专利名称：一种载生长激素海藻酸钙壳聚糖缓释微球及其应用的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及具有生理活性的壳聚糖，它经脱乙酰基后带有宇宙中罕见的正电荷 阳离子基团，且呈弱碱性，这对于生物体的健康，尤其是人类的健康具有重要意义。壳 聚糖被人体吸收后，能捆绑、吸附人体内带负电荷的脂肪、毒素等不良物质，可以降低 血脂、活化细胞、增强人体免疫功能、使骨折愈合时间縮短，从而减轻骨折患者的痛 苦。此外，脱乙酰甲壳质具有生物降解性，用作缓释剂型中控制药物释放的高分子载体 具有明显的优越性，避免了目前一些高分子材料(如硅橡胶等)作为药物载体而为患者带 来不必要的手术麻烦和痛苦。 本发明的微球球形度好，粒径分布范围窄，可使药物的释放吸收更持续。微球 成型过程简便、高效，成型条件温和，生长激素包封率和活性高，无需有机溶剂等。
本发明所涉及的原料中，生长激素注射液为长春金赛药业有限责任公司的产 品，海藻酸钠、氯化钙、壳聚糖由中国海洋大学提供，均为本行业常用试剂，其余未特 别指出的均为本行业常用试剂。 本发明所涉及的仪器设备，除已特别指出的外均为常用仪器。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明进一步详细说明。
实施例1 本实施例的载生长激素海藻酸钙壳聚糖缓释微球，其主要成分为生长激素、海 藻酸钙、壳聚糖，采用下列步骤制备 首先精密量取10IU/mL生长激素注射液与15mg/ml海藻酸钠溶液，以1 : 4体 积比混合均匀后装入注射器中；使脉冲电场制备仪的正极与注射器金属锐孔连接，锐孔 孔径为450um，负极与置于凝胶浴溶液中的金属导电圈连接，在锐孔和凝胶浴之间形成 脉冲静电场，脉冲电场装置指示电压380V、脉冲频率120Hz、脉宽2ms;注射器将液体 推出，原料液流速为8mL/h，在电场力作用下克服海藻酸钠溶液固有的粘滞力和表面张 力，使混合溶液液滴滴入20mg/ml CaCl2溶液中凝胶浴固化，形成微球，锐孔与液面距离 为2cm。然后将微球滤出，并与10mg/ml成膜壳聚糖溶液以1 : IO体积比混合，170rpm 振荡15min，在微球表面形成均匀半透性薄膜，得到复合凝胶微球；再将复合凝胶微球 在-75"预冻2h，在真空度3X 103Mbar、温度-45"冷冻干燥24h即得成品。
实施例2 本实施例的载生长激素海藻酸钙壳聚糖缓释微球，其主要成分为生长激素、海 藻酸钙、壳聚糖，采用下列步骤制备 首先精密量取10IU/mL生长激素注射液与20mg/ml海藻酸钠溶液，以1 : 4体 积比混合均匀后装入注射器中；使脉冲电场制备仪的正极与注射器金属锐孔连接，锐孔 孔径为600um，负极与置于凝胶浴溶液中的金属导电圈连接，在锐孔和凝胶浴之间形成 脉冲静电场，脉冲电场装置指示电压380V、脉冲频率120Hz、脉宽2ms;注射器将液体推出，原料液流速为25mL/h，在电场力作用下克服海藻酸钠溶液固有的粘滞力和表面张 力，使混合溶液液滴滴入30mg/ml CaCl2溶液中凝胶浴固化，形成微球，锐孔与液面距离 为5cm。然后将微球滤出，并与20mg/ml成膜壳聚糖溶液以1 : IO体积比混合，170rpm 振荡15min，在微球表面形成均匀半透性薄膜，得到复合凝胶微球；再将复合凝胶微球 在-75"预冻2h，在真空度3X 103Mbar、温度-45"冷冻干燥24h即得成品。
实施例3 本实施例的载生长激素海藻酸钙壳聚糖缓释微球，其主要成分为生长激素、海 藻酸钙、壳聚糖，采用下列步骤制备 首先精密量取10IU/mL生长激素注射液与5mg/ml海藻酸钠溶液，以1 : 4体 积比混合均匀后装入注射器中；使脉冲电场制备仪的正极与注射器金属锐孔连接，锐孔 孔径为500um，负极与置于凝胶浴溶液中的金属导电圈连接，在锐孔和凝胶浴之间形成 脉冲静电场，脉冲电场装置指示电压380V、脉冲频率120Hz、脉宽2ms;注射器将液体 推出，原料液流速为50mL/h，在电场力作用下克服海藻酸钠溶液固有的粘滞力和表面张 力，使混合溶液液滴滴入5mg/ml CaCl2溶液中凝胶浴固化，形成微球，锐孔与液面距离 为lcm。然后将微球滤出，并与5mg/ml成膜壳聚糖溶液以1 : 10体积比混合，170rpm 振荡15min，在微球表面形成均匀半透性薄膜，得到复合凝胶微球；再将复合凝胶微球 在-75t:预冻2h，在真空度3Xl(fMbar、温度-45"冷冻干燥24h即得成品。
实施例4 本实施例为对本发明的特定缓释微球的检测与分析。
1、微球球径测定 利用生物倒置显微镜随机读取IOO个载药微球球径，将算术平均值作为微球平 均粒径d。 2、微球中生长激素包封率测定 应用提取-水解法检测生长激素微球载药率和包封率。精密称取冷冻干燥的微球 20mg，用5ml模拟肠液溶解微球后，在1 X 104rpm条件下离心10min，保留上清液。沉 淀加入pH值为7.4的PBS1.0ml重新分散，离心后保留上清液；沉淀溶于10ml O.lmol/L 氢氧化钠，充分混合后离心；分离出上清液，与前步上清液合并；用O.lmol/L盐酸中和 混合的上清液。混合上清液中的生长激素含量根据《中华人民共和国药典》III部(2005 年版)附录VIB蛋白测定法第2法(Lowry法)测定。微球的包封率按下列公式计算
包封率=(实测载生长激素量/理论载生长激素量)X 100% 。
3、载生长激素微球形态及结构机理 冻干前载生长激素微球的整体形态，形态圆整、球形度良好。冻干后载生长激 素微球的粒径分布较为均匀，分散性好。微球并非光滑的球体，表面有许多孔洞，这 有利于药物分子从微球内部缓慢释放并防止胃肠道中消化酶进入微球中对生长激素的破 坏。 4、 Ca2+浓度对制备的载生长激素微球包封率的影响 表l列明的是在Ca2+浓度分别为0.5X、 1%、 2%、 3%时，1.5%褐藻胶、1%壳 聚糖条件下对制备的载生长激素微球包封率的影响。表1中的结果表明，Ca2+浓度2% 时，微球中生长激素的包封率最高，而微球粒径无明显变化。
表lCa2+浓度对制备的载生长激素微球包封率的影响
Ca"浓度 0.5% i% 2% 3% 包封率80% 85% 96% 90%
粒径 155um153um150un 155um 5、海藻酸钠浓度对载药微球粒径、包封率的影响 表2列明的是海藻酸钠浓度分别为0.5%、 1%、 1.5%、 2%时，0&2+浓度2%、
1%壳聚糖条件下对制备的载生长激素微球粒径及包封率的影响。结果表明，海藻酸钠浓
度越大，微球中生长激素的包封率越高，而微球粒径却是处于1.5%的海藻酸钠制备的载
生长激素微球粒径最小，且包封率均大于90%。 表2海藻酸钠浓度对载药微球粒径、包封率的影响褐藻胶浓度 0. 5%1% 1. 5% 2%
包封率 75% 84% 93% 96%粒径 130um 145咖 150um 190咖 6、壳聚糖浓度对载药微球粒径、包封率的影响 表3壳聚糖浓度对载药微球粒径、包封率的影响壳聚糖浓度 0. 5%1% 2%
包封率 95% 96% 96%粒径 150um 155咖 155咖表3列明的是壳聚糖浓度分别为0.5%、 1%、 2%时，Ca2+浓度2X、 1.5%海藻 酸钠条件下对制备的载生长激素微球包封率及粒径的影响。表3中的结果表明，壳聚糖 浓度对微球中生长激素的包封率及粒径影响最小。在包封率均大于90%情况下，采用 0.5 %的壳聚糖浓度所制备的微球粒径最小。
7、锐孔孔径对载药微球粒径、包封率的影响 表4列明的是锐孔孔径分别为450um、 600um、 700um时，1.5%褐藻胶、Ca2+ 浓度2%、 1%壳聚糖条件下对制备的微球的粒径以及包封率的影响。结果表明，孔径 越大，微球粒径越大，且包封率越小。当孔径分别为450um和600um时，包封率大于 80%，具有实际生产价值。 表4锐孔孔径对载药微球粒径、包封率的影响锐孑l,孑l,径 450um 600um 700um
包封率 94% 87% 70%
粒径 150um 175咖 220咖 8、原料液流速对载药微球粒径、包封率的影响 表5列明的是原料液流速分别为8mL/h、 25mL/h、 50mL/h时，1.5%褐藻胶、 (^2+浓度2%、 1%壳聚糖条件下对制备的微球的粒径以及包封率的影响。结果表明，原 料液流速对包封率的影响不显著，包封率均在80%左右。而对粒径的影响很明显，原料 液流速超过50mL/h后粒径迅速增大，当原料液流速越小时，制备的微球粒径也越小。在 微球制备过程发明人发现，当原料液流速太快，达到50mL/h时，常常出现放电现象，在 高压电弧的作用下，液体飞散，产生大量带尾小微球，而且其中的大微球容易破裂，形 状不规则；电弧还会破坏生长激素的活性。因而采用较小的原料液流速有利于减小微球
7粒径。 表5原料液流速对载药微球粒径、包封率的影响原料液流谏8mL/h 25mL/h 50mL/h
包封率90% 92% 95%
粒径 150um 2Q0um 260um 9、液面距对载药微球粒径、包封率的影响 表6列明的是液面距分别为lcm、 2cm、 5cm时，1.5%褐藻胶、0&2+浓度2%、
1%壳聚糖条件下对制备的胰岛素微球的粒径以及包封率的影响。包封率和粒径受液面距
的影响均体现了极值的存在。液面距分别为lcm、 2cm、 5cm时，包封率均在90%以上；
而当液面距为2cm时，粒径均达到了最低值。 表6液面距对载药微球粒径、包封率的影响 夜HI足巨 lcm 2cm 5cm
包封率 95% 90% 96%
粒径 175um 135um 220um 实施例5 本实施例为对本发明载药微球的应用试验。 所用试剂1、模拟胃液精密量取2.25ml浓盐酸，用双蒸水定容至250ml，测得pH二1.30。
2、模拟肠液精密称取氢氧化钠0.4g和磷酸二氢钾1.7g，用双蒸水溶解后，定容到250ml，测得pH = 7.5。
3、实施例1制备的微球。
试验方法 采用培养法，精密称取微球10mg，置于具塞试管中，加入20ml释放介质。样品放入37t:恒温台式振荡器中，以转速为50rpm振荡。定时取出样品管，在lX10Vpm冷冻离心10min后，取出上清液2ml，再加入等量新鲜的释放介质。不同时间段上清液中白蛋白的含量以空白微球的释放上清液作为空白对照，通过吸光光度值间接比较释放液中生长激素的含量。 实验结果是体外模拟胃液中，微球不溶胀而且所载生长激素基本不被释放；在模拟肠液中，微球溶胀而且所载生长激素被释放出来。由此表明微球溶胀的PH敏感性以及药物是以扩散机制释放的，冻干的微球在未溶胀的情况下表面存在许多皱折及较小孔洞，其将微球中的药物以及外界的消化酶隔离开；当进入肠液后，微球发生溶胀，微球表面的皱折消失而且空洞打开，这为溶出介质的渗入和药物的扩散提供了通道。由此可以得出结论本发明的载药微球非常适合应用于制备治疗骨折愈合的载有生长激素的药物。
权利要求
一种载生长激素海藻酸钙壳聚糖缓释微球，其主要成分为生长激素、海藻酸钙、壳聚糖，经下列步骤制备而成首先精密量取10IU/mL生长激素注射液与海藻酸钠溶液，以1∶4体积比混合均匀后装入注射器中；使脉冲电场制备仪的正极与注射器金属锐孔连接，负极与置于凝胶浴溶液中的金属导电圈连接，在锐孔和凝胶浴之间形成脉冲静电场，脉冲电场装置指示电压380V、脉冲频率120Hz、脉宽2ms；注射器将液体推出，在电场力作用下克服海藻酸钠溶液固有的粘滞力和表面张力，使混合溶液液滴滴入凝胶浴固化，形成微球；然后将微球滤出，并与成膜壳聚糖溶液以1∶10体积比混合后振荡，在微球表面形成均匀半透性薄膜，得到复合凝胶微球；再将复合凝胶微球真空冷冻干燥即得成品；其中所用的海藻酸钠溶液浓度为5～20mg/ml，凝胶浴溶液为5～30mg/ml CaCl2溶液，成膜壳聚糖溶液浓度为5～20mg/ml。
2. 根据权利要求1所述的载生长激素海藻酸钙壳聚糖缓释微球，其制备步骤如下首先精密量取10IU/mL生长激素注射液与海藻酸钠溶液，以l : 4体积比混合均匀后装入注射器中；使脉冲电场制备仪的正极与注射器金属锐孔连接，锐孔孔径为450um 600um，负极与置于凝胶浴溶液中的金属导电圈连接，在锐孔和凝胶浴之间形成脉冲静电场，脉冲电场装置指示电压380V、脉冲频率120Hz、脉宽2ms;注射器将液体推出，原料液流速为8mL/h 50mL/h，在电场力作用下克服海藻酸钠溶液固有的粘滞力和表面张力，使混合溶液液滴滴入凝胶浴固化，形成微球，锐孔与液面距离为lcm 5cm ;然后将微球滤出，并与成膜壳聚糖溶液以l : io体积比混合加入成膜壳聚糖溶液中170rpm振荡15min，在微球表面形成均匀半透性薄膜，得到复合凝胶微球；再将复合凝胶微球在-75"预冻2h，在真空度3X 103Mbar、温度-45"冷冻干燥24h即得成品；其中所用的海藻酸钠溶液浓度为15mg/ml，凝胶浴溶液为20mg/ml CaCl2溶液，成膜壳聚糖溶液浓度为10mg/ml。
3. 根据权利要求2所述的载生长激素海藻酸钙壳聚糖缓释微球，其特征在于在制备该缓释微球时，注射器金属锐孔孔径为450um，注射器推出料液流速为8mL/h，锐孔与液面距离为2cm。
4. 将权利要求1、 2或3任一项所述的载生长激素海藻酸钙壳聚糖缓释微球用于制备治疗骨折愈合的药物。
全文摘要
本发明公开了一种载生长激素海藻酸钙壳聚糖缓释微球，其主要成分为生长激素、海藻酸钙、壳聚糖，该缓释微球可用于制备治疗骨折愈合的药物。该缓释微球球形度好，粒径分布范围窄，可使药物的释放吸收更持续。微球成型过程简便、高效，成型条件温和，生长激素包封率和活性高，无需有机溶剂等。
文档编号A61K47/36GK101690716SQ20091001943
公开日2010年4月7日 申请日期2009年10月13日 优先权日2009年10月13日
发明者刘爱芬, 张亦军, 张增方, 赛佳明, 黄勇 申请人:张亦军;赛佳明