专利名称：：麦角甾-7，22-二烯-3β-醇的用途及其配方的利记博彩app
技术领域：
：本发明涉及一种已分离和纯化的化学物麦角甾-7，22-二烯-3p-醇，及其作为鉴定云芝(Cor/o/wveWco/or)标记的用途。本发明还涉及使用鉴定标记来鉴定在样本中云芝的方法。
背景技术：
：在传统中药中，云芝被普遍使用为有药用性的草本植物。云芝，又禾尔为户o一or船vera/co/or，vem'co/or，TurkeyTail,或cloudmushroom，是一种属于担子菌门(5asW/omycetes)和多孔菌禾斗(Po/;^oraw"。的可食用的真菌。云芝在世界各地的实验室被研究，而研究结果显示它具有调节和增强免疫系统的功能，和其他显著的效果。因为这些发现，对于这种草本植物的要求有所增加。虽然其中的多糖成份早已被报告，但没有其中的任何一种成分能被成功鉴定为指
发明内容基于上述背景，本发明目的是提供用来鉴定云芝的标记，以及其鉴定的方法。因此，本发明的一方面提供了，一种已分离和基本上纯化的麦角甾-7，22-二烯-3卩-醇，而该麦角甾-7，22-二烯-3p-醇是由以下化学式(I)代本发明另一方面提供了麦角甾-7,22-二烯-3^-醇作为云芝鉴定标记的用途，而该麦角甾-7，22-二烯-3卩-醇是由化学式(1)所代表。本发明另一个方面提供了一个在样本中定量云芝的方法。在该方法中，首先从云芝中萃取一些成分来组成样本萃取物。接着，利用分离技术将该样本萃取物分离以获得一个分离结果；之后，从该分离结果中鉴定麦角甾-7,22-二烯-3P-醇。该样本萃取物的质量随后根据在该样本萃取物中的预定麦角甾-7,22-二烯-3p-醇标准来测定。在上述方法中的一个不限制实施方案中，该分离技术为色谱法。在另一个不限制实施例中，所述色谱法是气相色谱法(GC)，而该运作条件在表4中显示。在另一个不限制实施方案中，所述色谱法是高效液相色谱法(HPLC)，而该运作条件在表3显示。本发明另一方面提供了一种含有麦角甾-7,22-二烯-3(3-醇的组合物，该组合物用于治疗癌症和其他有关疾病或失调。在一个不限制的实施方案中，所述癌症包括但不限于白血病。在另一个不限制实施方案中，麦角甾-7，22-二烯-3p-醇与其他草本植物和/或药理上可接受的载体混合。本发明另一方面提供了一种利用组合物来制备治疗癌症和其他有关疾病或失调的药物的应用，而该组合物包括麦角甾-7,22-二烯-3P-醇。在一个不限制的实施方案中，所述癌症包括但不限于白血病。在另一个不限制的实施方案中，麦角甾-7,22-二烯-3P-醇与其他草本植物和/或药理上可接受的载体混合。根据本发明，所述标记的使用可提供一种用来定性和定量有药用性的草本植物方法。而相对于传统方法中需要进行一系列测试和研究才能获得相同结果作为比较，本发明所提及的方法比较快捷和准确。此外，标记的运用可有用和有效率地鉴定和精确指出，在草药混合物的成分中，所需的有药用性的草本植物。图1显示了一幅根据本发明的一个实施例而准备的不纯麦角甾-7,22-二烯-3^-醇而构建的HPLC光谱。图2显示了一幅根据本发明的一个实施例而准备的基本上纯化的麦角甾-7,22-二烯-3p-醇而构建的HPLC光谱。图3显示了一幅根据本发明的一个实施例的含有云芝植物材料的样本而构建的HPLC光谱。图4显示了一幅根据本发明的一个实施例而准备的不纯麦角甾-7,22-二烯-3(3-醇而构建的GC光谱。图5显示了一幅根据本发明的一个实施例而准备的基本上纯化的麦角甾-7，22-二烯-3p-醇而构建的GC光谱。图6显示了一幅根据本发明的一个实施例的含有云芝植物材料的样本而构建的GC光谱。具体实施例方式如本说明书和权利要求书所用，"包括"是指包括跟随的成份但不排除其它成份。在对本说明书中的句子进行解释时，如该句子含有"包括"，这是指其他或其之前的成分也包括其中。相关的术语如"包含"、"含有"也可用相同方法来解释。本发明提供了被分离和基本上己纯化的麦角甾-7,22-二烯-3p-醇，而该麦角甾-7，22-二烯-3P-醇是由以上化学式(I)代表。在一个实施方案中，该麦角甾-7，22-二烯-3P-醇的熔点为169至172。C。在本发明的研究过程中，发现了纯化的麦角甾-7,22-二烯-3P-醇也具有与云芝相类似的生物活性(如抗白血病的效果)。因此，麦角甾-7,22-二烯-3卩-醇的纯度与其作为云芝标记的定量有直接关系，而且麦角甾-7,22-二烯-3(3-醇的浓度也可作为准备一种含有麦角甾-7,22-二烯-33-醇的物质的效率指标。本发明也涉及一种对于在样本中含用未知数量云芝的云芝定量方法。这方法包括(a)在样本中萃取云芝中的一些成分来组成样本萃取物；(b)利用分离技术将该样本萃取物分离以获得一个分离结果；(c)从该分离结果中鉴定麦角甾-7，22-二烯-3(3-醇；和(d)根据在该样本萃取物中预定的麦角甾-7,22-二烯-3P-醇标准来测定该样本萃取物的质量。在上述方法中的一个不限制实施例中，该分离技术为色谱法。在另一个不限制实施例中，所述色谱法是气相色谱法(GC)，而该运作条件在表4中显示出来。在另一个不限制实施例中，所述色谱法是高效液相色谱法(HPLC)，而该运作条件在表3显示出来。在一个不限制实施例中，含有未知数量云芝的样本在一量瓶内与氯仿:甲醇(2:1)超声萃取20分钟。干燥后，将氯仿和内部标准溶液(2ml氯仿含20mg5cx-胆甾垸)加进该萃取物。将所形成的样本萃取物用0.45mm过滤器过滤至小玻璃瓶内，作为GC分析用的标本。从GC光谱中可见到代表麦角甾-7,22-二烯-3P-醇的峰。最后，根据在该样本萃取物中预定的麦角甾-7，22-二烯-3(3-醇标准来测定在样本中的云芝质在另一个不限制实施例中，含有未知数量云芝的样本在一量瓶内与THF-Tween80((THF/Tween80):水的比例为1:1)水性混合物超声萃取10分钟。接着，用乙腈来装满该量瓶，将所形成的溶液作超声处理5分钟。将所形成的样本萃取物用0.45mm过滤器过滤至小玻璃瓶内，作为HPLC分析用的标本。从HPLC光谱中可见到代表麦角甾-7,22-二烯-3(3-醇的峰。最后，根据在该样本萃取物中预定的麦角甾-7,22-二烯-3|3-醇标准来测定在样本中的云芝质量。在上述定量方法的一个不限制实施例中，首先从一已知数量的纯化云芝粉末中萃取麦角甾-7，22-二烯-3(3-醇，用作定量纯化云芝粉末。经过纯化过程后，量度麦角甾-7，22-二烯-3(3-醇固体重量以用作测量在纯化云芝粉末中的麦角甾-7,22-二烯-3(3-醇浓度。如下实施例进一步说明本发明，但不代表作为本发明的限定。可理解的改动，如本领域的技术人员可以认识到的，都可以被使用而不会背离本发明的本质。实施例1从纯化的云芝粉末中准备纯化麦角甾-7,22-二烯-3(3-醇1.1从云芝纯化粉末中准备原液体萃取物首先，根据在2005年11月8号提出的美国专利申请11/269，294所提及的纯化方法，萃取和浓縮云芝生草药，以获得纯化云芝粉末。在一与利氏冷凝管连接的烧瓶内，加进纯化云芝粉末和氯仿，分量为每1.5kg纯化云芝粉末，使用6至7L氯仿作为萃取介质。将该混合物于7(TC下回流加热3至3.5小时。冷却后，用布氏漏斗过滤已加热的混合物；在减压情况下，将溶剂从滤液中移除。储存滤液和根据上述程序将固体残渣萃取最少两次。最后，将所有滤液萃取物结合以获得原液体萃取物。1.2原液体萃取物的柱分离首先将20至25g从步骤1.1得到的原液体萃取物与25至30g硅胶(70-230筛孔)混合。当硅胶样本内的溶剂完全蒸发，便可获得一硅胶样本。在一实施例中，将预先与石油醚混合的500至550g硅胶(230-400筛孔)装柱(5x60cm)来准备分离柱。用表1的数据来准备该<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>在另一个实施例中，将与石油醚混合的500g硅胶(230-400筛孔)装柱(8x30cm)来准备分离柱。用表2的数据来准备该柱的流动相表2<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>之后，将硅胶样本装载到分离柱中，收集分馏物直到第一黄色带移到接近分离柱的底部。每一收集得到的分馏物的容量约为240至260mL。1.3利用薄层色谱法去鉴定从柱分离方法收集的分馏物利用薄层色谱法(TLC)分析分馏物，而分馏物是从步骤1.2所描述的柱分离方法收集出来。在本步骤中，将分馏物和对照物点在一块有萤光染料的薄层硅胶60上，然后利用己烷的20%乙酸乙酯展开。在已展开的薄层上的点子，可用香草醛着色剂着色，或可于254nm和365nm的条件下用紫外光照射。根据TLC结果，将含有与参考物相同阻滞因数(Rf)数值的分馏物组合起来。在一实施例中，将含有Rf值为0.2，即与麦角甾-7,22-二烯-3卩-醇相应的分馏物组合起来以获得原制品。1.4将原制品再结晶以准备纯化麦角甾-7,22-二烯-3|3-醇将从上述步骤1.3得到的原制品溶解在氯仿和甲醇中，分量为每lg原制品，使用大约20mL氯仿和5mL甲醇。沉淀后，加进额外大约3mL甲醇，然后让混合物放置1至2日，直至完全再结晶。最后便获得纯化麦角甾-7,22-二烯-3p-醇晶体。在一实施例中，0.5g纯化麦角甾-7,22-二烯-3(3-醇晶体被用作为最后产品。1.5最后产品纯度的鉴定利用熔点分析方法,测定从歩骤1.4获得的麦角甾-7,22-二烯-3p-醇晶体是否纯净，结果其熔点为169-172°C。其他特征技术亦利用来测定这化学物的结构。此外，可利用气相色谱法(GC)和/或高效液相色谱法(HPLC)作为对产品纯度的鉴定。1.5.1高效液相色谱法(HPLC)1.5.1.1标本准备在一50mL量瓶内，将大约500mg测试样本(即，从步骤1.4获得的已纯化的麦角甾-7,22-二烯-3p-醇萃取物)溶解在40mLTHF-Tween80((THF/Tween80):水的比例为1:1)水性混合物中。接着，加进乙腈以装满该量瓶。将所形成的溶液用0.45mm过滤器过滤至小玻璃瓶内，作为HPLC检测之用。1.5丄2不纯麦角甾-7,22-二烯-3p-醇样本的准备在一50mL量瓶内，将大约500mg从上述步骤1.3获得的麦角甾-7,22-二烯-3|3-醇原产品溶解在40mLTHF-Tween80((THF/Tween80):水的比例为l:l)水性混合物中。接着，加进乙腈以装满该量瓶。将所形成的溶液用0.45mm过滤器过滤至小玻璃瓶内，作为HPLC检测之用。1.5.13HP1X系统整个HPLC系统以及它的机械部件均从WatersCorporation,Mass.，USA购买。所使用的仪器包括Waters2695SeparationModule和Waters2996PhotodiodeArrayDetector。1.5丄4运作条件HPLC分析所使用的运作条件在以下表3显示。3柱C18柱温度30oC波长282nrn流速1.OmIVmin注射容量流动相98.5%乙腈-1.5%水1.5丄5结果和分析从图1可见，于1至5分钟的区域内有数个峰，而在大约14分钟的区域内有一个明显的峰(与麦角甾-7,22-二烯-3|3-醇相应)。从图2也可见到一个于大约14分钟的峰。这被确定为代表麦角甾-7,22-二烯-3(3-醇的峰；因此，根据上述歩骤1.1至1.4描述的方法所准备的晶体是基本上纯净的。上述基本上纯化的麦角甾-7,22-二烯-3p-醇晶体，当与其他阳性鉴定结果作特征检验时具有上述方程式(I)描述的结构。1.5.2气相色谱法(GC)1.5.2.1标本准备在一5mL量瓶内，将大约5mg测试样本(即，从步骤1.4获得的已纯化的麦角甾-7,22-二烯-3P-醇萃取物)溶解在2mL氯仿中。接着，加进氯仿以装满该量瓶。将所形成的溶液用0.45mm过滤器过滤至小玻璃瓶内，作为GC检测之用。1.5.2.2不纯麦角甾-7,22-二烯-3(3-醇样本的准备在一5mL量瓶内，将大约5mg从上述步骤1.3获得的麦角甾-7,22-二烯-3(3-醇原产品溶解在2mL氯仿中。接着，加进氯仿以装满该量瓶。将所形成的溶液用0.45mm过滤器过滤至小玻璃瓶内，作为GC检测之用。1.5.2.3GC系统整个GC系统以及它的机械部件均从PerkinElmer，USA购买。所4吏用的"(义器包J舌Clarus600gaschromatographicsystem禾卩FlameIonizationDetector。1.5.2.4运作条件GC分析所使用的运作条件在以下表4显示。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>1.5.2.5结果和分析从图4可见，于25至50分钟的区域内有数个峰，而在大约41.5分钟的区域内有一个明显的峰(与麦角甾-7,22-二烯邻-醇相应)。从图5也可见到一个于大约41.5分钟的峰。这被确定为代表麦角甾-7，22-二烯-3P-醇的峰；因此，根据上述歩骤1.1至1.4描述的方法所准备的晶体是基本上纯净的。上述基本上纯化的麦角甾-7,22-二烯-3p-醇晶体，当与其他阳性鉴定结果作特征检验时具有上述方程式(I)描述的结构。实施例2麦角甾-7,22-二烯-3(3-醇作为云芝标记的用途2.1高效液相色谱法2.1.1标本准备根据实施例1描述的方法来获得麦角甾-7,22-二烯-3(3-醇粉末，而HPLC运作条件和色谱结果均与实施例1所描述的相同。标本是根据上述实施例1中的1.5.1.1段所描述方法准备。2丄2样本准备在一50mL量瓶内，将大约500mg云芝植物40mLTHF-Tween80((THF/Tween80):水的比例为1:1)水性混合物超声萃取10分钟。接着，用乙腈来装满该量瓶，将所形成的溶液作声处理5分钟。将所形成的萃取物用0.45mm过滤器过滤至小玻璃瓶内，作为HPLC分析用的标本。2丄3HPLC系统和运作条件请参考上述实施例1的1.5丄3和1.5丄4段。2丄4结果和分析从图3(云芝植物样本光谱)可以见到一个于大约14分钟(与麦角甾-7，22-二烯-3(3-醇相应)的峰。这显示了麦角甾-7,22-二烯-3P-醇存在于云芝植物样本中。2.2气相色谱法2.2.1标本准备根据实施例1描述的方法来获得麦角甾-7,22-二烯-3|3-醇粉末，而GC运作条件和色谱结果均与实施例1所描述的相同。标本是根据上述实施例1中的1.5丄2段所描述的方法准备。2.1.2样本准备在一100mL量瓶内，将2g云芝植物与100mL氯仿和甲醇的混合物(氯仿:甲醇的比例为2:1)超声萃取20分钟。在减压的情况下，干燥50mL已过滤的萃取物。加进2mL氯仿和内部标准溶液(2ml氯仿含20mg5ct-胆甾烷)以将残渣溶解。将所形成的溶液用0.45mm过滤器过滤至小玻璃瓶内，作为GC检测之用。2丄3GC系统和运作条件请参考上述实施例1的1.5.2.3和1.5.2.4段。2丄4结果和分析从图6(云芝植物样本光谱)可以见到一个于大约41.5分钟(与麦角甾-7,22-二烯-3P-醇相应)的峰。这显示了麦角甾-7,22-二烯-3(3-醇存在于云芝植物样本中。实施例3麦角甾-7，22-二烯-3(3-醇作为治疗白血病的用途以下对裸鼠所做的实验目的是研究麦角甾-7,22-二烯-邓-醇的抗肿瘤活动，尤其是对抗白血病的效果。3.1裸鼠和肿瘤接种将无胸腺裸鼠(BALB/cnu/nu，身体体重为20-25g，年龄为6-10周)保存在已经过高压消毒的笼，而该笼装置有聚酯纤维过滤器以防止裸鼠与病菌接触。在随意喂饲裸鼠前，所有食物和饮用水都经过高压消毒。接着，皮下注射(s.c.)lxl(f人体前髓细胞性白血病HL-60细胞悬浮液于裸鼠的背部。3.2施药时间表和肿瘤量度在这研究中，测试物为根据上述实施例1描述的方法而获得的麦角甾-7,22-二烯-3(3-醇粉末。在注射后14-21日内，当可触知的肿瘤(体积为大约100-200mm3)出现时，随机地将裸鼠分为三个治疗组和一个对照组，每组有15只。之后，对治疗组的裸鼠按三个剂量施用测试物:1.5，15.0或50.0mg(测试物)/kg(裸鼠体重)/日(在蒸馏水中)，而对对照组的裸鼠则施用蒸馏水(为对照物)。所有组别的裸鼠每天均以口服方式(灌胃)施用测试物或蒸馏水直至第28日。而其中在每个星期一、三、五都量度肿瘤的大小。用游标卡尺来量度肿瘤大小，而肿瘤重量和体积则根据以下方程式计算出来月中瘤重量(mg^LxW2x兀/6;月中瘤体积(mm3一LxWxHx兀/6;其中，L，W，H，分别为肿瘤的较大尺寸、较小尺寸、和高度(兀=3.1416)。相对肿瘤重量根据以下方法计算将某天的肿瘤重量除以第一天的平均肿瘤重量。同样地，相对肿瘤体积由以下方法计算将某天的肿瘤体积除以第一天的平均肿瘤体积。在施药后第28日，使裸鼠安乐死，然后记录最后的裸鼠身体体重和肿瘤重量，以便计算最后肿瘤对体重的比例。3.3结果和讨论三个治疗组均显示对于相对肿瘤重量和相对肿瘤体积有减少的效果。此外，治疗组的最后肿瘤对体重的百分比比例较对照组的为低。对于三个治疗组来说，1.5mg/kg/day剂量组是在该三个治疗组中显示出最明显的效果。仅以此为实施例，测试物对于1.5mg/kg/day剂量组的小鼠的抑制肿瘤百分比列表在表5。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>以上的结果被表达为在单一实验中，测试物对于HL-60异种移植在裸鼠内生长的抑制肿瘤百分比的平均值土SE。抑制肿瘤百分比(任何日子n)是根据以下方程式来计算(1-治疗组的相对肿瘤重量(第n日)/对照粗的相对肿瘤重量(第n日))xl00%。从表5可见，1.5mg/kg/day剂量组显示了对HL-60异种移植的抑制，而最大的抑制百分比为第26日的44.32%。3.4结论麦角留-7,22-二烯-3p-醇的抗肿瘤活性可以在三个剂量组中显示出来。而可使用剂量包括但不限于1.0至20.0mg/kg身体体重/日。在一个不限制实施例中，可使用剂量包括但不限于1.0至5.0mg/kg身体体重/曰。本发明的优选实施方案在此完全描述。尽管本说明书提及个别实施例，本发明所属领域的技术人员清楚知道本发明可在本发明范围内对其加以修改。因此，本发明不应被理解为仅限于上述实施例所载。例如，在鉴定和/或定量云芝方法中，本发明提及了使用气相色谱法和高效液相色谱法来分离样本萃取物，但本发明所属领域的技术人员也清楚知道其他分离技术如其他色谱分析技术(如液体或薄层色谱法)、光谱学、分馏和溶液萃取均可被使用。此外，利用麦角甾-7,22-二烯-3(3-醇来定量云芝的方法可以在准备云芝萃取物或云芝配方过程的不同阶段中使用。例如，在准备云芝配方的过程中，可以首先使用上述方法来定量云芝起初物。接着，萃取步骤之后，可以用这方法来测试萃取物。最后，也可以利用这方法来定量由萃取物和其他成分混合而成的最后产品云芝配方。权利要求1、一种已分离和基本上纯化的麦角甾-7，22-二烯-3β-醇，其特征在于，所述麦角甾-7，22-二烯-3β-醇由化学式(I)代表。2、一种利用麦角甾-7，22-二烯-3p-醇作为云芝鉴定标记的用途，其中所述麦角甾-7，22-二烯-3卩-醇由化学式(I)所代表。3、一种在样本中定量云芝的方法，其特征在于，所述方法包括在所述样本中从云芝萃取成分来组成样本萃取物；利用分离技术将所述样本萃取物分离以获得分离结果；测定所述样本萃取物的质量，所述测定是根据在所述样本萃取物中的预定麦角甾-7，22-二烯-3p-醇标准；其中所述麦角甾-7，22-二烯-3p-醇是由化学式(I)所代表。4、如权利要求3所述的方法，其中所述的分离技术是色谱法。5、如权利要求4所述的方法，其中所述色谱法是气相色谱法，其运作条件在表4中显示。6、如权利要求4所述的方法，其中所述色谱法是高效液相色谱法，其运作条件在表3中显示。7、一种组合物，其特征在于，所述组合物包括有效份量的麦角甾-7，22-二烯-3卩-醇，其中所述组合物用于治疗癌症和其他有关疾病或失调，而所述麦角甾-7,22-二烯-3p-醇是由化学式(I)所代表。8、如权利要求7所述的组合物，其中所述癌症是白血病。9、如权利要求7所述的组合物，其中所述组合物进一歩包括所述麦角甾-7,22-二烯-3P-醇与其他草本植物和/或药理上可接受的载体的混10、如权利要求7所述的组合物作为制备治疗癌症和其他有关疾病或失调的药物的应用。11、如权利要求10所述的应用，其中所述癌症是白血病。12、如权利要求IO所述的应用，其中所述组合物进一步包括所述麦角甾-7,22-二烯-邓-醇与其他草本植物和/或药理上可接受的载体的混全文摘要本发明提供一种已分离和基本上纯化的麦角甾-7，22-二烯-3β-醇(ergosta-7，22-dien-3β-ol)和其作为鉴定云芝(Coriolusversicolor)标记的用途及配方。此外，本发明还提供一种用于治疗癌症和其他有关疾病或失调的组合物，该组合物包括麦角甾-7，22-二烯-3β-醇。文档编号A61P35/00GK101544678SQ200910127058公开日2009年9月30日申请日期2009年3月23日优先权日2008年3月27日发明者陈曦龄申请人:维特健灵生物科技有限公司