专利名称：一种治疗皮肤缺损的注射剂及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种组织填充剂及其制备方法，更具体地说，是一种治疗皮肤缺损的注射剂及其制备方法。
背景技术：
人体软组织填充是作为修复软组织在损伤后的主要治疗方法。十九世纪就已经开 始使用石蜡、硅氧烷进行填充。上个世纪八十年代之后又出现了明胶粉末材料，但其均有疗 效不确定，毒副作用大等问题。1997年之后，Isolagen采用自体成纤维细胞作为团组织填充材料，有了一定的疗 效，但存在显效慢，疗效不显著等问题。中国专利03155833. X中公开了一种除皱祛疤的注射剂，应用了自体皮肤，经体外 分离、培养和扩增，制成于葡萄糖液中的一种注射剂，治疗疤痕和祛除皱纹。由于该技术使 用的生物材料取自患者自体，无排斥反应，效果持久，但该技术的不足之处是，注射剂中能 立即发挥人体软组织的填充和修复功能的胶原蛋白含量较低，导致注射到疤痕和皱纹处后 见效较慢，一般要4-6个月；另外，使用动物血清作为培养液的成分也可能存在安全性方面 的问题。我们在2006年发明了采用自体的成纤维前体细胞和透明质酸构成的新的填充材 料，有效的改善了单纯成纤维细胞治疗出现效果慢的缺陷，但是透明质酸最主要的作用是 保水，对细胞的扩增和存活作用较弱。应用治疗者自体富含血小板的血浆作为注射材料的一部分，自体血浆中的血小板 能有效的提高自体细胞的成活率，注射后其产生的细胞因子能促进自体细胞的扩增和产生 较多的胶原蛋白，同时自体血浆中的血小板成分与凝血因子构成一种网状结构，能使自体 细胞更大量的扩增并扩大了细胞分泌胶原蛋白的空间。本专利应用流产胎儿皮肤或新生儿包皮做为细胞培养来源，细胞活性好，并且治 疗者可得到即时治疗，优于以往的自体细胞培养需要等待两个月的培养时间才能得到治疗。
发明内容
为了克服上述注射用人体软组织填充剂的不足，本发明的目的在于提供一种立即 见效、疗效持久、受术者满意度更高的注射用人体软组织填充剂。本发明的另一个目的是提供这种注射用填充剂的制备方法。为实现上述目的，本发明采用以下技术方案一种治疗皮肤缺损的注射剂，该填充剂主要由细胞成分与富含血小板血浆组成， 每毫升注射用填充剂中细胞成分的含量为1000-5000万个，血小板的含量为100-700X106 个；所述细胞成分是用流产胎儿皮肤或新生儿切除的包皮的皮肤经过体外低血清或无血清 培养和扩增，收集得到的真皮成纤维干细胞、成纤维前体细胞、成纤维细胞中的至少一种。
优选地，在本发明所述填充剂中，所述的经培养和扩增后收集到的真皮成纤维干 细胞、成纤维前体细胞、成纤维细胞的数量之比为10-20 50-70 20-30。优选地，在本发明所述填充剂中，血浆中的血小板含量为100-700X IO6个/ml注 射用填充剂，进一步优选200-300X IO6个/ml注射用填充剂。本发明所述的填充剂除了细胞成分和富含血小板血浆、还可以含有一些辅助成 分，所述辅助成分可以是本领域常见的能够加入到填充剂中的任何一种或多种成分，如自 体胶原蛋白、维生素、葡萄糖、等渗生理盐水等等。本发明使用的低血清培养基仅需添加3% 5%胎牛血清，而传统培养基通常加 入约10%的新生牛血清，低血清培养基对于细胞生长、增殖、形态、活性和功能没有不良影 响，甚至有所改善。此外，本发明还提供了一种所述注射用人体软组织填充剂的制备方法，该方法包 括下列步骤(1)采用流产胎儿皮肤或新生儿切除的包皮的皮肤进行体外低血清或无血清培养 和扩增，对所得到的真皮成纤维干细胞、成纤维前体细胞、成纤维细胞进行收集；(2)将收集到的细胞成分与自体富含血小板的血浆配成注射用人体软组织填充 剂。本发明所采集的皮肤组织是流产胎儿皮肤或新生儿切除的包皮的皮肤，同时包括 表皮和真皮。在本发明所提供的填充剂制备方法中，将来源于流产胎儿皮肤或新生儿切除的包 皮皮肤，例如，1-30平方毫米的皮肤，在加入了生长因子和活性材料的低血清或无血清培养 液中进行体外培养和扩增，得到真皮成纤维干细胞、成纤维前体细胞、成纤维细胞。所述体外低血清或无血清培养和扩增中，所述培养液的组成可以是本领域常用的 基础培养液，例如，可以参见《细胞实验指南》中的有关介绍(2001年，科学出版社出版，主 编D. L.斯佩克特，黄培唐翻译)。优选地，在体外全程无血清培养和扩增过程中，使用的培 养液中还包括生长因子和活性材料。所述生长因子为选自上皮生长因子、成纤维生长因子 中的一种或多种；所述活性材料选自氢化可的松、肝素中的一种或多种。所述上皮生长因 子在培养液中的含量可以为1至5纳克/毫升，优选为3纳克/毫升；所述成纤维生长因子 在培养液中的含量可以为2至20纳克/毫升，优选为10纳克/毫升；所述氢化可的松在培 养液中的含量可以为0. 2至2微克/毫升，优选为1微克/毫升；所述肝素在培养液中的含 量可以为2至20微克/毫升，优选为10微克/毫升。上述的培养液和生长因子及活性材 料可以是选自一个公司或者多个公司(如美国的Cascade公司、Sigma公司、Hyclne公司 等)的市售产品。在本发明所提供的填充剂制备方法中，所述体外培养和扩增可采用本领域常见的 任何用于为获得自体细胞的体外培养和扩增方法，如组织消化培养法、组织块培养法等，优 选采用组织块培养法。下面进一步详细说明本发明所提供的填充剂制备方法，但本发明并不因此而受到 任何限制。1、皮肤取材用酒精消毒流产胎儿皮肤或新生儿切除的包皮。用手术剪刀将表皮和真皮组织取下，放入组织保存液中。2、皮肤组织培养前处理将皮肤组织块放置于培养皿中清洗上皮部位，然后去除皮下组织和脂肪，将皮肤组织剪碎为0. 1-0. 5平方毫米的皮肤碎片，最后将皮肤碎片平铺于培养皿的底面。也可首 先将皮肤组织块用胰酶液消化一段时间，再将消化后的组织块剪碎平铺于培养皿的底面。3、细胞体外培养包括原代细胞培养和传代细胞培养两个步骤。原代培养在已平铺皮肤碎片的培养皿中加入DMEM和低血清培养液进行培养，使 细胞扩增到50% -90%的培养皿底面即可进行传代培养。传代培养在原代培养的基础上加入生长因子(如上皮生长因子、成纤维生长因 子等)和活性材料(如氢化可的松、肝素等)，培养2-8周，大约培养扩增至1500万-2亿个 细胞。上皮生长因子在培养液中的含量可以为1至5纳克/毫升，优选为3纳克/毫升； 所述成纤维生长因子在培养液中的含量可以为2至20纳克/毫升，优选为10纳克/毫升； 所述氢化可的松在培养液中的含量可以为0. 2至2微克/毫升，优选为1微克/毫升；所述 肝素在培养液中的含量可以为2至20微克/毫升，优选为10微克/毫升。采用本领域常用的细胞培养条件即可，如可将从组织块培养出的真皮细胞(含成 纤维干细胞、成纤维前体细胞和成纤维细胞)用上述的低血清或无血清培养液在温度为 37°C，5%的CO2细胞培养箱中培养，每3-4天换上述培养液一次，直至得到所需的细胞成分 的含量。在医院或诊所由医护人员抽取治疗者5-30毫升血液。在洁净的实验室或化验室 条件下将此血液置入装有细胞分离液的离心管中，以500-2500转/分的转速离心25分钟， 优选转速1500转/分钟，优选离心时间为15分钟，提取上部的富含血小板的血浆作为自体 注射用的血浆。4、填充剂配制将培养数量达到要求的细胞首先使用胰蛋白酶进行消化处理，使其脱离培养皿底 面，在使用无外源性蛋白的DMEM清洗数次，去除外源性生长因子和活性物质。再将收集到 的细胞与少量胶原蛋白直接加入富含血小板的血浆中，混勻，配成注射填充剂，每毫升注射 用填充剂中细胞成分的总个数为1000-5000万个，血小板的含量为100-700 X IO6个。治疗步骤将含有细胞和血浆的溶液注射到治疗部位，使填充部位出现发白和轻 微的隆起为止，注射到稍感硬度、发白，注射过程完成。与现有技术相比，本发明的注射用人体的皮肤更具有细胞活性、扩增性，在注射部 位能快速产生填充除皱和修复效果；随后，在大量的血小板中产生的自体生长因子的作用 下，注射填充剂中含有的细胞成分能不断地分泌出胶原蛋白，保持填充和修复的效果。该注 射用人体软组织填充剂在注射后可快速出现明显的填充和修复效果，且疗效持久。因此，本发明的注射用人体软组织填充剂可广泛用于美容、改善皮肤弹性和光泽 以及其它部位和类型的填充和修复中，包括处理由于真皮缺损而导致的各种症状，例如面 部皱纹、凹陷性疤痕、妊娠纹、手背皱纹等，还可用于丰唇、增强真皮厚度和改善皮肤基质寸。
图1是培养成功的真皮细胞在100倍光学显微镜下形态学照片；图2是本发明的一个具体实施例的注射用人体软组织填充剂在包装瓶中照片。图3和图4是本发明的一个具体实施例治疗皱纹前后的对比照片， 其中图3为受 术者鼻唇沟治疗前照片，图4为受术者鼻唇沟治疗后照片；
具体实施例方式下面进一步详细说明本发明所提供的注射用人体软组织填充剂及其制备方法，但 本发明并不因此而受到任何限制。实施例人体软组织填充剂的制备一.自体健康皮肤样品的提取用70%的酒精消毒流产胎儿皮肤或新生儿切除的包皮标本，放入组织保存液 (DMEM细胞保存液，购自美国Hyclone公司)中，送实验室进行分离、培养。二 .细胞悬液的制备1.皮肤组织培养前处理将皮肤组织块放置于培养皿中清洗上皮部位，然后去除 皮下组织和脂肪，将皮肤组织剪碎为0. 1-0. 5平方毫米的皮肤碎片，最后将皮肤碎片平铺 于培养皿的底面。2.原代细胞培养在已平铺皮肤碎片的培养皿中加入DMEM和3%的胎牛血清，放 入Forma CO2 3131型培养箱中，在37°C，5% CO2的条件下进行培养，每隔2 3天换上述 培养液一次，当原代细胞达到80%汇集后传代。3.传代细胞培养在原代培养的基础上加入上皮生长因子为3纳克/毫升、成纤 维生长因子10纳克/毫升、氢化可的松1微克/毫升、肝素10微克/毫升，每3-4天换上 述培养液一次，培养4周，大约培养扩增至1500万个细胞。4.配制注射剂将培养数量达到要求的细胞首先使用胰蛋白酶进行消化处理，使 其脱离培养皿底面，再使用无外源性蛋白的DMEM清洗3次。将收集到的细胞与少量胶原蛋 白直接加入富含血小板的血浆中，混勻，配成注射填充剂，每毫升注射用填充剂中细胞成分 的总个数为1000-5000万个，血小板的含量为100-700X 106个。病毒检测皮肤组织和培养4周后的细胞进行HIV和肝炎病毒的检验，确定此为无 病毒细胞。免疫反应测试第4周将0. Iml细胞与血小板注射液对受术者进行皮试(同青霉 素皮试方法)，无免疫反应。成品检测1)外观细胞与血小板注射液为黄色混悬液。2)本品中细胞分类检定成纤维干细胞采用Brdu抗体测定(黄晖，赖西南，王正国，王丽丽，“创伤愈合中 物质对表皮干细胞迁移及受体表达的作用”;《中华创伤杂志》2004年；20 (3) 142-145。利用 核标记物)，产品中有10%的成纤维干细胞。成纤维前体细胞采用细胞形态学方法观察(在100倍光学显微镜下做形态学观察，其标准形态为细小长索状)，产品中有70%的成纤维前体细胞。成纤维细胞采用细胞形态学方法观察(在100倍光学显微镜下做形态学观察，其 标准形态为呈多触突的长索形细胞)，产品中有20%的成纤维细胞。3)无菌试验按《中国生物制品规程》(2000版)通则《生物制品无菌试验规程》 A/B项进行，结果符合无菌要求。三.治疗用于额头皱纹，眼角鱼尾纹，脖颈皱纹，妊娠纹等所有面部及其它身体部位的皱纹 和细小皱纹；治疗5例。1.治疗者术前检查，各项指标均正常，包括血尿便常规、心电图、肝肾功能、HIV, HbsAg02.将注射部位用70%的酒精消毒，局部注射的利多卡因麻醉。3.将Iml填充剂吸入Iml的注射器中备用。4.取2. 2cm长的4. 5号针头，采用多点斜面(针头与皮肤的角度20° 45° )， 在注射部位注射时，将注射部位表皮拉紧注射细胞，使其发白，注射时使注射部位留有弥散 空间。将含有细胞和血浆的溶液注射到治疗部位，使填充部位出现发白和轻微的隆起为止， 注射到稍感硬度，发白度更加明显，注射过程完成。疗程注射部位共注射1次。四、术后观察、调护1.手术后，用冰袋敷注射处2小时。2.观察局部及全身的情况一切正常。 3.每天二次口服维生素C (每次200mg，每天共400mg)，服用6个月。4.术后3天内防曝晒及慎用刺激性化妆品。五、效果描述皱纹在注射后基本消失或明显变浅，效果良好。注射前后的效果对比见图3至图 4。
权利要求
一种治疗皮肤缺损的注射剂，该填充剂主要由细胞成分与富含血小板血浆组成，每毫升注射用填充剂中细胞成分的含量为1000-5000万个，血小板的含量为100-700×106个；所述细胞成分是用流产胎儿皮肤或新生儿切除的包皮的皮肤经体外低血清或无血清培养和扩增后收集到的真皮成纤维干细胞、成纤维前体细胞、成纤维细胞中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的注射用人体软组织填充剂，其特征在于所述富含血小板的 血浆是从治疗者血液中提取，且所述血小板的含量范围为100-700 X IO6个/ml注射用填充 剂。
3.根据权利要求1所述的注射用人体软组织填充剂，其特征在于所述的经培 养和扩增后收集到的真皮成纤维干细胞、成纤维前体细胞、成纤维细胞的数量之比为 10-20 50-70 20-30。
4.一种制备权利要求1至2中任意一项所述的注射用人体软组织填充剂的方法，包括 以下步骤(1)采用流产胎儿皮肤或新生儿切除的包皮的皮肤进行体外低血清或无血清培养和扩 增，收集所得到的真皮成纤维干细胞、成纤维前体细胞、成纤维细胞；(2)富含血小板血浆，是从治疗者臂部抽全血5-30毫升，在体外分离所得富含血小板 的血浆。(3)将收集到的细胞成分或与富含血小板的血浆构成注射用人体软组织填充剂；每毫 升该填充剂中细胞成分的含量为1000-5000万个，，若加入富含血小板血浆，则血小板的含 量为 100-700 X IO6 个。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述低血清或无血清体外培养和扩 增采用组织块培养法。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于所述体外低血清或无血清培养和扩 增中加入了生长因子和活性材料；所述生长因子选自上皮生长因子、成纤维生长因子中的 一种或多种，所述活性材料选自氢化可的松、肝素中的一种或多种。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于所述上皮生长因子在培养液中的含 量为1至5纳克/毫升；所述成纤维生长因子在培养液中的含量为2至20纳克/毫升；所 述氢化可的松在培养液中的含量为0. 2至2微克/毫升；所述肝素在培养液中的含量为2 至20微克/毫升。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于所述上皮生长因子在培养液中为3 纳克/毫升；所述成纤维生长因子在培养液中的含量为10纳克/毫升；所述氢化可的松在 培养液中的含量为1微克/毫升；所述肝素在培养液中的含量为10微克/毫升。
9.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于从治疗者抽取5-30毫升全血， 进行500-2000转/分，15分钟离心得到富含血小板的治疗者自体的血浆，其含量为 100-700X IO6 个/ml。
10.用培养的细胞与富含自体血小板的血浆与制备成注射液。注射过程为将培养好 的细胞与富含血小板的血浆制备的注射液注射到需要填充的部位。
全文摘要
一种治疗皮肤缺损的注射剂，主要由细胞成分与富含血小板血浆组成，每毫升注射用填充剂中细胞成分的含量为1000-5000万个，血小板的含量为100-700×106个；所述细胞成分是用流产胎儿皮肤或新生儿切除的包皮经过体外低血清或无血清培养和扩增，收集得到的真皮成纤维干细胞、成纤维前体细胞、成纤维细胞中的至少一种。血小板也是从治疗者的自体血液中提取。本发明还提供了所述注射用人体软组织填充剂的制备方法。本发明的优点是注射后可立即出现明显的填充和修复效果，且疗效持久，治疗程序简便。
文档编号A61K35/16GK101804071SQ20091000907
公开日2010年8月18日 申请日期2009年2月17日 优先权日2009年2月17日
发明者韩斌 申请人:北京赛尔泰和生物医药科技有限公司