专利名称：膀胱原位的尿路上皮肿瘤动物模型建立方法
技术领域：
本发明涉及医疗领域，特别涉及医疗领域中的尿路上皮肿瘤的动物建模技术。
背景技术：
为了更好地探索人类疾病的发病机制，寻找预防及治疗方法，实验动物医学已愈 来愈受到人们的关注。由于实验动物有许多自发或诱发性疾病，能局部或全部地反映人类 类似疾病过程与特点，因此可用于研究相关的人类疾病。如突变系SHR大鼠，其自发性高血 压的变化与人类相似，并伴有高血压性心血管病变，如脑血栓、梗死等症状。猫是弓形虫的 宿主，是弓形虫研究中是一个很好的材料。同时，在研究白化病、关节炎、骨质疏松症等方 面，也较为理想。非人灵长类实验动物，可感染其他动物不可复制的人类传染病，如脊髓灰 质炎、脑炎、肝炎、麻疹、痢疾、疟疾等。因此，可作为研究这些疾病发生、发展过程及疫苗研 制的理想动物。目前，为了能更好地实现对人体膀胱肿瘤的研究，需要在实验动物上模拟人患膀 胱肿瘤的模型。而将人肿瘤细胞接种于动物皮下或腹腔的造模方法不能模拟肿瘤在原位器 官中的生长状态。其他的在活体膀胱原位制作浸润性膀胱肿瘤的方法主要有以下2种1.采用手术为裸小鼠接种人膀胱尿路上皮肿瘤细胞该方法为手术切开膀胱，再 将肿瘤细胞接种至膀胱。2.采用经尿道为裸小鼠接种人膀胱尿路上皮肿瘤细胞该方法为经尿道穿刺膀 胱壁，接种肿瘤细胞。然而，本发明的发明人发现，采用第一种方法不但操作复杂，会招致动物伤口感 染，而且裸小鼠费用昂贵；而第二种方法并非直视下接种，因小鼠膀胱小而薄，极易穿破膀 胱，操作难度大，失败率极高，而且同样存在裸小鼠费用昂贵的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种膀胱原位的尿路上皮肿瘤动物模型建立方法，使得尿 路上皮肿瘤能自发性地生长在实验动物的原位器官上，从而得到模拟人患膀胱肿瘤的理想 模型。为解决上述技术问题，本发明的实施方式提供了一种膀胱原位的尿路上皮肿瘤动 物模型建立方法，包含以下步骤对实验动物的膀胱灌注化学致癌剂N-甲基亚硝基脲；通过控制N-甲基亚硝基脲的膀胱灌注量和实验动物的生长时间获得在膀胱原位 的不同分期的尿路上皮肿瘤。本发明实施方式与现有技术相比，主要区别及其效果在于用化学致癌剂N-甲基亚硝基脲灌注实验动物的膀胱进而诱发膀胱自发性生长的 尿路上皮肿瘤，通过控制N-甲基亚硝基脲的膀胱灌注量和实验动物的生长时间可获得在 膀胱原位的不同分期的尿路上皮肿瘤。由于肿瘤是自发性生长于膀胱，区别于腹腔或皮下移植的肿瘤，因而更接近人患膀胱肿瘤时器官的病理生理状态，最接近人的患病状态，是模 拟人患膀胱肿瘤的理想模型。适合对在体器官肿瘤的研究，例如(1)可以观察药物、区域 热疗等方法治疗后肿瘤及机体的病理改变、病理生理改变。(2)适合针对肿瘤在盆腔局部浸 润以及远处转移情况的研究。进一步地，通过给予插尿管，灌注致癌剂，即可诱发膀胱自发性生长的尿路上皮肿 瘤，不但操作简单，而且成功率高。进一步地，实验动物为雌性大鼠。由于鼠的基因组和人类在相当程度上同源系，因 此是最好的实验动物之一。而选用雌性大鼠不但成本低，可以保证研究所需动物数量，从而 获得比较多的动物模型数量，而且更便于尿道插管，避免了雄性大鼠因有阴茎骨阻碍导致 尿道插管困难，损伤尿道而导致尿道出血、感染、狭窄。进一步地，为每只所述雌性大鼠灌注aiig的所述N-甲基亚硝基脲，隔周灌注一次， 灌注4次，之后继续饲养1周，在第8周即可获得浅表性尿路上皮肿瘤。经实验证明，通过 该方法获得浅表性尿路上皮肿瘤的成功率为100%。进一步地，为每只所述雌性大鼠灌注aiig的所述N-甲基亚硝基脲，隔周灌注一次， 灌注6次，之后继续饲养4周，在第16周即可获得浸润性尿路上皮肿瘤。经实验证明，通过 该方法获得浸润性尿路上皮肿瘤的成功率为100%。
图1是根据本发明第一实施方式的膀胱原位的尿路上皮肿瘤动物模型建立方法 流程图。
具体实施例方式在以下的叙述中，为了使读者更好地理解本申请而提出了许多技术细节。但是，本 领域的普通技术人员可以理解，即使没有这些技术细节和基于以下各实施方式的种种变化 和修改，也可以实现本申请各权利要求所要求保护的技术方案。为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的实施 方式作进一步地详细描述。本发明第一实施方式涉及一种膀胱原位的尿路上皮肿瘤动物模型建立方法，具体 流程如图1所示。在步骤110中，选择实验动物。在本实施方式中，选择6周龄的雌性大鼠(如近交 系F344大鼠、Wistar大鼠、SD大鼠均可)，体重(150±8)g。接着，在步骤120中，配制化学致癌剂N-甲基亚硝基脲的溶液。具体地说，将-20 V 冷冻保存的N-甲基亚硝基脲(N-methyl-nitroso-urea，简称“MNU”)置于4°C放置12小 时，使用时将M NU溶解于50mM枸橼酸缓冲液(PH 6.0)配成浓度为(10mg/ml)的MNU 溶液。接着，在步骤130中，对雌性大鼠的膀胱灌注化学致癌剂N-甲基亚硝基脲。通过 控制N-甲基亚硝基脲的膀胱灌注量和实验动物的生长时间获得在膀胱原位的不同分期的 尿路上皮肿瘤。在本实施方式中，以获得的尿路上皮肿瘤为浸润性尿路上皮肿瘤为例进行 具体说明。
首先，进行1.2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(30mg/kg)。然后，仰卧位固定四肢， 尿道口周围以络合碘消毒，选用硬膜外麻醉用导管IOcm长，石蜡油润滑后以钝头插入尿道 3cm进入膀胱，用Iml皮试注射器抽出膀胱内尿液，大鼠膀胱容量约为0. :3ml，导尿后给予每 只大鼠膀胱灌注MNU 0. 2ml (即每只大鼠每次灌注^iigMNU)，隔周灌注一次，灌注6次 (即每只大鼠一共灌注iangM NU)之后继续饲养4周，即第16周即可得到浸润性尿路上皮 肿瘤，不但操作简单，而且经实验证明，采用该方法获得的在原位器官(即膀胱)发生的浸 润性尿路上皮肿瘤的成功率为100%。在本实施方式中，由于肿瘤是自发性生长于膀胱，区别于腹腔或皮下移植的肿瘤， 因而更接近人患膀胱肿瘤时器官的病理生理状态，最接近人的患病状态，是模拟人患膀胱 肿瘤的理想模型。适合对在体器官肿瘤的研究，例如(1)可以观察药物、区域热疗等方法 治疗后肿瘤及机体的病理改变、病理生理改变。(2)适合针对肿瘤在盆腔局部浸润以及远处 转移情况的研究。而且，由于本实施方式中采用雌性大鼠作为实验动物，不但成本低，可以保证研究 所需动物数量，从而获得比较多的动物模型数量，而且更便于尿道插管，避免了雄性大鼠因 有阴茎骨阻碍导致尿道插管困难，损伤尿道而导致尿道出血、感染、狭窄。此外，可以理解，也可以选用其他类型的雌性大鼠，甚至也可以其他类型的实验 鼠，如雄性大鼠、裸小鼠等等。虽然在成本或操作简易度上不如选用雌性大鼠，但也可以基 本达到实验目的。另外，本实施方式中灌注的化学致癌剂N-甲基亚硝基脲为浓度为的N-甲基 亚硝基脲溶液。但在实际应用中，也可以通过其他方法配置N-甲基亚硝基脲溶液，所配置 的N-甲基亚硝基脲溶液也可以是0.8%、1. 2%等其他浓度，只需适当调整灌注的溶液量， 保证每只大鼠每次灌注^IigMNU即可。本发明第二实施方式涉及一种膀胱原位的尿路上皮肿瘤动物模型建立方法。第二 实施方式与第一实施方式基本相同，区别主要在于在第一实施方式中，通过控制N-甲基亚硝基脲的膀胱灌注量和实验动物的生长 时间的方式，获得的是浸润性尿路上皮肿瘤。然而在本第二实施方式中，通过控制N-甲基 亚硝基脲的膀胱灌注量和实验动物的生长时间的方式，获得的是浅表性尿路上皮肿瘤。具体地说，采用与第一实施方式中类似的方法，为每只雌性大鼠灌注2mg浓度为 的N-甲基亚硝基脲的溶液，隔周灌注一次。与第一实施方式不同的是，在第一实施方式中灌注6次，而在本实施方式中只需灌注4次(即每只大鼠一共灌注8mgM NU)，之后继续饲 养1周，在第8周即可获得浅表性尿路上皮肿瘤。经实验证明，通过该方法获得浅表性尿路 上皮肿瘤的成功率为100%。由此可见，本实施方式不但操作简单，而且通过控制MNU膀胱灌注量及动物的生 长时间，获得在原位器官(即膀胱)发生的浅表性尿路上皮肿瘤的成功率也极高。虽然通过参照本发明的某些优选实施方式，已经对本发明进行了图示和描述，但 本领域的普通技术人员应该明白，可以在形式上和细节上对其作各种改变，而不偏离本发 明的精神和范围。
权利要求
1.一种膀胱原位的尿路上皮肿瘤动物模型建立方法，其特征在于，包含以下步骤对实验动物的膀胱灌注化学致癌剂N-甲基亚硝基脲；通过控制所述N-甲基亚硝基脲的膀胱灌注量和所述实验动物的生长时间获得在膀胱 原位的不同分期的尿路上皮肿瘤。
2.根据权利要求1所述的膀胱原位的尿路上皮肿瘤动物模型建立方法，其特征在于， 所述不同分期的尿路上皮肿瘤为浅表性尿路上皮肿瘤和浸润性尿路上皮肿瘤。
3.根据权利要求1所述的膀胱原位的尿路上皮肿瘤动物模型建立方法，其特征在于， 所述实验动物为雌性大鼠。
4.根据权利要求3所述的膀胱原位的尿路上皮肿瘤动物模型建立方法，其特征在于， 通过以下控制所述N-甲基亚硝基脲的膀胱灌注量和所述实验动物的生长时间的方式，获 得浅表性尿路上皮肿瘤为每只所述雌性大鼠灌注ang的所述N-甲基亚硝基脲，隔周灌注一次，灌注4次，之后 继续饲养1周，在第8周即可获得浅表性尿路上皮肿瘤。
5.根据权利要求3所述的膀胱原位的尿路上皮肿瘤动物模型建立方法，其特征在于， 通过以下控制所述N-甲基亚硝基脲的膀胱灌注量和所述实验动物的生长时间的方式，获 得浸润性尿路上皮肿瘤为每只所述雌性大鼠灌注ang的所述N-甲基亚硝基脲，隔周灌注一次，灌注6次，之后 继续饲养4周，在第16周即可获得浸润性尿路上皮肿瘤。
6.根据权利要求3所述的膀胱原位的尿路上皮肿瘤动物模型建立方法，其特征在于， 所述雌性大鼠为近交系F344大鼠、Wistar大鼠或SD大鼠。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的膀胱原位的尿路上皮肿瘤动物模型建立方法， 其特征在于，在对实验动物的膀胱灌注化学致癌剂N-甲基亚硝基脲之前，还包含以下步 骤将-20°C冷冻保存的N-甲基亚硝基脲置于4°C放置12小时，使用时将N-甲基亚硝基 脲溶解于50mM枸橼酸缓冲液，配成浓度为1 %的N-甲基亚硝基脲溶液，其中所述枸橼酸缓 冲液的氢离子浓度指数PH值为6. 0 ；所述灌注的化学致癌剂N-甲基亚硝基脲为所述浓度为的N-甲基亚硝基脲溶液。
8.根据权利要求1至6中任一项所述的膀胱原位的尿路上皮肿瘤动物模型建立方法， 其特征在于，在所述对实验动物的膀胱灌注化学致癌剂N-甲基亚硝基脲的步骤中，包含以 下子步骤对所述实验动物插尿管，通过所插的尿管灌注所述N-甲基亚硝基脲。
全文摘要
本发明涉及医疗领域，公开了一种膀胱原位的尿路上皮肿瘤动物模型建立方法。本发明中，用化学致癌剂N-甲基亚硝基脲灌注实验动物的膀胱进而诱发膀胱自发性生长的尿路上皮肿瘤，通过控制N-甲基亚硝基脲的膀胱灌注量和实验动物的生长时间可获得在膀胱原位的不同分期的尿路上皮肿瘤。由于肿瘤是自发性生长于膀胱，区别于腹腔或皮下移植的肿瘤，因而更接近人患膀胱肿瘤时器官的病理生理状态，最接近人的患病状态，是模拟人患膀胱肿瘤的理想模型。
文档编号A61K49/00GK102038961SQ200910201608
公开日2011年5月4日 申请日期2009年10月12日 优先权日2009年10月12日
发明者刘红耀, 张旭, 米振国 申请人:刘红耀, 张旭, 米振国