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述化疗药物选自由紫杉醇、五氟尿嘧咬、阿霉素、4-羟-环磷酰胺和顺铂所组成的组中。7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述射线照射的照射源与肿瘤细胞的直线距离为5cm-3m,所述射线照射的总剂量为lGy-10Gy,所述射线照射的剂量率为0.5-2000cGy/min。8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述射线照射的照射源与肿瘤细胞的直线距离为10cm-lm，所述射线照射的总剂量为3Gy-9Gy，所述射线照射的剂量率为2-600cGy/min。9.根据权利要求1所述的方法，其中，该方法包括对肿瘤细胞进行化疗药物筛选的步骤，所述化疗药物在肿瘤细胞培养基中的终浓度范围为0.5-50mg/mL，所述化疗药物与肿瘤细月包接触的时间为12-36h。10.根据权利要求1所述的方法，其中，该方法包括对肿瘤细胞进行射线照射筛选的步骤，所述射线照射的照射源与肺瘤细胞的直线距离为10cm-lm,所述射线照射的总剂量为3Gy-9Gy，所述射线照射的剂量率为2-600cGy/min。11.根据权利要求1所述的方法，其中，该方法包括对肿瘤细胞进行化疗药物和射线照射筛选的步骤，所述化疗药物在肺瘤细胞培养基中的终浓度范围为0.5-50mg/mL,所述化疗药物与肺瘤细胞接触的时间为12-36h。所述射线照射的照射源与肿瘤细胞的直线距离为10cm-lm,所述射线照射的总剂量为3Gy-9Gy,所述射线照射的剂量率为2-600cGy/min。12.根据权利要求1所述的方法，其中，所述癌症选自由胃癌、肺癌、乳腺癌、胶质瘤、肝细胞癌、胰腺癌、脑癌、鼻咽癌、结肠癌、卵巢癌、黑素瘤、骨肉瘤、肾细胞癌、前列腺癌、转移瘤性癌、急性骨髓白血病和多发性骨髓瘤所组成的组中。13.根据权利要求1-12中任意一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括从离体癌症组织和/或肿瘤细胞系中分离肿瘤细胞。14.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述肿瘤细胞特异表达选自由表皮生长因子受体、P-糖蛋白、多药耐药相关蛋白、共济失调毛细血管扩张症突变基因编码的蛋白、共济失调毛细血管扩张症Rad3相关蛋白和低氧诱导因子所组成的组中的蛋白。15.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述裂解肿瘤细胞的步骤包括热休克和/或反复冻融；所述热休克裂解的条件包括在3745。C下保持lh-6h;所述反复冻融的次数为3-5次两次的间隔时间是10min-2h，所述冷冻的温度范围是零下120。C-零下196°C，所述融化的温度范围是10°C-37°C。16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述裂解肿瘤细胞的步骤包括热休克和反复冻融；所述热休克裂解的条件包括在37-45。C下保持lh-6h;所述反复冻融的次数为3-5次两次的间隔时间是10min-2h，所述冷冻的温度范围是零下120。C-零下196°C，所述融化的温度范围是20。C-37。C。17.权利要求l所述的方法，其特征在于，所述肿瘤细胞抗原组合物裂解自细月包浓度为lxl()5到lxl()8细胞/mL的肿瘤细月包。18.根据权利要求1所述的方法，其中，所述正常树突状细胞与制备肿瘤细胞抗原组合物的肿瘤细胞来自同一个体，或肿瘤细胞来自肿瘤细胞系培养获得的。19.根据权利要求1所述的方法，其中，所述正常树突状细胞与肺瘤细胞抗原组合物接触的时间是1-12h。20.由权利要求1-19中任意一项所述的方法得到的抗癌树突状细胞。21.—种树突状细胞疫苗，所述树突状细胞疫苗包括树突状细胞，其特征在于，所述树突状细胞为权利要求23所述的抗癌树突状细胞。22.根据权利要求22所述的疫苗，其中，所述疫苗包括lxl()S到5x107个/mL所述抗癌树突状细胞。23.根据权利要求21所述的疫苗，其特征在于，所述组合物还包括人血白蛋白；其中，以所述组合物为基准，所述人血白蛋白的含量为l-5重量体积%。24.权利要求20所述的抗癌树突状细胞在制备抗癌症药物中的应用。25.—种制备权利要求20所述的抗癌树突状细胞的疫苗，其特征在于，所述疫苗包括1)肿瘤细胞基础培养基；2)》丈射治疗同位素源和/或化疗药物；3)树突状细胞基础培养基；4)巨粒细胞-噬细胞集落刺激因子；5)白介素-4、干扰素a和肿瘤坏死因子a的至少一种；以及6)使用i兌明书；其中，所述放射治疗同位素源选自由oc射线、p射线、X射线和Y射线所组成的组中，所述化疗药物选自由烷化剂化疗药物、亚硝脲化疗药物、抗代谢化疗药物、抗生素化疗药物、植物化疗药物、激素及内分泌药物化疗药物、抗体阻断剂化疗药物、植物化疗药物、抗体阻断剂化疗药物、羟基脲、卡柏、草酸钼、顺钼、丙亚胺门冬酰胺酶和氮烯咪胺所组成的组中；所述使用说明书包括权利要求1-22中任意一项所述的方法。全文摘要本发明提供一种耐受性肿瘤细胞抗原负载的树突状细胞，该树突状细胞的制备方法，该树突状细胞在制备抗癌症药物中的应用，以及包括该耐受性肿瘤细胞抗原负载的树突状细胞的疫苗。本发明还包括耐受性肿瘤细胞的制备方法和应用。由本发明提供的耐受性肿瘤细胞抗原负载的树突状细胞以及包括该树突状细胞的免疫组合物制备的药物，能够在体内和体外杀死引起癌症复发的肿瘤细胞，从而为克服癌症耐受性、治疗癌症的复发和转移提供了可能。文档编号A61K39/00GK101670100SQ200910204848公开日2010年3月17日申请日期2009年10月15日优先权日2009年10月15日发明者张增明,飞徐申请人:济南迪博生物技术有限公司