TrkB抗体用于治疗呼吸病症的用途的利记博彩app

专利名称：TrkB抗体用于治疗呼吸病症的用途的利记博彩app
TrkB抗体用于治疗呼吸病症的用途
背景技术：
酪氨酸激酶受体B (TrkB)属于单跨膜受体酪氨酸激酶家族，该家族还包括TrkA和 TrkC0这些酪氨酸激酶受体(trks)介导神经营养蛋白的活性。神经营养蛋白是神经元的存 活和发育所必需的，其通过调节神经元结构和突触可塑性来调控突触传递。神经营养蛋白 包括但不限于神经生长因子(NGF)、脑衍生神经营养因子(BDNF)、神经营养蛋白-3 (NT-3) 和神经营养蛋白-4/5(NT-4/5) (Lo, KY et al.，(2005) T. Biol. Chem. ,280 :41744_52)。TrkB是BDNF 的高亲和性受体(Minichiello，et al. ,Neuron 21:335-45(1998))， 其在脑中，特别是新皮层、海马、纹状体和脑干中高水平表达；还在肌肉组织中发现了同 种型。神经营养蛋白与trk结合，活化受体，使得受体细胞内结构域上的特定酪氨酸残 基二聚化并且自磷酸化(Jing，etal.，(1992)Neuron 9 1067-1079 ；Barbacid, (1994) T. Neurobiol. 25 :1386_1403 ；Bothwell, (1995)Ann. Rev. Neurosci. 18 :223_253 ；Segal andGreenberg, (1996)Ann. Rev. Neurosci. 19 :463_489 ；Kaplan and Miller, (2000)Curr. Opinion Neurobiol. 10 =381-391) 0这些磷酸酪氨酸残基作为细胞内信号级联元件的停靠 点发挥作用，导致对神经元死亡的抑制(suppression)、对神经突(neurite)长出的促进作 用以及神经营养蛋白的其它作用。例如，3&、？1 -2、5!128、『4 5和？11^通过磷酸化的酪 氨酸残基与TrkB发生相互作用。这些衔接分子与活化的TrkB的联结导致信号途径(包括 有丝分裂原活化的蛋白激酶、磷脂酰肌醇3-激酶和PLC γ途径)的启动，由此介导神经营 养蛋白的作用(Lo，KY et al.，(2005) T. Biol. Chem.，280 41744~52)。雷特综合征(RTT)最初由Dr. Andreas Rett于1966年鉴定出来，其是来自 晚期神经发育缺陷的破坏性的CNS病症。其几乎仅仅影响所有种族的女童，发病率为 1/10，000-15，000出生人口。一些患有RTT的个体在童年时死亡，但是，很多可以活到成年 阶段并高度残障。高达25%的患者死于心脏//呼吸衰竭。迄今为止对该疾病没有有效治 疗。表观正常发育期之后，受到影响的女童在6至18个月期间发展出RTT症状，症 状在未来数年来不断恶化。症状包括出生时正常头围之后头部生长减速；获得性语言能 力丧失；交流障碍；认知受损；有目的的手部技能被刻板的手部运动代替(扭曲绞手、洗手 (hand washing)、拍手(clapping)、轻拍(patting)等)；受损或变差的运动能力(步态共 济失调(gait ataxia)、缺乏柔性(stiffness)等)；清醒时呼吸困难；从婴儿期早期开始受 损的睡眠模式；异常肌肉紧张伴肌肉消瘦和肌张力失常；外周血管舒缩障碍；进行性脊柱 侧凸或驼背和生长迟缓。该病症特征还在于中枢自主功能障碍，并且Rett患者显示出下述症状中的一些 或全部由屏气、浅呼吸、换气过度、延长的呼吸暂停期构成的多种呼吸节律障碍；心律不 齐伴随基线心迷走紧张的降低；h和心压力感受器反射敏感性。这些症状威胁生命，并且使 得Rett患者处于猝死风险中。他们显示出脑干不成熟，并且在觉醒期间缺乏心肺网络中的 和来自下丘脑或边缘皮层的综合抑制。此外，在Rett患者中报道了脑干神经营养蛋白信号 (NGF和BDNF)的改变，以及单胺(5-羟色胺、去甲肾上腺素)和神经肽(物质P)水平的降低。RTT是单基因型疾病，在绝大多数情况下，是X染色体连锁的基因mecp2的突变导 致的，该基因编码转录阻遏子MeCP2 (甲基-CpG胞嘧啶结合蛋白2)。MeCP2与甲基化的DNA 优先结合。神经营养蛋白因子BDNF是MeCP2的已知的直接靶标，是去甲肾上腺素和5_羟色 胺神经元的重要营养性因子。令人惊奇地，Mecp2-K0小鼠是脑BDNF缺陷的，脑BDNF的遗 传过量表达可增加其寿命，并且弥补其运动缺陷。目前需要寻找BDNF治疗策略，包括用于 雷特综合征和其它呼吸病症等状况的策略；此类策略包括靶向BDNF的此类结合伴侣，例如 酪氨酸激酶受体TrkB。

发明内容
本发明提供了治疗、诊断、预防和/或改善呼吸病症(例如，雷特综合征(RTT))的 方法，所述方法包括施用酪氨酸激酶受体B (TrkB)的经分离的抗体激动剂(在本文中还称 为“TrkB激动性抗体”、“TrkB结合分子”等)。在一些实施方式中，抗体是人源化抗体。在 其它实施方式中，抗体是单链抗体。在一些实施方式中，抗体不与酪氨酸激酶受体A或酪氨 酸激酶受体C结合。在一些实施方式中，抗体能结合人的TrkB，并且不与其它物种的TrkB 结合。在一些实施方式中，抗体既能结合人的TrkB，也能与其它物种的TrkB结合(即，能交 叉反应)(包括，例如，与小鼠、大鼠和/或非人灵长类(例如，猕猴或恒河猴))。在一些实施方式中，抗体与TrkB的配体结合结构域(LBD)结合。在一些实施方式 中，抗体与脑衍生神经营养因子(BDNF)竞争结合TrkB。在一些实施方式中，抗体与下述竞 争抗体针对与TrkB的结合竞争，所述竞争抗体包含包含SEQ ID NO 3的重链可变区和包 含SEQ ID NO :4的轻链可变区。在一些实施方式中，抗体包含包含SEQ ID NO 7的重链可 变区和包含SEQ ID NO 8的轻链可变区。在一些实施方式中，抗体包含包含SEQ ID NO 11的重链可变区和包含SEQ ID NO 12的轻链可变区。在一些实施方式中，抗体包含包含 SEQ ID NO: 15的重链可变区和包含SEQ ID NO 16的轻链可变区。在一些实施方式中，抗 体包含包含SEQ IDNO :7、SEQ ID NO 11和/或SEQ ID NO 15的重链可变区和包含SEQ IDN0:8、SEQ ID N0:12和/或SEQ ID NO 16的轻链可变区的组合。在一些实施方式中，抗 体包含包含SEQ ID NO 3的重链可变区和包含SEQ IDNO 4的轻链可变区。在一些实施方式中，本发明方法的抗体作为BDNF模拟物发挥作用，其能例如重现 所述配体的营养性活性(因此能施加神经保护性和神经营养性作用)。在一些实施方式中，抗体不与TrkB的配体结合结构域(LBD)结合。在一些实施方 式中，抗体不与脑衍生神经营养因子(BDNF)竞争结合TrkB。在一些实施方式中，在一些实 施方式中，抗体与下述竞争抗体竞争结合TrkB，所述竞争抗体包含包含SEQ ID N0:1的 重链可变区和包含SEQ ID NO :2的轻链可变区。在一些实施方式中，抗体包含包含SEQ IDNO :5的重链可变区和包含SEQ ID NO :6的轻链可变区。在一些实施方式中，抗体包含 包含SEQ ID NO 9的重链可变区和包含SEQ ID NO 10的轻链可变区。在一些实施方式中， 抗体包含包含SEQ ID NO 13的重链可变区和包含SEQ ID NO 14的轻链可变区。在一些 实施方式中，抗体包含包含SEQ ID N0:5、SEQ ID NO :9和/或SEQ ID NO: 13的重链可变 区和包含SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:10和/或SEQ ID NO 14的轻链可变区的组合。在一些实施方式中，抗体包含包含SEQ ID NO :1的重链可变区和包含SEQ ID NO 2的轻链可变区。TrkB激动性抗体与TrkB相互作用，其因此能调节TrkB功能。TrkB激动性结合分 子可用于促进TrkB途径信号传递；因此，TrkB激动性结合分子可用于例如诊断、改善与异 常低的TrkB途径信号传递水平相关的呼吸病症(例如，由于患病受试者中TrkB或其蛋白 相互作用者之一的突变形式导致的)，提供保护以抵抗所述呼吸病症以及治疗所述呼吸病 症。与对TrkB信号传递异常下调相关的病症的非限制性例子(例如，由于TrkB或其蛋白 相互作用者之一的突变形式导致的)是(i)雷特综合征(RTT)，其特征在于编码MeCP2(与 BDNF直接结合)的基因中的突变；和(ii)由于TrkB功能丧失突变导致的严重肥胖和发育 迟缓(Giles, S.，et al. (2004)Nature Neuroscience 7 1187-9)。本发明还提供了治疗、诊断、预防和/或改善呼吸病症(例如雷特综合征(RTT)) 的方法，所述方法包括施用包含治疗或预防有效量的TrkB激动性抗体和药物载体的药物 组合物。在一些实施方式中，药物组合物还包含能治疗、诊断、预防和/或改善呼吸性窘迫 的症状(例如呼吸困难)的分开的、独立的试剂，例如去甲肾上腺素和/或5-羟色胺途径的 小分子活化剂(例如三环类抗抑郁剂地昔帕明(DMI)、5_羟色胺IA受体部分激动剂、丁螺 旋酮以及可能更具选择性的抗抑郁剂氟西汀和瑞波西汀)、谷氨酸能AMPA受体的活化剂 AMPAkine CX546、前列腺素、孕酮或TrkB活性的增强剂(例如蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂)。在一些实施方式中，向个体施用与TrkB的抗体激动剂(或含有其的药物组合物) 组合的治疗和/或预防有效量的有效治疗、诊断、预防和/或改善呼吸病症(例如雷特综合 征(RTT))或呼吸窘迫的症状的第二种试剂。在一些实施方式中，第二种试剂和TrkB的抗 体激动剂(或含有其的药物组合物)作为混合物施用。在一些实施方式中，第二种试剂选 自下述物质构成的组去甲肾上腺素和/或5-羟色胺途径的小分子活化剂(例如三环类抗 抑郁剂地昔帕明(DMI)、5_羟色胺IA受体部分激动剂、丁螺旋酮以及可能更具选择性的抗 抑郁剂氟西汀和瑞波西汀)、谷氨酸能AMPA受体的活化剂=AMPAkine CX546、前列腺素、孕 酮或TrkB活性的增强剂(例如蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂)。本发明还提供了治疗、诊断、预防和/或改善呼吸窘迫(例如通常随呼吸病症发现 的那些)的方法，所述方法包括施用TrkB激动性抗体(或包含其的药物组合物)。所述症 状包括但不限于呼吸困难(例如喘鸣或喘息，屏气、浅呼吸、换气过度、延长的呼吸暂停)、 不良或减少的血氧(例如青紫)(例如，由于氧吸收受损、不足的肺血液灌注等导致的)、降 低的去甲肾上腺素(NE)含量、髓质中表达酪氨酸羟化酶的神经元减少以及胸痛。在一些实 施方式中，所述方法包括向个体施用治疗或预防有效量的酪氨酸激酶受体B(TrkB)的抗体 激动剂。在一些实施方式中，所述方法包括向个体施用药物组合物，所述组合物包含治疗或 预防有效量的TrkB激动性抗体和药物载体。在一些实施方式中，个体有一种或多种呼吸病 症和/或正在经历一种或多种呼吸窘迫的症状。在一些实施方式中，个体对呼吸窘迫的症 状易感。在一些实施方式中，个体具有雷特综合征。本发明提供了抑制神经细胞死亡的方法，所述方法包括施用TrkB激动性抗体(或 包含其的药物组合物)。在一些实施方式中，抗体是人源化抗体。在其它一些实施方式中， 抗体是单链抗体。在一些实施方式中，抗体不与酪氨酸激酶受体A或酪氨酸激酶受体C结 合。在一些实施方式中，抗体不与神经营养蛋白受体P75NR结合。在一些实施方式中，抗体能结合人的TrkB，但是不结合其它物种的TrkB。在一些实施方式中，抗体既能结合人的 TrkB,也能结合其它物种的TrkB(即能交叉反应)(包括，例如，与小鼠、大鼠和/或非人灵 长类(例如，猕猴或恒河猴))。在一些实施方式中，抗体是人源化抗体。在多种实施方式中，本发明提供了用调节(或促进)TrkB的一种或多种生物功能 的TrkB激动性抗体来治疗、诊断、预防和/或改善呼吸病症(例如雷特综合征(RTT))或 呼吸窘迫症状的方法，或抑制神经细胞死亡的方法。例如，TrkB激动剂抗体可调节TrkB的 二聚化，以及随后TrkB细胞内结构域上特定酪氨酸残基的自身磷酸化。进一步举例而言， TrkB激动剂抗体可初始化TrkB相关的细胞内信号级联(例如，有丝分裂原活化的蛋白激 酶、磷脂酰肌醇3-激酶和PLC γ途径)，由此导致对神经元死亡的抑制、对神经突长出的促 进和神经营养蛋白的其它作用。TrkB激动性抗体包括，例如，与TrkB结合(例如，在TrkB的特定结构域或表位内， 例如，与TrkB的配体结合结构域结合或者配体结合结构域之外)的抗体和包括此类抗体的 抗原结合部分的多肽。TrkB激动性抗体还包括下述分子其中，结合部分并不源于抗体，例 如源于具有免疫球蛋白样折叠的多肽的TrkB激动性抗体，并且，其中，通过随机化、选择和 亲和性成熟对抗原结合部分进行了工程改造，以与TrkB结合。在多种实施方式中，本发明提供了用下述TrkB激动剂抗体来治疗、诊断、预防和/ 或改善呼吸病症(例如雷特综合征(RTT))或呼吸窘迫的症状的方法或抑制神经细胞死亡 的方法，所述抗体能结合人TrkB内的表位并且能与非人灵长类(例如，猕猴或恒河猴)的 TrkB蛋白(或其部分)交叉反应。在多种实施方式中，所述TrkB激动剂抗体能与啮齿类物 种的TrkB (例如，小鼠TrkB、大鼠TrkB)交叉反应。在多种实施方式中，所述TrkB激动剂抗 体能与人TrkA或TrkC交叉反应。在其它一些实施方式中，本发明提供了用下述TrkB抗体来治疗、诊断、预防和/或 改善呼吸病症(例如雷特综合征(RTT))或呼吸窘迫的症状的方法或抑制神经细胞死亡的 方法，所述抗体与人TrkB内的表位结合，但是不与非人灵长类(例如，猕猴或恒河猴)的 TrkB蛋白(或其部分)交叉反应。在多种实施方式中，所述TrkB激动剂抗体不与啮齿类物 种的TrkB (例如，小鼠TrkB、大鼠TrkB)交叉反应。在多种实施方式中，所述TrkB激动剂抗 体不与人TrkA或TrkC或神经营养蛋白受体p75NR交叉反应。在多种实施方式中，本发明方法的TrkB激动性抗体的抗原结合部分与线性表位 结合。在多种实施方式中，所述抗原结合部分与非线性表位结合。在多种实施方式中，本发明方法的TrkB激动性抗体的抗原结合部分以等于或低 于1ηΜ、0. 5nM、0. 25nM或0. InM的解离常数(Kd)与TrkB结合。在一些实施方式中，抗体能结合人的TrkB，但是不结合其它物种的TrkB。在一些 实施方式中，抗体既能结合人的TrkB，也能结合其它物种的TrkB (即能交叉反应)(包括，例 如，与小鼠、大鼠和/或非人灵长类(例如，猕猴或恒河猴))。在多种实施方式中，本发明方法的TrkB激动性抗体的抗原结合部分以等于或低 于0. 3nM的Kd与非人灵长类(例如，猕猴或恒河猴)的TrkB结合。在多种实施方式中，所述抗原结合部分以等于或低于0. 5nM的Kd与小鼠TrkB结
I=I O
在一种实施方式中，本发明方法的TrkB激动性抗体是人抗体。在另一实施方式 中，所述TrkB激动剂抗体是非人抗体。在另一实施方式中，所述TrkB激动剂抗体是嵌合 (例如，人源化、人工程化)抗体。在一种实施方式中，本发明方法的TrkB激动性抗体的抗原结合部分是人抗体的 抗原结合部分。所述抗原结合部分可以是单克隆抗体或多克隆抗体的抗原结合部分。本发明方法的TrkB激动性抗体包括例如，抗体的Fab片段、Fab，片段、F(ab，)2或 Fv片段。在一些实施方式中，本发明方法的TrkB激动剂抗体是聚乙二醇化的。在一些实施 方式中，TrkB激动剂抗体是聚乙二醇化的Fab片段。在一种实施方式中，本发明方法的TrkB激动剂抗体包括单链Fv。在一种实施方式中，本发明方法的TrkB激动剂抗体包括双抗体(例如单链双抗体 或具有两条多肽链的双抗体)。在一些实施方式中，本发明方法的TrkB激动剂的抗原结合部分源于下述同种型 之一的抗体IgGl、IgG2、IgG3或IgG4。在一些实施方式中，所述抗体的抗原结合部分源于 IgA或IgE同种型的抗体。本发明方法的TrkB激动剂抗体可以展示出大量生物活性中的一种或多种。在多 种实施方式中，TrkB激动剂抗体抑制TrkB与BDNF、与神经营养蛋白4(NT_4)和/或与神经 营养蛋白5(NT-5)的结合。例如，相对于对照而言(例如，相对于不存在TrkB激动剂抗体 的情况下的结合而言)，TrkB激动剂抗体将TrkB与BDNF、NT-4和/或NT-5的结合抑制至 少5 %、10 %、15 %、25 %或50 %。在其它一些实施方式中，TrkB激动剂抗体不抑制TrkB与 BDNF、NT-4和/或NT-5的结合，并且不以任何方式与其竞争。在一种实施方式中，本发明方法的TrkB激动剂抗体与BDNF竞争结合TrkB，由此调 节TrkB途径信号传导的生物活性和后果。非限制性地举例而言，本发明方法的TrkB激动 剂抗体能活化、增强或延长TrkB途径活化和信号传导(例如通过与BDNF竞争结合TrkB)。 在一些实施方式中，所述TrkB激动剂抗体与TrkB配体结合结构域结合，由此与BDNF竞争 结合TrkB。在一些实施方式中，本发明方法的抗体作为BDNF模拟物发挥作用，其能，例如，重 现所述配体的营养性活性(因此能施加神经保护性和神经营养性作用)。在其它一些实施方式中，本发明方法的TrkB激动剂抗体不结合TrkB配体结合结 构域，并且不与BDNF竞争结合TrkB，但是其仍然可调节TrkB信号途径(例如活化、增强或 延长TrkB途径活化和信号传导)。在多种实施方式中，本发明提供了用下述TrkB激动剂抗体来治疗、诊断、预防和/ 或改善呼吸病症(例如雷特综合征(RTT))或呼吸窘迫的症状的方法或抑制神经细胞死亡 的方法，所述抗体能调节通常由TrkB以直接或间接方式调节的下游生物活性。所述活性的 非限制性例子包括调节TrkB的二聚化，以及随后TrkB细胞内结构域上酪氨酸残基的自身 磷酸化；启动TrkB相关的细胞内信号级联(例如，有丝分裂原活化的蛋白激酶、磷脂酰肌醇 3-激酶和PLCy途径)；以及抑制神经元死亡、促进神经突长出和神经营养蛋白的其它作 用。例如，相对对照(例如相对不存在TrkB激动剂抗体的情况下的活性)而言，本发明方 法的TrkB激动剂抗体将神经元死亡抑制至少5 %、10 %、15 %、25 %或50 %。进一步举例而言，相对对照(例如相对不存在TrkB激动剂抗体的情况下的活性)而言，所述TrkB激动剂 抗体将TrkB蛋白水平稳定至少5%、10%、15%、25%或50%。在多种实施方式中，本发明提供了用非抗体TrkB激动性分子来治疗、诊断、预防 和/或改善呼吸病症(例如雷特综合征(RTT))或呼吸窘迫的症状的方法或抑制神经细胞 死亡的方法。非抗体TrkB激动剂分子包括下述TrkB结合结构域，其具有源于非抗体多肽 的免疫球蛋白样(Ig样)折叠的氨基酸序列，例如下述之一生腱蛋白(tenascin)、N-钙 黏着蛋白、E-钙黏着蛋白、ICAM、肌联蛋白(titin)、GCSF-受体、细胞因子受体、糖苷酶抑制 剂、抗生素色蛋白、髓磷脂膜粘附分子P0、⑶8、⑶4、⑶2、I类MHC、T-细胞抗原受体、⑶1、 C2和VCAM-I的I-组结构域、肌球蛋白结合蛋白C的I-组免疫球蛋白结构域、肌球蛋白结 合蛋白H的I-组免疫球蛋白结构域、端蛋白(telokin)的I-组免疫球蛋白结构域、NCAM、 颤搐蛋白、神经胶质蛋白(neuroglial!)、生长激素受体、促红细胞生成素受体、促乳素受 体、干扰素_ Y受体、-半乳糖苷酶/葡糖苷酸酶、-葡糖苷酸酶、转谷氨酰胺酶、T-细胞抗 原受体、超氧化物歧化酶、组织因子结构域、细胞色素F、绿色荧光蛋白、GroEL或奇甜蛋白 (thaumatin)。通常，TrkB结合结构域的氨基酸序列相对于免疫球蛋白样折叠的氨基酸序 列而言有所改变，使得TrkB结合结构域与TrkB特异性结合(S卩，其中免疫球蛋白样折叠不 与TrkB特异性结合)。在多种实施方式中，TrkB结合结构域的氨基酸序列与纤连蛋白、细胞因子受体或 钙黏着蛋白的免疫球蛋白样折叠的氨基酸序列至少60 %相同(例如至少65 %、75 %、80 %、 85%或90%相同)。在多种实施方式中，TrkB结合结构域与下述之一的免疫球蛋白样折叠的氨基酸序 列至少60%、65%、75%、80%、85%或90%相同生腱蛋白、N-钙黏着蛋白、E-钙黏着蛋白、 ICAM、肌联蛋白、GCSF-受体、细胞因子受体、糖苷酶抑制剂、抗生素色蛋白、髓磷脂膜粘附分 子P0、CD8、CD4、CD2、I类MHC、T-细胞抗原受体、CDl、C2和VCAM-1的I-组结构域、肌球 蛋白结合蛋白C的I-组免疫球蛋白结构域、肌球蛋白结合蛋白H的I-组免疫球蛋白结构 域、端蛋白的I-组免疫球蛋白结构域、NCAM、颤搐蛋白、神经胶质蛋白、生长激素受体、促红 细胞生成素受体、促乳素受体、干扰素_ Y受体、_半乳糖苷酶/葡糖苷酸酶、_葡糖苷酸酶、 转谷氨酰胺酶、T-细胞抗原受体、超氧化物歧化酶、组织因子结构域、细胞色素F、绿色荧光 蛋白、GroEL或奇甜蛋白。在多种实施方式中，TrkB结合结构域以等于或低于InM的Kd与TrkB结合(例如 0. 5nM、0. InM)。在一些实施方式中，Ig样折叠是纤连蛋白的Ig样折叠，例如III型纤连蛋白的Ig 样折叠(例如III型纤连蛋白的模块10的Ig样折叠)。本发明还涉及使用包括本文所述的TrkB激动剂抗体的药物组合物的方法。所述 组合物包括，例如TrkB激动剂抗体和可药用载体。在一个方面，本发明涉及通过施用治疗和/或预防有效量的TrkB的抗体激动剂 (或含有其的药物组合物)来抑制神经细胞死亡或促进神经突长出的方法。这些方法包括 将组织或生物样品(例如表达TrkB的神经元细胞)与治疗和/或预防有效量的TrkB的抗 体激动剂(或含有其的药物组合物)相接触，由此活化和/或稳定TrkB信号途径，以及针 对神经营养蛋白(例如BDNF)的作用提供保护。TrkB激动剂抗体(或含有其的药物组合物)可以以有效抑制神经细胞死亡或促进神经突长出的量施用。在一些实施方式中，所述方法涉及腹膜内注射施用TrkB的抗体激动剂(或含有其 的药物组合物)。本发明一个或多种实施方式的细节在附图和下文说明书中详细示出。本发明的其 它特征、目的和优点将从说明书和附图以及权利要求中显而易见。附图简述

图1图示了在施用TrkB激动剂抗体的Mecp2敲除小鼠中观察到的体重和食物摄 入的下降。在图IA中，最顶上的线(白色方块示出数据点)代表施用盐水的Mecp2野生 型小鼠。次顶部的线(黑色方块示出数据点)代表施用TrkB激动剂抗体的Mecp2野生型 小鼠。次底部的线(白色圆圈示出数据点)代表施用盐水的Mecp2敲除小鼠。最底部的线 (黑色圆圈示出数据点)代表施用TrkB激动剂抗体的Mecp2敲除小鼠。图IB中，白色的条 形代表施用盐水的Mecp2野生型小鼠。黑色的条形代表施用TrkB激动剂抗体的Mecp2野 生型小鼠。浅灰色条形代表施用盐水的Mecp2敲除小鼠。深灰色的条形代表施用TrkB激 动剂抗体的Mecp2敲除小鼠。图IB左边部分代表在6周龄时进行的测量，右边部分代表在 8周龄时进行的测量。图2A和2B分别图示了施用TrkB激动剂抗体的Mecp2敲除小鼠中握力和体脂肪 组成的改善。图2中，方块示出的数据点代表用盐水(SAL)或TrkB激动剂抗体C20处理过 的野生型(WT)小鼠；圆圈示出的数据点代表用盐水(SAL)或TrkB激动剂抗体C20处理过 的敲除(KO)小鼠。图2A的左边部分代表后肢测量，右边是前肢测量。图2B的左边代表体 脂肪含量，右边是瘦肉质含量。图3图示了施用TrkB激动剂抗体的Mecp2敲除小鼠中观察到的增加的寿命。图 3A中，敲除小鼠被描述为K0，野生型描述为WT。SAL表示施用盐水，C20表示施用TrkB激动 剂抗体。图3B中，敲除小鼠被描述为K0，TrkB激动剂抗体描述为C20。如图3所示，TrkB 激动剂mAb处理过的敲除小鼠(K0-C20)存活时间是盐水处理的KO小鼠的至少两倍。发明详述本发明提供了用酪氨酸激酶受体B(TrkB)的经分离的抗体激动剂(本文中也被称 为“TrkB激动性抗体”等等)治疗、诊断、预防和/或改善呼吸病症(例如雷特综合征(RTT)) 的方法。所述方法可利用任何TrkB激动剂抗体，具体列出的那些被认为是非限制性的实 施方式。本发明提供了与TrkB结合的分子(“TrkB激动性抗体”)，特别是人抗体或其部 分，其能与人TrkB结合并调节其功能。还提供了 TrkB的表位和结合这些表位的试剂。全长人TrkB序列以Genbank 检索号AAB33109 (GI =913718)发现，其有822个 残基。其由Genbank 检索号S76473 (GI :913717)的mRNA序列编码。TrkB是在脑中广 泛分布的神经营养蛋白受体。其是多结构域跨膜蛋白，由细胞外配体结合结构域(LBD)、跨 膜区域和细胞内酪氨酸激酶结构域构成。TrkB是BDNF的高亲和性受体，其也能结合神经营 养蛋白4(NT-4)。在一些实施方式中，抗体是人源化抗体。在其它一些实施方式中，抗体是单链抗 体。在一些实施方式中，抗体不与酪氨酸激酶受体A或酪氨酸激酶受体C结合。在一些实施方式中，抗体能结合人的TrkB，并且不与其它物种的TrkB结合。在一些实施方式中，抗体 既能结合人的TrkB，也能与其它物种的TrkB结合(即，能交叉反应)(包括，例如，与小鼠、 大鼠和/或非人灵长类(例如，猕猴或恒河猴))。在一些实施方式中，抗体与TrkB的配体结合结构域(LBD)结合。在一些实施方式 中，抗体与脑衍生神经营养因子(BDNF)竞争结合TrkB。在一些实施方式中，抗体与下述竞 争抗体竞争结合TrkB，所述竞争抗体包含包含SEQ ID NO 3的重链可变区和包含SEQ ID NO 4的轻链可变区。在一些实施方式中，抗体包含包含SEQ ID NO 7的重链可变区和包 含SEQ ID NO :8的轻链可变区。在一些实施方式中，抗体包含包含SEQID NO: 11的重链可 变区和包含SEQ ID NO :12的轻链可变区。在一些实施方式中，抗体包含包含SEQ ID NO: 15的重链可变区和包含SEQ IDNO 16的轻链可变区。在一些实施方式中，抗体包含包含 SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:11 和 / 或 SEQ ID NO 15 的重链可变区和包含 SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :12和/或SEQ ID NO 16的轻链可变区的组合。在一些实施方式中，抗体包含包含 SEQ ID NO 3的重链可变区和包含SEQ ID NO 4的轻链可变区。在一些实施方式中，本发明方法的抗体作为BDNF模拟物发挥作用，其能例如重现 所述配体的营养性活性(因此能施加神经保护性和神经营养性作用)。在一些实施方式中，本发明的TrkB激动剂抗体结合TrkB配体结合位点和/或与 BDNF竞争结合TrkB。与TrkB的配体结合位点结合的示例性抗体是抗体A10F18. 2 (在本文 中还被称为“A10F18”或“A10”)。抗体AlO的重链可变区在SEQ ID NO 3中例示，抗体AlO 的轻链可变区在SEQID NO 4中例示。因此，本发明提供了与包含含SEQ ID NO :3的重链可变区以及含SEQID N0:4的轻 链可变区的抗体竞争结合TrkB的激动剂抗体。在一些实施方式中，本发明的抗体包含SEQ ID NO :3和/或4的互补决定区(⑶Rs)中的至少之一。不限制本发明的范围的情况下，我 们认为，CDR3在抗体AlO的结合中具有显著作用。因此，在一些实施方式中，本发明的抗体 包含SEQ ID N0s:7和/或8。但是，⑶Rl和/或⑶R2也在结合中具有作用。因此，在一些 实施方式中，本发明的抗体包含SEQ ID NOs 11和/或12或15和/或16。在一些实施方式中，抗体不与TrkB的配体结合结构域(LBD)结合。在一些实施方 式中，抗体不与脑衍生神经营养因子(BDNF)竞争结合TrkB。在一些实施方式中，抗体与下 述竞争抗体竞争结合TrkB，所述竞争抗体包含包含SEQ ID NO 1的重链可变区和包含SEQ ID NO 2的轻链可变区。在一些实施方式中，抗体包含包含SEQ ID NO 5的重链可变区和 包含SEQ ID NO 6的轻链可变区。在一些实施方式中，抗体包含包含SEQ ID NO 9的重 链可变区和包含SEQ ID NO :10的轻链可变区。在一些实施方式中，抗体包含包含SEQ ID NO 13的重链可变区和包含SEQID NO 14的轻链可变区。在一些实施方式中，抗体包含包 含 SEQ IDNO :5、SEQ ID NO :9 禾口 / 或 SEQ ID NO 13 的重链可变区和包含 SEQ IDNO :6、SEQ ID N0:10和/或SEQ ID NO 14的轻链可变区的组合。在一些实施方式中，抗体包含包含 SEQ ID NO 1的重链可变区和包含SEQ IDNO 2的轻链可变区。在一些实施方式中，本发明的TrkB激动剂抗体不结合TrkB配体结合位点和/或 不与BDNF竞争结合TrkB。不结合TrkB的配体结合位点的示例性抗体是抗体C20. i. 1. 1(本 文中还被称为“C20. il”、“C20. II”和“C20”)。抗体C20的重链可变区在SEQ ID NO 1中示 例。因此，本发明提供了激动剂抗体，其与包含含SEQ ID NO :1的重链可变区以及含SEQIDNO 2的轻链可变区的抗体竞争结合TrkB。在一些实施方式中，本发明的抗体包含SEQ ID NO :1和/或2的互补决定区(CDRs)中的至少之一。不限制本发明的范围的情况下，我们 认为，⑶R3在抗体C20的结合中具有重要作用。因此，在一些实施方式中，本发明的抗体包 含SEQ ID N0s:5和/或6。但是，⑶Rl和/或⑶R2也在结合中具有作用。因此，在一些实 施方式中，本发明的抗体包含SEQ ID NOs :9和/或10或13和/或14。TrkB激动性抗体与TrkB相互作用，由此能调节TrkB功能。TrkB激动性结合分子 可用于促进TrkB途径信号传导；因此，TrkB激动性结合分子可用于例如诊断、改善下述呼 吸病症，提供保护以抵挡下述呼吸病症以及治疗下述呼吸病症，所述呼吸病症是与异常低 水平的TrkB途径信号传导相关的(例如，由于患病受试者中TrkB或其蛋白相互作用者之 一的突变形式导致的)。与对TrkB信号传导异常下调相关的病症的非限制性例子(例如， 由于TrkB或其蛋白相互作用者之一的突变形式导致的)是雷特综合征(RTT)，其特征在于 编码MeCP2 (与BDNF直接结合)的基因中的突变。本发明还提供了用包含治疗或预防有效量的TrkB激动性抗体和药物载体的药物 组合物治疗、诊断、预防和/或改善呼吸病症(例如雷特综合征(RTT))的方法。在一些实 施方式中，药物组合物还包含能治疗、诊断、预防和/或改善呼吸病症的症状(例如呼吸困 难)的分开的、独立的试剂，例如去甲肾上腺素和/或5-羟色胺途径的小分子活化剂(例 如三环类抗抑郁剂地昔帕明(DMI)、5_羟色胺IA受体部分激动剂、丁螺旋酮以及可能更具 选择性的抗抑郁剂氟西汀和瑞波西汀)、谷氨酸能AMPA受体的活化剂AMPAkine CX546、前 列腺素、孕酮或TrkB活性的增强剂(例如蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂)。所述方法可利用包含治疗或预防有效量的任何TrkB激动剂抗体的药物组合物， 具体列出的那些抗体被认为是非限制性的实施方式。本发明还提供了治疗、诊断、预防和/或改善呼吸窘迫症状(例如通常随呼吸病症 发现的那些)的方法。所述症状包括但不限于呼吸困难(例如喘鸣或喘息，屏气、浅呼吸、 换气过度、延长的呼吸暂停)、不良或减少的血氧(例如青紫)(例如，由于氧吸收受损、不足 的肺血液灌注等导致的)以及胸痛。在一些实施方式中，所述方法包括向个体施用治疗或 预防有效量酪氨酸激酶受体B(TrkB)的抗体激动剂。在一些实施方式中，所述方法包括向 个体施用药物组合物，所述组合物包含治疗或预防有效量的TrkB激动性抗体和药物载体。 在一些实施方式中，个体有一种或多种呼吸病症和/或正在经历呼吸窘迫的一种或多种症 状。在一些实施方式中，个体对呼吸病症的症状易感。在一些实施方式中，个体具有雷特综 合征。所述方法可利用任何TrkB激动剂抗体(或包含任何TrkB激动剂抗体的药物组合 物)，具体列出的那些抗体被认为是非限制性的实施方式。在一些实施方式中，向个体施用与TrkB的抗体激动剂(或含有其的药物组合物) 组合的治疗和/或预防有效量的第二种有效治疗、诊断、预防和/或改善呼吸病症(例如雷 特综合征(RTT))的试剂。在一些实施方式中，第二种试剂和TrkB的抗体激动剂(或含有 其的药物组合物)作为混合物施用。在一些实施方式中，第二种试剂选自下述物质构成的 组去甲肾上腺素和/或5-羟色胺途径的小分子活化剂(例如三环类抗抑郁剂地昔帕明 (DMI)、5_羟色胺IA受体部分激动剂、丁螺旋酮以及可能更具选择性的抗抑郁剂氟西汀和 瑞波西汀)、谷氨酸能AMPA受体的活化剂=AMPAkine CX546、前列腺素、孕酮或TrkB活性的增强剂(例如蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂)。在一些实施方式中，抗体是人源化抗体。在多种实施方式中，本发明提供了用能调节(或促进)TrkB的一种或多种生物功 能的TrkB激动性抗体来治疗、诊断、预防和/或改善呼吸病症(例如雷特综合征(RTT))或 呼吸窘迫症状的方法。例如，TrkB激动剂抗体可调节TrkB的二聚化，以及随后TrkB细胞 内结构域上特定酪氨酸残基的自身磷酸化。进一步举例而言，TrkB激动剂抗体能启动TrkB 相关的细胞内信号级联(例如，有丝分裂原活化的蛋白激酶、磷脂酰肌醇3-激酶和PLCy 途径)，由此导致对神经元死亡的抑制、对神经突长出的促进和神经营养蛋白的其它作用。TrkB激动性抗体包括，例如，与TrkB结合(例如，在TrkB的特定结构域或表位内， 例如，与TrkB的配体结合结构域结合或者配体结合结构域之外)的抗体和包括此类抗体的 抗原结合部分的多肽。TrkB激动性抗体还包括下述分子其中，结合部分并不源于抗体，例 如源于具有免疫球蛋白样折叠的多肽的TrkB激动性抗体，并且，其中，通过随机化、选择和 亲和性成熟对抗原结合部分进行了工程改造，以与TrkB结合。在多种实施方式中，本发明提供了用下述TrkB激动剂抗体来治疗、诊断、预防和/ 或改善呼吸病症(例如雷特综合征(RTT))或呼吸窘迫的症状的方法，所述抗体能结合人 TrkB内的表位并且能与非人灵长类(例如，猕猴或恒河猴)的TrkB蛋白(或其部分)交叉 反应。在多种实施方式中，所述TrkB激动剂抗体能与啮齿类物种的TrkB (例如，小鼠TrkB、 大鼠TrkB)交叉反应。在多种实施方式中，所述TrkB激动剂抗体能与人TrkA或TrkC交叉 反应。在其它一些实施方式中，本发明提供了用下述TrkB抗体来治疗、诊断、预防和/或 改善呼吸病症(例如雷特综合征(RTT))或呼吸窘迫的症状的方法，所述抗体与人TrkB内 的表位结合，但是不与非人灵长类(例如，猕猴或恒河猴)的TrkB蛋白(或其部分)交叉 反应。在多种实施方式中，所述TrkB激动剂抗体不与啮齿类物种的TrkB (例如，小鼠TrkB、 大鼠TrkB)交叉反应。在多种实施方式中，所述TrkB激动剂抗体不与人TrkA或TrkC或神 经营养蛋白受体P75NR交叉反应。在多种实施方式中，本发明方法的TrkB激动性抗体的抗原结合部分与线性表位 结合。在多种实施方式中，所述抗原结合部分与非线性表位结合。在多种实施方式中，本发明方法的TrkB激动性抗体的抗原结合部分以等于或低 于1ηΜ、0. 5nM、0. 25nM或0. InM的解离常数(Kd)与TrkB结合。在一些实施方式中，抗体能结合人的TrkB，但是不结合其它物种的TrkB。在一些 实施方式中，抗体既能结合人的TrkB，也能结合其它物种的TrkB (即能交叉反应)(包括，例 如，与小鼠、大鼠和/或非人灵长类(例如，猕猴或恒河猴))。在多种实施方式中，本发明方法的TrkB激动性抗体的抗原结合部分以等于或低 于0. 3nM的Kd与非人灵长类(例如，猕猴或黑猩猩)的TrkB结合。在多种实施方式中，所述抗原结合部分以等于或低于0. 5nM的Kd与小鼠TrkB结
口 O在一种实施方式中，本发明方法的TrkB激动性抗体是人抗体。在另一实施方式 中，所述TrkB激动剂抗体是非人抗体。在另一实施方式中，所述TrkB激动剂抗体是嵌合 (例如，人源化、人工程化)抗体。
在一种实施方式中，本发明方法的TrkB激动性抗体的抗原结合部分是人抗体的 抗原结合部分。所述抗原结合部分可以是单克隆抗体或多克隆抗体的抗原结合部分。本发明方法的TrkB激动性抗体包括例如，抗体的Fab片段、Fab，片段、F(ab，)2或 Fv片段。在一些实施方式中，本发明方法的TrkB激动剂抗体是聚乙二醇化的。在一些实施 方式中，TrkB激动剂抗体是聚乙二醇化的Fab片段。在一种实施方式中，本发明方法的TrkB激动剂抗体包括单链Fv。在一种实施方式中，本发明方法的TrkB激动剂抗体包括双抗体(例如单链双抗体 或具有两条多肽链的双抗体)。在一些实施方式中，本发明方法的TrkB激动剂抗体的抗原结合部分源于下述同 种型之一的抗体IgGl、IgG2、IgG3或IgG4。在一些实施方式中，所述抗体的抗原结合部分 源于IgA或IgE同种型的抗体。在一种实施方式中，本发明方法的TrkB激动剂抗体与BDNF竞争结合TrkB，由此 调节TrkB途径信号传导的生物活性和后果。作为非限制性实例，本发明方法的TrkB激动 剂抗体可活化、增强或延长TrkB途径活化和信号传导(例如通过与BDNF竞争结合TrkB)。 在一些实施方式中，所述TrkB激动剂抗体与TrkB配体结合结构域结合，由此与BDNF竞争 结合TrkB。在一些实施方式中，本发明方法的抗体作为BDNF模拟物发挥作用，其能，例如，重 现所述配体的营养性活性(因此能施加神经保护性和神经营养性作用)。在其它一些实施方式中，本发明方法的TrkB激动剂抗体不结合TrkB配体结合结 构域，并且不与BDNF竞争结合TrkB，但是其可调节TrkB信号途径(例如活化、增强或延长 TrkB途径活化和信号传导)。在多种实施方式中，本发明提供了用下述TrkB激动剂抗体来治疗、诊断、预防和/ 或改善呼吸病症(例如雷特综合征(RTT))或呼吸窘迫的症状的方法，所述抗体能调节通常 由TrkB以直接或间接方式调节的下游生物活性。所述活性的非限制性例子包括调节TrkB 的二聚化，以及随后TrkB细胞内结构域上酪氨酸残基的自身磷酸化；启动TrkB相关的细胞 内信号级联(例如，有丝分裂原活化的蛋白激酶、磷脂酰肌醇3-激酶和PLCy途径)；以及 抑制神经元死亡、促进神经突长出和神经营养蛋白的其它作用。例如，相对对照(例如相对 不存在TrkB激动剂抗体的情况下的活性)而言，本发明方法的TrkB激动剂抗体将神经元 死亡抑制至少5%、10%、15%、25%或50%。进一步举例而言，相对对照(例如相对不存在 TrkB激动剂抗体的情况下的活性)而言，所述TrkB激动剂抗体将TrkB蛋白水平稳定至少 5%、10%、15%、25%或 50%。在多种实施方式中，本发明提供了用非抗体TrkB激动性分子来治疗、诊断、预防 和/或改善呼吸病症(例如雷特综合征(RTT))或呼吸窘迫的症状的方法。非抗体TrkB激 动剂分子包括下述TrkB结合结构域，其具有源于非抗体多肽的免疫球蛋白样(Ig样)折叠 的氨基酸序列，例如下述之一生腱蛋白、N-钙黏着蛋白、E-钙黏着蛋白、ICAM、肌联蛋白、 GCSF-受体、细胞因子受体、糖苷酶抑制剂、抗生素色蛋白、髓磷脂膜粘附分子P0、CD8、CD4、 ⑶2、1类1^(、11-细胞抗原受体、^1丄2和VCAM-I的I-组结构域、肌球蛋白结合蛋白C的 I-组免疫球蛋白结构域、肌球蛋白结合蛋白H的I-组免疫球蛋白结构域、端蛋白的I-组免疫球蛋白结构域、NCAM、颤搐蛋白、神经胶质蛋白、生长激素受体、促红细胞生成素受体、 促乳素受体、干扰素_ Y受体、“半乳糖苷酶/葡糖苷酸酶、“葡糖苷酸酶、转谷氨酰胺酶、 T-细胞抗原受体、超氧化物歧化酶、组织因子结构域、细胞色素F、绿色荧光蛋白、GroEL或 奇甜蛋白。通常，TrkB结合结构域的氨基酸序列相对于免疫球蛋白样折叠的氨基酸序列而 言有所改变，使得TrkB结合结构域与TrkB特异性结合(即，其中免疫球蛋白样折叠不与 TrkB特异性结合)。在多种实施方式中，TrkB结合结构域的氨基酸序列与纤连蛋白、细胞因子受体或 钙黏着蛋白的免疫球蛋白样折叠的氨基酸序列至少60 %相同(例如至少65 %、75 %、80 %、 85%或90%相同)。在多种实施方式中，TrkB结合结构域与下述之一的免疫球蛋白样折叠的氨基酸序 列至少60%、65%、75%、80%、85%或90%相同生腱蛋白、N-钙黏着蛋白、E-钙黏着蛋白、 ICAM、肌联蛋白、GCSF-受体、细胞因子受体、糖苷酶抑制剂、抗生素色蛋白、髓磷脂膜粘附分 子P0、CD8、CD4、CD2、I类MHC、T-细胞抗原受体、CDl、C2和VCAM-1的I-组结构域、肌球 蛋白结合蛋白C的I-组免疫球蛋白结构域、肌球蛋白结合蛋白H的I-组免疫球蛋白结构 域、端蛋白的I-组免疫球蛋白结构域、NCAM、颤搐蛋白、神经胶质蛋白、生长激素受体、促红 细胞生成素受体、促乳素受体、干扰素_ Y受体、_半乳糖苷酶/葡糖苷酸酶、_葡糖苷酸酶、 转谷氨酰胺酶、T-细胞抗原受体、超氧化物歧化酶、组织因子结构域、细胞色素F、绿色荧光 蛋白、GroEL或奇甜蛋白。在多种实施方式中，TrkB结合结构域以等于或低于InM的Kd与TrkB结合(例如 0. 5nM、0. InM)。在一些实施方式中，Ig样折叠是纤连蛋白的Ig样折叠，例如III型纤连蛋白的Ig 样折叠(例如III型纤连蛋白的模块10的Ig样折叠)。本发明还涉及使用包括本文所述的TrkB激动剂抗体的药物组合物的方法。所述 组合物包括，例如TrkB激动剂抗体和可药用载体。在一个方面，本发明涉及通过施用治疗和/或预防有效量的TrkB的抗体激动剂 (或含有其的药物组合物)来抑制神经细胞死亡或促进神经突长出的方法。这些方法包括 将组织或生物样品与治疗和/或预防有效量的TrkB的抗体激动剂(或含有其的药物组合 物)相接触，由此活化和/或稳定TrkB信号途径。TrkB激动剂抗体(或含有其的药物组合 物)可以以有效抑制神经细胞死亡或促进神经突长出的量施用。在一些实施方式中，所述方法涉及腹膜内注射施用TrkB的抗体激动剂(或含有其 的药物组合物)。根据本发明的方法可使用任何类型的TrkB激动剂抗体。通常，使用的抗体是单 克隆抗体。可通过本领域已知的任何方法来产生单克隆抗体(例如使用杂交瘤、重组表达 和/或噬菌体展示)。不加限制的情况下，本发明的方法中可使用来自任何下述专利和非 专利公开文献的 TrkB 激动剂抗体Qian，M.，et al. (2006) Journal of Neurosci. 26(37)； 9394-9403 ；美国专利号5，910，574 (及其任何相关的同族专利)；PCT专利公开号 W006/133164(及其任何相关的同族专利)。定义在本文中使用时，术语“呼吸病症”包括但不限于肺不张、囊性纤维化、雷特综合征(RTT)、哮喘、呼吸暂停(例如睡眠呼吸暂停)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、慢性阻塞性 肺病(COPD)、肺气肿、急性呼吸困难、呼吸急促、端坐呼吸、类风湿性肺病、肺充血或水肿、慢 性气道阻塞性疾病(例如肺气肿、慢性支气管炎、支气管哮喘和支气管扩张)、换气不足、匹 克威克综合征、肥胖换气不足综合征、婴儿猝死综合征(SIDS)和呼吸过度。此外，“呼吸病症”还包括人类中已知与遗传缺陷有关的状况，例如沙-马-图 病、Cheyne-Stokes呼吸病、Willi-Prader综合征、婴儿猝死综合征、先天性中枢性肺换气 不足、弥漫性间质性疾病(例如结节病、尘肺病、过敏性肺炎、细支气管炎、古德帕斯丘综合 征、特发性肺纤维化、特发性肺含铁血黄素沉着症、肺泡蛋白沉着症、脱屑性间质肺炎、慢性 间质性肺炎、纤维化肺泡炎、哈_里综合征、肺嗜酸性粒细胞增多症、弥漫性间质性纤维化、 韦格纳肉芽肿病、淋巴瘤样肉芽肿和脂质性肺炎)或肿瘤(例如支气管原癌、细支气管肺泡 癌、支气管类癌、错构瘤和间质瘤)。在本文中使用时，“调节”表示直接或间接控制或影响的能力，作为非限制性实例， 或者可表示抑制或刺激、激动或拮抗、阻碍或促进以及加强或削弱。“预防有效剂量”和“治疗有效剂量”的本发明的TrkB激动性抗体可分别预防疾病 症状(例如，与异常低的TrkB水平或TrkB的突变拷贝相关的病症的症状)的发作或者使得 这些症状的严重性降低。所述术语还可分别促进或增加疾病无症状期的频率和持续时间。 “预防有效剂量”和“治疗有效剂量”还可分别预防或改善由于患TrkB相关病症或呼吸病症 导致的受损或残障。术语“受试者”意欲包括遭受或患有与异常TrkB信号途径相关的疾病、病症或状 况的生物，例如真核生物。受试者的例子包括哺乳动物，例如，人、狗、奶牛、马、猪、绵羊、山 羊、猫、小鼠、兔、大鼠和转基因非人动物。在某些实施方式中，受试者是人，例如，遭受本文 所述的呼吸病症或状况(例如雷特综合征(RTT))、处于遭受本文所述的呼吸病症或状况 (例如雷特综合征(RTT))的风险中或可能遭受本文所述的呼吸病症或状况(例如雷特综合 征(RTT))的人。术语“抗体”在本文中使用时表示完整的抗体或抗原结合片段(即“抗原结合部 分”)或其单链(即轻链或重链)。完整抗体是包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H) 链和两条轻(L)链的糖蛋白。每条重链包含重链可变区(本文中缩写SVh)和重链恒定区。 重链恒定区包含三个结构域，CH1、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区(本文中缩写为 Vl)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域Q。V1^nt区域可进一步细分为被称为 互补决定区(CDR)的高变区，其间散布有被称为构架区(FR)的更保守的区域。每个Vh* Vl由从氨基末端到羧基末端以下述顺序排列的三个⑶Rs和四个FRs构成冊1、⑶R1、FR2、 ⑶R2、FR3、⑶R3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合区。抗体的恒定区 可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子(包括免疫系统的多种细胞(例如效应细胞)和经典 补体系统的第一组分(Clq))的结合。术语抗体的“抗原结合部分”在本文中使用时表示完整抗体中保留有与给定抗原 (例如TrkB)特异性结合的能力的一条或多条片段。抗体的抗原结合功能可通过完整抗体 的片段来实现。术语抗体的“抗原结合部分”所包括的结合片段的例子包括Fab片段—— 由\、VH、Cl和CHl结构域构成的单价片段；F(ab)2片段——包含通过二硫桥在铰链区相 连的两条Fab片段(通常一条来自重链，一条来自轻链)的二价片段；Fd片段——由％和CHl结构域构成；Fv片段——由抗体单臂的\和Vh结构域构成；单结构域抗体(dAb)片段 (Ward et al.，1989Nature 341 544-546)——其由Vh结构域构成；以及经分离的互补决定 区(CDR)。此外，虽然Fv片段的两个结构域——Vl和Vh是不同基因编码的，但是可使用重 组方法通过人工肽接头将其连接起来，使得它们被制造为单条蛋白链，其中，区域 配对形成单价分子(也被称为单链Fv(scFv)；见，例如，Bird et al.，1988Science 242 423-426 ；and Huston et al.，1988Proc. Natl. Acad. Sci. 85 :5879_5883)。此类单链抗体包 括抗体的一个或多个“抗原结合部分”。使用本领域技术人员已知的常规技术获得这些抗体 片段，以与完整抗体相同方式筛选这些片段的效用。抗原结合部分还可掺入单结构域抗体、大抗体(maxibodies)、微型抗体、胞内抗 体(intrabodies)、双抗体、三抗体、四抗体、v—NAR禾口双一scFv (见，例如Hollinger and Hudson, 2005, Nature Biotechnology，23，9，1126-1136)。抗体的抗原结合部分可移植到基 于多肽(例如III型纤连蛋白(Fn3))的骨架中(见美国专利号6，703，199，其描述了纤连 蛋白多肽单抗体(monobodies))。抗原结合部分可掺入包含串联Fv区段对(Vh-CHI-Vh-CHI)的单链分子，与互补轻 链多肽一起形成一对抗原结合区(Zapata et al.，1995Protein Eng. 8(10) 1057-1062 和 美国专利号5，641，870)。术语“骆驼抗体(camelid antibody) ”在本文中使用时表示从骆驼和单峰驼 (Camelus bactrianus禾口 Calelus dromaderius)家族的成员(包括新世界的成员，例如美 洲驼物种(Lama paccos、Lama glama ^P Lamavicugna))获得的完整抗体的一个或多个片 段。骆驼抗体的小的单可变结构域(被鉴定为Vhh)区域可通过遗传工程获得，以产生具有 针对靶标的高度亲和性的小蛋白，从而产生被称为“骆驼纳米抗体”的低分子量的、源于抗 体的蛋白。见美国专利号 5，759，808 ；还见 Stijlemans et al. ,2004 J.Biol. Chem. 279 1256-1261 ；Dumoulin et al.,2003Nature 424 783-788 ；Pleschberger et al. ,2003 Bioconjugate Chem. 14 440~448 ；Cortez-Retamozo et al. ,2002Int.J.Cancer 89: 456-62 和 Lauwereys. et al.，1998 EMBO J. 17 :3512_3520。“经分离的TrkB激动剂抗体”在本文中使用时指这样的结合分子，其基本上没有具 有针对非TrkB的抗原的抗原特异性的分子(例如，经分离的抗体，其特异性结合TrkB，但是 基本上没有特异性结合非TrkB的抗原的抗体)。但是，经分离的特异性结合TrkB的结合分 子可具有对其它抗原(例如，来自其它物种的TrkB分子)的交叉反应性。如果结合分子基 本上不含细胞物质，那么该结合分子是“经纯化的”。在本文中使用时，术语“人工程化抗体”表示结合相同表位但是序列不同的抗体。 示例性技术包括通过Kalobios的人工程化技术生产的人工程化抗体，其中，抗原结合区域 的序列是通过例如突变获得的，而非由于保守氨基酸置换获得。在本文中使用时，“特异性结合TrkB”的TrkB激动剂抗体(例如抗体或其抗原结 合部分)意欲表示以1x10_7M或更低的Kd与TrkB结合的TrkB激动剂抗体。与“抗原交叉 反应”的TrkB激动剂抗体(例如，抗体或其抗原结合部分)意欲表示以IxlO-6M或更低的 Kd与抗原结合的TrkB激动剂抗体。“不与”给定抗原“交叉反应”的TrkB激动剂抗体(例 如，抗体或其抗原结合部分)意欲表示这样的TrkB激动剂抗体，其与给定抗原的结合无法检测到，或者其以IxlO-5M或更高的Kd与给定抗原结合。在某些实施方式中，不与抗原交叉 反应的此类结合分子在标准结合测定中展示出基本上检测不到的针对这些蛋白的结合。术语“单克隆抗体组合物”在本文中使用时表示单种分子组成的抗体分子的制备 物。单克隆抗体组合物展示出针对特定表位的单结合特异性和亲和性。术语“人抗体”在本文中使用时意欲包括具有可变区的抗体，其中，构架和CDR 区源于人源序列。此外，如果抗体含有恒定区，恒定区也源于此类人序列，例如，人种系 (germline)序列或人种系序列的突变形式。本发明的人抗体可包括不由人序列编码的氨基 酸残基(例如，通过随机或位点特异性诱变体外引入或通过体细胞突变体内引入的突变)。 但是，术语“人抗体”在本文中使用时不包括下述抗体其中，源于另外的哺乳动物物种(例 如小鼠)的种系的CDR序列被移植到人构架序列上。术语“人单克隆抗体”指这样的抗体，其展示出单结合特异性，具有可变区，其中， 构架区和CDR区域都源于人序列。在一种实施方式中，人单克隆抗体是通过杂交瘤产生的， 所述杂交瘤包括与永生化细胞融合的从转基因非人动物(例如，转基因小鼠，其具有包含 人重链转基因和轻链转基因的基因组)获得的B细胞。术语“重组人抗体”在本文中使用时包括通过重组手段制备、表达、制造或分离 的任何人抗体，例如，从对于人免疫球蛋白基因为转基因或转染色体的动物(例如小鼠) 或由其制备的杂交瘤分离的抗体；从经转化以表达人抗体的宿主细胞(例如从转染瘤 (transfeetoma))分离的抗体；从重组、组合人抗体文库分离的抗体；以及通过涉及将人免 疫球蛋白基因序列的全部或部分与另外的DNA序列剪接的任何其它手段制备、表达、制造 或分离的抗体。此类重组人抗体具有下述可变区，其中，构架和CDR区源于人种系免疫球蛋 白序列。但是，在某些实施方式中，此类重组人抗体可经历体外诱变(或者当使用对人Ig 序列转基因的动物时，经历体内体细胞诱变)，由此，重组抗体的Vh和\区域的氨基酸序列 是这样的序列虽然源于人种系Vh和\序列及与其相关，但可不天然存在于人的人抗体种 系的全部组成部分(i^pertoire)中。在本文中使用时，“同种型”指重链恒定区基因编码的抗体类(例如IgM、IgE、IgG， 例如 IgGl 或 IgG4)。短语“识别抗原的抗体”或“对抗原特异性的抗体”在本文中可与术语“特异性结 合抗原的抗体”互换使用。在提到蛋白或肽时，短语“特异性(或选择性)结合”抗体或“特异性(或选择性)
与......免疫反应”指这样的结合反应，其能确定蛋白质在异源蛋白群或其它生物制剂中
的存在。因此，在指定的免疫测定条件下，指出的抗体以背景至少两倍的水平与特定蛋白结 合，并且基本上不以显著的量与样品中存在的其它蛋白结合。在此类条件下与抗体的特异 性结合可能需要针对其与特定蛋白的特异性选择出的抗体。这种选择可通过扣除与例如 TrkA或TrkC或神经营养蛋白受体p75NR交叉反应的抗体来实现。多种免疫测定形式可用 于选择能与特定蛋白特异性免疫反应的抗体。例如，固相ELISA免疫测定常规用于选择能 与蛋白特异性免疫反应的抗体(关于可用于测定特异性免疫反应性的免疫测定形式和条 件的描述，见例如 Harlow&Lane，Antibodies，A Laboratory Manual (1998))。典型地，特异 性或选择性反应将是背景信号或噪声的至少两倍，更典型地，超过背景10-100倍以上。术语“抗体激动剂”指这样的抗体，其能活化受体以诱导出完全或部分的受体介导的应答。例如，TrkB的激动剂与TrkB结合，并且诱导TrkB介导的信号传导。在一些实施 方式中，可通过其接触SH-SY5Y细胞时结合TrkB并诱导神经突长出的能力，或按照本文所 述，来鉴定针对激动剂的TrkB抗体。本发明的多肽的“活性”指多肽在其天然细胞或组织中的结构、调控或生物化学功 能。多肽的活性的例子包括直接活性和间接活性。示例性的直接活性是与多肽直接相互作 用的结果，包括配体结合，例如，BDNF与配体结合结构域(LBD)的结合。在本文中使用时，提到IgG抗体时，术语“高度亲和性”表示抗体针对靶抗原具有 ICT9M或更低的Kd。如果核苷酸序列被改变，以使用在生产细胞或生物(通常是真核细胞，例如，酵 母(例如毕赤酵母(Pichia))的细胞，昆虫细胞，哺乳动物细胞，例如，中国仓鼠卵巢细胞 (CHO)或人细胞)中优选的密码子来编码氨基酸序列的话，该核苷酸序列就被称为“经优化 的”。经优化的核苷酸序列被工程改造，以编码与原始起始核苷酸序列编码的氨基酸序列 (也被称为“亲本”序列)相同或几乎相同的氨基酸序列。下文章节中更详细地描述了本发明的多个方面。用于评估分子结合多个物种的TrkB(特别是TrkB的表位)的能力的标准测定法 是本领域已知的，其包括，例如ELISAs和western印迹。可利用肽表位竞争测定法，来测定 TrkB激动剂抗体是否结合TrkB的特异性表位。例如，将TrkB激动剂抗体与对应于感兴趣 的TrkB表位的肽在肽的饱和浓度下一起孵育。针对与固定化的TrkB的结合，对经预孵育 的TrkB激动剂抗体进行测试，例如通过；Biaeore 分析来进行。与肽预孵育对TrkB结合的 抑制表明，TrkB激动剂抗体与肽表位结合(见，例如，美国专利公开20070072797)。还可通 过本领域已知的标准测定法来评估结合动力学，例如通过Biaeore 分析，或通过facs分 析来评估表观结合。下文中详细描述了评价TrkB激动性抗体对TrkB功能性质的影响的测 定法。因此，按照本领域已知的和本文描述的方法测定时，“抑制”这些TrkB功能性质 (例如，生物化学、细胞、生理或其它生物活性等等)中一种或多种的TrkB激动剂抗体将被 理解为相对于在不存在结合分子的情况下(例如，当存在无关特异性的对照分子时)观察 到的而言，特定功能性质产生统计学上显著减少。抑制TrkB活性的TrkB激动剂抗体能实 现将测定参数统计学上显著减少至少5%。在某些实施方式中，拮抗抗体或其它TrkB激动 剂抗体可使得选择的功能性质较之对照减少至少10%、20%、30%或50%。识别或促进TrkB活性的TrkB激动剂抗体实现将测量的参数统计学上显著地增加 至少5%。在某些实施方式中，TrkB激动剂抗体或其部分可使得选择的功能性质较之对照 增加至少10%、20%、30%或50%。jrf.^本文描述的抗TrkB抗体包括人单克隆抗体。在某些实施方式中，与TrkB结合的 抗体的抗原结合部分(例如Vh和\链)是“混合并匹配的”，以产生其它抗TrkB激动性抗 体。可使用前文所述的结合测定(例如ELISAs)来测试此类“混合并匹配的”抗体的结合。 当选择Vh与特定\序列混合并匹配时，典型地，选择的Vh与其在和该\的配对中置换的Vh 结构上相似。类似地，来自特定全长重链/全长轻链配对的全长重链序列通常被结构上相 似的全长重链序列置换。类似地，来自特定配对的\序列应当被结构上相似的\序列置换。类似地，来自特定全长重链/全长轻链配对的全长轻链序列应当被结构上相似的 全长轻链序列置换。本文上下文中，鉴定结构相似性是本领域公知的方法。在其它方面，本发明提供了以多种组合包含一种或多种TrkB结合抗体的重链和 轻链⑶Rls、⑶R2s和⑶R3s的抗体。鉴于这些抗体每条都可结合TrkB，并且抗原结合特 异性主要由CDRU2和3区域提供，VhCDRU2和3序列和Vl CDRU2和3序列可“混合并匹 配”(即，来自不同抗体的CDRs可混合并匹配)。可使用本文描述的结合测定(例如ELISAs) 来测试此类“混合并匹配的”抗体的TrkB结合。CDR序列结合并匹配时，来自特SVh 序列的⑶R1、⑶R2和/或⑶R3序列应当被结构上相似的⑶R序列置换。类似地，当Vl⑶R 序列混合并匹配时，来自特定\序列的⑶R1、⑶R2和/或⑶R3序列应当被结构上相似的 CDR序列置换。本文上下文中，鉴定结构相似性是本领域公知的方法。在本文中使用时，如果抗体的可变区或全长链是从使用人种系免疫球蛋白基因作 为序列来源的系统获得的话，人抗体包含重或轻链可变区或全长重或轻链，其是特定种系 序列“的产物”或“源于”特定种系序列。在一种此类系统中，人抗体是在携带人免疫球蛋白 基因的转基因小鼠中产生的。用感兴趣的抗原(例如，TrkB的表位)免疫转基因。或者， 通过提供在噬菌体上展示的人免疫球蛋白基因文库并且用感兴趣的抗原(例如TrkB的表 位)筛选该文库，来鉴定人抗体。可通过将人抗体的氨基酸序列与人种系免疫球蛋白的氨基酸序列相比较，并选择 序列上与人抗体的序列最接近(即，最高％同一性)的人种系免疫球蛋白序列，来鉴定是人 种系免疫球蛋白序列“的产物”的或“源于”其的人抗体。是特定人种系免疫球蛋白序列“的 产物”的或“源于”其的人抗体较之种系编码的序列可含有氨基酸差异，所述差异例如由于 天然存在的体细胞突变或人工定点突变导致的。但是，选择的人抗体典型地具有与人种系 免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列至少90%同一性的氨基酸序列，并且含有当与其它物种 的种系免疫球蛋白氨基酸序列(例如小鼠种系序列)比较时将人抗体鉴定为人的氨基酸残 基。在某些情况下，人抗体在氨基酸序列上可与种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列有 至少60%、70%、80%、90%或至少95%同一性，或者甚至至少96%、97%、98%或99%同一 性。两条序列间的百分比同一性是序列共享的相同位置的数量的函数(即，％同一性 =相同位置#/总位置#χ100)，其中要考虑到空位数量和每个空位的长度，需要引入这些空 位以对两条序列进行最优比对。使用E. Meyers和W. Miller的算法(1988 Comput. Appl. Biosci.，4 :11_17)，来比较序列并且测定两条序列间的百分比同一性，该算法已被整合到 ALIGN程序(版本2. 0)，其中使用PAM120权重残值表，空位长度罚分为12，空位罚分为4。典型地，源于特定人种系序列的人抗体的￥11或\将展示出与人种系免疫球蛋白基 因编码的氨基酸序列相比不超过10个氨基酸差异。在某些情况下，人抗体的Vh或\可展 示出与种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列相比不超过5个或者甚至不超过4、3、2或1 个氨基酸差异。骆驼抗体已在大小、结构复杂性和对人受试者的抗原性方面，对从骆驼和单峰驼(Camelus bactrianus和Calelus dromaderius)家族的成员(包括新世界的成员，例如美洲驼物种 (Lamapaccos、Lama gIama禾口 Lama vicugna))获得的抗体蛋白进行了表征。自然界中在该家族的哺乳动物中发现的某些IgG抗体缺少轻链，并且由此在结构上与来自其它动物的抗 体典型的具有两条重链和两条轻链的四链四级结构有所不同。见WO 94/04678。骆驼抗体的小的单可变结构域(被鉴定为Vhh)区域可通过遗传工程获得，以产 生具有针对靶标的高度亲和性的小蛋白，从而产生被称为“骆驼纳米抗体”的低分子量的 源于抗体的蛋白质。见美国专利号5，759，808 ；还见Stijlemans et al. ,2004 J.Biol. Chem. 279 1256-1261 ；Dumoulin et al. ,2003 Nature 424 783-788 ；Pleschberger et al.,2003Bioconj ugate Chem. 14 440~448 ；Cortez-Retamozo et al.,2002Int. J. Cancer 89 456-62 和 Lauwereys. et al.，1998EMB0 J. 17 :3512_3520。路轮抗体和抗体片段的工 程化文库可商业获得，例如从Ablynx，Ghent, Belgium获得。和非人来源的其它抗体一样， 骆驼抗体的氨基酸序列可被重组改变，以获得更接近于人序列的序列，即，纳米抗体可以是 “人源化的”。因此，骆驼抗体对人的天然低抗原性可被进一步降低。骆驼纳米抗体具有大约是人IgG分子十分之一的分子量，该蛋白具有仅数纳米的 物理直径。小尺寸的一种后果是骆驼纳米抗体能结合对于较大抗体蛋白来说功能上不可见 的抗原位点，即，骆驼纳米抗体可用作为试剂，以检测使用经典免疫技术检测不到的抗原， 以及可用作为可能的治疗剂。因此，小尺寸的另一结果是，由于与靶蛋白的沟或窄缝中的特 异性位点结合，骆驼纳米抗体可抑制靶蛋白，以及由此可以以比典型抗体更接近典型低分 子量药物的功能的能力发挥作用。低分子量和紧凑的大小进一步导致骆驼纳米抗体极其热稳定、对极端pH和对蛋 白水解消化稳定，和更少的抗原性。另一结果是，骆驼纳米抗体易于从循环系统移动进组 织，并且甚至穿过血脑屏障，因此可治疗影响神经组织的病症。纳米抗体可进一步协助药物 运输穿过血脑屏障。见2004年8月19日公开的美国专利公开号20040161738。这些特征 与在人中的低抗原性组合表明了极大的治疗潜力。此外，这些分子可在原核细胞，例如大肠 杆菌中完全表达。因此，本发明的特征是具有针对TrkB的高度亲和性的骆驼抗体或骆驼纳米抗体。 在本文某些实施方式中，骆驼抗体或纳米抗体是在骆驼动物中天然产生的，即，使用本文所 述针对其它抗体的技术，用TrkB或其肽片段进行免疫之后由骆驼产生的。或者抗TrkB的 骆驼纳米抗体是工程化的，即，通过选择，例如，使用淘选方法，用本文描述的TrkB或TrkB 表位作为靶标，从展示经合适诱变的骆驼纳米抗体蛋白的噬菌体文库进行选择，来生产抗 TrkB的骆驼纳米抗体。可通过遗传工程对经工程化的纳米抗体进行进一步定制，以将接受 的受试者中的半寿期从45分钟增加至2周。双抗体双抗体是二价的、双特异性的分子，其中，V1^Pt结构域在单条多肽链上表达，它 们通过短到不允许相同链上两个结构域间配对的接头相连。Vh和\结构域与另一条链的 互补结构域配对，由此产生两个抗原结合位点(见例如，Holliger et al. , 1993Proc. Natl. Acad. Sci. USA90 :6444_6448 ；Poljak et al.，1994Structure 2 1121-1123)。可通过在相 同细胞中表达具有结构νΗΑ-νω和Vhb-Vla (Vh-Vl构型)或Vla-Vhb和\B_VHA (Vl-Vh构型)的两 条多肽链，来产生双抗体。它们中的大多数可以以可溶形式在细菌中表达。单链双抗体(scDb)是通过用大约15个氨基酸残基的接头将两条形成双抗体的 多肽链连接起来而产生的(见 Holliger and Winter, 1997Cancer Immunol. Immunother.,45(3-4) 128-30 ；Wu et al. , 1996Immunotechnology, 2 (1) :21_36)。scDb 可以以可溶的活 性单体形式在细菌中表达(见 Holliger and Winter, 1997Cancer Immunol. Immunother.， 45(34) 128-30 ；Wu et al. ,1996Immunotechnology, 2(1) 21-36 ；Pluckthun and Pack, 1997Immunotechnology,3 (2) 83-105 ；Ridgway et al. , 1996Protein Eng. ,9 (7) 617-21)。双抗体可与Fc 融合，产生“双双抗体”(见 Lu et al. , 2004J. Biol. Chem. ,279(4) 2856-65)。经工稈化和修饰的抗体可使用具有一条或多条Vh和/或\序列的抗体作为起始材料，对经修饰的抗体工 程化，来制备本发明的抗体，其中所述经修饰的抗体具有与起始抗体不同的性质。可通过修 饰一个或全部两个可变区(即，\和/或VJ中(例如，一个或多个CDR区域中和/或一个 或多个构架区中)的一个或多个残基，来对抗体工程化。此外或备选地，可通过修饰恒定区 内的残基，来对抗体进行工程化，例如，以改变抗体的效应功能。可进行的一种类型的可变区工程化是⑶R移植。抗体主要通过位于六个重链和轻 链CDRs中的氨基酸残基与靶抗原相互作用。为此，在各抗体间CDRs内的氨基酸序列要比 CDRs外的序列更具多样性。因为CDR序列负责大部分抗体-抗原相互作用，因此可通过构 建下述表达载体，来表达模拟特异性的天然存在的抗体的性质的重组抗体，所述表达载体 包括移植到来自具有不同性质的不同抗体的构架序列上的、来自特异性的天然存在的抗体 的 CDR(见，例如 Riechmann et al. , 1998Nature 332 :323_327 Jones et al. , 1986Nature 321 -.522-525 ；Queen et al. , 1989Proc. Natl. Acad. See. U. S. A. 86 :10029-10033 ；美国专 利号 5，225，539 和美国专利号 5，530，101,5, 585，089,5, 693，762 和 6，180，370)。构架序列可从公开的DNA数据库或公开的文献(包括种系抗体基因序列) 中获得。例如，针对人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可在“VBase”人种系 序歹Ij数据库(可在Internet上于www. mrc-cpe. cam. ac. uk/vbase获得)中找至Li， 以及在 Kabat et al. ,1991Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U. S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 ；Tomlinson et al.，1992 J. Mol. Biol. 227 :776_798 和 Cox et al. ,1994Eur. J. Immunol. 24 827-836中找到；它们每篇的内容都通过引用明确并入本文。Vh⑶Rl、2和3序列和\⑶Rl、2和3序列可被移植到下述构架区上，所述构架区 具有与构架序列来源的种系免疫球蛋白基因中所发现的相同的序列，或者CDR序列可被移 植到较之种系序列而言含有一处或多处突变的构架区上。例如，已经发现，在某些情况下， 在构架区内突变残基以保持或增强抗体的抗原结合能力是有利的(见，例如，美国专利号 5，530，101,5, 585，089,5, 693，762 和 6，180，370)。还可将CDRs移植进并非免疫球蛋白结构域的多肽的构架区中。合适的骨架形 成构象上稳定的构架，其展示移植的残基，使得它们形成局部表面，并且结合感兴趣的 靶标(例如TrkB)。例如，可将CDRs移植到骨架上，其中，构架区基于纤连蛋白、锚蛋白 (ankyrin)、脂质运载蛋白(Iipocalin)、neocarzinostain、细胞色素 b、CPl 锌指、PSTU 卷曲螺旋、LACI-DU Z 结构域或 tendramisat(见例如 Nygren and Uhlen, 1997Current Opinion in Structural Biology,7,463—469)。
另一种类型的可变区修饰是对V1^P/或\⑶R1、⑶R2和/或⑶R3区域中的氨基 酸残基加以突变，由此改善感兴趣的抗体的一种或多种结合性质(例如亲和性)，这被称为 “亲和性成熟”。可进行位点定向诱变或PCR介导的诱变，以引入突变，可在本文所述的体外 或体内测定中评价对抗体结合或其它感兴趣的功能性质的影响。可引入保守修饰。突变可 以是氨基酸取代、添加或缺失。此外，典型地，在⑶R区域中改变不超过一个、两个、三个、四 个或五个残基。本发明的经工程化的抗体包括在V1^P/或&中的构架残基中进行了修饰的那些， 例如，以改善抗体的性质。典型地，进行此类构架修饰，以减少抗体的免疫原性。例如，一种 方法是将一个或多个构架残基“回复突变(backmutated)”成相应的种系序列。更具体地， 经历体细胞突变的抗体可含有不同于抗体所源于的种系序列的构架残基。可通过将抗体构 架序列与抗体所源于的种系序列加以比较，来鉴定此类残基。为将构架区序列返回至其种 系构型，可通过，例如，位点定向诱变或PCR介导的诱变，将体细胞突变“回复突变”成种系 序列。此类“回复突变”的抗体也是本发明所包括的。另一类型的构架修饰包括对构架区内或者甚至一个或多个⑶R区域内的一个或 多个残基加以突变，以除去T-细胞表位，由此降低抗体的潜在免疫原性。该方法还被称为 “去免疫化”，在Carr et al.的美国专利公开号20030153043中对其有更详细的描述。除了构架或CDR区域中进行的修饰之外，或备选地，可对本发明的抗体进行工程 化，以在Fc区域内包括修饰，典型地，用于改变抗体的一种或多种功能性质，例如，血清半 寿期、补体固定、Fc受体结合和/或抗原依赖性细胞毒性。此外，本发明的抗体可被化学修 饰(例如，可向抗体连接一个或多个化学部分)，或被修饰以改变其糖基化，再次改变抗体 的一种或多种功能性质。在一种实施方式中，对CHl的铰链区加以修饰，使得铰链区的半胱氨酸残基的数 量被改变，例如，增加或减少。该方法由Bodmer et al.进一步描述于美国专利号5，677，425 中。CHl的铰链区中半胱氨酸残基的数量被改变，以例如促进轻链和重链的装配，或者增加 或减少抗体的稳定性。在另一实施方式中，抗体的Fc铰链区被突变，以减少抗体的生物半寿期。更具体 地，一个或多个氨基酸突变被引入Fc铰链片段的CH2-CH3结构域界面区域，使得抗体较之 天然Fc-铰链结构域SpA结合而言具有受损的葡萄球菌蛋白A(SpA)结合。该手段在Ward et al.的美国专利号6，165，745中被更详细地描述。在另一实施方式中，抗体被修饰，以增加其生物半寿期。多种方法是可能的。例 如，美国专利号6，277，375描述了在IgG中增加其体内半寿期的如下突变T252L、T254S、 T256F。或者，为了增加生物半寿期，可在CHl或CL区域中对抗体加以改变，以含有取自IgG 的Fc区域的CH2结构域的两个环的挽救受体结合表位，如Presta et al.的美国专利号 5，869，046 和 6，121，022 所述。在另外一些实施方式中，通过用不同的氨基酸残基置换至少一个氨基酸残基来改 变Fc区域，以改变抗体的效应功能。例如，可用不同的氨基酸残基置换一个或多个氨基酸， 使得抗体具有改变的针对效应配体的亲和性，但是仍然保留亲本抗体的抗原结合能力。针 对其的亲和性被改变的效应配体可以是，例如，Fc受体或补体的Cl组分。该方法在Winter et al.的美国专利号5，624，821和5，648，260中被更详细地描述。
在另一个实施方式中，可用不同的氨基酸残基置换选自氨基酸残基的一个或多个 氨基酸，使得抗体具有改变的Clq结合和/或降低或消失的补体依赖性细胞毒性(CDC)。该 方法在Idusogie et al.的美国专利号6，194，551中更详细地描述。在另一实施方式中，对一个或多个氨基酸残基加以改变，从而改变抗体的补体固 定能力。该方法在Bodmer et al.的WO 94/29351中被更详细地描述。在另一实施方式中，通过修饰一个或多个氨基酸，对Fc区域加以修饰，以增加抗 体介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的能力，和/或增加抗体对Fc γ受体的亲和性。该方 法在Presta的WO 00/42072中被更进一步地描述。此外，人IgGl上针对Fc γ Rl、Fe γ RII、 FcyRIII和FeRn的结合位点已被作图，并且已经描述了具有改善的结合的变体(见 Shields, R. L. et al.，2001 J. Biol. Chem. 276 :6591_6604)。在再一种实施方式中，对抗体的糖基化加以修饰。例如，可产生非糖基化的抗体 (即，所述抗体缺乏糖基化)。可对糖基化加以改变，例如以增加抗体对抗原的亲和性。可 例如通过改变抗体序列内一个或多个糖基化位点，来完成此类碳水化合物修饰。例如，可进 行一个或多个氨基酸取代，导致消除一个或多个可变区构架糖基化位点，由此消除该位点 的糖基化。此类无糖基化可增加抗体对抗原的亲和性。此类方法在Co et al.的美国专利 号5，714，350和6，350，861中被更详细地描述。此外或备选地，产生具有改变的糖基化类型的抗体，例如，具有降低量的岩藻糖基 残基的岩藻糖基化不足的抗体，或者具有增加的二分GlcNac结构的抗体。此类改变的糖 基化模式已被证实能增加抗体的ADCC能力。此类碳水化合物修饰可通过，例如，在具有改 变的糖基化机制的宿主细胞中表达抗体来完成。具有改变的糖基化机制的细胞在本领域中 被描述过，其可用作为宿主细胞，其中，表达本发明的重组抗体，由此产生具有改变的糖基 化的抗体。例如，Hang et al.的EP 1，176，195描述了具有功能破坏的FUT8基因(其编 码岩藻糖基转移酶)的细胞系，使得在此类细胞系中表达的抗体展示出岩藻糖基化不足。 Presta的PCT Pub. WO 03/035835描述了变体CHO细胞系Lecl3细胞，其将岩藻糖连接到 Asn(297)相连的碳水化合物上的能力降低，还导致该宿主细胞中表达的抗体岩藻糖基化不 足(还见 Shields，R. L. et al. ,2002 J. Biol. Chem. 277 :26733_26740)。Umana et al.的 WO 99/54342描述了经工程化以表达修饰糖蛋白的糖基转移酶(例如，β (1，4)_Ν乙酰葡糖 胺基转移酶III(GnTni))的细胞系，使得经工程化的细胞系中表达的抗体展示出增加的 二分GlcNac结构，这导致抗体增加的ADCC活性(还见Umana et al. , 1999Nat. Biotech. 17 176-180)。本发明包括的对本文中抗体的另一修饰是聚乙二醇化。可对抗体聚乙二醇化，以 例如增加抗体的生物(例如血清)半寿期。为对抗体进行聚乙二醇化，典型地，用聚乙二醇 (PEG)，例如PEG的反应性酯或醛衍生物，与抗体或其片段反应，该反应在一个或多个PEG部 分与抗体或抗体片段连接的条件下进行。可使用反应性PEG分子(或类似的反应性水溶性 聚合物)，通过酰化反应或烷基化反应来进行聚乙二醇化。在本文中使用时，术语“聚乙二 醇”意欲包括已被用于衍生化其它蛋白的任何形式的PEG，例如，单(Cl-ClO)烷氧基或芳氧 基-聚乙二醇或聚乙二醇马来亚酰胺。在某些实施方式中，将被聚乙二醇化的抗体是非糖 基化的抗体。用于对蛋白进行聚乙二醇化的方法是本领域已知的，其可应用于本发明的抗 体。见，例如，Nishimura et al.的 EP 0 154 316 和 Ishikawa et al.的 EP 0 401 384。
此外，可通过引入非天然氨基酸，在本发明的TrkB结合多肽的任何部分实现聚 乙二醇化。可通过 Deiters et al.，J Am Chem Socl25 11782-11783,2003 ；Wang and Schultz, Science 301 :964_967，2003 ；Wang et al.，Science 292 :498_500，2001 ；Zhang et al. ,Science 303 :371_373，2004或美国专利号7，083，970描述的技术引入某些非天然 氨基酸。简言之，这些表达系统中的一些涉及位点定向诱变，以向编码本发明的多肽的可读 框中引入无义密码子，例如，琥珀TAG。然后再将此类表达载体引入可利用对引入的无义密 码子来说具有特异性的tRNA的宿主，并装载选择的非天然氨基酸。对将部分与本发明的多 肽缀合的目的有益的特定的非天然氨基酸包括具有乙炔和叠氮化物侧链的那些。然后可在 蛋白中这些选择的位点上对含有这些新的氨基酸的多肽进行聚乙二醇化。对抗体讲行工稈化的方法如上文所讨论的，可使用抗TrkB抗体，通过修饰全长重链和/或轻链序列、Vh和/ 或\序列或与其连接的恒定区来产生新的抗TrkB抗体。例如，可将抗体的一个或多个CDR 区域与已知的构架区和/或其它⑶Rs重组组合，以产生新的、经重组工程化的抗TrkB抗 体。其它类型的修饰包括前文章节中描述的那些。用于工程化方法的起始材料是\和/或 八序列中的一条或多条或者其一个或多个CDR区域。为制造经工程化的抗体，并不一定要 实际制备出具有Vh和/或\序列中的一条或多条或者其一个或多个CDR区域的抗体(即， 作为蛋白质表达)。而是，用序列中含有的信息作为起始材料，以制造源于原始序列的“第 二代”序列，然后制备“第二代”序列，并将其表达为蛋白质。可使用标准分子生物学技术来制备和表达改变的抗体序列。改变的抗体序列编码 的抗体是保留了其所源于的抗TrkB抗体的一种、一些或全部功能性质的抗体，所述功能性 质包括但不限于与TrkB特异性结合、干扰TrkB结合神经营养蛋白(例如BDNF)的能力以 及调节TrkB 二聚化和在其细胞内结构域上酪氨酸残基自身磷酸化的能力，如本文所述。可 使用本领域可获得的和/或本文描述的标准测定法(例如ELISAs)来评估改变的抗体的功 能性质。在本发明的对抗体进行工程化的方法的某些实施方式中，在抗TrkB抗体编码序 列的全部或部分上随机或选择性引入突变，可针对结合活性和/或其它功能性质(与TrkB 特异性结合、干扰TrkB结合神经营养蛋白(例如BDNF)的能力以及调节TrkB 二聚化和在其 细胞内结构域上酪氨酸残基自身磷酸化的能力，如本文所述)，对得到的经修饰的抗TrkB 抗体加以筛选。突变方法在本领域中已有描述。例如，Short的PCT公开W002/092780描 述了使用饱和诱变、合成连接装配或其组合来产生和筛选抗体突变的方法。或者，Lazar et al.的WO 03/074679描述了使用计算机筛选方法来优化抗体的物理化学性质的方法。非抗体TrkB激动性抗体本发明还提供了展示出抗体的功能性质但是其构架和抗原结合部分源于其它多 肽(例如并非是抗体基因编码的那些，也不是抗体基因体内重组产生的那些的多肽)的 TrkB激动性抗体。这些结合分子的抗原结合结构域(例如TrkB结合结构域)是通过定向 进化方法产生的。见，美国专利号7，115，396。具有与抗体的可变结构域类似的总体折叠 (“免疫球蛋白样”折叠)的分子是合适的骨架蛋白。适合得到抗原结合分子的骨架蛋白包 括纤连蛋白或纤连蛋白二聚体、生腱蛋白、N-钙黏着蛋白、E-钙黏着蛋白、ICAM、肌联蛋白、 GCSF-受体、细胞因子受体、糖苷酶抑制剂、抗生素色蛋白、髓磷脂膜粘附分子P0、CD8、CD4、
26⑶2、1类1^(、11-细胞抗原受体、^1丄2和VCAM-I的I-组结构域、肌球蛋白结合蛋白C的 I-组免疫球蛋白结构域、肌球蛋白结合蛋白H的I-组免疫球蛋白结构域、端蛋白的I-组 免疫球蛋白结构域、NCAM、颤搐蛋白、神经胶质蛋白、生长激素受体、促红细胞生成素受体、 促乳素受体、干扰素_ Y受体、“半乳糖苷酶/葡糖苷酸酶、“葡糖苷酸酶、转谷氨酰胺酶、 T-细胞抗原受体、超氧化物歧化酶、组织因子结构域、细胞色素F、绿色荧光蛋白、GroEL或 奇甜蛋白。非抗体结合分子的抗原结合结构域(例如免疫球蛋白样折叠)可具有小于IOkD 或大于7.5kD的分子量(例如，7.5-lOkDa之间的分子量)。用于获得抗原结合结构域的蛋 白是天然存在的哺乳动物蛋白(例如人蛋白)，较之其源于的蛋白的免疫球蛋白样折叠而 言，抗原结合结构域包括多达50% (例如，多达34%、25%、20%或15%)的经突变的氨基 酸。具有免疫球蛋白样折叠的结构域通常由50-150个氨基酸(例如，40-60个氨基酸)构 成。为产生非抗体结合分子，产生克隆文库，其中，对骨架蛋白中形成抗原结合表面的 区域(例如，在位置和结构上与抗体可变结构域免疫球蛋白折叠的CDRs类似的区域)中的 序列进行随机化。针对与感兴趣的抗原(例如TrkB)的特异性结合以及针对其它功能(例 如抑制TrkB的生物功能)，对文库克隆加以测试。选择的克隆可用作为基础，用于进一步的 随机化和选择，以产生对抗原有更高亲和力的衍生物。选择方案的一个例子被描述于美国 专利号6，207，446中。产生高度亲和性结合分子，例如，使用纤连蛋白III的第10个模块C°Fn3)作为骨 架。针对WFN3的三个⑶R样环中的每一个，在残基23-29、52-55和78-87处构建文库。为 构建每种文库，通过寡核苷酸合成对编码与每个⑶R样区域重叠的序列的DNA区段随机化。 用于产生可选择uiFr^的文库的技术被描述于美国专利号6，818，418和7，115,396 ；Roberts and Szostak, 1997Proc. Natl. Acad. Sci USA 94 12297 ；美国专利号 6，261，804 ；美国专利 号 6，258，558 和 Szostak et al. W098/31700 中。非抗体结合分子可作为二聚体或多聚体产生，以增加对靶抗原的亲合力。例如，抗 原结合结构域作为与抗体的恒定区(Fe)的融合物表达，其形成Fc-Fc 二聚体。见例如美国 专利号 7, 115，396。编码本发明的抗体的核酸分子本发明的另一方面涉及编码本发明的TrkB激动性抗体的核酸分子。核酸可存在 全细胞中、细胞裂解物中，或可以是经部分纯化的或基本上纯的形式的核酸。当通过标准技 术(包括碱/SDS处理、CsCl显带、柱层析、琼脂糖凝胶电泳和本领域公知的其它技术)纯化 去除其它细胞组分或其它污染物，例如，其它细胞核酸或蛋白质时，核酸就是“经分离的”或 “使得为基本上纯的”。见 F. Ausubel，et al.，ed. 1987 Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing and Wiley Interscience,New York。本发明的核酸可以是， 例如，DNA或RNA，并且可以含有或可以不含内含子序列。在一种实施方式中，核酸是cDNA 分子。核酸可以存在于载体中，例如噬菌体展示载体或重组质粒载体中。可使用标准分子生物学技术来获得本发明的核酸。对于通过杂交瘤(按照下文 进一步描述的，从携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠制备的杂交瘤)表达的抗体而言， 可通过标准PCR扩增或eDNA克隆技术，获得编码通过杂交瘤产生的抗体的轻链和重链的eDNA。对于从免疫球蛋白基因文库(例如使用噬菌体展示技术)获得的抗体而言，可从是 文库成员的多个噬菌体克隆回收编码抗体的核酸。一旦获得了编码Vh和\区段的DNA片段，可通过标准重组DNA技术，对这些DNA 片段进行进一步操作，例如以将可变区基因转化为全长抗体链基因，转化为Fab片段基因 或scFv基因。在这些操作中，将编码\或Vh的DNA片段与另外的DNA分子或编码另外的 蛋白质的片段(例如抗体恒定区或柔性接头)有效连接。术语“有效连接”在本文上下文 中使用时意欲表示两条DNA片段以功能性方式相连，例如，使得两条DNA片段编码的氨基酸 序列保持符合读码框，或者使得蛋白在想要的启动子的控制下表达。可通过将编码Vh的DNA与编码重链恒定区(CH1、CH2和CH3)的另外的DNA分子有 效连接，将编码Vh区域的经分离的DNA转化为全长重链基因。人重链恒定区基因的序列是 本领域己知的(见，例如 Kabat et al. , 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U. S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242)，包含这些区域的DNA片段可通过标准PCR扩增获得。重链恒定 区可以是IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区。对于Fab片段重链基因而 言，可将编码Vh的DNA与仅编码重链CHl恒定区的另外的DNA分子有效连接。可通过将编码Vl的DNA与编码轻链恒定区CL的另外的DNA分子有效连接，将 编码\区域的经分离的DNA转化为全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人轻链恒定 区基因的序列是本领域已知的(见，例如Kabat et al.，1991Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U. S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242)，包含这些区域的DNA片段可通过标准PCR扩增 获得。轻链恒定区可以是κ或λ恒定区。为产生scFv基因，将编码Vh和\的DNA片段与编码柔性接头(例如，编码氨基酸 序列(Gly4-Ser)3)的另外的片段有效连接，使得Vh和\序列可作为连续的单链蛋白表达， 其中Vl和Vh区域通过柔性接头相连(见，例如，Bird et al.，1988Science 242 :423_426 ； Huston et al.,1988Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 5879-5883 ；McCafferty et al., 1990Nature348 :552_554)。单克隆抗体产生可通过多种技术，包括传统单克隆抗体方法，例如Kohler和 Milstein (1975Nature, 256 495)的标准体细胞杂交技术，或使用文库展示方法，例如噬菌 体展示，来产生单克隆抗体(mAbs)。用于制备杂交瘤的动物系统是鼠系统。小鼠中的杂交瘤产生是已良好建立的方 法。免疫方案和用于分离经免疫的脾细胞用于融合的技术是本领域已知的。融合伴侣(例 如鼠骨髓瘤细胞)和融合步骤也是已知的。可基于按照上文所述制备的鼠单克隆抗体的序列，来制备本发明的嵌合或人源化 抗体。可从感兴趣的鼠杂交瘤获得编码重链和轻链免疫球蛋白的DNA，并使用标准分子生物 学技术对其加以人工改造，使其含有非鼠(例如人)免疫球蛋白序列。例如，为产生嵌合抗 体，可使用本领域已知的方法将鼠可变区与人恒定区相连(见例如Cabilly et al.的美国 专利号4，816，567)。为产生人源化抗体，可使用本领域已知的方法，将鼠⑶R区域插入人 构架。见，例如，美国专利号5，225，539和美国专利号5，530，101,5, 585，089,5, 693，762和6，180，370。在某实施方式中，本发明的抗体是人单克隆抗体。可使用携带人免疫系统而非小 鼠系统的部分的转基因或转染色体小鼠，来产生针对TrkB的此类人单克隆抗体。这些转基 因和转染色体小鼠包括在本文中分别被称为HuMAb小鼠和KM小鼠的小鼠，它们被合称为 “人Ig小鼠”。HuMAb小鼠 (Medarex, Inc.)含有人免疫球蛋白基因微基因座，其编码未经重排 的人重(μ和Y)链和K轻链免疫球蛋白序列，以及使得内源μ和K链基因座失活的靶 向突变(见,例如 Lonberg et al.，1994Nature368 (6474) :856_859)。因此，小鼠展示出小 鼠IgM或K的降低的表达，并且应答于免疫，引入的人重链和轻链转基因经历类别转换和体 细胞突变，产生高亲和性的人IgGK单克隆(Lonberg，N. et al.，1994supra ；reviewed in Lonberg, N. ,1994Handbook of Experimental Pharmacologyl13 :49_101 ；Lonberg, N. and Huszar,D. ,1995Intern. Rev. Immunol. 13 :65_93 禾口 Harding,F. and Lonberg,N. ,1995Ann. N. Y. AcacL Sci. 764 :536_546) 。 Taylor， L. et al. , 1992 Nucleic Acids Research 20 6287-6295 ；Chen, J. et at. ,1993 International Immunology 5 647-656 ；Tuaillon et al.,1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 3720-3724 ；Choi et al. ,1993Nature Genetics 4117-123 ；Chen, J. et al. ,1993 EMBO J. 12 821-830 ；Tuaillon et al. , 1994J. Immunol. 152 :2912_2920 ；Taylor, L. et al.，1994International Immunology 579-591 禾口 Fishwild, D. et al.，1996Nature Biotechnology 14 :845_851 中进一步描述了 HuMAb 小 鼠的制备和使用以及此类小鼠携带的基因组修饰，这些文献的所有内容都通过引用整体 明确并入本文。还见，Lonberg和Kay的美国专利号5, 545,806,5, 569,825,5,625, 126、 5，633，425,5, 789，650,5, 877，397,5, 661,016,5, 814，318,5, 874，299 和 5，770，429 ； Surani et al.的美国专利号 5，545，807 ;Lonberg and Kay 的 PCT
发明者C·布劳斯坦 申请人:诺瓦提斯公司