专利名称：一种地衣芽胞杆菌及原药的制备方法
技术领域：
本发明涉及污染水体净化、垃圾除臭等新领域，更具体涉及一种地衣芽胞杆菌，同 时还涉及一种地衣芽胞杆菌制备原药(5，000亿活芽胞/克)的方法，将在饲料工业和水产 养殖方面上得到广泛应用。随着芽胞杆菌功能还在不断地被发现，应用范围也在不断扩大， 在国内国际市场上有很强的竞争力。
背景技术：
自20世纪50年代以来，抗生素作为疾病治疗剂和动物生长促进剂发挥了重大作 用。然而，由于抗生素负面效果越来越严重，世界卫生组织已禁止在饲料中使用任何抗菌药 物，一些发达国家对兽用抗生素的使用也有明确规定。饲料和养殖业以添加抗生素预防和 促进动物生长的饲养方式已经受到了很大冲击，抗生素替代品的使用和推广成为养殖业发 展的必然方向。芽胞杆菌益生菌具备抗生素预防疾病和促进生长的特点，成为抗生素的替 代品，将取得理想的应用效果，在养殖业中具有很大的开发潜力。 益生菌又称微生态制剂，是指有益微生物经过特殊驯化和加工制成的活菌制剂， 益生菌可以改善动物肠道中微生物的菌群平衡，防治某些细菌性疾病的发生，能提高动物 的饲料利用率、提高机体免疫力，促进生长和改善生产性能，得到安全无药物残留的动物产
品。现已开发成商品制剂的益生菌有芽胞杆菌类、酵母、乳酸菌、双歧杆菌、链球菌、曲霉等。 目前，国内芽胞杆菌益生菌制品的生成工艺主要有两种，即固体发酵法和液体深 层发酵法。固体发酵法是把益生菌接种到固体培养基上进行发酵培养，其优点是相对管理 比较粗放，具有生产工艺简单，投资少的特点，但同时具易受杂菌污染，菌体含量不易控制、 产品质量不稳定的缺点。目前我国大多数芽胞杆菌益生菌产品都是采用该生产方法。液体 深层发酵法是采用现代发酵技术，将益生菌菌种接种到反应器中进行通风培养，对整个发 酵过程都可以进行精细的过程控制，具有便于无菌操作，容易控制菌体含量，产品质量稳定 的特点，但技术水平要求较高，相对固体发酵投资要高，但更适合工业化生产。其一般工艺 流程为菌种接种培养一种子罐培养一发酵罐发酵培养一排放培养液一收集菌体一加入适 量载体和保护剂一干燥一粉碎一过筛一稀释混和一成品包装一质检一益生菌产品。
国内通常采用的固体发酵方式生产的地衣杆菌制剂(有效活菌数一般在200亿 cfu/g左右)和部分厂家采用液体发酵生产的制剂(芽胞数一般为1000-2000亿cfu/g)。
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种地衣芽胞杆菌，它能在动物消化道中萌发，而且 有自身增殖的能力；能够拮抗动物病原菌，维护和调节肠道生态平衡；能够产生多种酶类， 促进动物消化酶活性；还能够增强动物机体的免疫功能。 本发明的另一个目的是在于提供了一种地衣芽胞杆菌制备原药的方法，安全、高 效优质，方法易行，由该工艺生产的地衣芽胞杆菌原药中的活芽胞数达5， 000亿活芽胞/克。发明内容包括安全的地衣芽孢杆菌益生菌的筛选；培养基优化及液体高密度补料发 酵技术；高效的芽胞提取回收工艺；产品活芽胞数高。为了实现上述目的，本发明采用以下 技术措施 —种地衣芽胞杆菌制备原药的方法，其步骤是
l.Bl菌种的筛选 从全国各地不同土壤和水体中收集富含芽孢杆菌芽胞的土样和水样，将样品用无 菌水稀释到100-200个芽胞/ml水，涂布在A工分离培养基上，于29-3rC温控培养箱中培 养3-5d后，挑出芽胞同步率高的菌株，经革兰氏染色后显微镜检，选出具有Bl形态特征的 菌株转接到液体摇瓶发酵培养基中，29-3rC摇瓶培养后，选出生长迅速(发酵周期36小时 以内)、生物量高(600nm可见光光密度0D6。。 > 70)的菌种KN-08转接到试管斜面生长后于
4t:保种。 2.Bl菌种的确认 对从土壤中分离到的KN-08菌株进行了形态和生理生化特征研究，测定KN-08菌 株的16SrDNA共1514个有效碱基，根据地衣芽孢杆菌在Genebank中的16SrDNA序列进行 分子鉴定，结合系统发育资料及分类资料(伯杰氏细菌手册)鉴定KN-08菌株为地衣芽胞 杆菌。KN-08菌株于2008年12月09日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC NO. M208251 (菌种专利保护)。地衣芽胞杆菌形态学特性细胞排列呈杆状、单生，产生近中 生的椭圆状芽孢，孢囊稍膨大；培养特性在肉汁培养基上的菌落为扁平、边缘不整齐、白 色、表面粗糙皱褶，24h后菌落直径为3mm;生理特性产生多肽抗菌素，可诱导产生青霉素 酶。产碱性蛋白酶；代谢特性在缺乏生长因素的条件下能以氨作为唯一氮源生长。
3.高产Bl的培养基优化 采用Box-Behken设计的响应面实验，以芽胞数为筛选指标，首先从众多因子中选 择重要的部分因子筛选设计，利用单因子实验首先从碳源、氮源、微量元素因子中选择因子 筛选设计，用于寻找临近最大值的优化区域的最陡坡试验(Path of Ste印est ascent), 和用于优化响应面最大值的中心组合设计(CentralComposite Design)来拟合因素与响 应值之间的函数关系得到回归方程，通过对回归方程的分析，采用多元一次和二次回归方 程来拟合因素与响应值之间的函数关系得到回归方程，通过回归方程设计B^发酵培养基 B-51，芽胞数为70亿cfu/ml ;设计优化B51发酵培养基B_51 (葡萄糖28. 84g/L，玉米浆 27. 92g/L，蛋白胨30. 05g/L，，豆粕3. 88g/L，水解植物复合氨基酸3. 91g/L，，磷酸二氢钾 (KH2P04) 0. 5g/L，氯化钠(NaCl) 3g/L)。 4.液体深层高密度补料发酵技术提高发酵生物量 采用Box-Behken设计的响应面实验优化的发酵培养基B-51进行分批发酵动力学 研究，以发酵前期，对数期，稳定期OD、溶氧、pH、芽胞数为指标，确定各时期迟缓期、对数生 长期和稳定期最佳营养平衡(以C/N表示)，及与芽胞形成关系。在分批发酵研究基础上，优 化高密度补料发酵工艺，在分批发酵配方上进行碳源和氮源浓度加倍，采用糖浓度10g/ml， 通过补加葡萄糖，使发酵过程还原糖浓度为0. 5-1. 0%质量比，发酵过程共用葡萄糖7%质 量比；发酵过程补加氨水，使pH控制在6. 8-7. 2范围，发酵液活芽胞数达100亿/ml。
5.特殊、高效的芽胞提取与回收工艺 芽胞提取与回收工艺发酵罐酸化2N稀盐酸，2_4. 5，升温35_37。C ， 80-85目过滤，加3. 18%。(质量比)硫酸锌，搅拌3-5分钟，再加2. 27%。(质量比)黄血盐，搅拌 1-2分钟，静置15-20分钟，离心菌浆进行喷雾干燥，喷雾干燥进口风温200-20rC，出口风 温85-87°C ，原粉活芽胞数达5， 000亿/克。 发明的目的在于对筛选的生长迅速、生物量高、产芽胞同步率高的地衣芽胞杆菌 菌株(菌种专利保护)，采用培养基的优化和高密度发酵工艺、高效芽胞回收工艺，生产出 活芽胞数达到5， 000亿/克的地衣芽胞杆菌安全原药，远高于国内通常采用的固体发酵方 式生产的地衣杆菌制剂(有效活菌数一般在200亿cfu/g左右)和部分厂家采用液体发酵 产品(芽胞数一般为1000-2000亿cfu/g)。 —种5， 000亿活芽胞/克地衣芽胞杆菌原药的制备方法，其步骤是
l.Bl菌种的筛选 从全国各地不同土壤和水体中收集富含芽孢杆菌芽胞的土样和水样，将样品用无 菌水稀释到100-200个芽胞/ml水，涂布在A工分离培养基上，于29-3rC温控培养箱中培养 3-5d后，挑出芽胞同步率高的菌株，经革兰氏染色后显微镜检，选出具有Bl形态特征的菌 株转接到B工液体摇瓶发酵培养基中，29-3rC摇瓶培养后，选出生长迅速(发酵周期36小 时以内)、生物量高(600nm可见光光密度0D6。。 > 70)的菌种KN-08转接到试管斜面生长后 于4"保种。 所述的^分离培养基(微生物实验手册)蛋白胨10g，酵母浸粉5g，氯化钠 (NaCl) 10g，琼月旨15g，水1000mL， pH 7. 0， 121。C灭菌30min ; 所述的B工液体摇瓶发酵培养基豆粕20g，玉米浆10g，葡萄糖25g，蛋白胨5g， 氯化钠(NaCl)3g，磷酸二氢钾(KH2P04)0. 5g，七水硫酸镁(MgS04. 7H20)0. 2g，七水硫酸亚铁 (FeS04. 7H20)0. Olg，水1000mL， pH 7. 5， 121。C灭菌30min。
2.Bl菌种的确认对KN-08菌株进行了形态和生理生化特征研究，测定KN-08菌株的16SrDNA共 1514个有效碱基，根据地衣芽孢杆菌在Genebank中的16SrDNA序列进行分子鉴定，结合系 统发育资料及分类资料(伯杰氏细菌手册)鉴定KN-08菌株为地衣芽胞杆菌。KN-08菌株 于2008年12月09日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC N0.M208251。
3.高产Bl的培养基优化 采用Box-Behken设计的响应面实验，(以芽胞数为筛选指标，利用单因子实验首 先从碳源、氮源、微量元素因子中选择因子筛选设计，采用多元一次和二次回归方程来拟合 因素与响应值之间的函数关系得到回归方程，通过回归方程设计培养基B-51，芽胞数为70 亿cfu/ml)首先从众多因子中选择重要的部分因子筛选设计，利用合理的试验设计，考虑 碳源、氮源、无机离子等多个因素之间的协同作用，用于寻找临近最大值的优化区域的最陡 坡试验(Path of Ste印estascent)，和用于优化响应面最大值的中心组合设计(Central Composite Design)。来拟合因素与响应值之间的函数关系，通过对回归方程的分析，设计 优化Ba发酵培养基B-51 :为葡萄糖28. 84g/L，玉米浆27. 92g/L，蛋白胨30. 05g/L，，豆粕 3. 88g/L，水解植物复合氨基酸3. 91g/L，，磷酸二氢钾(KH2P04) 0. 5g/L，氯化钠(NaCl) 3g/L。
4.液体深层高密度补料发酵技术提高发酵生物量 采用Box-Behken设计的响应面实验优化的发酵培养基进行分批发酵动力学研 究，以发酵前期，对数期，稳定期0D、溶氧、pH、芽胞数为指标，确定各时期迟缓期、对数生长期和稳定期最佳营养平衡(以C/N表示)，及与芽胞形成关系。在分批发酵研究基础上，优 化高密度补料发酵工艺。 5.特殊、高效的芽胞提取与回收工艺 芽胞提取与回收工艺发酵罐酸化2N稀盐酸，2，升温35 °C ， 80目过滤，加 3. 18%。(质量比)硫酸锌，搅拌3分钟，再加2. 27%。(质量比)黄血盐，搅拌l分钟，静置 15分钟，离心菌浆进行喷雾干燥，喷雾干燥进口风温200°C，出口风温85-87t:，原粉活芽胞 数达5，000亿/克。
6.活芽胞数检测 称取步骤5中获得的原粉0.99g l.Olg试样到中性瓶中，加入100mL，浓度 为0. 85-0. 9% (质量比)水的生理盐水，猛烈摇动混合均匀。再把混合瓶放在磁力搅 拌器(CJJ-4上海君竺仪器制造有限公司)平台上混合30-35min后，放入超声波水浴器 (KQ-600B昆山市超声仪器有限公司)中超声15-20min，然后再放在匀质器(Bagmixer 400W/P/VW)中混合10-15min。将处理好的试样溶液依次稀释到10—8放入7(TC水浴锅中水 浴30-35min，然后稀释到10—9取0. lmL到每个营养琼脂培养基平板中，用涂棒把试样溶液 均匀涂布后，放在37t:恒温培养箱中培养16hr 20hr。计平板上的菌落数，按下式计算试 样中地衣芽胞杆菌的芽胞数。 N = C/M*1010......... 式中 C—一几个有效平板的平均菌落数，单位为个； M—一试样的称样量，单位为克(g); 101Q—-试样稀释倍数。 两次平行测定相对偏差不大于12%。 本发明与现有技术相比具有以下优点和效果 (1)处理方法能有效分散粉剂中粘结集聚的芽胞、杀灭热稳定性和生物活性不稳 定的无效芽胞，准确的检测出产品中有效活芽胞的数量；
(2)重复性好； (3)检测过程不需要特殊昂贵的仪器；
(4)成本低；
(5)可以同时检测7-8个样品；
(6)操作简单便于推广。
具体实施例方式
—种地衣芽胞杆菌制备原药的方法，其步骤是
l.Bl菌种的筛选 从全国各地不同土壤和水体中收集样品，在无菌超净台上，称取样品1. Og装入小 三角瓶中，加入9mL无菌水，充分振荡后静置，取上清液做浓度梯度稀释(1 X 10—4， 1 X 10—5，， 1 X 10—6， 1 X 10—7， 1 X 10—8)。用移液枪吸取稀释液100ul均匀涂布在分离培养基上，于3(TC温 控培养箱中培养3-5d后，挑出芽胞同步率高(芽胞形成率>90%)的菌株，经革兰氏染色 后显微镜检，选出具有B1形态特征的菌株转接到Bj夜体摇瓶发酵培养基中，500mL摇瓶装量为25mL，摇床转速为200rpm，3(TC摇瓶培养后，选出生长迅速(发酵同期36小时以内)、 生物量高(600nm可见光光密度0D6。。 > 70)的菌种KN-08转接到试管斜面生长后于4"C保 种。 所述的&分离培养基蛋白胨10g，酵母浸粉5g，氯化钠(NaCl) 10g，琼脂15g，水 1000mL， pH 7. 0， 121。C灭菌30min ; 所述的B工液体摇瓶发酵培养基豆粕20g，玉米浆10g，葡萄糖25g，蛋白胨5g， 氯化钠(NaCl)3g，磷酸二氢钾(KH2P04)0. 5g，七水硫酸镁(MgS04. 7H20)0. 2g，七水硫酸亚铁 (FeS04. 7H20)0. Olg，水lOOOmL， pH 7. 5， 121。C灭菌30min。
2. Bl菌种的确认 对KN-08菌株进行了形态和生理生化特征研究，根据该菌株的16SrDNA序列进行 分子分类。该菌株的16SrDNA共测定1514个有效碱基，系统发育资料及分类资料(伯杰氏 细菌手册)鉴定该菌株为地衣芽胞杆菌。该菌株于2008年12月09日在中国典型培养物 保藏中心保藏，保藏号为CCTCC N0.M208251。
(1)菌种鉴定理化实验结果见下表
试验项目结果试验项目结果
革兰氏染色阳性细胞形状杆状细胞直径> 1 y m-形成芽孢+芽孢膨大_芽孢圆形_形成 伴孢晶体-接触酶+氧化酶+厌氧生长+VP 试验+VP < PH6-VP > PH7+甲基红试验-利用碳水化合物产酸葡萄糖+木糖+L-阿拉 伯糖+甘露醇+利用葡萄糖产气_利用柠檬 酸盐+硝酸盐还原+50°C生长+PH5. 7生长 +7 % NaCl生长+淀粉水解+明胶液化+分解 酪素+ ①测序试齐U盒Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit(PERKIN ELMER); ②测序分析仪器ABI PRISM 377 DNA Sequencer ; ③测序引物16 (+) : 5 ， GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG3' 16 (-) : 5 ， CGGCTACCTTGTTACGAC3 ， 序列，共计1514bp :
8
TGGGACAGATGATTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTA
3.高产Bl的培养基优化 采用Box-Behken设计的响应面实验，以芽胞数(cfu)为筛选指标，利用单因子 实验首先从10个碳源因子(玉米淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、甘露醇、大米粉、土豆 淀粉、糊精、玉米粉，)；13个氮源因子(水解植物复合氨基酸、棉籽粉、豆粕、花生粕、蛋白 胨、酵母粉、玉米浆粉、玉米浆、鱼粉、大豆蛋白、谷氨酸钠、天门冬氨酸、硫酸铵，)；9个微 量元素因子通过单因子实验，从氯化钴(CoCl》、碳酸钙(CaC0》、硫酸镁(MgS0》、磷酸二 氢钾(腿2 04)、氯化钠(NaCl)、硫酸亚铁(FeS0》、氯化锰(MnCl2)、硫酸铜(CuS04)、硫酸锌 (ZnS04)因子中选择重要的部分因子筛选设计，利用合理的试验设计，考虑重要碳源(葡萄 糖和玉米淀粉)、氮源(蛋白胨、豆粕和玉米浆)及无机离子(磷酸二氢钾(KH2P04)和氯化钠 (NaCl))等多个因素之间的协同作用，用于寻找临近最大值的优化区域的最陡坡试验(Path of Ste印est ascent)，和用于优化响应面最大值的中心组合设计(Central Composite Design)来拟合因素与响应值之间的函数关系得到回归方程，通过对回归方程的分析来设 计优化培养基B-51，芽胞数为70亿cfu/ml。 (1)、碳源因子通过单因子实验，从玉米淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、甘露 醇、大米粉、土豆淀粉、糊精、玉米粉中筛选出葡萄糖和玉米淀粉为Bl最佳碳源需求因子。
(2)、氮源因子通过单因子实验，从水解植物复合氨基酸、棉籽粉、豆粕、花生粕、 蛋白胨、酵母粉、玉米浆粉、玉米浆、鱼粉、大豆蛋白、谷氨酸钠、天门冬氨酸、硫酸铵中筛选 出蛋白胨、豆粕和玉米浆为Bl最佳氮源需求因子。 (3)、微量元素因子通过单因子实验，从氯化钴(CoCl》、碳酸f丐(CaC0》、硫酸镁 (MgS0》、磷酸二氢钾(腿2 04)、氯化钠(NaCl)、硫酸亚铁(FeS0》、氯化锰(MnCl》、硫酸铜 (CuS0》、硫酸锌(ZnS04)中筛选出磷酸二氢钾(KH2P04)和氯化钠(NaCl)为Bl最佳微量元 素需求因子。 (4)、利用PB实验设计(Plackett-Burman Design)筛选影响Bl芽胞形成的 重要因子，试验表明葡萄糖、玉米浆和蛋白胨对B1芽胞形成有极显著的影B向，因此增加 它们的用量对促进B1芽胞形成具有积极的意义。通过最陡坡试验(Pathof Ste印estascent)最终确定葡萄糖用量为14. 42g/L，玉米浆用量为18. 61g/L，蛋白胨用量30. 05g/ L时Bl芽胞数达到60亿。利用本公司从SAS公司购买的SAS统计软件设计中心组合实验 (Central Composite Design)，最终得到Bl发酵最佳配方B-51 :为葡萄糖28. 84g/L，玉米 浆27. 92g/L，蛋白胨30. 05g/L，，豆粕3. 88g/L，水解植物复合氨基酸3. 91g/L，，磷酸二氢钾 (KH2P04)0. 5g/L，氯化钠(NaCl)3g/L，采用该配方，发酵液活芽胞数达70亿/ml。
4.高密度液体补料发酵技术提高发酵生物量以响应面法优化的培养基配方 B-51进行分批发酵动力学研究，以发酵前期，对数期，稳定期0D、溶氧、pH、芽胞数为指标， 确定各时期最佳营养平衡(以C/N表示)，及与芽胞数关系。在分批发酵配方上进行碳源 和氮源浓度加倍，分析出现反馈抑制因素及浓度，进行分批补料发酵动力学研究，确定补料 工艺为采用初始糖浓度10g/mL，通过补加葡萄糖，使发酵过程还原糖浓度保持0. 5-1. 0% (质量比)水平，发酵工程共用葡萄糖7% (质量比)；发酵过程补加氨水，使pH控制在 6. 8-7. 2范围；发酵过程通过调节转速控制溶氧水平不低于临界氧(3ppm)。较分批发酵相 比，虽然菌数和总耗量明显增加，但采用补料工艺，不仅没有出现底物反馈抑制，也没有因 对数期溶解氧不能维持在临界氧之上而影响芽胞的形成。采用此工艺，发酵液活芽胞数达 100亿/ml。 5.高效的芽胞提取与回收工艺 芽胞提取与回收工艺发酵罐酸化2N稀盐酸，2_4. 5，升温35_37。C ， 80-85 目过滤，加3. 18%。(质量比)硫酸锌，搅拌3-5分钟，再加2. 27%。(质量比)黄血盐，搅拌 1-2分钟，静置15-20分钟，离心菌浆进行喷雾干燥，喷雾干燥进口风温200-201°C ，出口风 温85-87°C ，原粉活芽胞数达5， 000亿/克。
6.活芽胞数检测 称取步骤5中获得的原粉0.99g l.Olg试样到中性瓶中，加入100mL，浓度为 0. 85克氯化钠/100ml水的生理盐水，猛烈摇动混合均匀。再把混合瓶放在磁力搅拌器 (CJJ-4上海君竺仪器制造有限公司)平台上混合30min后，放入超声波水浴器(KQ-600B昆 山市超声仪器有限公司)中超声15min，然后再放在匀质器(Bagmixer 400W/P/VW)中混合 10min。将处理好的试样溶液依次稀释到10—8放入7(TC水浴锅中水浴30min，然后稀释到 10—9取0. lmL到每个营养琼脂培养基平板中，用涂棒把试样溶液均匀涂布后，放在37t:恒温 培养箱中培养16hr 20hr。计平板上的菌落数，按下式计算试样中地衣芽胞杆菌的芽胞 数。 N = C/M*1010......... 式中 C—一几个有效平板的平均菌落数，单位为个；
M—一试样的称样量，单位为克(g);
10l—试样稀释倍数。
两次平行测定相对偏差不大于12%。 SEQUENCE LISTING
〈110〉武汉科诺生物科技股份有限公司 〈120〉 一种地衣芽胞杆菌及原药的制备方法 〈130〉 一种地农芽胞杆菌及原药的制备方法〈140>2009100638223
〈141>2009-09-04
〈160>1
〈170>PatentIn version 3.1
〈210>1
〈211>1514
〈212>DNA
〈213〉地衣芽胞杆菌 〈400>1
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权利要求
一种地衣芽胞杆菌，其特征在于地衣芽胞杆菌地衣亚种(Bacilluslicheniformis subsp.licheniformis)，BL KN-08，CCTCCNO.M208251。
2. 权利要求1所述的一种制备地衣芽胞杆菌原药的方法，其步骤是A. B1菌种的筛选从土壤和水体中收集富含芽孢杆菌芽胞的土样和水样，将样品用无 菌水稀释到100-200个芽胞/ml水，涂布在&分离培养基上，于29-3rC温控培养箱中培养 3-5d后，挑出芽胞同步率高的菌株，经革兰氏染色后显微镜检，选出Bl形态特征的菌株转 接到B工液体摇瓶发酵培养基中，29-3rC摇瓶培养后，选出生长的菌种KN-08转接到试管斜 面生长后于4t:保种；所述的B工液体摇瓶发酵培养基豆粕20g，玉米浆10g，葡萄糖25g，蛋白胨5g，氯化钠 3g，磷酸二氢钾0. 5g，七水硫酸镁0. 2g，七水硫酸亚铁0. Olg，水1000mL，pH 7. 5， 121。C灭菌 30min ;B. B1菌种的确认对KN-08菌株进行了形态和生理生化特征研究，测定KN-08菌株的16SrDNA共1514个 有效碱基，根据地衣芽孢杆菌在Genebank中的16SrDNA序列进行分子鉴定，结合系统发育 资料及分类资料鉴定KN-08菌株为地衣芽胞杆菌；C. Bl的培养基采用Box-Behken设计的响应面实验，以芽胞数为筛选指标，利用单因子实验首先从碳 源、氮源、微量元素因子中选择因子筛选设计，采用多元一次和二次回归方程来拟合因素与 响应值之间的函数关系得到回归方程，通过回归方程设计B^发酵培养基B-51，芽胞数为70 亿cfu/ml ;所述的B51发酵培养基B-51 :葡萄糖28. 84g/L，玉米浆27. 92g/L，蛋白胨30. 05g/L，，豆 粕3. 88g/L，水解植物复合氨基酸3. 91g/L，，磷酸二氢钾0. 5g/L，氯化钠3g/L ;D. 提高发酵生物量采用Box-Behken设计的响应面实验的培养基进行分批发酵，以发 酵前期，对数期，稳定期OD、溶氧、pH值、芽胞数为指标，确定营养平衡，及与芽胞数关系，在 分批发酵配方上进行碳源和氮源浓度加倍，采用糖浓度10g/ml，通过补加葡萄糖，使发酵过 程还原糖浓度为0. 5-1. 0%质量比，发酵过程共用葡萄糖7%质量比；，发酵过程补加氨水， 使PH控制在6. 8-7. 2范围，发酵液活芽胞数达100亿/ml ;E. 芽胞提取与回收发酵罐酸化2N稀盐酸，PH4. 2-4. 5，升温35-37t:，80-85目过滤， 加3. 18%。质量比硫酸锌，搅拌3-5分钟，再加2. 27%。质量比黄血盐，搅拌1_2分钟，静置 15-20分钟，离心菌浆进行喷雾干燥，喷雾干燥进口风温200-20rC，出口风温85-87°C ，原 粉活芽胞数达5， 000亿/克；F. 活芽胞数检测称取步骤(E)中获得的原粉0.99g l.Olg试样到中性瓶中，加入100mL，0.85X质 量比的生理盐水，摇动混合均匀，再把混合瓶放在磁力搅拌器平台上混合30min后，放入超 声波水浴器中超声15min，然后再放在匀质器中混合10min，将处理的试样溶液依次稀释到 10—8放入7(TC水浴锅中水浴30min，稀释到10—9取0. lmL到每个营养琼脂培养基平板中，用 涂棒把试样溶液均匀涂布后，放在37t:恒温培养箱中培养16hr 20hr。
3. 根据权利要求1所述的一种制备地衣芽胞杆菌原药的方法，其特征在于所述的碳 源因子从玉米淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、甘露醇、大米粉、土豆淀粉、糊精、玉米粉中筛选出葡萄糖和玉米淀粉为Bl碳源需求因子；
4. 根据权利要求1所述的一种制备地衣芽胞杆菌原药的方法，其特征在于所述的氮 源因子从水解植物复合氨基酸、棉籽粉、豆粕、花生粕、蛋白胨、酵母粉、玉米浆粉、玉米浆、 鱼粉、大豆蛋白、谷氨酸钠、天门冬氨酸、硫酸铵中筛选出蛋白胨、豆粕和玉米浆为Bl氮源 需求因子。
5. 根据权利要求1所述的一种制备地衣芽胞杆菌原药的方法，其特征在于所述的微 量元素因子从氯化钴、碳酸钙、硫酸镁、磷酸二氢钾、氯化钠、硫酸亚铁、氯化锰、硫酸铜、硫 酸锌中筛选出磷酸二氢钾和氯化钠为Bl微量元素需求因子。
全文摘要
本发明公开了一种地衣芽胞杆菌原药的制备方法，地衣芽胞杆菌(Bacilluslicheniformis subsp.licheniformis)，BL KN-08，CCTCCNO.M208251。其步骤A.B1菌种的筛选，从土壤和水体中收集样品，加入无菌水，静置；B.B1菌种的确认，该菌株的16SrDNA共测定1514个有效碱基，鉴定；C.B1的培养基，采用Box-Behken设计的响应面实验，以芽胞数为筛选指标，利用单因子实验从众多碳源、氮源、微量元素因子中选择因子；D.提高发酵生物量，以响应面法的培养基进行分批发酵；E.芽胞提取与回收；F.活芽胞数检测。本发明准确的检测出产品中有效活芽胞的数量；重复性好，检测成本低，可以同时检测7-8个样品，操作简单便于推广，该发明的地衣芽胞杆菌原药中的活芽胞数达5,000亿/克。
文档编号A61P31/04GK101775360SQ20091006382
公开日2010年7月14日 申请日期2009年9月4日 优先权日2009年9月4日
发明者刘华梅, 刘荷梅, 张敬明, 李青, 杨克华, 王巧梅, 程治国, 缪华军, 谢攀, 谢翔, 陈又香, 陈振民, 黄志远 申请人:武汉科诺生物科技股份有限公司