专利名称：人体氧化应激无创荧光检测装置与方法
技术领域：
本发明涉及一种人体无创检测方法及装置，特别涉及一种使用组织荧光检测人体
氧化应激状态的方法及装置。
背景技术：
氧化应激是指机体内高活性分子如活性氧簇(R0S)和活性氮簇(RNS)产生过多或消除减少，从而导致组织损伤。在正常状态下机体可产生少量ROS参与正常代谢，同时体内存在清除自由基，抑制自由基反应的体系，使得过多的自由基被清除或使自由基减少，自由基的产生和清除保持平衡；但在某些病理状态下，这一机制遭到破坏，体内自由基显著增加，过多的自由基可直接作用于机体，致机体损伤，同时，机体抗氧化防御能力下降，氧化能力显著超过抗氧化能力而发生氧化应激，机体内氧化应激的产生就是源于自由基产生增多和(或)抗氧化防御功能损害。 氧化应激被认为是造成糖尿病及其慢性并发症、肺纤维化、癫痫、高血压、感冒、动
脉粥样硬化和相应的心血管疾病、癌症、肾病变和帕金森病等疾病的重要原因。 糖尿病是以胰岛素分泌缺陷和(或)胰岛素抵抗导致的一组以慢性高血糖为特征
的代谢性疾病。越来越多的研究表明，氧化应激和糖尿病及其并发症的发生、发展关系密
切。 一方面，糖尿病患者因葡萄糖和糖基化蛋白质自动氧化可产生大量的自由基，大量自由
基若不及时清除则可积聚在组织，使组织产生氧化应激或者氧化应激增强。在人体内、体外
及动物实验中，均发现糖尿病导致氧化应激增强的证据。另一方面，氧化应激增强会对糖尿
病产生影响氧化应激增强可通过损伤胰岛P细胞和降低外周组织对胰岛素的敏感性，导
致糖尿病的发生；ROS可以直接损伤胰岛|3细胞，还可以通过影响胰岛素合成和分泌的信
号传导通路间接损伤胰岛P细胞；R0S可作为类似于第2信使的信号分子激活许多氧化还
原敏感性信号通路，这些通路包括NF-kB、 P38丝裂原活化蛋白激酶、JNK、己糖胺等，进而引
起胰岛素信号传导通路中的胰岛素受体和胰岛素受体底物蛋白磷酸化，造成胰岛素信号传
导通路下游信号分子的相关性和/或活性降低，减少了胰岛素的效应，导致胰岛素抵抗；氧
化应激还可通过减弱3T3-L1脂肪细胞葡萄糖转运蛋白4的表达和转运，导致胰岛素抵抗。
另外，研究证实，氧化应激增强是糖尿病慢性并发症的主要发病机理之一。 糖尿病患者体内含有大量的晚期糖基化终末产物(Advanced glycation
endproducts, AGE) 。 AGE是在非酶条件下，蛋白质、氨基酸、脂类或核酸等大分子物质的游
离氨基与还原糖的醛基经过縮合、重排、裂解、氧化修饰后产生的一组稳定的终末产物。AGE
与其受体相互作用后，产生大量的活性氧，破坏体内氧化剂和抗氧化剂的平衡，从而产生氧
化应激。因此，人体氧化应激与体内的晚期糖基化终末产物密切相关。 尽管高氧化应激水平对机体的损伤是快速的，但是造成机体的临床疾病表现还需
要一定的时间，也就是说存在一个"潜伏期"。因此，可采用某种方法，对人体氧化应激反应
指标进行测量，了解人体的氧化应激水平，从而预防因氧化应激所致的疾病，并对已有疾病
进行辅助治疗提供可靠的依据。
目前检测人体氧化应激标志物的高效液相色谱法，首先要对测试对象进行样本采集，例如抽血，然后再送到实验室进行化验分析。这种有创的分析方法不仅一次测量需要耗费大量时间、测量成本高，而且抽血化验增加了测试对象的痛苦，可能存在感染的风险，从而限制了检测的次数，不利于疾病的早期诊断。 目前，人们在利用皮肤组织自体荧光判断人体健康状况方面，作了一些尝试和努力。例如，通过对测试对象局部进行麻醉，获得皮肤切片样品，样品通常进行冷冻保存。在进行分析前，皮肤样品再经过解冻处理，同时切除皮下脂肪，余下组织还需进行清洗和干燥，再对样品进行荧光检测，这种方法的缺点是必须对被测者皮肤进行切片，样品处理过程繁琐耗时。 国际专利W0 01/22869号阐述一种测定皮肤自体荧光的装置。所述装置由宽带光源加滤光片构成，皮肤荧光由光谱仪进行检测。发明者提出可由皮肤荧光定量检测皮肤中的晚期糖基化终末产物，但是并没有说明使用所述装置定量测量AGE的任何方法，且没有提出所述装置在疾病诊断中的用途。针对个体皮肤颜色和结构对荧光测量的干扰，也并没有提出任何补偿或校正荧光光谱的方法。 中国发明专利申请200710003189. X号阐述了一种使用皮肤组织自体荧光确定某一糖化终产物或疾病状态的装置和方法。所述装置由氙灯和单色仪组成，荧光信号由光电探测器接收。发明者仅阐述了糖化终产物的自体荧光和糖尿病之间的关系，并没有建立皮肤组织自体荧光和人体氧化应激之间的关系。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用组织荧光，实时、无创的检测人体氧化应激状态
的装置及方法。 人体氧化应激无创荧光检测装置，包括有激发光源系统、光谱采集系统和光谱信号分析处理系统 激发光源系统包括近紫外光源，在近紫外光源出射光路上的滤光片和分束镜，分束镜把出射光分成参考光与激发光； 光谱采集系统包括传导光纤、光纤探头和光谱仪；传导光纤用于将参考光传输至光谱仪；光纤探头用于传导激发光至被测人体皮肤部位，收集人体皮肤因激发而产生的荧光并传输至光谱仪；光谱仪用于光谱信号的探测； 光谱信号分析处理系统用来分析处理所采集到的光谱信号，并最终获得被测对象的氧化应激状态。 所述的人体氧化应激无创荧光检测装置，其特征在于所述的近紫外光源具有300nm-450nm范围的波长，可以是宽带光源或多个窄带光源的组合。 所述的人体氧化应激无创荧光检测装置，其特征在于所述的滤光片是窄带滤光片或多个截止型滤光片的组合。 所述的人体氧化应激无创荧光检测装置，其特征在于传导光纤可以传输300nm-600nm的光谱信号，可以是一根光纤或多根光纤组成的光纤束。 所述的人体氧化应激无创荧光检测装置，其特征在于所述的光纤探头由传导光纤和收集光纤组成，可以是多种组合形式的光纤束。
所述的人体氧化应激无创荧光检测装置，其特征在于光谱信号采集系统同时采集经皮肤组织反射和散射的光谱信号，通过组织的反射特性来确定经校正的荧光测量值。
所述的人体氧化应激无创荧光检测装置，其特征在于光谱信号分析处理系统将测试对象的生物学信息，经校正的荧光测量值和组织状态相关联的模型结合以确定所述组织的状态。 所述的人体氧化应激无创荧光检测装置，其中所述的生物学信息包括个体的种族、性别、身高、体重、是否吸烟、家族病史、皮肤的黑色素和血红素水平。 所述的人体氧化应激无创荧光检测装置，其中所述的模型通过对多个测试对象皮肤组织的荧光特性和测试对象的皮肤组织状态进行检测，将最小二乘法、协方差分析法、主成分分析法、多元回归分析法、神经网络算法用于组织状态的测定。
人体氧化应激无创荧光检测方法，其特征在于包括以下步骤 近紫外光源产生的光，经滤光片和分束镜形成两束波长相同，传播方向不同的单色光，其中一束作为激发光L ( A )，另一束作为参考光12 ( A );激发光由传导光纤传输至人体测试部位皮肤，人体测试部位皮肤组织内晚期糖基化终末产物受激发产生420nm-600nm
的荧光，荧光由接收光纤采集，皮肤组织反射和散射的激发光同时也被接收光纤采集；接收光纤收集的光谱经光纤传导至光谱仪，光谱仪所测量到的信号记作Fm^(Ax， AJ ;参考光
12 ( A )经光纤直接传导至所述的光谱仪，光谱仪将光信号转化为电信号后传输至计算机。
参考光用于校正光源波动对测量结果的影B向。皮肤反射光和皮肤散射光用于校正测试对象皮肤的吸收和散射作用对测量结果的影响，从而获得测试对象的固有荧光光谱。
光谱信号分析处理系统对测试对象的生物学信息，固有荧光光谱和组织状态相关联的模型进行分析，获得所述组织的氧化应激状态。所述的生物学信息包括个体的种族、性别、身高、体重、是否吸烟、家族病史、皮肤的黑色素和血红素水平；所述的模型是通过对多个测试对象皮肤组织光学特性进行检测，并运用最小二乘法、协方差分析法、主成分分析法、多元回归分析法、神经网络算法以确定皮肤组织状态；所述氧化应激状态包括体内氧化应激是否存在、氧化应激程度以及氧化应激程度变化的速率；具有、不具有发生氧化应激的可能性；同时包括组织内晚期糖基化终末产物浓度、积累速率以及积累速率的变化。
本发明具有以下特点和优点 1.无需对人体进行抽血化验或皮肤切片采样，避免了抽血化验给病人带来的痛苦以及被感染的风险。 2.利用皮肤的自体荧光反映人体氧化应激状态，检测速度快，实时显示检测结果。
3.测量结果不仅反映人体氧化应激状态，而且可以对糖尿病及其并发症的发生和发展进行跟踪，能为重大疾病的预防、诊断及治疗效果的评价提供可靠依据。
图1是一种人体氧化应激无创荧光检测装置实施图。
图2是Y形光纤探头a、b、c三种组合方式。
图3中(a)光纤探头结构示意图；(b)光纤探头端面图。
图4是不同测试对象皮肤组织自体荧光原始光谱图。
图5是部分测试对象皮肤组织反射率曲线。
图6是部分测试对象的测量结果对比图。 图7是测试对象氧化应激状态交叉验证后验概率盒须图。 图8是本发明有关的受试者工作特征曲线。
具体实施例方式
人体皮肤内蛋白质、氨基酸、脂类或核酸等大分子物质的游离氨基，在非酶条件下与还原糖的醛基经过縮合、重排、裂解、氧化修饰后产生的一组稳定的终末产物，即为晚期糖基化终末产物。晚期糖基化终末产物与其受体相互作用后，产生大量的活性氧，破坏体内氧化剂和抗氧化剂的平衡，从而产生氧化应激。因此，可以通过检测人体皮肤内的晚期糖基化终末产物来反映氧化应激状态。晚期糖基化终末产物具有荧光特性，在350nm-420nm的光激发下，在420nm-600nm产生荧光。 本发明使用皮肤组织荧光，实时、无创的检测人体氧化应激状态。本发明使用激发光照射个体皮肤组织的一部分并检测所述组织发出的荧光。本发明将光谱处理算法应用于所测得的荧光光谱上，然后提供相关模型或者诊断阈值将光谱信息与氧化应激状态相关联起来。 荧光的产生当激发光照射皮肤组织时，某些受到激发的分子从低能级跃迁到激发能级，激发能级是不稳定的，因此分子从较高能级跃迁到较低能级，这个过程伴随着荧光的发射，释放的荧光波长总是比激发波长更长。 光的传播当激发光照射到皮肤组织上时，会经历散射和吸收过程，这与被照射部位的光学性质、激发光波长、采集系统与被测皮肤之间的距离相关。所产生的荧光也会经历相关的吸收和散射。因此，测试对象的皮肤差异对最终确定组织氧化应激状态有重大影响。
光谱校正本发明所感兴趣的组织荧光是其固有荧光——均一、无散射和光学上稀薄样品发出的光。为了获得皮肤组织的固有荧光光谱，针对不同测试对象进行光谱校正，获得感兴趣分子的固有荧光光谱，从而判定测试对象的氧化应激状态。 上式中Fmeas ( A x，、)是在激发波长入，
ILas ( A m)是皮肤组织被测位置的反射率，F。OT (入
激发下，所测量到的皮肤组织荧光光谱，，入J是校正皮肤差异后的荧光光谱。<formula>formula see original document page 6</formula>
上式中A「、为荧光波段，入3-入4为激发波段，在校正光源不稳定所带来的影响后，A.F.能够反映体内晚期糖基化终末产物分子含量。 —种人体氧化应激无创荧光检测装置，见附图1 :包括有近紫外光源l，在近紫外光源1出射光路上的窄带滤光片2和分束镜3，耦合透镜4、光纤探头5、光谱仪7、激发光传导光纤9及激发光接收光纤10，以及光谱信号分析处理系统8。人体测试部位皮肤6置于光纤探头5前方。 所述的近紫外光源1具有300nm-450nm范围的波长，可以是宽带光源或多个窄带光源的组合；
所述的滤光片2是窄带滤光片或多个截止型滤光片的组合； 所述的分束镜3是用于产生波长相同，传播方向不同的两束光，即激发光和参考光； 所述的透镜4是透镜组合，目的是耦合激发光进入传导光纤； 所述的光纤探头5由传导光纤和收集光纤组成，可以是多种组合形式的光纤束；所述的光谱仪7是能够检测350nm-600nm波段光谱信号的高精度光谱仪； 所述的计算机8是光谱信号分析处理系统用来分析处理所采集到的光谱信号，并
最终获得被测对象的氧化应激状态。 本装置的工作原理和基本工作过程描述如下 近紫外光源1产生的光，经滤光片2和分束镜3形成两束波长相同，传播方向不同的单色光，其中一束充当激发光L ( A )、另一束起参考光12 ( A )作用。激发光经透镜4耦合进入激发光传导光纤9，至光纤探头5 ;人体测试部位皮肤6紧贴光纤探头5端面，经与其成45度角的单色光照射后，组织内晚期糖基化终末产物受激发产生420nm-600nm的荧光，荧光溢出皮肤组织之后被光纤探头5的收集光纤采集；激发光源照射在皮肤组织上产生的反射光和散射光，同样被光纤探头的接收光纤采集，传导至光谱仪7。分束镜3产生的参考光经光纤直接传导至光谱仪7，光谱仪光信号转化为电信号后经串口传输至光谱分析处理系统8。 结合Fmeas(入x， 、) 、 Rmeas (、)及12 (入)，首先校正皮肤散射吸收对测试结果的
影响，然后采用峰值积分法多变量光谱数据处理技术(P頂S， Peak Integration MethodSpectro)，校正光源不稳定对测量结果的影B向，A.F.值能够反映被测对象皮肤晚期糖基化终末产物相对浓度。不同测试对象的A.F.值对比如图5所示，利用此装置测得的氧化应激者的A.F.值明显高于正常人。 利用上述A.F.值，同时采集测试对象的其他生物学信息，如年龄、身高、体重、是
否吸烟、是否患有糖尿病、体内氧化应激状态的生化检测结果等，进行综合分析处理。 首先利用多元回归分析及主成份分析法，分析各信息对氧化应激状态评判的影
响，以降低获得数据的维数。而后，采取多元回归分析，协方差分析，神经网络训练算法，建
立荧光_氧化应激状态模型。最终，根据无创测量结果，并结合此模型，能够判定组织氧化
应激状态。 实施例 人体氧化应激无创荧光检测装置，包括有激发光源系统、光谱采集系统和光谱信号分析处理系统。 此种检测装置的实例I包括作为激发光源系统核心元件的高功率氙灯、单色仪和耦合透镜组；包括作为光谱采集系统的传导光纤、光纤探头和光谱仪，其中光纤探头如图2(a)所示，为1根中心光纤和12根边缘光纤的组合，传导光纤与光纤探头通过光纤互连接器连接，光谱仪是能够检测350nm-600nm波段光谱信号的高精度光谱仪；包括作为光谱信号分析系统的计算机及分析处理软件。 实例II中用近紫外多波长LED取代实例I中的高功率氙灯、单色仪和耦合透镜组。 实例III中用如图2(b)或2(c)中所示的光纤探头取代实例I中2(a)所示的光纤探头，改变光纤探头的结构可以改变能够探测到的皮肤深度。 应用实例I中所述装置，针对不同测试对象进行检测。图4是部分测试对象皮肤组织受激发产生的原始荧光光谱Fm^( A x， A m)，在420nm-600nm波段，氧化应激程度高的测试对象荧光光谱明显强于正常人。 图5是部分测试对象通过无创荧光检测装置测量到的皮肤发射率，不同测试对象的皮肤反射率不同，对光的吸收及散射程度不同，因而会导致了所测得荧光光谱发生畸变。根据不同测试对象各自的皮肤反射率校正其荧光光谱，并进行分析处理，最后得到反映其荧光强度的指标，如图6所示。氧化应激程度高的测试对象其指标普遍高于正常人。
图7是不同测试对象氧化应激状态交叉验证后验概率的盒须图。从图中可见，存在氧化应激的测试对象检测出氧化应激的概率明显高于正常人，但不能找到能够完全区分氧化应激者和正常人的单个阈值。常用方法是对测试结果进行特异性-敏感性分析，绘制特异性-敏感性曲线。受试者工作特征曲线如图7所示曲线下的面积达到了 0.868，与随机偶然的测试值0. 5比较，差异具有统计学意义，能够应用于临床上诊断测试对象是否存在氧化应激。 显然，本领域的技术人员可以对本发明的无创荧光检测装置及方法进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若对本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
权利要求
人体氧化应激无创荧光检测装置，包括有激发光源系统、光谱采集系统和光谱信号分析处理系统激发光源系统包括近紫外光源，在近紫外光源出射光路上的滤光片和分束镜，分束镜把出射光分成参考光与激发光；光谱采集系统包括传导光纤、光纤探头和光谱仪；传导光纤用于将参考光传输至光谱仪；光纤探头用于传导激发光至被测人体皮肤部位，收集人体皮肤因激发而产生的荧光并传输至光谱仪；光谱仪用于光谱信号的探测；光谱信号分析处理系统用来分析处理所采集到的光谱信号，并最终获得被测对象的氧化应激状态。
2. 根据权利要求1所述的人体氧化应激无创荧光检测装置，其特征在于所述的近紫外 光源具有300nm-450nm范围的波长，可以是宽带光源或多个窄带光源的组合。
3. 根据权利要求1所述的人体氧化应激无创荧光检测装置，其特征在于所述的滤光片 是窄带滤光片或多个截止型滤光片的组合。
4. 根据权利要求1所述的人体氧化应激无创荧光检测装置，其特征在于传导光纤可以 传输300nm-600nm的光谱信号，可以是一根光纤或多根光纤组成的光纤束。
5. 根据权利要求1所述的人体氧化应激无创荧光检测装置，其特征在于所述的光纤探 头由传导光纤和收集光纤组成，可以是多种组合形式的光纤束。
6. 根据权利要求1所述的人体氧化应激无创荧光检测装置，其特征在于光谱信号采集 系统同时采集经皮肤组织反射和散射的光谱信号，通过组织的反射特性来确定经校正的荧 光测量值。
7. 根据权利要求1所述的人体氧化应激无创荧光检测装置，其特征在于光谱信号分析 处理系统将测试对象的生物学信息，经校正的荧光测量值和组织状态相关联的模型结合以 确定所述组织的状态。
8. 根据权利要求7所述的人体氧化应激无创荧光检测装置，其中所述的生物学信息包 括个体的种族、性别、身高、体重、是否吸烟、家族病史、皮肤的黑色素和血红素水平。
9. 根据权利要求7所述的人体氧化应激无创荧光检测装置，其中所述的模型通过对多 个测试对象皮肤组织的荧光特性和测试对象的皮肤组织状态进行检测，将最小二乘法、协 方差分析法、主成分分析法、多元回归分析法、神经网络算法用于组织状态的测定。
10. 人体氧化应激无创荧光检测方法，其特征在于包括以下步骤 近紫外光源产生的光，经滤光片和分束镜形成两束波长相同，传播方向不同的单色光，其中一束作为激发光L ( A )，另一束作为参考光12 ( A );激发光由传导光纤传输至人体测 试部位皮肤，人体测试部位皮肤组织内晚期糖基化终末产物受激发产生420nm-600nm的 荧光，荧光由接收光纤采集，皮肤组织反射和散射的激发光同时也被接收光纤采集；接收 光纤收集的光谱经光纤传导至光谱仪，光谱仪所测量到的信号记作Fm^(Ax， AJ ;参考光12 ( A )经光纤直接传导至所述的光谱仪，光谱仪将光信号转化为电信号后传输至计算机。
全文摘要
本发明公开了人体氧化应激无创荧光检测装置与方法。激发光源系统包括近紫外光源，在近紫外光源出射光路上的滤光片和分束镜，分束镜把出射光分成参考光与激发光。光谱采集系统包括传导光纤、光纤探头和光谱仪。传导光纤用于将参考光传输至光谱仪；光纤探头用于传导激发光至被测人体皮肤部位，收集人体皮肤因激发而产生的荧光并传输至光谱仪。光谱仪用来分析处理所采集到的光谱信号，并最终获得被测对象的氧化应激状态。利用皮肤的自体荧光反映人体氧化应激状态，检测速度快，能实时显示结果。能为重大疾病的预防、诊断及治疗效果评价提供可靠的依据。
文档编号A61B5/00GK101716069SQ20091018552
公开日2010年6月2日 申请日期2009年11月17日 优先权日2009年11月17日
发明者刘勇, 吴晓松, 夏营威, 张龙, 朱灵, 朱震, 李志刚, 王安, 王贻坤 申请人:中国科学院安徽光学精密机械研究所