专利名称：去除疫苗制品中杂蛋白及宿主dna的方法
技术领域：
本发明涉及在疫苗制品中去除杂蛋白及宿主DNA的方法。
背景技术：
目前狂犬病疫苗的提取普 遍采用简单的分子筛凝胶层析提取，使用这种工艺提 取得到的狂犬病疫苗，存在以下缺陷1、病毒疫苗在提取后仍含有过高的宿主蛋白，去除杂蛋白率不高，导致疫苗在 临床使用后有较大的副作用。2、病毒疫苗提取后宿主DNA含量过高。3、影响了病毒疫苗产品的产品质量，制约了疫苗产品的生产。为此许多人在纯化层析过程中，对层析柱连接方式进行尝试，对平衡盐pH值进 行调节，改变层析用凝胶等方法，采用不同的纯化方式，仅在结果上取得了轻微变化， 没能取得实质上的变化。狂犬病病毒疫苗是将狂犬病毒接种于适合的动物细胞上，经过动物细胞发生免 疫反应后产生抗体，释放到培养液中，再经浓缩纯化后提取得到狂犬病病毒疫苗原液。 在此过程中，会产生游离的宿主DNA及与抗原蛋白结合的宿主DNA，原液中还含有大量 的宿主蛋白，浓缩纯化工艺会将游离的DNA除去，但与抗原蛋白结合的DNA及宿主蛋 白仍有很大一部分残留在纯化原液中，这部分DNA会随着疫苗一起被注入到人体内。由 于异源物质的注入，会在人体引起不良反应。
发明内容
为实现对疫苗的处理要尽可能不损失抗原，即不影响疫苗制品的药效，有效的 去除杂蛋白及残留宿主DNA的目标，本发明的目的在于提供一种用超声波振荡处理疫苗 中间产品-浓缩液和纯化液，去除疫苗制品中杂蛋白及宿主DNA的方法，获得杂蛋白及 宿主DNA低含量的狂犬病病毒疫苗。本发明有以下两个技术方案方案一以疫苗浓缩液为原料1、使用超声波细胞粉碎机超声处理疫苗浓缩液；2、经过分子筛层析对上述浓缩液进行第一次提纯，得到本发明所称的第一次纯 化液，观察杂蛋白、宿主DNA的去除情况。方案一的工艺流程是疫苗浓缩液一超声处理一提纯一本发明所称的第一次纯化 液。方案二 以常规的疫苗纯化液为原料1、使用超声波细胞粉碎机超声处理常规的疫苗纯化液；2、经过分子筛层析对上述常规的疫苗纯化液再次提纯，得到本发明所称的纯化 液，观察杂蛋白、宿主DNA的去除情况。
方案二的工艺流程是常规的疫苗纯化液一超声处理一提纯一本发明所称的纯化 液。 利用超声波细胞粉碎机对狂犬病疫苗进行超声处理，可以将杂蛋白、宿主DNA 与狂犬病病毒抗原的结合打破、或者将宿主DNA粉碎，经过分子筛层析纯化后，分离 得到纯化的狂犬病疫苗，由于超声波的波长远大于狂犬病病毒抗原，所以超声波不会对 狂犬病病毒抗原产生强力的破坏，经过合理的设置超声程序，得到最佳的超声波处理功 率、工作时间、间隙时间、总工作时间等工作参数，可应用于对狂犬病疫苗的处理。与现有技术相比，本发明的创新之处在于，在不向疫苗制品中添加任何物理、 化学、生物等物质，保证疫苗抗原原始结构的前提下，有效去除杂蛋白、宿主DNA的含 量，突破疫苗制品的质量瓶颈，提高产品质量。
下面结合实施例及图谱详尽说明本发明。附图1 超声后狂犬病疫苗浓缩、本发明所称的第一次纯化液及对照浓缩液分 子筛层析纯化图谱，图中曲线1是未超声的狂犬病疫苗浓缩液分子筛层析纯化图谱，曲 线2是超声后的狂犬病疫苗浓缩液分子筛层析纯化图谱，曲线3是超声后的本发明所称的 第一次纯化液分子筛层析纯化图谱。附图2:超声后狂犬病疫苗纯化液及对照纯化液分子筛层析纯化图谱，图中曲 线4是未超声的狂犬病疫苗纯化液分子筛层析纯化图谱，曲线5是超声后的狂犬病疫苗纯 化液分子筛层析纯化图谱。附图3:狂犬病疫苗浓缩、本发明所称的第一、二次纯化液DNA检测图谱。附图4 :狂犬病疫苗纯化液及本发明所称的纯化液DNA检测图谱。附图5 DNA琼脂糖凝胶电泳图谱1，图中Marker是DNA marker DL2000，1是
纯化液样品(未超声)，2是纯化液样品(超声)，3是浓缩液样品(未超声)，4是浓缩 液样品(超声)。附图6 DNA琼脂糖凝胶电泳图谱2，图中Marker是DNA marker DL2000，5是
纯化液样品(未超声)，6是纯化液样品(超声)，7是纯化液样品(超声)。
具体实施例方式以下实施例详细说明了本发明，但不用于限制本发明的范围。本实施例采用常 规实验技术，这些均是本技术领域人员所熟悉的，可以按照本实施例使用材料厂商所提 供的说明书即可进行。实施例一针对方案一的实施例步骤1，使用Φ6变幅杆的ScientZ-IID型超声波细胞粉碎机对狂犬病疫苗浓缩液 进行超声处理，检测病毒抗原损失情况。准备常规工艺生产的狂犬病疫苗浓缩液，在冰浴保护下进行超声，保证浓缩液 温度不超过26°C，每次超声处理液量为20ml，通过改变超声波细胞粉碎机的功率、工作 时间、间隙时间、总工作时间的设置，设计一系列超声程序，通过《中华人民共和国药 典》2005版三部附录中要求的ELISA法检测抗原含量，未超声处理的狂犬病疫苗浓缩液为对照，计算抗原损失率，获得超声处理的最佳程序。超声程序及抗原检测结果见表1。表1 对狂犬病疫苗浓缩液超声程序及抗原检测结果
权利要求
1.一种去除疫苗制品中杂蛋白及宿主DNA的方法，其特征是(1)、使用超声波细胞粉碎机超声处理疫苗浓缩液；(2),经过分子筛层析对上述浓缩液进行第一次提纯，得到本发明所称的第一次纯化 液，观察杂蛋白、宿主DNA的去除情况。
2.按照权利要求1所述的去除疫苗制品中杂蛋白及宿主DNA的方法，其特征是(3)、对步骤( 得到本发明所称的第一次纯化液，重复步骤(1)和( 后，得到本 发明所称的第二次纯化液。
3.按照权利要求2所述的去除疫苗制品中杂蛋白及宿主DNA的方法，其特征是(4),利用超声波细胞粉碎机处理狂犬病疫苗中提取的DNA样品，经过琼脂糖凝胶 电泳后对DNA的粉碎情况进行分析。
4.按照权利要求1-3任一项所述的去除疫苗制品中杂蛋白及宿主DNA的方法，其特 征是在步骤(1)之前，利用超声波细胞粉碎机对疫苗浓缩液进行超声处理，检测病毒 抗原损失情况，超声处理在冰浴保护下进行。
5.按照权利要求1-3任一项所述的去除疫苗制品中杂蛋白及宿主DNA的方法，其特 征是超声波细胞粉碎机的功率为700W，超声处理为5秒，间隙10秒，总工作时间8分 钟。
6.一种去除疫苗制品中杂蛋白及宿主DNA的方法，其特征是(1)、使用超声波细胞粉碎机超声处理常规的疫苗纯化液；(2),经过分子筛层析对上述常规的疫苗纯化液再次提纯，得到本发明所称的纯化 液，观察杂蛋白、宿主DNA的去除情况。
7.按照权利要求6所述的去除疫苗制品中杂蛋白及宿主DNA的方法，其特征是在 步骤(1)之前，利用超声波细胞粉碎机对疫苗浓缩液进行超声处理，检测病毒抗原损失 情况，超声处理在冰浴保护下进行。
8.按照权利要求6或7所述的去除疫苗制品中杂蛋白及宿主DNA的方法，其特征是(3)、利用超声波细胞粉碎机处理狂犬病疫苗中提取的DNA样品，经过琼脂糖凝胶 电泳后对DNA的粉碎情况进行分析。
9.按照权利要求6或7所述的去除疫苗制品中杂蛋白及宿主DNA的方法，其特征 是超声波细胞粉碎机的功率为700W，超声处理为10秒，间隙10秒，总工作时间8分钟。
全文摘要
本发明提供了一种去除疫苗制品中杂蛋白及宿主DNA的方法，所要解决的问题是浓缩、纯化等提取狂犬病疫苗方法只能将游离DNA去除，不能去除与抗原蛋白结合的宿主DNA；临床不良反应现象屡见不鲜。本发明的要点是使用超声波对狂犬病疫苗进行超声处理，将宿主DNA与抗原蛋白的结合、宿主蛋白与抗原蛋白的结合破坏，通过层析纯化去除杂蛋白及宿主DNA。本发明的积极效果是在保证疫苗效价的前提下，提高疫苗产品质量，去除大量杂蛋白及宿主DNA，解决了目前狂犬病疫苗行业面临的质量问题。
文档编号A61P31/14GK102018958SQ20091018732
公开日2011年4月20日 申请日期2009年9月11日 优先权日2009年9月11日
发明者张译, 汪春义, 王凯, 程晓耕, 苏文全 申请人:辽宁依生生物制药有限公司