专利名称：一种具有抑制肿瘤细胞多药耐药的高活性抗癌新药甲酰阿地咪的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及一种具有抗肿瘤活性的化合物甲酰阿地咪4(5-N-formalardeemin)， 能作为肿瘤细胞生长抑制剂和化疗增敏剂(多药耐药逆转剂)，单用或与其他抗肿瘤药物 联合使用于治疗恶性肿瘤。所述的其他抗肿瘤药物包括影响肿瘤细胞核酸生物合成的药 物；直接破坏肿瘤细胞DNA阻止其复制的药物；嵌入肿瘤细胞DNA中干扰转录过程的药物； 干扰有丝分裂影响肿瘤细胞蛋白质合成的药物，通过抑制环氧化酶产生抗肿瘤作用的药
物，以及针对EGFR相关Tyrosine激酶，热休克蛋白Hsp90，蛋白酶体Proteasome的抑制剂等。 —、实验材料吲哚生物碱甲酰阿地咪4和乙酰阿地咪2按文献方法(Qin， Y. et al. J. Org. Chem. 2009， 74， 298，图1)通过20步全合成获得。
二、甲酰阿地咪4的抗肿瘤活性研究(图2)。 1.甲酰阿地咪4可显著抑制肿瘤细胞增殖，且其作用呈现剂量依赖关系(见实施 例1禾P 2); 2.甲酰阿地咪4与其他抗肿瘤药物合用，显著增强肿瘤细胞对药物的敏感性(见 实施例3); 3.甲酰阿地咪4可有效逆转多药耐药肿瘤细胞对抗肿瘤药物的耐药性，其作用呈 现剂量依赖关系，并且其活性显著高于乙酰阿地咪2 (见实施例4， 5和6);
图1是本发明路线中阿地咪1、乙酰阿地咪2和甲酰阿地咪4的合成方法。
图2是甲酰阿地咪4逆转多药耐药人乳腺癌细胞株(MCF-7/Adr)对阿霉素(Adr) 和长春新碱(VCR)的耐药性照片。 图3是用不同浓度的甲酰阿地咪4处理人乳腺癌MCF-7细胞后，通过MTT比色法 检测肿瘤细胞存活率。 图4是用不同浓度的甲酰阿地咪4处理人宫颈癌Siha细胞后，通过MTT比色法检 测肿瘤细胞存活率。 图5是用阿霉素(0. 4ii g/ml)和不同浓度的甲酰阿地咪4处理人宫颈癌Siha细 后，通过乳酸脱氢酶(LDH)释放实验检测肿瘤细胞死亡率。 图6是用阿霉素和甲酰阿地咪4或乙酰阿地咪2处理人乳腺癌多药耐药细胞株 MCF-7/Adr后，通过MTT比色法检测肿瘤细胞存活率。 图7是用阿霉素和甲酰阿地咪4或乙酰阿地咪2处理人乳腺癌多药耐药细胞株MCF-7/Adr后，通过乳酸脱氢酶(LDH)释放实验检测肿瘤细胞死亡率。 图8是用阿霉素和不同浓度的甲酰阿地咪4处理人乳腺癌多药耐药细胞株MCF-7/ Adr后，MTT比色法检测肿瘤细胞存活率。 图9是用长春新碱和甲酰阿地咪4或乙酰阿地咪2处理人乳腺癌多药耐药细胞株 MCF-7/Adr后，通过MTT比色法检测肿瘤细胞存活率。 图10是用长春新碱和甲酰阿地咪4或乙酰阿地咪2处理人乳腺癌多药耐药细胞 株MCF-7/Adr后，通过乳酸脱氢酶(LDH)释放实验检测肿瘤细胞死亡率。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，但本发明请求保护的范围不局限于本具体实施方式
的说明。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件， 或按照厂商所建议的条件进行。吲哚生物碱乙酰阿地咪2((-)-acetylardeemin)和甲酰阿 地咪4((-)-formalardeemin)按文献方法(Qin， Y. et al. J. Org. Chem. 2009， 74， 298)合成 制备。 乙酰阿地咪2((-)-N-Acetylardeemin) :[a ]D20 = -49 ° (c 0. 1， CHC13) ,H NMR (400MHz, CDC13) S 1. 02 (s， 3H) ， 1. 21 (s， 3H) ， 1. 42 (d， J = 7. 6Hz， 3H) ， 2. 67 (s br，3H)， 2. 69-2. 68 (m， 1H) ， 3. 02 (dd， J = 12. 8， 5. 7Hz， 1H) ， 4. 45—4. 43 (m， 1H) ， 5. 16—5. 12 (m， 2H)， 5.37(q， J = 7.6Hz，lH)，5.81(dd， J = 16. 8， 10. 8Hz， 1H) ， 6. 08 (s br， 1H) ， 7. 24—7. 22 (m， 1H) ， 7. 45-7. 42 (m， 2H) ， 7. 55-7. 52 (m， 1H) ， 7. 73 (d， J = 8. 8， 1H) ， 7. 80-7. 78 (m， 1H) ， 8. 08 (s br， 1H) ，8. 29 (d， J = 8. 0， 1H) 甲酰阿地咪4((-)-N-Formalardeemin) :[a ]D20 = -52 ° (c 0. 1， CHC13) ,H 画R(400MHz， CDC13) S 1. 02(s，3H) ， 1. 18(s，3H) ， 1. 50(d， J = 6. 8Hz， 3H) ， 2. 73 (t， J = 12. 0Hz，lH)，3. 03(dd， J= 13. 2， 6. 0Hz，lH)，4. 57—4. 53 (m， 1H) ， 5. 17—5. ll(m，2H)，5. 46 (q， J = 7. 2Hz， 1H) ，5. 89(dd， J = 17. 2， 10. 8Hz， 1H) ，6. 14 (s， 1H) ， 7. 20 (t， J = 7. 2Hz， 1H)，
7. 37 (t， J = 8. OHz， 1H) ， 7. 42 (d， J = 8. OHz， 1H) ， 7. 51 (t， J = 7. 6Hz， 1H) ， 7. 66 (d， J =
8. 4Hz， 1H) ，7. 78(t， J = 7. 6Hz， 1H) ， 8. 09 (d， J = 8. OHz， 1H) ， 8. 28 (d， J = 7. 6Hz，lH)，
9. lO(s， 1H) ;13C画R(lOOMHz， CDC13) S 17. 5，22. 3，23. 0，38. 7，41. 1，53. 2，58. 1，60. 6， 77. 3， 115. 5， 117. 3， 120. 5， 124. 9， 125. 0， 127. 0， 127. 2， 127. 4， 129. 6， 132. 3， 134. 8， 141. 1， 142. 4， 147. 0， 150. 1， 159. 8， 161. 8， 166. 2 ;匪S-ESI calcd forC27H26N403Na (M+Na) + 477. 1897， found 477. 1893 ;IR(KBr) 3310， 2895， 1715， 1643， 1410， 1367,755cm—1. 实施例1甲酰阿地咪4对人乳腺癌MCF-7细胞的增殖抑制作用
实验方法 人乳腺癌MCF-7细胞用含10%胎牛血清的PRMI1640 (Hyclone)培养液培养，置 37°C、5% C02培养箱中。肿瘤细胞0. 7X 104/孔接种于96孔板上，培养24h后，分别加入 终浓度为10 ii M、20 ii M、40 ii M、80 y M、 160 y M的甲酰阿地咪4，对照组加DMSO，另设调零组 (只加培养液)，每个组设三个复孔。将96孔板置37°C 、5% C02培养箱再培养72h后，采用 MTT比色法检测肿瘤细胞存活率，即每孔加入5mg/ml MTT(美国Sigma公司)试剂10 yl， 继续培养4h，吸除上清液，用PBS液洗后，每孔加入二甲基亚砜(DMSO) lOOiU，放于震荡器 上震荡15min后，用酶标仪(570nm波长)测每孔的OD值。用下列公式计算细胞存活率细<formula>formula see original document page 6</formula>结果以均数±标准差 表示。
结果 如图3所示，甲酰阿地咪4剂量依赖性地抑制体外培养的人乳腺癌MCF-7细胞的 生长。 实施例2甲酰阿地咪4对人宫颈癌Siha细胞的增殖抑制作用
实验方法 人宫颈癌Siha细胞用含10X胎牛血清的PRMI1640(Hyclone)培养液培养，置 37°C 、5% C02培养箱中。肿瘤细胞0. 7X 104/孔接种于96孔板上，培养24h后，按实施例1 加入不同浓度的甲酰阿地咪4，继续培养72小时后，按照实施例1中的方法检测肿瘤细胞存 活率。
结果 如图4所示，甲酰阿地咪4剂量依赖性地抑制体外培养的人宫颈癌Siha细胞的生 长。 实施例3甲酰阿地咪4显著增加人宫颈癌Siha细胞对阿霉素的敏感性
实验方法 人宫颈癌Siha细胞培养条件同实施例2。肿瘤细胞0. 7X 104/孔接种于96孔板 上，培养24h后，分别单独加入阿霉素(0. 4 g/ml，意法玛西亚)，或不同浓度的甲酰阿地咪 4 (20 ii M， 40 ii M， 80 y M， 160 y M)，或者同时加入阿霉素和不同浓度的甲酰阿地咪4，对照组 加匿SO，另设调零组(只加培养液)，每个组设三个复孔。将96孔板置37t:、5XC02培养 箱再培养72h后，通过乳酸脱 氢酶(LDH)释放实验，采用乳酸脱氢酶检测试剂盒(Cyto Tox 96' Non-RadioactiveCytotoxicity Assay,Promega，货号G1780)，检测细胞死亡率。具体方法 简述如下收集每孔的培养上清到一个新的96孔板，加入等体积的底物反应液，室温孵育 30分钟后，加入终止液终止反应，用酶标仪(490nm波长)测每孔的0D值，同时加入细胞裂 解液裂解细胞，收集上清，检测细胞最大释放值。根据检测的0D490值，按照下列公式计算 细胞死亡率细胞死亡率二培养上清LDH释放(0D490)/LDH最大释放(0D490)。结果以均 数±标准差表示。
结果 用阿霉素(0.4iig/ml)和不同浓度的甲酰阿地咪4处理人宫颈癌Siha细胞后，通 过乳酸脱氢酶(LDH)释放实验检测肿瘤细胞死亡率如图5所示。 实施例4甲酰阿地咪4显著逆转人乳腺癌多药耐药细胞株MCF-7/Adr对阿霉素的 耐药性，其活性明显高于乙酰阿地咪2
实验方法 人乳腺癌多药耐药细胞株MCF-7/Adr培养在含10%胎牛血清PRMI1640 (Hyclone) 培养液中，并加入维持剂量的阿霉素(1P g/ml)，置37t:、5X C02培养箱。肿瘤细胞 0. 7X 104/孔接种于96孔板上，培养24h后，分别单独加入阿霉素(3 y g/ml)，甲酰阿地咪 4 (40 ii M)，乙酰阿地咪2 (40 ii M)，或者同时加入阿霉素和相应的吲哚生物碱，每组设六个复 孔。将96孔板置37°C 、5% C02培养箱再培养72h后，每个组取三复孔分别加入5mg/ml MTT试剂10iU，采用MTT比色法检测细胞存活率。另外三个复孔，按实施例3中方法，通过乳酸 脱氢酶(LDH)释放实验，检测细胞死亡率。结果以均数±标准差表示。
结果 如图6和图7，通过检测细胞存活率和细胞死亡率均显示，甲酰阿地咪4能够显著 逆转人乳腺癌耐药细胞株MCF-7/Adr对阿霉素的耐药性，更重要的是，其逆转肿瘤耐药的 活性显著高于乙酰阿地咪2。 实施例5甲酰阿地咪4能够剂量依赖性地逆转人乳腺癌多药耐药细胞株MCF-7/
Adr对阿霉素的耐药性 实验方法 人乳腺癌多药耐药细胞株MCF-7/Adr培养条件同实施例4。按实施例4中条件接 种细胞于96孔板，24h后，分别加入阿霉素(3 ii g/ml)，或不同浓度的甲酰阿地咪4 (20 y M， 40iiM，60iiM)，或者同时加入阿霉素和相应浓度的甲酰阿地咪4。将96孔板置37°C、5% C02培养箱再培养72h后，采用MTT比色法检测细胞存活率。结果以均数±标准差表示。
结果 如图8、通过检测细胞存活率显示，甲酰阿地咪4能够显著逆转人乳腺癌耐药细胞 株MCF-7/Adr对阿霉素的敏感性，其作用呈剂量依赖关系。 实施例6甲酰阿地咪4显著逆转人乳腺癌多药耐药细胞株MCF-7/Adr对长春新碱 的耐药性，其活性明显高于乙酰阿地咪2
实验方法 人乳腺癌多药耐药细胞株MCF-7/Adr培养条件同实施例5。按实施例5中条件接 种细胞于96孔板，24h后，分别加入长春新碱(VCR， 1 ii M)，甲酰阿地咪4 (40 y M)，乙酰阿地 咪2 (40 ii M)，或者同时加入长春新碱和相应的吲哚生物碱，每个组设六个复孔。将96孔板 置37°C、5% C02培养箱再培养72h后，其中三孔采用MTT比色法检测细胞存活率。另外三 个复孔，通过乳酸脱氢酶(LDH)释放实验，检测细胞死亡率。结果以均数±标准差表示。
结果 如图9和图IO，通过检测细胞存活率和细胞死亡率均显示，甲酰阿地咪4能够显著 逆转人乳腺癌耐药细胞株MCF-7/Adr对长春新碱的敏感性，更重要的是，其逆转肿瘤耐药 的活性显著高于乙酰阿地咪2。
权利要求
如化学结构式所示的吲哚生物碱甲酰阿地咪((-)-5-N-formalardeemin)，及其药学上可接受的盐，作为抗肿瘤药物用于人类恶性肿瘤的治疗。FSB00000022522300011.tif
2. 如权利要求1所述的甲酰阿地咪作为抗肿瘤药物单独使用，和与其它抗肿瘤药物组 成药物组合物联合使用治疗恶性肿瘤，其特征在于，含有治疗有效剂量的如权利要求1所 述的甲酰阿地咪及其药学上可接受的盐。
3. 如权利要求2所述的药物组合物，其特征在于，所述甲酰阿地咪及其药学上可接受 的盐的含量为0. 001 99. 9wt%。
4. 如权利要求2 3所述的药物组合物，其特征在于，该药物组合物包括一种影响 肿瘤细胞核酸生物合成的药物；直接破坏肿瘤细胞DNA阻止其复制的药物；嵌入肿瘤细胞 DNA中干扰转录过程的药物；干扰有丝分裂影响肿瘤细胞蛋白质合成的药物或通过抑制 环氧化酶产生抗肿瘤作用的药物；以及EGFR相关的激酶抑制剂，热休克蛋白Hsp90抑制 剂，Proteasome抑制剂；这些药物如阿霉素、长春碱、长春新碱、紫杉醇、多烯紫杉醇、顺铂、 Gef itinib (Iressa)、17-DMAG、 Bortezomib。
5. 权利要求2 5所述的药物组合物，在治疗人类恶性肿瘤的药物中的应用，优选作为 恶性肿瘤化疗增敏剂使用，以克服恶性肿瘤化疗过程中产生的多药耐药性问题。
全文摘要
本发明涉及如化学结构式所示的吲哚生物碱甲酰阿地咪((-)-5-N-formalardeemin)，及其药学上可接受的盐，作为抗肿瘤药物在治疗人类恶性肿瘤中的应用。其作为抗肿瘤药物不仅可直接抑制恶性肿瘤细胞的增长，更为重要的是可作为化疗增敏剂，与其它抗肿瘤药物如阿霉素、长春新碱等联用，通过逆转肿瘤细胞的多药耐药性而达到有效杀灭肿瘤细胞的作用。更有意义的是，其作为化疗药物增敏剂较其直接作为肿瘤细胞生长抑制剂在治疗恶性肿瘤方面更为有效，具有重要的临床应用前景。
文档编号A61P35/00GK101756992SQ200910164330
公开日2010年6月30日 申请日期2009年9月2日 优先权日2009年9月2日
发明者何彬, 宋颢, 张 林, 林勇, 王霞, 秦勇, 郑雪莲 申请人:四川大学