专利名称：锦灯笼宿萼皂苷在制备治疗糖尿病药物和保健品中的应用的利记博彩app
技术领域：
本发明属于制药领域中的应用，具体涉及锦灯笼宿萼皂苷在制备治疗糖尿病药物及保健品中的应用。
背景技术：
随着社会进步和经济快速发展，糖尿病的发病率日益增高，而且中青年人两倍于老年人的速度加入糖尿病的“大军”。因此，与预防和治疗糖尿病相关的药物成为国际、国内研究的热点和发展趋势。
目前，我国的降糖市场以西药为主，约占整个市场份额的73.68％；中成药为辅，约占24.7％。占降糖类产品绝对优势份额的主要是化学类处方药，虽然效果较明显，但长期服药引起的耐药性、抗药性、肝肾损伤等副作用使糖尿病患者倍感痛苦。而植物成分，特别是中医常用的中药成分如植物多糖和皂苷等，不仅毒副作用小，而且很多药物同时具有降血脂、提高免疫力、调节内分泌等多种作用，对糖尿病并发症有预防及治疗作用。因而从药用植物中发掘既具有有效降血糖活性又有增强机体免疫能力的天然药物具有重要的意义和广阔的市场应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供锦灯笼宿萼皂苷的制备方法及其锦灯笼宿萼皂苷在制备治疗糖尿病药物和保健品方面的应用。
本发明的锦灯笼宿萼皂苷的制备方法具体步骤如下 1干燥的锦灯笼果实宿萼用70％的乙醇或者甲醇溶液，重复3次回流提取，每次1-4小时50-70℃，过滤后将滤液合并、离心，旋转蒸发使滤液浓缩；用水饱和的正丁醇溶液对滤液进行萃取后，旋转蒸发得浸膏样物质；用少量甲醇溶解沉淀，加入4-6倍乙醚反复洗涤后，在真空干燥箱中干燥得皂苷粗品。
2皂苷粗品通过D-101型大孔吸附树脂柱，用蒸馏水进行洗脱后，采用60-80％浓度的乙醇或者甲醇溶液进行洗脱并收集富含皂苷的洗脱液；将富含皂苷的洗脱液旋转蒸发后，冰冻干燥，即得锦灯笼宿萼皂苷。
经检测该样品主要成分为甾体皂苷，动物实验表明该皂苷具有明显的降低血糖的作用，同时对动物具有明显的免疫增强作用。因此锦灯笼宿萼皂苷可作为糖尿病患者的治疗药品以及预防糖尿病、提高机体免疫能力的保健品。
本发明的优点 1.本发明具体地阐明了锦灯笼宿萼中降血糖的有效药用成分为甾体皂苷，具有显著降血糖作用和免疫增强作用，可用于糖尿病患者的治疗药物以及预防糖尿病、提高机体免疫能力的保健品。而其他相关研究和发明均为极其粗糙的提取物，药效成分不明确，利用价值低。
2.提取工艺简便，成本低廉。
3.材料来源广泛。锦灯笼适应性很强，极易大规模人工栽种，一旦种植可多年生存下去，规模化的种植锦灯笼可以使种植农户脱贫致富。
具体实施例方式 实施例1 锦灯笼宿萼皂苷的制备 步骤1将锦灯笼果实宿萼200g浸泡于60-70％的乙醇溶液1500ml过夜，重复3次回流提取，每次2小时60℃，过滤后将滤液合并；滤液离心后，旋转蒸发使滤液浓缩至约200ml；用水饱和的正丁醇溶液对滤液进行反复萃取，正丁醇层合并后，旋转蒸发得浸膏样物质；用少量甲醇溶解沉淀，加入5倍乙醚反复洗涤至上清液无色，弃上清；将沉淀在真空干燥箱中干燥得粗皂苷约1.5g。
步骤2将组皂苷200mg溶解在20ml蒸馏水中，上样于已经准备好的D-101型大孔吸附树脂柱；用蒸馏水、30％的乙醇进行洗脱后，采用60％的乙醇进行洗脱，并收集该洗脱液；将该富含皂苷的洗脱液旋转蒸发后，冰冻干燥，即得锦灯笼宿萼皂苷约100mg。
实施例2 锦灯笼宿萼皂苷的制备 步骤1将锦灯笼果实宿萼200g浸泡于80％的甲醇溶液1500ml过夜，重复3次回流提取，每次1小时50℃，过滤后将滤液合并；滤液离心后，旋转蒸发使滤液浓缩至约200ml；用水饱和的正丁醇溶液对滤液进行反复萃取，正丁醇层合并后，旋转蒸发得浸膏样物质；用少量甲醇溶解沉淀，加入4倍乙醚反复洗涤至上清液无色，弃上清；将沉淀在真空干燥箱中干燥得粗皂苷约1.5g。
步骤2将组皂苷200mg溶解在20ml蒸馏水中，上样于已经准备好的D-101型大孔吸附树脂柱；用蒸馏水、30％的乙醇进行洗脱后，采用70％的甲醇进行洗脱，并收集该洗脱液；将该富含皂苷的洗脱液旋转蒸发后，冰冻干燥，即得锦灯笼宿萼皂苷约100mg。
实施例3 锦灯笼宿萼皂苷的制备 步骤1将锦灯笼果实宿萼200g浸泡于70％的甲醇溶液1500ml过夜，重复3次回流提取，每次4小时70℃，过滤后将滤液合并；滤液离心后，旋转蒸发使滤液浓缩至约200ml；用水饱和的正丁醇溶液对滤液进行反复萃取，正丁醇层合并后，旋转蒸发得浸膏样物质；用少量甲醇溶解沉淀，加入6倍乙醚反复洗涤至上清液无色，弃上清；将沉淀在真空干燥箱中干燥得粗皂苷约1.5g。
步骤2将组皂苷200mg溶解在20ml蒸馏水中，上样于已经准备好的D-101型大孔吸附树脂柱；用蒸馏水、30％的乙醇进行洗脱后，采用60％的甲醇进行洗脱，并收集该洗脱液；将该富含皂苷的洗脱液旋转蒸发后，冰冻干燥，即得锦灯笼宿萼皂苷约100mg。
实施例4 锦灯笼宿萼皂苷降血糖活性的药效试验 昆明小鼠四氧嘧啶致高血糖后，筛选高血糖小鼠每组10只；连续灌胃7天后测定其空腹血糖。其分组如下 正常对照组为正常小鼠连续灌胃7天生理盐水； 高血糖对照组为四氧嘧啶致高血糖后连续灌胃7天生理盐水； 消渴丸组为四氧嘧啶致高血糖后连续灌胃7天消渴丸60mg/kg，为阳性对照组； 高血糖+皂苷组为四氧嘧啶致高血糖后连续灌胃7天锦灯笼宿萼皂苷150mg/kg。
(1)降血糖作用 由表1可以看出，与高血糖对照组相比，锦灯笼宿萼皂苷对四氧嘧啶致高血糖小鼠具有明显降血糖作用(p<0.01)，其作用效果与消渴丸相当。
表1 锦灯笼宿萼皂苷对四氧嘧啶引起的高血糖小鼠空腹血糖的影响
实验测定值用平均值±标准差表示，*表示与高血糖对照组比较P<0.01。
(2)对体重的影响 由表2可以看出，正常对照组体重增加，高血糖组体重有所降低，降低率为1.5％；而灌胃皂苷组的糖尿病小鼠体重明显增重，增重的效果与消渴丸相当。
表2 锦灯笼宿萼皂苷对四氧嘧啶引起的高血糖小鼠体重的影响
注实验测定值用平均值±标准差表示 (3)对饮水量的影响 由表3可以看出，正常对照组和高血糖组的饮水量没有明显变化；而灌胃皂苷组的糖尿病小鼠的饮水量明显减少，减少的饮水量与消渴丸相当。
表3 锦灯笼宿萼皂苷对四氧嘧啶引起的高血糖小鼠饮水量的影响
注实验测定值用平均值±标准差表示 3 毒性实验 以正常皂苷剂量的十倍(1.5g/kg)连续灌胃昆明小鼠7天后，无一小鼠死亡并未见任何毒副作用和异常，说明该皂苷无毒副作用。
上述动物实验表明锦灯笼宿萼皂苷具有明显的降低血糖的作用，并未见任何毒副作用，可作为糖尿病患者的治疗药品或高血糖亚健康人群缓解以及预防糖尿病的保健品。
实施例5 锦灯笼宿萼皂苷免疫增强活性实验 一、动物分组及其免疫方法 五周龄雄性ICR小鼠用于动物实验，每组5只；以鸡卵清蛋白(OVA)为抗原，皮下注射。
实验分组如下 第一组(Saline)注射生理盐水，作为空白对照 第二组(OVA)注射OVA100μg/只，作为阴性对照 第三组(AL)注射OVA100μg/只+Al(OH)3胶体200μg/只，为阳性对照 第四组(锦灯笼宿萼皂苷)注射OVA100μg/只+锦灯笼宿萼25μg/只 以上各组均免疫两次，间隔14天。第二次免疫后14天，MTT法检测动物脾淋巴细胞增值反应；用ELISA方法检测动物抗血清中抗OVA特异性抗体IgG的变化。
二、小鼠脾淋巴细胞转化实验 1、无菌取小鼠脾脏，并制成单细胞悬液，用RPMI1640培养液将细胞稀释成2x107/ml。
2、于96孔培养板中，每孔加100μl脾细胞悬液，各孔分别加等体积的ConA溶液(终浓度为5μg/ml)或LPS溶液(终浓度为10μg/ml)，并设空白对照组。
3、37℃、5％CO2培养箱中培养68小时后，各孔分别加10μl MTT溶液(5mg/ml)，继续培养4小时，离心后，每孔分别吸去上清，加入200μl酸性二甲基亚砜(DMSO)溶液，振荡，于室温放置15min。
4、用酶标仪于570nm处测定OD值。按下式计算刺激指数SI＝试验孔OD570/对照孔OD570 5、实验结果 (1)锦灯笼宿萼皂苷对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖反应的影响见表4. 表4锦灯笼宿萼皂苷对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖反应的影响 注实验结果用SI平均值±标准差表示(n＝5)，*表示OVA对照组比较P<0.01 表4实验结果表明与OVA组相比，锦灯笼宿萼皂苷组对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖反应具有明显的增强作用，而铝佐剂组差异不显著。
(2)锦灯笼宿萼皂苷对LPS诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖反应的影响见表5. 表5锦灯笼宿萼皂苷对LPS诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖反应的影响
注实验结果用SI平均值±标准差表示(n＝5)，*表示OVA对照组比较P<0.01 表5实验结果表明与OVA组相比，锦灯笼皂苷对LPS诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖反应具有明显的增强作用，而铝佐剂组差异不显著。
三、ELISA检测小鼠抗血清中抗OVA特异性抗体IgG 1、于96孔酶标板上，每孔加入100μl包被液(含50μg/ml OVA的0.05M，PH9.6的碳酸盐缓冲液)，置4℃孵育24小时。
2、用洗涤缓冲液液洗涤3次，每次3分钟。
3、每孔加封闭液100μl，于37℃孵育1小时后洗涤。
4、每孔分别加100μ]待测小鼠抗血清稀释液，37℃孵育1小时，用洗涤缓冲液洗涤。
5、分别加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG，IgGl或IgG2b抗体稀释液100μl，37℃孵育0.5小时，洗涤。
6、每孔分别加50μl底物显色液A和底物显色液B，室温放置15分钟，每孔加终止液(2M H2SO4)50μl终止反应，用酶标仪于波长450/630nm处测定OD值。
7、实验结果 实验结果(见表6)表明与OVA组相比，锦灯笼宿萼皂苷组抗血清抗OVA特异性抗体IgG差异显著，其作用效果与铝佐剂组相当。
表6锦灯笼宿萼皂苷对小鼠抗血清中抗OVA抗体IgG含量的影响
注实验测定值用平均值±标准差表示(n＝5)，*表示OVA对照组比较P<0.05 免疫增强活性试验表明锦灯笼宿萼皂苷既增强了机体的细胞免疫又增强了机体的体液免疫，其作用效果优于AL，可用于提高机体免疫能力的保健品。
权利要求
1、锦灯笼宿萼皂苷的制备方法，其特征是具体步骤如下
(1)、干燥的锦灯笼果实宿萼用70％的乙醇或者甲醇溶液，重复3次回流提取，每次1-4小时50-70℃，过滤后将滤液合并、离心，旋转蒸发使滤液浓缩；用水饱和的正丁醇溶液对滤液进行萃取后，旋转蒸发得浸膏样物质；用少量甲醇溶解沉淀，加入4-6倍乙醚反复洗涤后，在真空干燥箱中干燥得皂苷粗品；
(2)、皂苷粗品通过D-101型大孔吸附树脂柱，用蒸馏水进行洗脱后，采用60-80％浓度的乙醇或者甲醇溶液进行洗脱并收集富含皂苷的洗脱液；将富含皂苷的洗脱液旋转蒸发后，冰冻干燥，即得锦灯笼宿萼皂苷。
2、按照权利要求1所述制备方法制备的锦灯笼宿萼皂苷。
3、锦灯笼宿萼皂苷在制备治疗糖尿病药物中的应用。
4、锦灯笼宿萼皂苷在制备预防糖尿病保健品中的应用。
全文摘要
本发明属于制药领域中的应用，具体涉及锦灯笼宿萼皂苷在制备治疗糖尿病药物及保健品中的应用。本发明用干燥的锦灯笼果实宿萼经过回流提取、浓缩、萃取、洗涤、干燥等得皂苷粗品。通过D-101型大孔吸附树脂柱，用蒸馏水进行洗脱后，再进行乙醇溶液洗脱、旋转蒸发后，冰冻干燥等即得锦灯笼宿萼皂苷。提取工艺简便，成本低廉。材料来源广泛，适应性很强，极易大规模人工栽种。本发明产品具有显著降血糖作用和免疫增强作用，可用于糖尿病患者的治疗药物以及预防糖尿病、提高机体免疫能力的保健品。
文档编号A61K36/81GK101474291SQ200910066490
公开日2009年7月8日 申请日期2009年1月22日 优先权日2009年1月22日
发明者王桂云, 刘雅丽 申请人:东北师范大学