黄连素在治疗或预防流感病毒药物中的应用的利记博彩app

专利名称：：黄连素在治疗或预防流感病毒药物中的应用的利记博彩app
技术领域：
：本发明涉及医药
技术领域：
，更具体涉及黄连素在治疗或预防流感病毒药物中的应用。
背景技术：
：流感病毒是引起流行性感冒的病原，分为甲(influenzaAvirus)、乙(influenzaBvirus)、丙(influenzaCvirus)三型，其中以甲型流感对人类威胁最大。人流感病毒主要是HI、H2和H3亚型，而目前危害严重的高致病性禽流感病毒多为H5、H7和H9亚型，即H5m、H7N7、H9N2等，其中以H5m亚型病死率高。因此本发明主要以H5m、H3N2两种A型流感病毒为研究对象对黄连素的抗病毒活性进行了探讨。流感病毒属正粘病毒科(Orthomyxoviridae)，具有包膜的8个片段，共编码11种蛋白质的单链负RNA病毒。与其他RNA病毒不同的是，流感病毒所有RNA(mRNA.cRNA.vRNA)的合成均在被感染细胞的核内完成。mRNA在核内合成后转移到胞浆，合成病毒的结构和非结构蛋白；而后开始装配流感病毒，完成后以出芽方式释放出子代病毒颗粒，进一步侵入新的宿主细胞。在流感病毒的各个基因中，NP基因最为保守。NP具有型特异性，还是一种多功能蛋白质，除了形成病毒的核衣壳外，还可通过RNP来稳定vRNA，使之免受RNA酶作用。多年来研究认为，PBl是病毒RNA聚合酶的催化亚基，负责病毒RNA的复制以及转录；PB2是负责以一种称为“Snatch”的方式夺取宿主mRNA的CAP帽子结构用于病毒mRNA转录。流感病毒能否在人体细胞内进行有效的复制，主要与病毒复制酶(PB1、PB2和PA)基因有关。目前，流感仍属未能有效控制的急性上呼吸道传染病。由于流感病毒的抗原变异能力强，加之个体免疫力的不同，疫苗的保护率并不高，且疫苗只对已知的流感病毒亚型有预防作用，而对于由抗原性漂移或抗原性转换所产生的新型流感病毒无效。当前FDA批准用于防治流感的药物有金刚烷胺(Amantadine)、金刚乙胺(Rimantadine)和扎那米韦(Zanamivir)，但分别存在易引起流感病毒耐药株的出现和服用不方便的问题。中医药治疗药物包括清开灵口服液、双黄连注射液、藿香正气丸、参脉注射液等清热解毒、增强人体免疫力的中成药，这些药物具有综合疗效好、毒副作用低等优势。因此，抗流感病毒药物的研究方兴未艾。中草药是天然宝库，以其内在科学性和实践的有效性，正日益受到世界各国医药学工作者的关注。中药不仅具有耐药性低、副作用和不良反应少等优点，而且还有抑制病毒复制、调节免疫功能、改善血液循环、解热镇痛、及抗菌消炎等综合功效，其在防治流感病毒方面具有独特的优势和广阔的发展前景。因此，近年来，国内外均开展了抗流感病毒中草药的研究，取得了较好的结果。黄连为毛茛科植物黄连CoptischinensisFranch.、三角叶黄连CoptisdeltoideaC.Y.ChengetHsiao或云连CoptisteetaWall.的干燥根茎。具有清热燥湿，泻火解毒等功效。用于湿热痞满、呕吐吞酸、泻痢、黄疸、高热神昏、心火亢盛、心烦不寐、血热吐衄、目赤、牙痛、消渴、痈肿疔疮；外治湿疹、湿疮、耳道流脓。黄连素是一种重要的生物碱，是我国应用很久的中药。可从黄连、黄柏、三颗针等植物中提取。它具有显著的抑菌作用。近期文献报道生物碱类化合物具有抗流感病毒的功效，黄连素为黄连的主要有效成分，目前还未有其抗流感病毒作用的报道，因此本发明首次发现了黄连素具有良好的抗流感病毒活性，表明其具有很好的开发利用前景。
发明内容本发明的目的在于提供黄连素在治疗或预防流感病毒药物中的应用，从而为临床上流感病毒性疾病的治疗提供一种安全有效毒副作用小的天然药物。为了实现上述任务，本发明采用以下技术方案黄连素在细胞和分子水平上对流感病毒的抑制作用，表明该药物具有开发成抗流感病毒的有效药物而应用于临床。通过血凝效价试验(HA)与Real-Time荧光定量PCR试验，对前期筛选的有效药物的给药剂量及有效性做出分析。同时采用体外细胞模型——MDCK细胞，从直接杀病毒、抑制病毒的吸附与入侵、抑制病毒的复制、影响病毒出膜等方面研究药物的抗病毒机制。研究结果表明黄连素在细胞水平上对流感病毒具有良好的抗病毒作用，表明该药物可以作为临床上潜在的抗病毒药物进一步开发。本发明公开了一种黄连素在作为制备治疗或预防流感病毒药物中的应用，从细胞和分子层面对黄连素抗流感病毒作用进行了评价，为其进一步开发应用奠定了良好的基石出。由于黄连素具有一定的抗感染和炎症作用，同时在临床上用于肠炎性疾病有很好的应用基础，而病毒所引起的传染性疾病发生过程中常伴随有炎症反应，故该药物在治疗病毒性疾病的同时对病毒所引起的炎症等症状均有较好的缓解和辅助治疗作用。目前黄连素在临床上主要以片剂用于肠炎性疾病，结合现代常用药物制剂手段，可将其制成薄膜包衣片、胶囊剂、颗粒剂、分散剂，口服。在治疗流感病毒感染及其并发症的药物中可加入该药成分或在治疗过程中联合用药使用该药。相对于目前的其他抗流感病毒药物而言，本发明与现有技术相比具有以下优点和效果1、该药物是一种纯天然药物，具有毒副作用小等优点。2、对甲、乙、丙型流感病毒均有效。3、既有治疗作用，也有预防作用。4、可口服给药，使用方便。5、为非核苷类化合物，兼有抗炎作用，故能提高治疗过程中的耐受性，提高治疗质量和给药依从性，减轻治疗痛苦。A、黄连素的获得黄连素(化学名为盐酸小檗碱，C20H18ClNO4.2H20)，主要从毛茛科植物黄连CoptischinensisFranch.、三角叶黄连CoptisdeltoideaC.Y.ChengetHsiao或云连CoptisteetaWall.的干燥根茎中中分离获得，采用《中药植物化学》中生物碱的提取分离纯化手段和技术路线，其纯度经HPLC检测有98%以上。B、黄连素的功效研究简述黄连素主要来源于药用植物黄连，该植物是传统中医药中一味很重要的清热解毒良药。黄连素在临床中一直作为非处方药用于治疗腹泻，但是现代药理学研究证实黄连素具有显著的抗心力衰竭、抗心律失常、降低胆固醇、抑制血管平滑肌增殖、改善胰岛素抵抗、抗血小板、抗炎等作用，因而在心血管系统和神经系统疾病方面将可能有广泛、重要的应用前景，日益受到重视。黄连素是一种重要的生物碱，是我国应用很久的中药。可从黄连、黄柏、三颗针等植物中提取。它具有显著的抑菌作用，常用来治疗细菌性胃肠炎、痢疾等消化道疾病。临床主要用于治疗细菌性痢疾和肠胃炎，它无抗药性和副作用。而关于其在流感病毒性疾病治疗方面还未见报道和应用。故本发明是对其新药用价值的发现，对流感病毒性疾病的治疗提供了一种新的有效药物。本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果1、黄连素在较大浓度范围内没有细胞毒性。采用H5m来感染MDCK细胞或者A549等流感病毒易感染细胞，在病毒细胞进入细胞体内后，加入不同浓度的黄连素，检查黄连素加入前后感染流感病毒细胞的OD值，计算细胞的存活率，表1黄连素对MDCK细胞毒性试验结果浓度OD570(mean±SD)500ug/ml0.891±0.013100ug/ml0.974±0.03620ug/ml0.891±0.0344ug/ml0·859±0.0550.8ug/ml0.986±0.0510.16ug/ml0.814±0.038normal0.76233±0.063由表1可以看出黄连素在比较大的浓度范围内对细胞没有毒性，表明药物的安全性较好。2、黄连素能够提高细胞对病毒感染的预防作用采用血凝效价实验(HA)检测药物对病毒的抑制率和药物的作用模式，进行药物的作用机制初步探讨，从药物对病毒的吸附和入侵、病毒在细胞体内的复制、药物对病毒的杀伤作用、药物影响细胞抗流感病毒感染等角度进行了作用特点的初步探讨表2不同给药方式对流感病毒复制的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>结果显示黄连素和病毒共同孵育之后加入到细胞之中的抑制病毒作用效果与病毒感染细胞后再加入药物的作用结果类似，表明黄连素不能直接杀伤病毒，但是能够抑制病毒的复制。药物加入到细胞之后再将病毒加入到细胞之中的实验结果显示其抑制病毒的作用效果与其他给药方式也没有明显差异性，说明药物能够提高细胞对病毒的抵抗作用，但是并不能阻止病毒的入侵。3、黄连素能够抑制病毒感染所导致的炎症反应采用PGE2检测试剂盒，分别在36、48h时收集病毒感染后的A549细胞上清液，按照试剂盒测定方法测定细胞上清中的PGE2含量。表3药物对流感病毒感染A549细胞上清液中PGE2的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>结果显示病毒感染细胞48小时后炎症反应比较明显，黄连素在使用48小时后明显降低PGE2的含量，表明药物能够较低病毒感染过程中所导致的炎症反应，起到保护机体的功能。图1药物细胞毒性试验，不同浓度药物加入到细胞中培养24h后，采用MTT观察药物对细胞生长的影响。图2黄连素在100μg/ml浓度时加入到MDCK细胞中培养24h后，电子显微镜下观察细胞形态的变化。A没有药物处理组；B加入黄连素处理组。图3不同浓度药物加入到病毒感染细胞之后培养48h时，采用MTT测定细胞存活率情况。图4血凝效价试验(48h)不同浓度药物对病毒增殖的抑制作用。图5不同的药物加入到感染病毒的MDCK细胞中，通过HA试验来检测不同时间点细胞上清中的病毒滴度。图6采用噬斑法(plaquereduceassay)的方法检测黄连素对流感病毒的抑制作用。(狗肾传代单层细胞感染A型流感病毒，经过1小时吸附，除去细胞上清液，并加入2ml含药培养基(药物浓度为lOOug/ml)，培养24小时后，取细胞上清液，收集150ul细胞上清液加入到另一长满单层MDCK细胞的6孔板中，在37°C作用1小时后，然后在感染的细胞中覆盖含0.5%琼脂的固体培养基。孵化后3天在37°C，10%福尔马林膜固定，染色，结晶紫染色。蓝染色表明细胞没有受到病毒影响；未染色而出现空斑的结果表明细胞受到流感病毒的侵蚀。图7.加入不同药物的感染H5W的MDCK细胞，进行免疫荧光试验。A.未感染病毒的阴性对照；B.感染病毒的细胞对照；C.为感染病毒后加入黄连素的实验组；D.为感染病毒后加入金刚烷胺的实验组。图8采用real-timePCR检测药物对流感病毒复制过程病毒载量的影响。A.NP特异性片段mRNA(*p<0.05；**p<0.01)；B.NP特异性片段cRNA(*p<0.05；**p)；C.NP特异性片段vRNA(*p<0.05；**p<0.01)。图9.1不同给药方式时药物对流感病毒的抑制作用。在药物作用24小时收集细胞上清液，采用HA检测病毒滴度。数据为平均值士标准差(每个浓度3个平行)。与模型组比较，*p<0.05(病毒滴度的差异超过2倍可视为有显着性差异)，结果药物并不能影响病毒的吸附与入侵。图9.2不同给药方式时药物对流感病毒的抑制作用。在药物作用36小时收集细胞上清液，采用HA检测病毒滴度。数据为平均值士标准差(每个浓度3个平行)。与模型组比较，*p<0.05(病毒滴度的差异超过2倍可视为有显着性差异)，结果药物并不能影响病毒的吸附与入侵。图9.3不同给药方式时药物对流感病毒的抑制作用。在药物作用48小时后收集细胞上清液，采用HA检测病毒滴度。数据为平均值士标准差(每个浓度3个平行)。与模型组比较，*p<0.05(病毒滴度的差异超过2倍可视为有显着性差异)，结果药物并不能影响病毒的吸附与入侵。图10.1哺乳动物双杂交试验检测测定NP和黄连素之间的相互作用实验。在HeLa细胞中，分别转染报告质粒pG5Luc和测试质粒pvP16核蛋白(NP)携带NP基因，然后在6h后分别添加药物。NP和药物相互作用的荧光素酶活性测定。质粒pVP16(VP16)为阴性对照和本底控制对照。数据为平均值士标准差(3个平行样)。与阳性对照比较，*p<0.05；**p<0.01表示有显著性差异。图10.2哺乳动物双杂交试验检测黄连素是否抑制NP与NP之间的相互作用。图10.3动物双杂交试验检测黄连素素是否抑制NP、PB2蛋白间的相互作用图10.4乳动物双杂交试验检测黄连图11为一种族什图是否抑制NP、PBl蛋白间的相互作用图12为工艺流程图。具体实施例方式一种黄连素在治疗或预防流感病毒药物中的应用，其应用过程是目前常采用的四甲基偶氮唑盐(MTT)法，检测药物对流感病毒感染后MDCK细胞存活率的差异性进行药物筛选。另外也有一些针对流感病毒复制的关键酶进行的药物体外筛选，但是相比而言，采用细胞培养筛选的方法会更简单，并可以系统探讨药物的有效浓度和治疗指数，为后期机理研究提供更多基础。工艺流程图请见图12。实施例1黄连素抗流感病毒活性的评价1、材料细胞、病毒和质粒MDCK细胞由中国科学院山东医学微生物研究所提供，A549细胞、HeLa细胞、病毒H5m或H3N2购于中国典型微生物保藏中心；pVP-16-NP、pM-PBUpM_PB2、pVP_16_NP、pG5Luc质粒由武汉大学病毒学国家重点实验室医学病毒学研究课题组吴建国教授指导完成，pG5Luc为带有绿色荧光GFP的报告基因载体，质粒pVP_16_NP、pM-PBUpM_PB2、pVP-16-NP分别是流感病毒的不同蛋白连接到载体pVP和pM上，相关详细信息可见本实验室已经发表的论文——Mukhtar，Μ.M.，Li，S.，Li，W.，Wan,Τ.，Mu,Y.，Wei，W.，Kang,L.,Rasool,S.Τ.,Xiao,Y.,Zhu,Y.,andWu,J.(2009).Single-chainintracellularantibodiesinhibitinfluenzavirusreplicationbydisruptinginteractionofproteinsinvolvedinviralreplicationandtranscription.IntJBiochemCellBiol41(3)，554-60.)2、工具酶LA-taq,LC_taq，M-MLVReverseTranscriptase,M-MLVRT5XBuffer,RNAexhibit购自宝生物(TaKara)公司；3、其他试剂DMEM粉剂购自Gibco公司；Sofast转染试剂，购自上海太阳马公司；测荧光仪^=TurnerBioSystemsTD-20/20-HiSi十(TurnerDesigns,Sunnyvale,CA)；TRIzol试剂购自Gibco公司；黄连素(Berberine)均为自制，HPLC检测纯度为98%以上。药物毒性检测试验首先对不同药物浓度对MDCK细胞毒性进行了评价。1、消化T25瓶中MDCK细胞，加适量细胞培养基，吹打细胞10_15次。2、将细胞铺到96孔板中，放置于培养箱中，培养24h待用。3、将培养的MDCK细胞取出，倒去原有培养液，换用2%FBS的维持培养基稀释的梯度药物，培养24h待用。4、然后加入不同浓度的药物，继续培养48h后，弃培养液上清，于培养板加入5mg/mLMTT液50μL/孔(以不含血清的DMEM培养基配制成)，置C02培养箱中继续培养。5、培养2_3h后，弃MTT上清，PBS洗3次，每孔加溶解液(DMS0乙醇体积比为11)100μL，振荡5-10分钟。6、待结晶完全溶解，置酶标测定仪上，测定570nm(490nm)波长处的光密度OD值。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>7、找出药物对细胞的最大无毒浓度范围。结果显示药物在0.16ug/ml——500ug/ml的范围对该细胞没有明显细胞毒性(图1.)，在显微镜下观察细胞也没有病变发生(图2.)，因此说明药物有比较安全的适用范围。黄连素抗H5W病毒的筛选试验A、HA检测药物是否具有抗流感病毒作用1、用胰酶将生长良好的MDCK细胞分散成单个细胞悬液，按1X105/mL浓度分加于48孔板，每孔0.2mL。2、置37°C、5%C02培养箱中培养24h。将培养的MDCK细胞取出，倒去原有培养液，换上无血清无抗性的培养基，加1M.0.I的病毒液，于37°C孵育1-2小时。3、倒出病毒液，换用换用2%FBS的维持培养基稀释的梯度药物。设空白对照、阳性对照、阴性对照。实验组药物有六个梯度。4、置37°C、5%CO2孵箱中培养，36h后收集各实验孔病毒上清进行血凝实验。5、选用96孔血凝实验板，除第一孔外，每孔加入75μL的PBS。6、第一孔加入75μL待测病毒悬液，然后等比稀释，至第12孔时弃去75μL。7、每孔加入鸡红细胞悬液75μL，轻弹实验板，使红细胞与病毒充分混合，室温(20-25°C以下相同)静置30min、45min、60min时，观察血凝现象并记录结果。8、以静置45min时的血凝现象为最终结果。以出现“++”(即红细胞在孔底形成一个环状，四周有小凝集块)的流感病毒最高稀释度为血凝终点，该稀释度的倒数即为流感病毒的血凝滴度。实验同时设生理盐水对照(排除血细胞自身的非特异性凝集)和病毒对照。9、处理试验数据，得出试验组各药物抗病毒的最佳浓度。10、按上述试验结果，取各药物抗病毒的最佳浓度进行试验。11、重复上述1-9的步骤，此时，只加入抗病毒药物的最佳浓度(无需做梯度试验)，分别于24h、36h、48h取上清做病毒的时间相关性试验。在上述基础上，考察了不同剂量的给药是否对流感病毒表现出不同的作用，结果显示黄连素作用于流感病毒时也没有明显的剂量依耐性关系(图3.)，可能原因是药物使用安全浓度范围内，药物已经在较低剂量时已经达到了较好的抑制病毒复制作用，而随着药物浓度的增加，其作用效果并不会发生明显变化，也提示该药物在治疗时剂量可以适当调整。同时检测了药物处理病毒感染后的细胞上清液中的病毒滴度，结果同样表明不同药物的作用效果比较近似(图4)，虽然没有剂量依赖性关系，但也说明药物的细胞毒性较低，药物能够在较低浓度和较大浓度范围内发挥抗病毒作用。根据上述实验结果，选用黄连素和金刚烷胺的细胞给药浓度均为lOOug/ml，探讨了不同作用时间后病毒感染细胞上清液中病毒滴度，以病毒稀释倍数来计数，结果图5所示，不同作用时间点实验结果显示病毒滴度随着病毒感染时间的延长不断增加，在48h达到最高值，而黄连素和阳性对照药物金刚烷胺在24h时就表现出良好的抑制病毒效果，随着作用时间的延长，其抑制病毒的作用也在增强，表明药物能够抑制病毒的复制，并能维持作用时间。B、噬斑法检测黄连素是否具有抗流感病毒的作用实验过程病毒感染细胞Ih后，然后分别加入不同药物，在药物作用24h后，分别收集细胞上清液150ul，加入到已经长满单层细胞的六孔板，在病毒上清液吸附Ih之后，按照传统噬斑法加入0.5%琼脂糖，然后继续培养72h，0.4%的甲醛固定后，采用结晶紫染色，观察药物作用后噬斑情况。结果显示黄连素具有比较好的抗病毒复制作用，病毒感染的细胞中加入黄连素其细胞比较完整，几乎看不到病毒蚀斑，其作用效果类似于阳性对照药金刚烷胺(图6)。C、免疫荧光试验检测病毒感染细胞1、免疫荧光染色操作1、固定液的准备用4%多聚甲醛作为固定液，或根据特定的一抗或样品用有效成分为乙醇、甲醇或其它类型的固定液。2、洗涤液的准备10XTBS的配制称取24.2gTris(Tris碱)，80gNaCl；用盐酸调节pH值至7.6，定容至一升。TBS配制把10XTBS按照19的比例用水稀释至IX即为TBS。TBSTx的配制在TBS中加入TritonX-100使最终浓度为0.1%，混勻，即为TBSTx。3、封闭液的准备配制含5%BSA的TBSTx作为封闭液含5%BSA的TBSTx的配制在100毫升TBSTx中加入5克BSA，溶解并混勻，即为含5%BSA的TBSTx。4、一抗稀释液的准备使用上述封闭液，即含5%BSA的TBSTx，作为一抗稀释液。一抗的稀释一抗为鼠抗人H5WHA单克隆抗体。按照一抗说明书中推荐的用于免疫荧光染色的稀释比例用一抗稀释液稀释一抗。5、荧光标记二抗的稀释把荧光标记的二抗，按照11000的比例用本试剂盒提供的免疫荧光染色二抗稀释液进行稀释。根据荧光的强弱，稀释的比例可以适当提高或降低。在荧光显微镜下，其结果如图7所示。阴性对照组在激发光下不产生荧光；在视野中病毒感染未加任何药物处理对照组在绿色激发荧光下产生非常多的红色荧光，表明细胞中表达的HA蛋白量很大，证明被流感病毒感染的MDCK细胞很多；加入药物UA与多肽165的实验组荧光结果与病毒感染对照组相似，说明这两种药物没有明显的抗病毒作用；加入药物黄连素的实验组细胞，被激发出的荧光少且荧光较弱，可见被感染H5W病毒、并表达HA蛋白的细胞较少，说明黄连素具有很显著的抗病毒作用；阳性对照组金刚烷胺的荧光效果与黄连素相近。D、Real-TimeRT-PCR检测黄连素对病毒复制的影响为了检测药物对病毒转录和复制的影响，通过实时荧光定量试验检测了A型流感病毒三种不同形式的病毒RNA(mRNA、cRNA、vRNA)。不同药物加入感染H5W病毒的MDCK细胞，4小时后收样提取RNA。用不同的引物将病毒的mRNA、cRNA、vRNA反转录成cDNA，再通过荧光定量试验，检测病毒mRNA、cRNA、vRNA的量。引物设计1、RT-PCR引物mRNA5，_ττττττττττττττττττ_3，NP-cRNA5’-AGTAGAAACAAGGGTATTTTTCTTTAATTGTCAT-3’NP-vRNA5’-CTCACCGAGTGACATCAACATCATG-3’2、Real-TimePCR引物NPsense5，-GGATTTGGCGTCAAGCGAACA-3，antisense5’-GTCCCTACCCCCTTTACTGC-3’r-actin:sense5，-TCTGTCAGGGTTGGAAAGTC-3，antisense5，-AAATGCAAACCGCTTCCAAC-3，病毒RNA的提取1、用6孔板培养MDCK细胞，加入病毒1.5h后分别加入最佳浓度的药物，设空白对照、阳性对照与阴性对照；2、4h后每孔加入ImlTrizol勻浆；3、移入1.5ml新离心管；4、冰上孵育5分钟；5、离心12，000rpm4°C5分钟取上清液移入1.5ml新离心管；6、加0.2ml氯仿，震荡，冰上孵育5分钟；7、12，OOOrpm4°C离心10分钟取上层液移入1.5ml新离心管；8、加0.5ml异丙醇，震荡，冰上孵育5分钟；9、12，000rpm4°C离心5分钟弃去上清液；10、加入Iml75%乙醇，震荡；11、离心7，500rpm4°C5分钟弃去上清液；12、室温下使之变透明；13、加入DEPC处理水10μ1-35μ1溶解RNA(可保存在液氮或低温冰箱)。RT-PCR反应体系第一步RNA抽提物2μ1，20mM引物各Ιμ，70°C10分钟，立即放入冰浴。第二步5xPT-PCR缓冲液5μ1，RNAsin0.5μ1,25mMMgC121.5μ1,2.5mMdNTP2μ1,AMV逆转录酶Ιμ，无菌水Ιμ;37°C1.5小时，94°ClOmin。Real-TimePCR反应体系上下游引物各IulIOxPCR缓冲液2.5μ1，25mMMgC121.5μ1,DNA模板Ιμ，SYBRgreenI1μ1,2.5mMdNTP2μ1,Taq酶1μ1,无菌水14μ1;反应条件1、95°C5分钟，为第一个步1个循环；2、95°C30秒，55°C30秒，72°C1分钟为第二步40个循环；3、72°C10分钟。Real-TimePCR的结果表明相对于对照组，病毒NP特异片段的mRNA在金刚烷胺(P<0.01)、黄连素(ρ<0.01)与UA(ρ<0.05)的作用下显著减少(图8)。病毒NP特异性片段的cRNA能显著的被黄连素(ρ<0.01)和金刚烷胺(ρ<0.01)所抑制，并且黄连素的作用效果要高于金刚烷胺；相对于对照组，多肽165(ρ<0.05)与对NP的cRNA的形成也有很强的抑制作用(图8)。而病毒NP片段的vRNA只有在金刚烷胺(ρ<0.01)存在时，才会显著降低；实施例2黄连素预防病毒感染、对流感病毒吸附入侵、复制的影响分别将铺成单层的细胞进行不同的处理方式药物预先加入到细胞中孵育Ih之后，换液，加入相应的流感病毒；药物对流感病毒吸附入侵采用药物加入到病毒中共同孵育lh，然后再加入到细胞中；药物对流感病毒的复制影响，采用病毒先感染细胞Ih后，然后加入药物。所有实验中使用的药物浓度均为lOOug/ml，病毒感染量为1M.0.I的病毒液。分别在24、36、48h时采集部分上清，采用HA测定药物的抗病毒作用。结果如图9所示，黄连素不影响病毒的吸附和入侵，但是对病毒的复制抑制作用比较明显，同时药物具有一定的预防作用，能够提高细胞对病毒感染的抵抗作用。实施例3哺育动物双杂交试验探讨药物对复制过程中一些酶的影响1、细胞转染质粒分别为pM-PBl、pM-PB2、pVP_16_NP、pG5Luc。本试验组设阴性对照不加入任何质粒，阳性对照加入pM-PBl(或pM-PB2)、pVP_16_NP、pG5Luc三种质粒，实验组加入pM-PBl(或pM-PB2)、pVP-16-NP、pG5Luc三种质粒与各种药物。Sofast脂质体转染以下转染操作以24孔板为例。转染全过程必须严格无菌操作。1.在转染前一天将待转染细胞接种于24孔板中，37°C培养。转染前的细胞密度以40-60%为准。2.准备以下溶液①稀释1.5μISofast试剂于30μ1无血清、无抗菌素的DMEM培养基。混勻后室温静置3分钟。②稀释0.6μg待转染质粒DNA于30μ1无血清、无抗菌素的DMEM培养基。混勻后室温静置。3.混合①、②两种溶液，室温静置20分钟。4.弃掉培养板中的旧培养基，加入0.5ml无血清、无抗菌素的DMEM培养基。5.加入上述Sofast试剂-DNA混合物于24孔板。6.37°C温育4-6小时后换10%血清和抗生素的DMEM培养基。7.24后换无血清DMEM培养基，37°C培养。8.48-72小时后检测。2、荧光素酶活性测定1、取出荧光素酶底物和荧光素酶裂解液在室温下平衡。2、用PBS漂洗细胞。此过程必须仔细，不要接触贴壁细胞。最后尽可能将PBS吸出ο3、加入足够的裂解缓冲液以覆盖细胞。例如400μl/60mm培养皿，900μ1/lOOmm培养皿或96孔板每孔20μ1。晃动培养皿数次以保证裂解缓冲液完全覆盖细胞。4、将细胞从培养皿刮下。将细胞及所有的液体转移至一个离心管中。将离心管置于冰上。旋涡震荡离心管5-10秒钟，然后以12000g离心15秒钟(室温)，将上清液转移至一个新的试管中。5、取约30μ1(所用裂解液总量为100μ1)与50μ1的平衡好的底物在一个1.5ml的Ep管中混合，然后立即在TurnerBioSystemsTD-20/20荧光光度计(TurnerDesigns，Sunnyvale,CA)上检测样品的荧光素酶的活性。黄连素(Berberine)不能抑制病毒的吸附入侵。所以通过哺乳动物双杂交试验，检测黄连素是否通过抑制病毒的核蛋白(NP)与PB1、PB2之间的相互作用从而影响病毒的复制。试验结果如图10.1所示各实验组药物对NP、PB1蛋白间相互作用没有很显著的影响(图10.2)；而黄连素能抑制NP、PB2蛋白间的相互作用，相对于阳性对照，抑制率达到50%(图10.3)。本实验结果表明，黄连素可能是通过降低NP、PB2的结合而抑制病毒的复制。黄连素对流感病毒感染所引起的炎症反应的影响作用采用PGE2检测试剂盒，分别在36、48h时收集病毒感染后的A549细胞上清液，按照试剂盒测定方法测定细胞上清中的PGE2含量。结果如图11所示，病毒感染细胞36小时时产生的PGE2没有明显变化，且含量很低，等病毒感染细胞48小时测定时，病毒感染未加任何药物处理的细胞组PGE2含量最高，与正常细胞对照组和用药组有显著性差异(*p<0.05；**p<0.01)，黄连素和阳性对照药金刚烷胺能够显著降低PGE2的分泌(与病毒感染组比较，*P<0.05；**p<0.01)。说明黄连素能够显著降低病毒感染过程中引起的一些炎症因子的分泌。权利要求一种黄连素在制备治疗或预防流感病毒药物中的应用。全文摘要本发明公开了一种黄连素在制备治疗流感病毒药物中的应用，本发明证实黄连素在体外对H5N1、H3N2等A型流感病毒感染的MDCK细胞和A549细胞均具有良好的抗流感病毒作用。同时黄连素对流感病毒具有一定的杀伤作用，能够预防流感病毒的侵袭，并对流感病毒感染后的细胞具有较好的抑制作用，其作用效果与阳性对照药金刚烷胺比较近似，另外黄连素对流感病毒引起的炎症反应也有较好的抑制作用，揭示该药物有开发成抗流感病毒药物的前景。文档编号A61P31/16GK101829113SQ20091006316公开日2010年9月15日申请日期2009年7月14日优先权日2009年7月14日发明者吴建国,朱应,袁婷婷,陶君彦申请人:武汉大学