专利名称：A型产气荚膜梭菌杨树皮类脂灭活疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种疫苗，特别是涉及一种A型产气荚膜梭菌灭活疫苗。本发明还涉 及该疫苗的制备方法。
背景技术：
产气荚膜梭状芽抱杆菌(Clostridiump peffringens)又称魏氏梭菌 (Clostridium welchii)，由英国人Welchii和Nuttad首先从一个腐败的人尸体产生气泡 的血管中分离得到，并以Welchii的姓命名为魏氏梭菌。该菌在各种普通培养基中均能迅 速生长，最突出的生化特性是对石蕊牛乳培养基的"暴裂发酵"，可用于快速诊断。该菌在 体内能形成明显的荚膜，无鞭毛，不能运动。在自然界常以芽孢形式存在，但芽孢形成较困 难。芽孢的抵抗力非常强，10%福尔马林10分钟才能将其致死。该菌广泛分布于自然界， 遍布世界各地，同时也是肠道中的常在菌群之一，在一定条件下，可引起各种严重疾病。该 菌能产生多种强烈的夕卜毒素，目前发现的有12禾中(a 、 e、 Y、 n、 S 、 e 、 t 、 e 、 K 、入、ii 和v)，其中，a、 13、 e和t是主要的致死毒素。依据主要致死性毒素与其抗毒素的中和 试验，可将此菌分为A、 B、 C、 D、 E五个型。 A型产气荚膜梭菌主要引起胃肠道的病变，是人畜气性坏疽病、兔梭菌性下痢、马 坏死性肠炎及人食物中毒的主要致病菌，也是引起鹿出血性肠炎的主要致病菌。该型菌产 生的多种外毒素中，最主要的是a毒素。A型产气荚膜梭菌的变异菌株能产生既无磷脂酶 活性也无溶血活性的相应a毒素，能显著诱导抗体的产生。在生产上可作为高效疫苗菌株 加以利用。 为了控制产气荚膜梭菌病的流行，许多学者曾在细胞水平上研制过产气荚膜梭菌 的单联和多联灭活菌苗用于预防。陈锡全等进行了 "兔病毒性出血症"和A型产气荚膜梭 菌联苗的研究；姚湘燕等采用三个不同地方的牛源产气荚膜梭菌研制过牛产气荚膜梭菌浓 縮氢氧化铝灭活苗，证实该苗安全性好，免疫后30天以2个致死量强毒攻击，可获100%保 护，免疫后200天以同样剂量攻击仍可获90%保护；阎喜军、赵传芳等对吉林省的鹿出血 性肠炎流行情况进行了调查，之后研制了鹿魏氏梭菌单价灭活苗，疫苗使用安全，免疫效果 可靠；谭诗文等曾经进行了羔羊痢疾、大肠杆菌病、羊猝疽、羊肠毒血症四联油佐剂灭活苗 的研制；屠伟英等研制了仔猪产气荚膜梭菌肠毒血症疫苗；徐为中等研制了兔病毒性出血 症、多杀性巴氏杆菌病、A型产气荚膜梭菌病三联浓縮灭活苗，对产气荚膜梭菌的保护率达 到80%以上；宁玉容等研制了羊四种梭菌病(羊快疫、肠毒血症、猝狙、羔羊痢疾)疫苗，该 苗的免疫期限为一年，肠毒血症暂定为半年；文希喆等还研制了产气荚膜梭菌多联干粉灭 活苗。
已研制出的疫苗在使用中尚存在一些需要进一步解决的问题1 、家畜接种反应较 重；2、注射剂量大，使用多有不便；3、免疫持续期较短。因此，需要尝试筛选和使用其它佐 剂，以制备出A型产气荚膜梭菌新的佐剂疫苗，来提高疫苗免疫原性和机体免疫应答水平。
佐剂的种类很多，按其作用机理分为吸附佐剂、颗粒佐剂、免疫调节因子等；也可
3按其来源分为植物来源、微生物及生物来源、人工合成有机物和无机盐等。有些是由不同来 源的物质配制而成的。 免疫佐剂是先于抗原或抗体同时应用，能非特异性地改变或增强机体对抗原的特
异性免疫应答，发挥其辅助作用的物质。免疫佐剂能明显增强多糖或多肽等抗原性微弱的
物质诱导机体产生特异性免疫应答；用最少量的抗原和最少的接种次数剌激机体产生足够
的免疫应答和高滴度的抗体，在血管或粘膜表面能维持较长时间，发挥持久效果。 杨树皮类脂是从毛白杨树皮中提取的一种橙黄色脂溶性纯天然萃取物，具有高度
的生物学活性，含有大量的多糖类、有机酸、甾醇、甙类、黄酮类物质，这些物质在动物体内
协调统一，可以大大提高动物体的免疫机能。 将杨树皮类脂作为免疫佐剂用于制备兽用灭活疫苗具有以下优点1)产生坚强 免疫力的时间持久电镜下观察类脂颗粒能与病毒粒子形成复杂的免疫剌激复合物，类脂 呈弥漫性存在，病毒粒子散在或镶嵌其中，并且仍保持了完整的形态结构，从而使疫苗释放 抗原的时间大大延长。2)免疫空白期短电镜下的疫苗中存在少量裸露游离的病毒粒子和 类脂佐剂，接种机体后可迅速剌激机体产生免疫应答，5 7天即可产生坚强免疫力，应答 时间比油佐剂疫苗提前10天左右。3)剌激性小，无副作用传统疫苗由于采用矿物油为 佐剂制备疫苗，剌激性大、毒副作用强，机体长时间处于免疫力低下期，通常这一时间持续 24 48小时，病原菌很容易在这段时间乘虚而入，造成免疫后24 48小时内爆发疾病。 研究表明，该佐剂疫苗注射后，无注苗反应，免疫造成的应激小，不影响精神食欲，注射局部 无肿胀、无坏死，且佐剂本身是一种纯天然物质，无残留，符合动物性食品卫生出口要求；4) 保存运输方便该佐剂疫苗打破了传统疫苗保存温度的限制，可在较大的温度范围下保存 运输，O 3(TC环境中保存6个月不变色、不分层，不影响免疫期。
发明内容
本发明的目的是提供一种A型产气荚膜梭菌杨树皮类脂灭活疫苗，以提高疫苗免 疫原性和机体免疫的应答水平。 本发明的另一个目的是提供A型产气荚膜梭菌杨树皮类脂灭活疫苗的制备方法。
本发明的A型产气荚膜梭菌杨树皮类脂灭活疫苗是以杨树皮类脂为佐剂，将灭活 脱毒的A型产气荚膜梭菌毒素液与杨树皮类脂佐剂按照4:1的重量比混合，高速搅拌合 成的疫苗。
本发明的A型产气荚膜梭菌杨树皮类脂灭活疫苗是按照以下步骤制备得到的
1)将A型产气荚膜梭菌无菌接种于培养基肉肝胃酶消化汤中，于37t:厌氧培养 15 20h后，收集菌液； 2)选取典型菌落接种于血斜面上，于37t:厌氧培养20 24h ; 3)将上述纯培养的菌液按照培养基总重1%的比例接种于肉肝胃酶消化汤中，
35。C恒温培养7 8h，4。C下3000r/min离心20min，得到的上清液即为毒素液； 4)在收集的毒素液中加入毒素液总重0. 3 0. 5%的甲醛，充分振摇后，37t:灭活
脱毒5d，期间间断振摇； 5)将灭活脱毒的毒素液与杨树皮类脂佐剂按照4 : 1的重量比混合，高速搅拌后， 合成疫苗。
其中，所述的培养基肉肝胃酶消化汤是在水浴中煮沸10min，进行排氧处理后的肉肝胃酶消化汤。 所述步骤5)中的高速搅拌是以500 1000r/min的速度进行高速搅拌。 本发明制成的A型产气荚膜梭菌杨树皮类脂灭活疫苗具有以下优点 1)将杨树皮类脂作为免疫佐剂用于制备灭活疫苗，类脂颗粒能与病毒粒子形成复
杂的免疫剌激复合物，类脂呈弥漫性存在，病毒粒子散在或镶嵌其中，并且仍保持了完整的
形态结构，从而使疫苗释放抗原的时间大大延长。 2)该疫苗注射后，无注苗反应，免疫所造成的应激小，不影响精神、食欲，注射局部无肿胀，无坏死。 3)该疫苗打破了传统疫苗保存温度的限制，可在较大的温度范围下保存运输，保
存运输方便，O 3(TC环境中保存6个月不变色、不分层，不影响免疫期。 4)本发明在疫苗制备工艺中对肉肝胃酶消化汤进行排氧处理，培养出的菌苗质量更好。
具体实施方式
实施例1 将A型产气荚膜梭菌T5-A解冻，无菌接种于水浴中煮沸10min排氧处理的厌氧肉肝胃酶消化汤中，37t:厌氧培养15h。钓取菌液分别接种于5%鲜血-葡萄糖_琼脂平板和厌氧肉肝胃酶消化汤上，培养观察培养特性及菌落形态是否一致。然后钓取鲜血-葡萄糖-琼脂平板上有清晰双溶血环的产气荚膜梭菌菌落特征的菌少许，制片，革兰氏染色，镜检，观察记录结果。将典型菌落接种于血斜面，于37t:厌氧纯培养24h，生化试验(糖发酵试验，喷哚试验，H2S试验，硝酸盐还原试验，石蕊牛乳培养基试验等)鉴定其生化特性。
取厌氧肉肝胃酶消化汤一管，水浴煮沸10min进行排氧处理，迅速冷却至37°C左右，将上述纯培养的菌液按照培养基总重l^的比例接种于管内，35t:恒温培养7h，4°C 3000r/min离心20min，上清液即为毒素液。 分别以O. 2ml，0. lml，O. 05ml，0. 025ml，0. Olml五个不同剂量的毒素液对16 20g小白鼠尾静脉注射，0. 2ml/只，2只/剂量，注射剂量不足0. 2ml的用明胶缓冲液补充，尾静脉注射灭菌生理盐水作为对照，0. 2ml/只，观察3d，测定小白鼠的最小致死量，并根据死亡情况判定制苗菌种的毒力是否符合制苗菌株的毒力标准。 达到制苗毒力要求的毒素液做革兰氏染色镜检，接种普通琼脂斜面、血小板、厌气肉肝汤和石蕊牛乳培养基各2管，每管接种0. 2ml，37t:培养48h，观察是否有杂菌生长，并测定小白鼠最小致死量是否一致。 取经纯粹检验合格的毒素液，每瓶按毒素液总重的0.5%加入甲醛，经充分振摇后，37t:灭活脱毒5d，每天早、中、晚各振摇一次。并进行灭活检验(取样接种于TG平板、TG小管、GA斜面、GP小管、血斜面和厌氧肉肝汤，37t:培养3d，观察结果)和脱毒检验(16 20g小白鼠，3只/组，0. 4ml/只，设立两只对照，尾静脉注射观察3d，应全部健活，如有死亡继续脱毒，直至不死为止)。 将鲜杨树皮烘干粉碎，采用乙醚抽提法进行抽提，粗提物再用乙醚抽提，得到杨树皮类脂，在经过热过滤提纯后，常温密封保存备用。
5
将灭活脱毒的毒素液与杨树皮类脂佐剂按照4 : 1的重量比混合，以1000r/min
的速度高速搅拌后，合成疫苗。 将合成的疫苗无菌检查，即得成品。 实施例2 将A型产气荚膜梭菌T5-A解冻，无菌接种于水浴中煮沸10min排氧处理的厌氧肉肝胃酶消化汤中，37t:厌氧培养20h。钓取菌液分别接种于5%鲜血-葡萄糖-琼脂平板和厌氧肉肝胃酶消化汤上，培养观察培养特性及菌落形态是否一致。然后钓取鲜血-葡萄糖-琼脂平板上有清晰双溶血环的产气荚膜梭菌菌落特征的菌少许，制片，革兰氏染色，镜检，观察记录结果。将典型菌落接种于血斜面，于37t:厌氧纯培养20h，生化试验(糖发酵试验，喷哚试验，H2S试验，硝酸盐还原试验，石蕊牛乳培养基试验等)鉴定其生化特性。
取厌氧肉肝胃酶消化汤一管，水浴煮沸10min进行排氧处理，迅速冷却至37°C左右，将上述纯培养的菌液按照培养基总重1^的比例接种于管内，35t:恒温培养7h，4°C 3000r/min离心20min，上清液即为毒素液。 取经纯粹检验合格的毒素液，每瓶按毒素液总重的0.3%加入甲醛，经充分振摇后，37t:灭活脱毒5d，每天早、中、晚各振摇一次。 将灭活脱毒的毒素液与杨树皮类脂佐剂按照4 : 1的重量比混合，以1000r/min的速度高速搅拌后，合成疫苗，无菌检查后得成品。
权利要求
A型产气荚膜梭菌杨树皮类脂灭活疫苗，其特征是是以杨树皮类脂为佐剂，将灭活脱毒的A型产气荚膜梭菌毒素液与杨树皮类脂佐剂按照4∶1的重量比混合，高速搅拌合成的疫苗。
2. 权利要求1所述A型产气荚膜梭菌杨树皮类脂灭活疫苗的制备方法，其特征是包括 以下步骤1) 将A型产气荚膜梭菌无菌接种于培养基肉肝胃酶消化汤中，于37t:厌氧培养15 20h后，收集菌液；2) 选取典型菌落接种于血斜面上，于37t:厌氧培养20 24h ;3) 将上述纯培养的菌液按照培养基总重1%的比例接种于肉肝胃酶消化汤中，35°。恒 温培养7 8h，4。C下3000r/min离心20min，得到的上清液即为毒素液；4) 在收集的毒素液中加入毒素液总重0. 3 0. 5%的甲醛，充分振摇后，37t:灭活脱毒 5d，期间间断振摇；5) 将灭活脱毒的毒素液与杨树皮类脂佐剂按照4 : l的重量比混合，高速搅拌后，合成疫苗。
3. 根据权利要求2所述的A型产气荚膜梭菌杨树皮类脂灭活疫苗的制备方法，其特征 是所述的培养基肉肝胃酶消化汤是在水浴中煮沸10min，进行排氧处理后的肉肝胃酶消化 汤。
4. 根据权利要求2所述的A型产气荚膜梭菌杨树皮类脂灭活疫苗的制备方法，其特征 是所述步骤5)中的高速搅拌是以500 1000r/min的速度进行高速搅拌。
全文摘要
A型产气荚膜梭菌杨树皮类脂灭活疫苗，是以杨树皮类脂为佐剂，将灭活脱毒的A型产气荚膜梭菌毒素液与杨树皮类脂佐剂混合合成疫苗。具体是将A型产气荚膜梭菌无菌接种于肉肝胃酶消化汤中，37℃厌氧培养15～20h，选取典型菌落接种于血斜面上，37℃厌氧培养20～24h；再按照培养基总重1％的比例接种于肉肝胃酶消化汤中，35℃恒温培养7～8h，离心得到毒素液，加入毒素液总重0.3～0.5％的甲醛，37℃灭活脱毒5d。将灭活脱毒的毒素液与杨树皮类脂佐剂按照4∶1的重量比混合，高速搅拌合成疫苗。本发明的A型产气荚膜梭菌杨树皮类脂灭活疫苗免疫力时间长，注射后无注苗反应，应激小。
文档编号A61K39/08GK101695568SQ200910075809
公开日2010年4月21日 申请日期2009年10月23日 优先权日2009年10月23日
发明者王靖 申请人:王靖;