专利名称：：条斑紫菜藻胆蛋白肉瘤抑制活性测定方法
技术领域：
：本发明涉及生物活性测定方法,特别是涉及条斑紫菜藻胆蛋白肉瘤抑制活性的测定方法。
背景技术：
：光动力疗法是近20年来建立和发展起来的一种新型肿瘤疗法。其原理主要通过光敏剂富集于病灶处，并在光照下产生光敏损伤来实现对肿瘤细胞的杀伤作用。光动力治疗在很大程度上取决于采用的光敏剂的性质。传统光敏剂具有严重的皮肤光毒性等缺点，开发新型光敏剂成为研究热点。藻胆蛋白是很好的纯天然色素，可用于食物、化妆品、荧光检测等领域，近年来，根据其吸收光谱的特征和产生自由基特点，藻红蛋白、藻蓝蛋白均可作为光敏剂。国内首先有蔡心涵、何立明等报道100ug/mL螺旋藻藻蓝蛋白经铜泵激光器辐照12J/cm2,使人大肠癌细胞服8348存活率仅为22.2%。之后又有李冠武、王广策等报道用提取自多管藻的藻红蛋白处理人口腔8113细胞和小鼠S180细胞，再经488nm氩离子激光器辐照25J/cm2，发现细胞存活率分别为25%和24%。藻胆蛋白以其高效、无毒、副作用小等优点，被认为是光动力学治疗法中一种非常有前景的光敏剂。相比螺旋藻、多管藻，条斑紫菜在我国已大量人工栽培，具有量上的优势，其本身作为高等红藻也富含藻胆蛋白。建立条斑紫菜藻胆蛋白抑瘤活性的测定模型，有利于为新型抑瘤光敏剂的开发应用提供技术方案。
发明内容本发明的目的是提供一种条斑紫菜藻胆蛋白肉瘤抑制活性的测定方法以条斑紫菜为原料，通过对小鼠B-16肉瘤的抑制作用研究，测定紫菜藻胆蛋白的抑瘤活性；为紫菜藻胆蛋白在抑瘤方面的应用，提供研究模型；为藻胆蛋白在抑瘤领域提供更为丰富廉价且有效的原料；为新型光敏剂开发应用提供技术方案。本方法以INNOVR400氩离子激光器为光源时，对肉瘤杀伤率更高。3本发明的目的是这样实现的一种条斑紫菜藻胆蛋白肉瘤抑制活性测定方法，包括如下步骤(1)培养小鼠B-16黑色素瘤细胞；(2)待细胞生长旺盛时，用胰酶消化细胞，洗涤吹散细胞于离心管中冰浴，在小鼠左前肢肋下皮下接种；(3)饲养7-IO天后，挑选移植瘤直径长至0.5-0.7cm的小鼠实验；(4)将小鼠于瘤边缘0.5cm处皮下注射高纯度蛋白溶液，4h后给予激光辐照，辐照后的小鼠避光饲养，连续观察10天并记录瘤重；(5)计算抑瘤率，测定抑瘤活性。所述的细胞培养液为10%小牛血清的1640培养液；所述的细胞培养条件为37°C、5%0)2浓度及饱和湿度；所述的激光辐照能量为100-200J/cm2。由于本发明以条斑紫菜藻胆蛋白和小鼠B-16黑色素瘤细胞为材料，通过激光辐照杀伤肿瘤细胞，因此，具有以下优点1、藻胆蛋白来源丰富，我国是紫菜生产大国，年产量20亿张左右，目前市场上大多是自然晾干的紫菜，销售价格在每千克20-30元，而每吨词料级螺旋藻干粉6-8万元人民币(60-80元/千克)，曾一度高达每kg30美元(约240元/千克)，是紫菜的十倍，因此本发明所用原料来源广泛，无需加工，成本相对于螺旋藻便宜的多；2、藻胆蛋白提取方便，根据之前制备流程(发明专利申请号2004100990370)，目前从条斑紫菜提取高纯度藻胆蛋白工艺简单，成本低廉，得率较高；3、黑色素瘤细胞一般见于皮肤表层，便于光动力治疗；4、黑色素瘤发病率逐年增髙，光动力治疗肿瘤副作用小，该方法一旦应用于临床，市场前景广阔；5、从结果看，条斑紫菜藻红蛋白和藻蓝蛋白均对癌细胞有较高杀伤率，是一种有效的光敏剂。图l:R-PE对小鼠B16黑色素实体瘤生长的抑制作用。图2:C-PC对小鼠B16黑色素实体瘤生长的抑制作用。具体实施例方式以下将结合实施例，对条斑紫菜藻胆蛋白肉瘤抑制活性测定方法，作进一步详细的描述。条斑紫菜(采自江苏吕泗条斑紫菜栽培海区)；小鼠(昆明鼠，购自复旦大学动物房)；小鼠B-16肉瘤细胞(购自中科院细胞库)；其它试剂均为以化学分析纯按常规配制。实施例一本实施例中所用的材料为条斑紫菜藻红蛋白(R-PE，紫菜藻红蛋白)和小鼠B-16肉瘤，具体步骤如下(1)、小鼠B-16黑色素瘤细胞用含10%小牛血清的1640培养液培养，培养条件为37'C，5%0)2浓度及饱和湿度。待细胞生长旺盛时，用含EDTA的胰酶消化细胞，洗涤吹散细胞于事先冷冻的2mL离心管中冰浴，以备小鼠体内接种；(2)、小鼠随机分组后于左前肢肋下皮下接种，每只接种0.2mL，约l(f个细胞，常规方法饲养，每两天观察肿瘤大小变化，7-10d后，挑选移植瘤直径长至0.5-0.7cm的小鼠实验；(3)、荷瘤小鼠于瘤边缘0.5cm处皮下注射0.5mL纯度为5.5(A鹏加/A280nra)的藻红蛋白溶液，浓度梯度分别取0.5、1、2mg/mL;(4)、4h后，使用I,OVR400氩离子激光器(美国Coherent公司仪器)，各组给予200J/cm2的激光照射，辐照后的小鼠避光饲养；(5)、以荷瘤对照组、5-氟尿嘧啶阳性给药组、激光单独辐照组、R-PE浓度(2mg/mL)单独治疗组作对照，并设空白组；(6)、长有肿瘤各组小鼠每两天测量记录下其肿瘤的长径a与横径b，瘤重按体积二aXb2(cm)/2折算。连续观察记录10d，观察结束后，解剖小鼠取出瘤体，称瘤体重量，计算抑瘤率；(7)、结果见图1，显示lmg/mL浓度藻红蛋白对小鼠B-16黑色素瘤的抑制率最大，为64%。图中曲线标注与相应处理条件的关系如下:<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>实施例二本实施例中所用的材料为条斑紫菜藻蓝蛋白(C-PC，紫菜藻蓝蛋白)和小鼠B-16肉瘤，具体步骤如下(1)、同实施例l;(2)、同实施例l;(3)、荷瘤小鼠于瘤边缘0.5cm处皮下注射0.5mL纯度为4.0(A615B/A肌》的藻蓝蛋白溶液，浓度梯度分别取0.5、1、2mg/mL;(4)、4h后，使用He-Ne激光器(QHP型，上海玻璃仪器一厂)，各组给予100J/cm2的He-Ne激光辐照，辐照后的小鼠避光伺养；(5)、以荷瘤对照组、5-氟尿嘧啶阳性给药组、激光单独辐照组、C-PC浓度(2mg/mL)单独治疗组作对照，并设空白组；(6)、长有肿瘤各组小鼠每两天测量记录下其肿瘤的长径a与横径b，瘤重按体积二aXb2(cm)/2折算。连续观察记录10d，观察结束后，解剖小鼠取出瘤体，称瘤体重量，计算抑瘤率；(7)、结果见图2，显示2mg/mL浓度藻蓝蛋白对小鼠B-16黑色素瘤的抑制率最大，为55%。图中曲线标注与相应处理条件的关系如下:<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>权利要求1、条斑紫菜藻胆蛋白肉瘤抑制活性测定方法，其特征在于包括如下步骤(1)培养小鼠B-16黑色素瘤细胞；(2)待细胞生长旺盛时，用胰酶消化细胞，洗涤吹散细胞于离心管中冰浴，在小鼠左前肢肋下皮下接种；(3)饲养7-10天后，挑选移植瘤直径长至0.5-0.7cm的小鼠实验；(4)将小鼠于瘤边缘0.5cm处皮下注射高纯度蛋白溶液，4h后给予激光辐照，辐照后的小鼠避光饲养，连续观察10天并记录瘤重；(5)计算抑瘤率，测定抑瘤活性。2、如权利要求1所述的测定方法，其特征在于所述的细胞培养液为10%小牛血清的1640培养液。3、如权利要求1所述的测定方法，其特征在于所述的细胞培养条件为37r:、5^C(V浓度及饱和湿度。4、如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述的激光辐照能量为100-200J/cm2。全文摘要本发明提供一种条斑紫菜藻胆蛋白肉瘤抑制活性的测定方法以条斑紫菜为原料，采用INNOVR400氩离子激光器为光源，通过对小鼠B-16肉瘤的抑制作用研究，测定紫菜藻胆蛋白的抑瘤活性。为紫菜藻胆蛋白在抑制肉瘤方面的应用，提供研究模型；为肿瘤治疗提供更为丰富廉价且有效的原料。文档编号A61K49/00GK101642578SQ20091019450公开日2010年2月10日申请日期2009年8月25日优先权日2009年8月25日发明者何培民,李春霞,卿汪,源王,蔡春尔申请人:上海海洋大学