使用抗硬骨素抗体治疗骨折的方法

专利名称：使用抗硬骨素抗体治疗骨折的方法
使用抗硬骨素抗体治疗骨折的方法本发明总地说来涉及使用硬骨素(sclerostin)抑制剂增强骨折愈合的方法。交叉参考相关申请和通过引用合并本申请要求2007年12月14日提交的美国临时专利申请61/013，917的优先 权。此外，下列申请以其全文通过引用合并入本文2007年9月17日提交的美国临时专 利申请60/973，024、2006年4月25日提交的美国专利申请11/410，540，其要求2006年4 月17日提交的美国临时专利申请60/792，645、2006年3月13日提交的美国临时专利申 请60/782，244、2006年2月24日提交的美国临时专利申请60/776，847和2005年5月3 日提交的美国临时申请60/677，583的优先权；和2006年4月25日提交的美国专利申请 11/411,003，其要求2006年4月17日提交的美国临时专利申请60/792，645、2006年3月 13日提交的美国临时专利申请60/782，244，和2006年2月24日提交的美国临时专利申请 60/776, 847的优先权。
背景技术：
骨折是可导致疼痛、肿胀、对软组织的伤害和瘀伤(来自内出血)的骨的断裂或裂 缝。任何人，无论年龄、种族或经济背景，都易受骨折影响。骨折最常见地由身体外伤例如车 辆事故、躯体虐待或严重跌落引起。然而，低骨矿物质含量显著地增加人对骨折的易感性。 例如，骨质疏松症相关损伤代表重大的医疗挑战，特别是对于老人，更大的意外跌倒的风险 加重其增加的骨质脆弱(bone fragility)。破裂的髋、腕和椎骨是最常见的与骨质疏松症 相关的损伤。髋部骨折特别地对于患者和对于妇女是极不舒服的并且费用很高，且与高比 率的死亡率和发病率相关。在大多数情况下，通过用夹板、石膏模或支撑物(brace)固定并且长时间限制活 动来治疗骨折。骨折治疗对患者和患者家庭的影响很大。骨折治疗的直接费用通常包括医 院费用和物理治疗费用。1995年，在美国与前臂骨折的治疗相关的医疗费用总计385百万 美元(Ray等人，J. Bone Miner. Res. ,12(1) :24_25 (1997))。间接费用更是难以估计。骨折 通常导致受限制的生产力，这在一些情况下减少了赚钱的可能和照料家庭成员的能力。骨 折还影响患者的生活质量和自尊。例如，据报道，髋部骨折存活者在骨折后12个月中生活 质量下降 52% (Tosteson 等人，Osteoporos Int.，12(12) 1042-49 (2001))。发明概述本发明涉及使用硬骨素抑制剂治疗患有骨折的人的方法。例如，本发明提供了治 疗骨折的方法，其中所述方法包括在持续至少2周的治疗期中对受试者施用治疗有效量的 硬骨素抑制剂。在一个方面，治疗期在骨折的2周内开始。在某些实施方案中，治疗期为大 约8周、大约4周，或短于4周，或不长于3周，或不长于2周(例如，两周)，或不长于1周。 在治疗期中，可每两周1次，每周1次，每周2次，每周3次或更多次施用硬骨素抑制剂。硬骨素抑制剂可以是硬骨素结合剂(例如，抗硬骨素抗体)。特别地涉及美国专利 公开案20070110747中公开的硬骨素结合剂例如在本文中公开的任一方法中的用途或用 于制备用于根据本文中公开的任一方法施用的药物的用途。以有效地增强骨折愈合或在骨 折部位提高骨矿物质密度的量和时间施用一个或多个剂量的硬骨素抑制剂。一个或多个剂量的硬骨素抑制剂可包括大约0. 1至大约30毫克硬骨素抑制剂/千克体重(mg/kg)。例 如，硬骨素抑制剂(例如，硬骨素结合剂)的剂量可以在大约0. 5mg/kg至大约25mg/kg体 重(例如，大约0.8mg/kg至大约20mg/kg)的范围内。在一些实施方案中，硬骨素抑制剂 (例如，硬骨素结合剂)的剂量可以在大约0. 5mg/kg至大约10mg/kg、lmg/kg至大约15mg/ kg(例如，12mg/kg)、大约lmg/kg至大约10mg/kg(例如，大约2mg/kg或大约9mg/kg)或大 约 3mg/kg 至大约 8mg/kg (例如，大约 4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg 或 7mg/kg)的范围内。在一 些实施方案中，在骨折的2周内，例如在骨折的10天内，在骨折的7天内，在骨折的5天内， 在骨折的3天内或在骨折的1天内施用硬骨素结合剂。本发明还包括有效量的硬骨素结合剂(大约0. 5mg/kg至大约10mg/kg的量)治 疗骨折的用途，其中在持续至少2周(例如，2周、4周或8周)的治疗期中进行硬骨素结合 剂的1次或多次施用。在一些实施方案中，治疗期在骨折的2周内开始。硬骨素抑制剂可用于使用本文中描述的任一剂量和时间安排方案进行施用的药 物的制备。任选地，硬骨素抑制剂存在于装有成剂量的用于施用的硬骨素抑制剂(例如，大 约70至大约450mg的硬骨素抑制剂)的容器，例如单剂量或多剂量的小瓶中。在一个示例 性实施方案中，小瓶可装大约70mg或75mg的硬骨素抑制剂，例如抗硬骨素抗体，并且适用 于施用大约lmg/kg的单个剂量。在其他实施方案中，小瓶可装大约140mg或150mg ；或大约 2 IOmg 或 220mg 或 250mg ；或大约 280mg 或 290mg 或 300mg ；或大约 350mg 或 360mg ；或大约 420mg或430mg或440mg或450mg的硬骨素抑制剂，例如抗硬骨素抗体。本发明包括装有抗 硬骨素抗体或其片段的容器和用于施用抗体或其片段以治疗骨折(以大约0. 5mg/kg至大 约10mg/kg的量，每周2次，进行包括2至4周的治疗期)的说明书。发明详述本发明至少部分基于发现硬骨素抑制剂增强骨折愈合，如在动物模型中通过指 示增加的抗弯曲和扭转(扭曲)力的骨强度的参数和通过缩短的恢复时间测量的。在这方 面，本发明提供了增强骨愈合或治疗骨折的方法。该方法包括在例如至少2周和/或短于 4周的治疗期中对受试者(例如，哺乳动物例如人)施用一个或多个剂量的硬骨素抑制剂， 例如硬骨素结合剂(例如，抗硬骨素抗体)。本发明的材料和方法优于其治疗功效是有限的 并且需要延长的恢复时间的现有疗法。硬骨素抑制剂的施用增强或加速骨折愈合，从而“治疗”骨折。“增强”骨愈合意指 介导超过(即，高于)未施用硬骨素抑制剂的受试者(例如，哺乳动物，例如人)(即，对照受 试者)中经历的骨愈合水平的骨愈合水平。骨愈合由例如改善的骨密度、改善的骨矿物质 含量、骨折间隙内的骨形成(即，骨桥的形成)、成熟骨痂、改善的骨强度(任选地伴随医学 上可接受的骨刚度(bone stiffness)水平)或改善的受影响区域的患者应用来证明。“改 善的”意指测量的参数的增加或减小(当需要时)。增加可以是测量的参数完全或部分恢 复至基线水平(例如，骨折前的水平)、至本领域使用的标准数据库中提供的值或至对侧功 能水平(例如，完全或部分恢复至例如对侧肢体的功能性能力)。在一些情况下，增加可以 是超过基线水平的提高。如果需要，可将施用了一个或多个剂量的硬骨素抑制剂的患者的 测量参数与未施用硬骨素抑制剂的骨折患者(任选地年龄和性别匹配的)的相同参数相比 较，以进一步分析本发明的方法的功效。可使用单和/或双能X线吸收法(X-ray absorptometry)、定量计算机体层摄影术(quantitative computed tomography，QCT)、超声检查术、放射线照相术(例如，射线吸 收法(radiographicabsorptometry))和磁共振成像来测量骨折部位上的骨矿物质含量、 成熟骨痂、骨桥的形成和骨密度。在一些实施方案中，可以以有效地在骨折部位增加骨矿物 质密度、骨桥形成、骨痂的形成或骨密度(或体积)至少大约5% (大约6%、大约7%、大 约8%或大约9%)的剂量和时间来施用硬骨素抑制剂(例如，硬骨素结合剂)。在一些实 施方案中，骨折部位上的骨矿物质密度、骨桥形成、骨痂的形成或骨密度增加至少大约10% (例如，至少大约10%、大约12%、大约15%或大约18% )。在其他实施方案中，硬骨素抑制 剂在骨折部位上增加骨矿物质密度、骨桥形成、骨痂的形成或骨密度至少大约25% (例如， 至少大约20%、大约22%、大约25%或大约28% )。在其他实施方案中，骨折部位上的骨 矿物质密度、骨桥形成、骨痂的形成或骨密度增加至少大约30% (例如，至少大约32%、大 约35%、大约38%或大约40% )或至少大约50% (例如，至少大约60 %、大约70 %、大约 80%、大约90%或大约100% )。可在硬骨素抑制剂的初次施用后1周、2周、3周或4周测 定骨矿物质密度的增加或重建。备选地，可在治疗期结束后(例如，在治疗期后1周、2周、 3周或4周)测定骨密度水平。在一个方面，与未接受硬骨素抑制剂的年龄和性别匹配的患 者相比，该方法减少建立期望水平的骨形成、骨体积、骨痂或骨密度(例如，本文中描述的 骨形成、骨矿物质密度、骨痂或骨体积的任何百分比增加)所需要的时间量，从而减少受试 者的恢复时间。例如，在一个实施方案中，硬骨素抑制剂减少在骨折部位增加骨密度或体积 所需要的时间量至少大约10% (例如，至少大约20%、至少大约25%、至少大约30%、至少 大约35%、至少大约40%、至少大约45或至少大约50% )。指示骨愈合的功能性生活质量参数包括但不限于强度和承载力的恢复、减少的疼 痛和疼痛药物治疗的使用以及改善的职业病状态(occupational status) 0如本文中所述 的，一个或多个剂量的硬骨素抑制剂的施用在测试的患者群体中以统计学上显著的方式加 速与骨折相关的功能性生活质量参数的改善。在某些方面，与未接受硬骨素抑制剂的患者 的恢复时间相比，该方法减少施用了一个或多个剂量的硬骨素抑制剂的患者的恢复时间至 少10% (例如，至少20%、至少30%、至少40%、至少50%或至少65%)。可使用许多康复 效果测量中的任一种例如髋骨折的FIM仪运动评分(FIM instrument motor score) (Munin 等人，Arch. Phys. Med. Rehabil，86 :367_372 (2005))、Olerud-Molander 踝关节评分(OMAS) 和踝骨折的SF-12问卷法(Shah等人，Injury，38 (11) 1308-1312 (2003))以及膝关节置换 术的膝关节学会评分(Knee Society Scoring) (Insall 等人，ClinicalOrthopaedics，248 13-14(1989))来评估“恢复，，。在一些实施方案中，在包括1、2、3、4、5、6、7、8、9或10周的治疗期过程中对人施 用一个或多个剂量的硬骨素抑制剂，例如硬骨素结合剂(例如，抗硬骨素抗体)。“治疗期” 开始于第一剂硬骨素抑制剂(例如，硬骨素结合剂)施用之时并结束于最后一剂硬骨素抑 制剂施用之时。如果需要，可以每周多次施用成剂的硬骨素抑制剂。在一个实施方案中，治 疗期包括至少2周。在一些实施方案中，治疗期持续2、4或8周。备选地或此外，治疗期持 续不超过5周(例如，30天)。事实上，可在持续不超过4周(例如，26天或24天)，短于 4周，不超过3周(例如，18或15天)、短于3周，不超过2周(例如，12天或10天)或不 超过1周(例如，5天或3天)的治疗或医疗期内进行包含硬骨素抑制剂的药物组合物的1 次或多次施用。在一个实施方案中，治疗期不长于2周，但当与未治疗的骨折相比时，仍然产生显著的愈合参数(例如(但不限于)骨强度(例如，经历疼痛前的最大承载力)、骨体 积、骨桥形成、肢体功能和/或恢复时间)的改善。例如，在2周的治疗后，患者在无疼痛的 情况下可承受的最大负载可以是骨折前强度(或年龄和性别匹配的受试者的强度)的至少 大约20% (例如，25%、30%、35%或40%)。同样，在4周的治疗后，患者在无疼痛情况下 可承受的最大负载可以是骨折前强度(或年龄和性别匹配的受试者，例如未进行骨折治疗 的受试者的强度)的至少大约20% (例如，25%、30%、35%或40% )。此外，在一个方面， 治疗期在检测到骨折后立即开始，例如，治疗期在骨折的2周内(例如，10天内、7天内、5天 内、3天内或1天内)开始。以促进、增强或加速骨折愈合的量施用硬骨素结合剂(例如，抗硬骨素抗体)。对 受试者(例如，哺乳动物，例如人)施用的硬骨素结合剂的剂量可以在大约0. lmg/kg至大 约30mg/kg体重的范围内。例如，硬骨素结合剂的剂量可以在大约0. 5mg/kg至大约25mg/ kg(例如，大约0. 5mg/kg至大约10mg/kg、或大约0. 8mg/kg至大约20mg/kg)体重的范围 内。在一些实施方案中，硬骨素结合剂(例如，抗硬骨素抗体)的剂量范围可以是大约Img/ kg至大约15mg/kg (例如12mg/kg)、大约lmg/kg至大约10mg/kg (例如，大约2mg/kg或大 约 9mg/kg)或大约 3mg/kg 至大约 8mg/kg (例如，大约 4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg 或 7mg/kg)。 在一个方面，硬骨素结合剂的剂量是大约0. 5mg/kg至大约2. 5mg/kg (例如，大约lmg/kg至 大约2mg/kg，或大约1.5mg/kg)体重。此外，取决于选择用于特定患者的治疗方案，可有利 地施用多个剂量的硬骨素结合剂或间隔剂量的施用。例如，取决于骨折的严重度、患者的年 龄和身体健康情况等，可每2周1次、每周1次、每周2次、每周3次、每周4次或更多次施 用成剂的硬骨素抑制剂。以多种方式分类骨折。在闭合性或单纯性骨折中，围绕骨的皮肤未被损坏，然而开 放性或复合骨折刺穿皮肤。如果断裂延伸整个骨，则骨折是“完全的”。“不完全”或“青枝 (greenstick) ”骨折是未延伸至整个骨直径的部分断裂。应力性骨折由破裂骨的反复活动 的应力引起。本发明的方法不受待治疗的骨折的类型或骨折的原因限制。例如，骨折患者还 可患有骨相关病症，所述病症选自软骨发育不全、锁骨颅骨发育不全、内生软骨瘤病、纤维 发育异常、戈谢病(Gaucher' sDisease)、低血磷酸盐性佝偻病、马凡氏综合征(Marfan' s syndrome)、遗传性多发性外生骨疣、神经纤维瘤病、成骨不全、骨硬化病、骨斑点症、硬化性 损伤、假关节、脓性骨髓炎、牙周病、抗癫痫药诱导的骨丧失、原发性和次发性甲状旁腺功能 亢进、家族性甲状旁腺功能亢进综合征、失重诱导的骨丧失、男性骨质疏松症、绝经后的骨 丧失、骨关节炎、肾性骨营养不良、骨的浸润病症、口腔骨丧失、颂骨坏死、青少年帕哲氏病 (juvenile Paget ‘ s disease)、肢骨纹状肥大、代谢性骨病、肥大细胞增生病、镰刀形细 胞贫血症/疾病、器官移植相关骨丧失、肾移植相关骨丧失、系统性红斑狼疮、强直性脊柱 炎、癫痫、青少年关节炎、地中海贫血、粘多糖贮积病、法布里病(FabryDisease)、特纳综合 征(Turner Syndrome)、唐氏综合征(DownSyndrome)、克莱里菲尔特综合征(Klinefelter Syndrome)、麻风病、佩特兹病(Perthe' s Disease)、青少年特发性脊柱侧凸、婴儿期多系 统炎性病、温彻斯特综合征(Winchester Syndrome)、门克斯病(Menkes Disease)、威尔森 氏病(Wilson' s Disease)、缺血性骨疾病(例如累-卡-佩氏病(Legg-Calve-Perthes disease)和局限性移行性骨质疏松症)、贫血状态、由类固醇引起的状况、糖皮质激素诱导 的骨丧失、肝素诱导的骨丧失、骨髓病症、坏血病、营养不良、缺钙、骨质疏松症、骨质减少、酒精中毒、慢性肝病、绝经后状态、慢性炎性状况、类风湿性关节炎、炎性肠病、溃疡性结肠 炎、炎性结肠炎、克罗恩病、月经过少、闭经、妊娠、糖尿病、甲状腺功能亢进症、甲状腺病症、 甲状旁腺病症、库欣病(Cushing' s disease)、肢端肥大症、性腺功能减退、固定或废弃 (immobilization or disuse)、反射性交感神经营养不良综合征、局限性骨质疏松症、骨软 化症、与关节置换术相关的骨丧失、HIV相关骨丧失、与生长激素丧失相关的骨丧失、与囊性 纤维化相关的骨丧失、化学治疗相关骨丧失、肿瘤诱导的骨丧失、癌症相关骨丧失、激素磨 蚀性骨丧失(hormone ablativebone loss)、多发性骨髓瘤、药物诱导的骨丧失、神经性厌 食、疾病相关面骨丧失、疾病相关颅骨丧失、疾病相关颂骨丧失、疾病相关头骨丧失、与衰老 相关的骨丧失、与衰老相关的面骨丧失、与衰老相关的颅骨丧失、与衰老相关的颂骨丧失、 与衰老相关的头骨丧失、和与太空旅游相关的骨丧失。优选以生理可接受的(例如，药物)组合物对患者施用硬骨素结合剂，所述组合物 可包含载体、赋形剂或稀释剂。应理解，本文中描述的硬骨素结合剂可用于使用本文中公开 的任何剂量和时间安排方案进行施用的药物的制备。药物组合物和治疗方法公开于美国专 利公开案20050106683，其通过引用合并入本文。“生理可接受的”是指当对人施用时不产 生变应性或类似的不良反应的分子实体和组合物。此外，对受试者施用的组合物可包含多 于一种的硬骨素抑制剂(例如，两种抗硬骨素抗体，或硬骨素结合剂和合成的化学硬骨素 抑制剂)或与一种或多种具有不同作用机制的治疗剂组合的硬骨素抑制剂。用于在多种治疗方案(包括例如皮下、口服、胃肠外、静脉内、鼻内和肌内施用和 制剂)中使用本文中描述的特定组合物的合适的剂量和治疗方案的开发在本领域内是熟 知的并且论述于美国专利公开案20070110747中。例如，在某些情况下，期望皮下、胃肠外、 静脉内、肌内或甚至腹膜内递送包含硬骨素结合剂的药物组合物。此类方法对于本领域技 术人员来说是熟知的，其中一些方法进一步描述于例如美国专利5，543，158,5, 641，515和 5，399，363中。适合用于注射使用的示例性药物形式包括无菌水溶液或分散体以及用于无 菌注射液或分散体的临时制备的无菌粉剂(例如，参见美国专利5，466，468)。在所有情况 下，形式必须是无菌的并且必须具有易于注射的流动性。在一个实施方案中，对于以水溶液形式进行的胃肠外施用，如果需要，应当对溶液 进行适当的缓冲，并且首先用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释剂等渗。此类特定的水溶液 特别适合于静脉内、肌内、皮下和腹膜内施用。例如，可将一个剂量溶解在Iml的等渗NaCl 溶液中，然后加入至1000ml的皮下输液液体(hypodermoclysis fluid)中或在计划的输注 部位进行注射(参见,例如，Remington' sPharmaceutical Sciences，第 15 版，Mack Pub. Co.，Easton，PA，pp. 1035-1038和1570-1580)。取决于待治疗的受试者的条件年龄、身高、 体重和总体健康状况以及任何副作用的存在，施用的剂量和频率可发生一些变化。此外，可 将包含硬骨素结合剂的药物组合物置于容器(例如，小瓶)中，连同提供关于此类药物组合 物的使用的说明书的包装材料一起。通常，这样的说明书将包括描述试剂浓度的明确表述， 以及在某些实施方案中，重构药物组合物所必需的赋形剂成分或稀释剂(例如，水、盐水或 PBS)的相对量的明确表述。本发明的方法包括施用一定量的“硬骨素抑制剂”。如本文中使用的，术语“硬骨 素抑制剂”意指抑制硬骨素对骨的生物学活性(如通过骨矿物化、骨密度、对成骨细胞和/ 或破骨细胞的作用、骨形成的标记、骨质吸收的标记、成骨细胞活性的标记和/或破骨细胞活性的标记的变化测量的)的任何分子。此类抑制剂可通过结合硬骨素或其受体或结合伴 侣起作用。该类型中的抑制剂包括“硬骨素结合剂”例如抗体或基于肽的分子。“硬骨素抑 制剂”还指结合硬骨素并且抑制其活性的任选地分子量低于大约1000道尔顿的小有机化合 物。备选地，抑制剂可通过抑制硬骨素的表达来起作用。该类型中的抑制剂包括结合硬骨 素DNA或mRNA并且抑制硬骨素表达的多核苷酸或寡核苷酸，包括抑制硬骨素表达的反义寡 核苷酸、抑制性RNA、DNA酶、核酶、适体或其可药用的盐。“硬骨素结合剂”特异性结合硬骨素或其部分以阻断或削弱人硬骨素与一种或多 种配体的结合。硬骨素，SOST基因的产物，不存在于硬化性骨化病(以骨的过度生长和 强密度骨为特征的骨骼疾病)中(Brunkow等人，Am. J. Hum. Genet.，68 :577-589 (2001)； Balemans 等人，Hum. Mol. Genet.，10 :537_543 (2001))。人硬骨素的氨基酸序列由 Brunkow 等人报导，并在美国专利公开案20070110747(该专利公开案以其关于对硬骨素结合剂和 序列表的描述的全文合并入本文)中公开为SEQ ID NO :1。重组人硬骨素/SOST可从R&D Systems (Minneapolis,Minn. ,USA ；2006 Catalog #1406-ST_025)商购获得。此外，重组小 鼠硬骨素/SOST 可从 R&D Systems (Minneapolis,Minn. ,USA ；2006 Catalog#1589-ST_025) 商购获得。研究级硬骨素结合单克隆抗体可从R&D Systems (Minneapolis，Minn.，USA ；小 鼠单克隆2006 Catalog#MAB1406 ；大鼠单克隆2006 Catalog#MAB1589)商购获得。美 国专禾Ij 6，395，511和6，803，453以及美国专利公开案20040009535和20050106683涉及 抗硬骨素抗体。适合用于本发明背景的硬骨素结合剂的实例还描述于美国专利公开案 20070110747和20070072797中，其通过引用合并入本文。关于产生硬骨素结合剂的材料和 方法的另外的信息可见于美国专利公开案20040158045中。本发明的硬骨素结合剂优选是抗体。术语“抗体”是指完整抗体或其结合片段。 抗体可包括完整抗体分子(包括具有全长重链和/或轻链的多克隆抗体、单克隆抗体、嵌 合抗体、人源化抗体或人形式抗体)，或包括其抗原结合片段。抗体片段包括F(ab' )2、 Fab、Fab'、Fv, Fc和Fd片段，并且可被整合入单结构域抗体、单链抗体、maxibody、微小 抗体、细胞内抗体(intrabody)、双价抗体(diabody)、三价抗体(triabody)、四价抗体 (tetrabody)、v-NAR禾口双-scFv (参见，例如，Hollinger 禾口 Hudson, Nature Biotechnology, 23(9) :1126-1136(2005))。抗体多肽，包括纤连蛋白多肽monobody，也公开于美国专利 6，703，199中。其他抗体多肽公开于美国专利公开案20050238646。抗硬骨素抗体可以以低 于或等于lxlCTM，低于或等于1χ10_8Μ，低于或等于1χ10_9Μ，低于或等于ΙχΙΟ,Μ，低于或等 于IxlO-11M或低于或等于IxlO-12M的亲和力结合SEQ ID NO :1的硬骨素或其天然发生的变 体。亲和力可通过亲和力ELISA测定法来测定。在某些实施方案中，亲和力可通过BIAcore 测定来测定。在某些实施方案中，亲和力可通过动力学方法来测定。在某些实施方案中，亲 和力可通过平衡/溶液法来测定。抗体片段可以是任何合成的或经遗传工程改造的蛋白质。例如，抗体片段包括由 轻链可变区组成的分离的片段、由重链和轻链的可变区组成的“Fv”片段，以及其中轻链和 重链可变区通过肽连接体连接的重组单链多肽分子(scFv蛋白)。抗体片段的另一种形式是包含抗体的一个或多个互补决定区(OTR)的肽。⑶R(也 称为“最小识别单位”或“高变区”)可通过构建编码目的⑶R的多核苷酸来获得。这样的多 核苷酸例如通过使用产生抗体的细胞的mRNA作为模板，利用聚合酶链式反应合成可变区来制备(参见，例如，Larrick 等人，Methods :A Companion to Methods inEnzymology, 2 106(1991) ；Courtenay-Luck, " GeneticManipulation of Monoclonal Antibodies, " in MonoclonalAntibodies Production, Engineering and Clinical Application, Ritter 等人(eds.)，第 166 页，Cambridge University Press (1995)；和 Ward 等人，“Genetic Manipulation and Expression ofAntibodies," in Monoclonal Antibodies Principles andApp 1 ications, Birch 等人，(eds.),第 137 页，ffiley-Liss, Inc. (1995))。在本发明的一个实施方案中，硬骨素结合剂交叉阻断抗体Ab-A、Ab-B、Ab-C、Ab_D、 Ab-I、Ab-2、Ab-3、Ab-4、Ab-5、Ab-6、Ab-7、Ab-8、Ab-9、Ab-10、Ab-Il、Ab-12、Ab-13、Ab-14、 Ab-15、Ab-16、Ab-17、Ab-18、Ab-19、Ab-20、Ab-21、Ab-22、Ab-23 和 Ab_24 (其全部描述于美 国专利公开案20070110747)中的至少一个与硬骨素的结合。备选地或此外，硬骨素结合剂 与硬骨素的结合被抗体 Ab-A、Ab-B、Ab-C、Ab-D、Ab-1、Ab-2、Ab_3、Ab-4、Ab_5、Ab_6、Ab_7、 Ab-8、Ab-9、Ab-10、Ab-ll、Ab-12、Ab-13、Ab-14、Ab-15、Ab-16、Ab-17、Ab-18、Ab-19、Ab-20、 Ab-21、Ab-22、Ab-23和Ab-24(其全部描述于美国专利公开案20070110747)中的至少一个 交叉阻断。术语“交叉阻断”、“交叉阻断的”和“交叉阻断性”在本文中可互换地使用，意指 抗体或其他结合剂干扰其他抗体或结合剂与硬骨素的结合的能力。抗体或其他结合剂能够 干扰另一种抗体或结合剂与硬骨素的结合的程度，从而其是否可被认为交叉阻断，可使用 竞争结合测定来确定。在本发明的一些方面，交叉阻断性抗体或其片段减少参照抗体的硬 骨素结合大约40%至大约100%，例如大约60%至大约100%，特别地70%至100%，更特 别地80%至100%。用于检测交叉阻断的特别合适的定量测定使用Biacore仪器，其使用表 面等离子共振技术测量相互作用的程度。另一个合适的定量交叉阻断测定使用基于ELISA 的方法来测量抗体或其他结合剂之间在它们与硬骨素的结合方面的竞争。合适的硬骨素结合剂包括美国专利公开案20070110747中描述的抗体和其部分， 例如，其中明确公开的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3中的一个或多个。 CDR-Hl、CDR-H2、CDR-H3、CDR-Ll、CDR-L2和CDR-L3区域中的至少一个可具有至少一个氨基 酸置换，只要结合剂保持非置换的CDR的结合特异性。结合剂的非CDR部分可以是非蛋白质 分子，其中结合剂交叉阻断本文中公开的抗体与硬骨素的结合和/或中和硬骨素。结合剂 的非CDR部分可以是非蛋白质分子，其中结合剂在人硬骨素肽表位竞争结合测定中展示与 由抗体 Ab-A、Ab-B、Ab-C、Ab-D、Ab-I、Ab-2、Ab-3、Ab-4、Ab-5、Ab-6、Ab-7、Ab-8、Ab-9、Ab-10、 Ab-ll、Ab-12、Ab-13、Ab-14、Ab-15、Ab-16、Ab-17、Ab-18、Ab-19、Ab-20、Ab-21、Ab-22、Ab-23 和Ab-24(其全都描述于美国专利公开案20070110747)中的至少一个展示的相似的对人硬 骨素肽的结合模式，和/或中和硬骨素。结合剂的非CDR部分可由氨基酸组成，其中结合剂 是重组结合蛋白或合成的肽，并且重组结合蛋白交叉阻断抗体与硬骨素的结合和/或中和 硬骨素。结合剂的非CDR部分可由氨基酸组成，其中结合剂是重组结合蛋白，并且重组结合 蛋白在人硬骨素肽表位竞争结合测定(描述于美国专利公开案20070110747)中展示与由 抗体 Ab-A、Ab-B、Ab-C、Ab-D、Ab-l、Ab-2、Ab-3、Ab-4、Ab-5、Ab-6、Ab-7、Ab-8、Ab-9、Ab-10、 Ab-ll、Ab-12、Ab-13、Ab-14、Ab-15、Ab-16、Ab-17、Ab-18、Ab-19、Ab-20、Ab-21、Ab-22、Ab-23 和Ab-24(描述于美国专利公开案20070110747中)中的至少一个展示的相似的对人硬骨 素肽的结合模式，和/或中和硬骨素。优选，硬骨素结合剂是美国专利公开案20070110747 中的 Ab-A、Ab-B、Ab-C、Ab-D、Ab-I、Ab-2、Ab-3、Ab-4、Ab-5、Ab-6、Ab-7、Ab-8、Ab-9、Ab-10、Ab-ll、Ab-12、Ab-13、Ab-14、Ab-15、Ab-16、Ab-17、Ab-18、Ab-19、Ab-20、Ab-21、Ab-22、Ab-23 或Ab-24。 此外，硬骨素结合剂可以包含至少一个⑶R序列，其与选自美国专利公开案 20070110747 中公开的 SEQ ID NOs :39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、 54、55、56、57、58、59、60、61、62、78、79、80、81、99、100、101、102、103、104、105、106、107、 108、109、110、111、112、113、114、115、116、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、 247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、 266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、 285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、351、352、353、358、359 和 360的⑶R具有至少75%的同一性(例如，100%的同一性)。优选，硬骨素结合剂包含至 少一个CDR序列，其与选自 SEQ ID NO s :245、246、247、78、79、80、269、270、271、239、240和 241 (其全都描述于美国专利公开案20070110747中)的⑶R具有至少75%的同一性。如美 国专利公开案20070110747中所描述的，硬骨素结合剂可包含a)SEQ ID NOs :54、55和56 的 CDR 序列以及 SEQ ID NOs :51、52 和 53 的 CDR 序列；b)SEQ ID NOs :60、61 和 62 的 CDR 序列以及SEQ ID NOs 57、58和59的CDR序列；c) SEQID NOs :48、49和50的CDR序列以及 SEQ ID NOs :45、46 和 47 的 CDR 序列；d) SEQ ID NOs :42、43 和 44 的 CDR 序列以及 SEQ ID NOs :39、40 和 41 的 CDR 序列；e)SEQ ID NOs :275、276 和 277 的 CDR 序列以及 SEQ ID NOs 287、288 和 289 的 CDR 序列；f)SEQ ID NOs 278、279 和 280 的 CDR 序列以及 SEQ ID NOs 290、291 和 292 的 CDR 序列；g) SEQ ID NOs 78、79 和 80 的 CDR 序列以及 SEQ ID NOs 245、 246 和 247 的 CDR 序列；h) SEQ ID N0s:81、99 和 100 的 CDR 序列以及 SEQ ID NOs 248、249
和250的⑶R序列i)SEQIDNOs:101、102 和103的CDR序列以及SEQIDNOs:251、252和253的⑶R序列j) SEQIDNOs:104、105 和106的CDR序列以及SEQIDNOs:254、255和256的⑶R序列k) SEQIDNOs:107、108 和109的CDR序列以及SEQIDNOs:257、258和259的⑶R序列1)SEQIDNOs:110、111 和112的CDR序列以及SEQIDNOs:260、261和262的⑶R序列m) SEQIDNOs:281、282 和283的CDR序列以及SEQIDNOs:293、294和295的⑶R序列η) SEQIDNOs:113、114 和115的CDR序列以及SEQIDNOs:263、264和265的⑶R序列ο) SEQIDNOs:284、285 和286的CDR序列以及SEQIDNOs:296、297和298的⑶R序列ρ) SEQIDNOs:116、237 和238的CDR序列以及SEQIDNOs:266、267和268的⑶R序列q) SEQIDNOs:239、240 和241的CDR序列以及SEQIDNOs:269、270和271的⑶R序列r) SEQIDNOs:242、243 和244的CDR序列以及SEQIDNOs:272、273和274的⑶R序列或 s)SEQID NOs 351,352和353的CDR序列以及SEQID NOs :358、359和360的CDR序列。 硬骨素结合剂还可包含至少一个⑶R序列，该⑶R序列与选自⑶R-H1、⑶R-H2、 CDR-H3、CDR-Ll、CDR-L2和CDR-L3的CDR具有至少75 %的同一性(例如，100 %的同一性)， 其中 CDR-Hl 具有 SEQ ID N0:245 或 SEQ ID NO :269 中给出的序列，CDR-H2 具有 SEQ ID NO: 246 或 SEQ ID NO 270 中给出的序列，CDR-H3 具有 SEQ ID NO 247 或 SEQ ID NO 271 中给 出的序列，CDR-Ll具有SEQ ID NO 78或SEQ IDNO 239中给出的序列，CDR-L2具有SEQ ID N0:79 或 SEQ ID NO :240 中给出的序列，以及 CDR-L3 具有 SEQ ID N0:80 或 SEQ ID NO 241 中给出的序列，其全都描述于美国专利公开案20070110747。
备选地，硬骨素结合剂可具有重链(所述重链包含⑶R H1、H2和H3以及包含具有 SEQ ID NO :137中提供的序列的多肽)或其变体(在所述变体中所述⑶R分别与SEQ ID N0:245、246和247至少75%同一(例如，100%同一))以及轻链(所述轻链包含CDR Li、 L2和L3以及包含具有SEQ ID NO 133中提供的序列的多肽)或其变体(在所述变体中所 述CDR分别与SEQ ID N0:78、79和80至少75%同一(例如，100%同一))(如美国专利公 开案20070110747中描述的)。硬骨素结合剂可具有重链(所述重链包含⑶R H1、H2和H3以及包含具有SEQ ID N0:145或392中提供的序列的多肽)或其变体(在所述变体中所述CDR分别与SEQ ID NO 245、246和247至少75%同一(例如，100%同一))以及轻链(所述轻链包含CDR Li、L2 和L3以及包含具有SEQ ID N0:141中提供的序列的多肽)或其变体(在所述变体中所述 CDR分别与SEQ ID N0:78、79和80至少75%同一(例如，100%同一))(如美国专利公开 案20070110747中所描述的)。硬骨素结合剂可具有重链(所述重链包含⑶R H1、H2和H3以及包含具有SEQ ID NO 335中提供的序列的多肽)或其变体(在所述变体中所述⑶R分别与SEQ ID NO :269、 270和271至少75%同一(例如，100%同一))和轻链(所述轻链包含⑶R L1、L2和L3以 及包含具有SEQ ID NO :334中提供的序列的多肽)或其变体(在所述变体中所述⑶R分 别与SEQ ID N0:239、240和241至少75%同一(例如，100%同一))(如美国专利公开案 20070110747中所描述的)。备选地，硬骨素结合剂可具有重链(所述重链包含⑶R H1、H2和H3以及包含具有 SEQ ID NO :331中提供的序列的多肽)或其变体(在所述变体中所述⑶R分别与SEQ ID N0:269、270和271至少75%同一(例如，100%同一))和轻链(所述轻链包含CDR L1、L2 和L3以及包含具有SEQ ID NO 330中提供的序列的多肽)或其变体(在所述变体中所述 CDR分别与SEQ ID N0:239、240和241至少75%同一(例如，100%同一))(如美国专利公 开案20070110747中所描述的)。硬骨素结合剂可具有重链(所述重链包含⑶R H1、H2和H3以及包含具有SEQ ID NO :345或396中提供的序列的多肽)或其变体(在所述变体中所述CDR分别与SEQ ID NO 269、270和271至少75%同一(例如，100%同一))和轻链(所述轻链包含CDR L1、L2和 L3以及包含具有SEQ ID NO 341中提供的序列的多肽)或其变体(在所述变体中所述⑶R 分别与SEQ ID N0:239、240和241至少75%同一(例如，100%同一))(如美国专利公开 案20070110747中所描述的)。备选地，硬骨素结合剂具有包含具有SEQ ID NO 137中提供的序列的多肽的重链 以及包含具有SEQ ID NO 133中提供的序列的多肽的轻链；或包含具有SEQ ID NO 145或 392中提供的序列的多肽的重链以及包含具有SEQ ID NO :141中提供的序列的多肽的轻 链；或包含具有SEQ ID NO :335中提供的序列的多肽的重链以及包含具有SEQ ID NO 334 中提供的序列的多肽的轻链；或包含具有SEQ ID NO :331中提供的序列的多肽的重链以及 包含具有SEQ ID NO 330中提供的序列的多肽的轻链；或包含具有SEQ ID NO 345或396 中提供的序列的多肽的重链以及包含具有SEQ ID NO :341中提供的序列的多肽的轻链(如 美国专利公开案20070110747中所描述的)。用于本发明方法的硬骨素抑制剂(例如，硬骨素结合剂)优选在美国专利公开案20070110747中描述的基于细胞的测定中和/或美国专利公开案20070110747中描述的体 内测定中调节硬骨素功能和/或结合一个或多个美国专利公开案20070110747中描述的表 位和/或交叉阻断美国专利公开案20070110747中描述的抗体中的一个抗体的结合和/或 与硬骨素的结合被美国专利公开案20070110747中描述的抗体中的一个抗体交叉阻断。备选地，本发明的方法可包括施用除了硬骨素结合剂外的硬骨素抑制剂。此类试 剂可直接或间接地作用于SOST或硬骨素。预期用于本发明的方法的硬骨素抑制剂包括美 国专利公开案20030229041 (其全部公开内容通过引用合并入本文，特别强调的是硬骨素 抑制剂的描述)中描述的硬骨素抑制剂。例如，可用于调节SOST表达和硬骨素活性的试剂 包括但不限于类固醇(例如相应于美国专利公开案20030229041的式1的类固醇)、生物 碱、萜类化合物、类肽和合成的化学药品。在一些实施方案中，SOST拮抗剂或激动剂可结合 糖皮质激素受体。例如，地塞米松倾向于消除BMP-4和BMP-6对SOST表达的刺激作用。其 他化学实体(包括糖皮质激素类似物、胆汁盐(例如相应于美国专利公开案20030229041 中式3的那些)和前列腺素(例如相应于美国专利公开案20030229041中式2的那些)) 也调节骨形态发生蛋白对SOST表达的作用，并且预期用于本发明的方法。硬骨素抑制剂还可以是直接或间接作用于SOST或硬骨素以在体内加速或增强骨 折修复的其他小分子治疗剂。术语“小分子”包括合成的、天然来源的或部分合成的化合物 或分子复合物，其优选具有低于5，000道尔顿(例如，大约100至1，500道尔顿)的分子量。 可使用本领域内已知的组合文库方法中的许多方法的任一种获得试剂，所述方法包括空间 可寻址(addressable)平行固相或液相文库、需要去卷积(deconvolution)的合成文库法、 “一珠一化合物”文库法和使用亲和层析选择的合成文库法(参见，例如，Lam, Anticancer Drug Des.，12 145 (1997)和美国专利 5，738，996 ；5，807，683 ；和 7，261，892)。开发和筛选 硬骨素抑制剂的方法进一步描述于美国专利公开案20030229041中，其公开内容通过引用 合并入本文。可按照本发明的方法使用的硬骨素表达抑制剂包括抑制剂寡核苷酸或多核 苷酸，包括其可药用的盐，例如钠盐。非限定性实例包括反义寡核苷酸(Eckstein， Antisense Nucleic Acid Drug Dev. ,10 117-121(2000) ；Crooke, Methods Enzymol, 313 3-45(2000) ；Guvakova 等人，J. 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Neurochem. ,88 :257_265 (2004))，小干扰RNA/RNAi (Fire 等人，Nature，391 :806_811 (1998) ；Montgomery 等人，Proc. Natl. Acad. Sci U.S. Α. ,95 15502-15507(1998) ；Cullen, Nat. Immunol, 3 :597_599(2002) ；Hannon, Nature,418 :244_251 (2002) ；Bernstein 等人，Nature, 409 :363_366(2001) ；Nykanen 等人，Cell, 107 309-321(2001) ；GiImore 等人，J. Drug Target, 12 :315_340 (2004)； Reynolds 等人，Nat. Biotechnol，22 :326_330(2004) ；Soutschek 等人，Nature,432 173-178(2004) ；Ralph 等人，Nat. Med. , 11 :429_433 (2005) ；Xia 等人，Nat. Med. , 10(8) 816-820(2004)和Miller 等人，NucleicAcids Res. ,32 :661_668 (2004))、适体(Ellington 禾口 Szostak，Nature, 346 818-822 (1990) ；Doudna 等人，Proc. Natl. Acad. SciU. S. Α.， 92 2355-2359(1995) ；Tuerk 和 Gold, Science,249 505-510(1990) ；White 等人，Mol. Ther.，4 :567_573 (2001) ；Rusconi 等人，Nature，419 :90_94(2002) ；Nimjee 等人，Mol. Ther.，14 :408_415 (2006) ；Gragoudas 等人，N. Engl. J. Med.，351 :3805_2816 (2004)； Vinores, Curr. Opin. M01. Ther. ,5(6) :673_679 (2003)以及 Kourlas 和 Schiller 等人， Clin. Ther. ,28 36-44(2006))或诱馆寡核苷酸(Morishita 等人，Proc. Natl. Acad. Sci U. S. Α.，92 5855-5859 (1995) ；Alexander 等人，J. Am. Med. Assoc, 294 :2446_2454 (2005)； Mann 和 Dzau, J.Clin· Invest, 106 1071-1075 (2000)和 Nimjee 等人，Annu. Rev. Med.， 56 =555-583(2005)) 0上述文献以其全文通过引用合并入本文，特别强调的是文献的关于 设计、制备和使用抑制性寡核苷酸的方法的部分。商业提供商例如Ambion Inc. (Austin, TX), Darmacon Inc. (Lafayette, CO),InvivoGen(San Diego, CA),禾口 Molecular Research Laboratories, LLC(Herndon, VA)生产定制的siRNA分子。此外，可获得商业试剂盒来产生 定制的 siRNA 分子，例如 SILENCER siRNA Construction 试剂盒(Ambion Inc. , Austin, TX)或 psiRNA 系统(InvivoGen, San Diego, CA)。稳定的，具有高核酸酶抗性，具有合适的药物动力学以使它们能够以无毒剂量运 输至靶组织部位，并且具有穿过质膜的能力的抑制性寡核苷酸预期用作治疗剂。抑制性寡 核苷酸可与靶基因的编码部分、3'或5'非翻译区、基因的内含子序列、或备选地靶mRNA 中的编码序列或内含子序列互补。内含子序列通常较不保守，从而可提供更大的特异性。在 一个实施方案中，抑制性寡核苷酸抑制一个物种的基因产物的表达但在另一物种中不抑制 其同源物的表达；在其他实施方案中，抑制性寡核苷酸在两个物种例如人和灵长类动物或 人和鼠中抑制基因的表达。已显示反义寡核苷酸在细胞中的组成型表达可能通过阻断翻译或阻止剪接来抑 制基因表达。在某些实施方案中，抑制性寡核苷酸能够在中等或高严格条件下与硬骨素基 因或mRNA (或其反向链(reversestrand))的至少8、9、10、11或12个连续碱基杂交。合适 的抑制性寡核苷酸可以是单链的并且包含长度为例如至少12、15或18个碱基的区段，所述 区段足够互补于和特异于mRNA或DNA分子，从而其可与mRNA或DNA分子杂交，并抑制转录、 剪接或翻译。通常少于30个碱基的长度上的互补性是绰绰有余的。通常，严格条件是其中在pH 7. O至8. 3下盐浓度低于大约1. 5MNa离子，通常大约 0. 01至1. OM Na离子浓度(或其他盐)并且温度为至少大约30°C (对于短核酸(例如，10 至50个核苷酸))和至少大约60°C (对于较长的核酸(例如，大于50个核苷酸))的条件。 严格条件还可通过加入去稳定剂例如甲酰胺来获得。示例性低严格性条件包括利用30%至 35%甲酰胺、IM NaClU% SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲液在37°C下进行的杂交，和在IX至2X SSC (20X SSC = 3. 0MNaCl/0. 3M柠檬酸三钠)中于50°C至55°C下进行的清洗。示例 性中等严格性条件包括在40 %至45 %甲酰胺、1. OM NaCl、1 % SDS中于37 °C下进行的杂交， 和在0. 5X至IX SSC中于55°C至60°C下进行的清洗。示例性高严格性条件包括在50%甲 酰胺、IM NaClU% SDS中于37°C下进行的杂交，和在0. IX SSC中于60°C至65°C下进行的 清洗。杂交的持续时间通常短于大约24小时，通常为大约4小时至大约12小时。在一些情况下，取决于互补区的长度，可耐受1、2或多个错配而不影响抑制功能。 在某些实施方案中，抑制性寡核苷酸是反义寡核苷酸、抑制性RNA(包括siRNA或RNAi或 shRNA)、DNA酶、核酶(任选地锤头状核酶)、适体或其可药用的盐。在一个实施方案中，寡 核苷酸与编码美国专利公开案20040158045的SEQ ID NO 1的核苷酸序列的至少10个碱 基互补。在一个实施方案中，寡核苷酸靶向位于硬骨素mRNA的3’非翻译区的附近的核苷 酸。用于寡核苷酸的设计的特定序列可以是靶的表达的基因信使中包含的任何连续 核苷酸序列。决定抑制性寡核苷酸序列的靶位点的因素包括寡核苷酸的长度、结合亲和力 和靶序列的可及性。可通过测量对靶蛋白质翻译和靶相关表型的抑制例如对培养中的细 胞的细胞增殖的抑制来就它们的抑制活性的潜能体外筛选序列。通常，已知可使用反义寡 核苷酸来靶向RNA的大多数区域(5'和3'非翻译区、AUG起始区、编码区、剪接点和内含 子)。本领域内已知的程序和算法可用于选择合适的靶序列。此外，可利用经设计用于预测 指定的单链核酸序列的二级结构的程序，并允许选择可能在折叠的mRNA的暴露的单链区 域中发生的序列来选择最佳序列。用于设计合适的寡核苷酸的方法和组合物可见于例如美 国专利6，251，588中，其内容以其全文通过引用合并入本文。可使用硫代磷酸酯反义寡核苷酸。磷酸二酯键以及杂环或糖的修饰可使效率增 加。硫代磷酸酯用于修饰磷酸二酯键。已描述N3' -P5'氨基磷酸酯键稳定寡核苷酸(以 抗核酸酶)并增加与RNA的结合。肽核酸(PNA)键是核糖和磷酸二酯主链的完全替换，并 且对于核酸酶是稳定的，其增加了对RNA的结合亲和力，并且不被RNA酶H切割。其基本结 构也易于修饰，该修饰可使其最优化为反义组分。关于杂环的修饰，已证明某些杂环修饰增 强了反义作用而不干扰RNA酶H活性。此类修饰的实例是C-5噻唑修饰。最后，还可考虑 糖的修饰。2' -0-丙基和2'-甲氧基乙氧基核糖修饰在细胞培养物中和体内稳定寡核苷 酸以抗核酸酶降解。已显示大多数mRNA包含许多二级和三级结构。RNA中的二级结构元件主要通过相 同RNA分子的不同区域之间的Watson-Crick类型相互作用形成。重要的二级结构元件包 括分子内双链区域、发夹环、双链RNA中的凸起(bulge)和内环。当二级结构元件彼此或与 单链区域接触并产生更复杂的三维结构时，形成三级结构元件。许多研究者已测量了大量 RNA双链体结构的结合能并且已得出了一套可用于预测RNA的二级结构的规则(参见例如 Jaeger 等人，Proc. Natl. Acad. SciUSA, 86 (20) :7706_10 (1989)；和 Turner 等人，Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem. ,17 167-192 (1988))。该规则可用于鉴定RNA结构元件，特别是用 于鉴定单链RNA区域，所述区域代表被靶向以进行siRNA、核酶或反义技术的mRNA的区段。短干扰(si) RNA技术(也称为RNAi)通常包括降解特定序列的mRNA (所述降解由 与该序列同源的双链RNA(dsRNA)诱导)，从而“干扰”相应基因的表达。任何选择的基因可 通过导入相应于该基因的mRNA的全部或大部分的dsRNA来抑制。似乎当表达长dsRNA时，其首先被核糖核酸酶III加工成长度少至21至22个碱基对的更短的dsRNA寡核苷酸。因 此，siRNA可通过导入或表达相对短的同源dsRNA来进行。示例性siRNA具有大约21个核 苷酸的有义和反义链，其形成大约19个核苷酸的双链RNA (在各3 ‘末端上具有2个核苷酸 的悬突)。事实上，使用相对短的同源dsRNA可具有某些有利方面。哺乳动物细胞具有至少2条受双链RNA (dsRNA)影响的途径。在序列特异性siRNA 途径中，如上所述，起始dsRNA首先断裂成短干扰RNA。短干扰RNA据认为提供使得特定信 使RNA能够被靶向降解的序列信息。相反地，非特异性途径由任何序列的dsRNA触发，只要 其长度为至少大约30个碱基对。非特异性作用的发生是因为dsRNA激活两个酶PKR，其活性形式磷酸化翻译起始 因子eIF2以关闭所有蛋白质合成，和2' ,5'寡腺苷酸合成酶(2‘ ,5' -AS)，其合成激活 RNA酶L(靶向所有mRNA的非特异性酶)的分子。非特异性途径可代表宿主对应激或病 毒感染的应答，并且通常，优选使非特异性途径的作用最小化。很明显，较长的dsRNA似乎 是诱导非特异性途径所必需的，因此，短于大约30个碱基对的dsRNA预期通过RNAi实现 基因阻遏(参见 Hunter 等人，J. Biol. Chem. ,250 409-17 (1975) ；Manche 等人，Mol. Cell. Biol. 12 5239-48(1992) ；Minks 等人，J. Biol. Chem.，254 :10180_3 (1979)；和 Blbashir 等 人，Nature，411 :494_8 (2001))。已证明siRNA是多种细胞类型中减少基因表达的有效方法。siRNA通常将基因 的表达降至比使用反义技术获得的水平更低的水平，并时常完全消除表达(参见Bass， Nature, 411 :428_9 (2001))。在哺乳动物细胞中，siRNA在低于通常用于反义实验中的浓度 几个数量级的浓度下是有效的(Elbashir等人，Nature，411 :494_8 (2001))。用于进行RNAi的双链寡核苷酸优选长度少于30个碱基对，例如，长度为大约25、 24、23、22、21、20、19、18或17个碱基对或更短，并且包含与靶mRNA充分互补从而允许与靶 mRNA杂交的区段。任选地，dsRNA寡核苷酸可包含3 ‘悬突末端。示例性2-核苷酸的3 ‘悬 突可由任何类型的核糖核苷酸残基组成，甚至可以由2’ _脱氧胸苷残基组成，其降低RNA 合成的成本并且可增强siRNA在细胞培养基中和转染细胞中的核酸酶抗性(参见Elbashi 等人，同上)。示例性dsRNA可通过化学方法合成或使用合适的表达载体体外或体内产生 (参见，例如，Elbashir等人，Genes Dev.，15 188-200 (2001)。较长的RNA可从本领域内 已知的启动子例如T7 RNA聚合酶启动子转录。50、75、100或甚至500个或更多个碱基对的更长的dsRNA也可用于本发明的某些 实施方案中。用于进行RNAi的dsRNA的示例性浓度是大约0. 05ηΜ、0. 1ηΜ、0. 5nM、l. OnM、 1. 5nM、25nM或ΙΟΟηΜ，尽管可使用其他浓度(取决于被处理的细胞的性质、基因靶和本领域 技术人员可容易地辨别的其他因素)。siRNA技术的另外的组合物、方法和应用提供于美国专利6，278，039 ；5, 723，750 ； 和5，244，805中，其以其全文通过引用合并入本文。与siRNA相比，shRNA在沉默寿命和递送选择中提供了有利方面。关于综述，参见， 例如，Hannon 等人，Nature，431 :371_378 (2004)。已报导了产生 shRNA 的载体，所述 shRNA 在细胞内被加工成具有siRNA样性质的短双链体RNA(Brummelkamp等人，Science，296 550-553(2000) ；Paddison 等人，Genes Dev.，16 :948_958 (2002))。此类载体提供了可在将 载体稳定地整合入宿主细胞基因组后介导持续的基因沉默的基因沉默试剂的可更新来源。此外，可用无数经设计用于递送允许异位mRNA表达的DNA构建体的方法中的任一种将核心 沉默“发夹”盒容易地插入逆转录病毒、慢病毒或腺病毒载体，从而促进shRNA至广泛的细 胞类型内的递送(Brummelkamp 等人，Cancer Cell, 2 :243_247 (2002) ；Dirac 等人，J. Biol. Chem.，278 :11731-11734(2003) ；Michiels 等人，Nat. Biotechnol, 20 1154-1157 (2002)； Stegmeie 等人，Proc. Natl. Acad. Sci USA, 102 13212-13217 (2005) ；Khvorova 等人，Cell， 115 :209-216(2003))。可以以左手发夹(left-handed hairpin)(即，5'-反义-环-有义_3')或右 手发夹(right-handed hairpin)(即，5 ‘-有义-环-反义)的形式组织发夹。取决 于发夹的组织，siRNA还可在有义链或反义链的5'或3'末端包含悬突。优选，如果存在 任何悬突，则它们存在于发夹的3'末端上并且包含1至6个碱基。悬突可以不被修饰，或 可包含一个或多个特异性或稳定性修饰，例如2'位置的卤素或0-烷基修饰，或核苷酸间 修饰例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或甲基膦酸酯修饰。悬突可以是核糖核酸、脱氧核糖核 酸或核糖核酸与脱氧核糖核酸的组合。此外，发夹还可在最5'的核苷酸(5' -most nucleotide)上包含磷酸基。最5' 的核苷酸的磷酸化是指一个或多个连接至5'末端核苷酸的糖部分的5'碳的磷酸基的存 在。优选，只有一个磷酸基存在于将在Dicer加工后形成反义链的区域的5'末端上。在 一个示例性实施方案中，右手发夹可包含不具有5'磷酸基的5'末端(即，有义区域的游 离5'末端)，或可具有以阻止磷酸化的方式修饰的有义区域的游离最5'的核苷酸的5' 碳。这可利用多种方法来获得，所述方法包括但不限于磷酸化阻断基团(例如，5' -0-烷 基)的添加、或5' -OH官能团的消除(例如，最5'的核苷酸是5'-脱氧核苷酸)。在其 中发夹是左手发夹的情况下，优选磷酸化最5'的核苷酸的5'碳位置。可通过Dicer加工具有长于26个碱基对的茎长度的发夹，以使一些部分不为促进 mRNA降解的所得的siRNA的部分。因此，可包含有义核苷酸的第一区域和可包含反义核苷 酸的第二区域还可包含一段这样的核苷酸，其是互补的(或至少大体上彼此互补)但与或 不与靶mRNA相同或互补。虽然shRNA的茎可由互补或部分互补的有义和反义链(不包括 悬突)组成，但shRNA还可包括下列(1)远离最后的Dicer切割位点的分子的部分包含大 体上与靶mRNA互补/同源的区域；和⑵临近Dicer切割位点的茎的区域(S卩，临近环的 区域)与靶mRNA无关或仅部分相关(例如，互补/同源)。第二区域的核苷酸含量可基于 许多参数(包括但不限于热动力学特性或特征)来选择。经修饰的shRNA可在Dicer加工后的双链体中保留修饰。在示例性实施方案 中，在其中发夹是在分子的3'末端上包含2至6个核苷酸的悬突的右手发夹(例如， 5' -S-环-AS-3')的情况下，可将2' -0-甲基修饰加至在发夹的5'末端的位置2、位置 1和2、或位置1、2和3上的核苷酸。同样，具有该构型的发夹的Dicer加工可保持有义链 的5'末端完整，从而在Dicer加工后的双链体中保留化学修饰的模式。该构型中3'悬突 的存在可以是特别有利的，因为含有指定的修饰模式的平端分子可以以除去具有2'修饰 的核苷酸的方式进一步被Dicer加工。在其中存在/保留3'悬突的情况下，所得的具有有 义修饰的核苷酸的双链体可具有关于沉默特异性和功能性的高度有利的特性。示例性修饰 模式的实例详细地描述于美国专利公开案20050223427以及国际公开案WO 2004/090105 和WO 2005/078094中，其各自的公开内容以其全文通过引用合并入本文。
shRNA可包含随机选择的或按照任何合理的设计选择方法选择的序列。例如，合 理的设计算法描述于国际公开案WO 2004/045543和美国专利公开案20050255487中，其 公开内容以其全文通过引用合并入本文。此外，可能期望完全或部分基于可有助于接近 细胞机器或通过细胞机器进行加工的平均内部稳定性特征(average internalstability profiles, "AISP")或局部内部稳定性特征(regionalinternal stability profile, "RISP")来选择序列。核酶是能够催化mRNA的特异性切割，从而阻止翻译的酶促RNA分子。(关于综述， 参见Rossi，Current Biology，4 :469_471 (1994))。核酶作用的机制包括核酶分子与互补 靶RNA的序列特异性杂交，然后是内切核苷酸的(endonucleolytic)切割事件。核酶分子 优选包括(1) 一个或多个与靶mRNA互补的序列，和(2)负责mRNA切割的熟知的催化序列 或功能等价的序列(参见，例如，美国专利5，093，246，其以其全文通过引用合并入本文)。虽然在位点特异性识别序列上切割mRNA的核酶可用于破坏靶mRNA，但备选地可 使用锤头状核酶。锤头状核酶在由与靶mRNA形成互补碱基对的侧翼区域确定的位点上切 割mRNA。优选，靶mRNA具有下列2碱基序列5 ‘ -UG-3 ‘。锤头状核酶的构建和产生在本 领域内是熟知的并且更详细地描述于Haseloff和Gerlach，Nature, 334 =585-591(1988)； 以及PCT申请WO 89/05852中，其内容以其全文通过引用合并入本文。靶向基因的核酶可包含与靶mRNA的两个区域互补的杂交区域，所述两个区域各 自为至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续核苷酸(但二者不必 为相同长度)。可将锤头状核酶序列包埋入稳定的RNA例如转运RNA(tRNA)中以增加体内切 割效率(Perriman 等人，Proc. Natl. Acad. Sci USA, 92 :6175_79 (1995) ；de Feyter 和 Gaudron,Methods in MolecularBiology,第 74 卷，第 43 章，“Expressing Ribozymes in Plants, “ Turner, P. C. (ed.)，Humana Press Inc.，Totowa, N. J.)。特别地，RNA 聚合酶 III介导的tRNA融合核酶的表达在本领域内是熟知的(参见Kawasaki等人，Nature，393 284-9(1998) ；Kuwabara 等人，Nature Biotechnol, 16 961-5 (1998)；和 Kuwabara 等人， Mol. Cell, 2 617-27 (1998) ；Koseki 等人，J. Virol. ,75 1868-77 (1999) ；Kuwabara 等人， Proc. Natl. Acad. Sci USA，96 1886-91 (1999) ；Tanabe 等人，Nature，406 :473_4 (2000))。 通常在给定的靶cDNA序列中存在许多潜在的锤头状核酶切割位点。优选，对核酶进行工程 改造以使切割识别位点位于靶mRNA的5'末端附近以增加效率和使非功能性mRNA转录物 的细胞内积累减少至最少。此外，位于编码靶mRNA的不同部分的靶序列中的任何切割识别 位点的使用可允许选择性靶向一个或其他靶基因。用于本发明的方法的核酶还包括RNA内切核糖核酸酶("Cech型核酶”)例如 在嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila)中天然发生的核酶(称为IVS或L-19 IVS RNA)，并且该核酶已在 Zaug 等人，Science, 224 :574_578 (1984) ；Zaug,等人，Science, 231 470-475(1986) ；Zaug 等人，Nature，324 :429_433 (1986)；国际专利公开案 WO 88/04300 ； 和Been等人，Cell，47 :207-216(1986))中进行了详尽的描述。Cech型核酶具有8碱基对 活性位点，其与靶RNA序列杂交，随后发生靶RNA的切割。在一个实施方案中，本发明的方 法使用靶向存在于靶基因或核酸序列中的8碱基对活性位点序列的Cech型核酶。核酶可由修饰的寡核苷酸组成( 如，为了改善的稳定性、靶向性等)并且可通过化学方法合成或通过表达载体产生。因为核酶与反义分子不同，具有催化活性，因此只需较 低的细胞内浓度来达到效率。此外，在某些实施方案中，可通过首先鉴定足以引起通过RNAi 产生的有效抑制的序列部分来设计核酶。然后可将相同序列的部分整合入核酶。备选地，可通过靶向与基因的调控区(即，启动子和/或增强子)互补的脱氧核糖 核苷酸序列以形成三螺旋结构(所述结构在体内阻止靶细胞中的基因转录)来减少靶基因 表达。(通常参见，Helene，C，Anticancer Drug Des.，6 :569_84 (1991) ；Helene 等人，Ann. N. Y. Acad. Sci，660 :27_36(1992)；和 Maher, L. J.，Bioassays, 14 :807_15 (1992))。用于三螺旋形成以抑制转录的核酸分子优选是单链的并且由脱氧核糖核苷酸组 成。此类寡核苷酸的碱基组成应当通过Hoogsteen碱基配对法则来促进三螺旋形成，这通 常需要相当大的嘌呤或嘧啶区段存在于双链体的一条链上。核苷酸序列可以是基于嘧啶 的，这将导致TAT和CGC三联体横跨所得的三螺旋的3条结合的链。富含嘧啶的分子提供 了对双链体的单链的富含嘌呤的区域的碱基互补性(以与该链平行的方向)。此外，可选择 富含嘌呤例如包含G残基区段的核酸分子。此类分子将与富含GC对的DNA双链体形成三 螺旋，其中大部分嘌呤残基位于被靶向的双链体的单链上，从而导致CGC三联体横跨三链 体中的3条链。备选地，可被靶向以形成三螺旋的靶序列可通过产生所谓的“之字形 (switchback)”核酸分子来增加。之字形分子以交替的5' -3'、3' -5'方式合成，这样 它们与双链体的第一条链碱基配对，然后与另一条配对，从而消除了对相当大的嘌呤或嘧 啶区段存在于双链体的一条链上的需要。备选地，DNA酶可用于抑制靶基因例如硬骨素基因的表达。DNA酶整合了反义和核 酶技术的一些机制特征。设计DNA酶以使它们能够识别特定的靶核酸序列(非常类似于反 义寡核苷酸)。然而，它们还具有催化作用并且特异性切割靶核酸。DNA酶包括由Santoro和Joyce (参见，例如，美国专利6，110, 462)鉴定的两种基 本类型。10-23 DNA酶包含连接两个臂的环结构。两个臂通过识别特定靶核酸序列提供了 特异性，同时环结构提供了在生理条件下的催化功能。优选，独特的或大体上独特的序列是富含G/C的大约18至22个核苷酸。高G/C 含量帮助确保DNA酶与靶序列之间的更强的相互作用。可在DNA酶的两个臂之间分开将酶 靶向信使的特异性反义识别序列。制备和施用DNA酶的方法可见于例如美国专利6，110，462。此外，本领域技术人员 将理解，与反义寡核苷酸一样，可任选地修饰DNA酶以改善稳定性和改善对降解的抗性。可直接施用抑制性寡核苷酸或通过经载体(包括病毒载体或质粒)的转化或转 染将其递送至细胞，所述载体中已放置了编码抑制性寡核苷酸的DNA和合适的调控序列， 包括启动子，从而导致抑制性寡核苷酸在期望的细胞中表达。已知的方法包括标准瞬时转 染、稳定转染和使用病毒(范围从逆转录病毒至腺病毒)的递送。预期通过复制型载体或 复制缺陷型载体递送核酸抑制剂。表达还可由组成型或诱导型启动子系统驱动(Paddison 等人，Methods Mol. Biol.，265 :85-100 (2004))。在其他实施方案中，表达可在组织或发育 特异性启动子的控制之下。例如，载体可通过使用载体组合物例如Lipofectamine 2000 (Life Technologies)或 Oligofectamine (Life Technologies)的转染导入。对于哺乳动物细胞系，转染效率可在编码hGFP的pAD3的共转染后使用荧光显微镜检查进行检查(Kehlenback 等人，J. Cell Biol, 141 :863_74(1998))。递送途径是提供最佳抑制效果(如根据上述标准测量的)的途径。通过阳离子脂 质体介导的递送、通过逆转录病毒载体的递送和直接递送是有效的。抑制性寡核苷酸的有效性可在足以进行内源库周转(在新蛋白质合成被抑制后) 的时间后，通过许多测定法中的任一种来估量，所述测法定包括逆转录聚合酶链式反应或 测定存在的人硬骨素mRNA的水平的Northern印迹分析或使用识别人硬骨素蛋白的抗体的 Western印迹分析。可以以许多方法测量用于本发明的方法的特定的硬骨素抑制剂例如硬骨素结合 剂的活性，包括上文中描述的用于检测骨矿物质含量或骨密度的增加的方法。硬骨素抑制 剂调节骨质量的能力可根据体重或通过使用其他方法(参见Guirmess-Hey，Metab. Bone Dis. Relat. Res.，5 177-181 (1984))来计算。将动物和特别地动物模型用于本领域以检 测药物组合物和方法对例如骨丧失、骨质吸收、骨形成、骨强度或骨矿物化的参数的影响。 此类模型的实例包括卵巢切除的大鼠模型(Kalu，Bone and Mineral, 15 175-192 (1991)； Frost 禾口 Jee， Boneand Mineral,18 :227_236(1992)；以及 Jee 禾口 Yao， J.Musculoskel. Neuron. Interact.，1 :193-207 (2001))。用于测量本文中描述的硬骨素结合剂的活性的方 法还可用于测定其他硬骨素抑制剂的功效。备选地，可基于其调节骨标记(bone marker)的水平的能力选择硬骨素抑制剂。 骨标记是在骨重建过程中产生的产物，并且由骨、成骨细胞和/或破骨细胞释放。骨质吸 收和/或骨形成“标记”水平的波动暗示着骨重建/建造(modeling)的变化。国际骨质 疏松症基金会(International Osteoporosis Foundation, I OF)推荐使用骨标记监控骨 密度疗法(参见，例如，Delmas 等人，Osteoporos Int. , Suppl. 6 :S2_17 (2000)，通过引 用合并入本文)。指示骨质吸收(或破骨细胞活性)的标记包括例如，C-端肽(例如， 1型胶原的C-末端端肽(CTX)或血清交联的C端肽)、N-端肽(1型胶原的N-末端端肽 (NTX))、脱氧吡啶啉(DPD)、吡啶啉、尿羟脯氨酸、半乳糖基羟赖氨酸和耐酒石酸盐酸性磷酸 Sl (tartrate-resistant acid phosphatase)(例如，血清耐酒石酸盐酸性憐酸醇亚型5b)。 骨形成/矿物化标记包括但不限于骨特异性碱性磷酸酶(BSAP)、从I型原胶原的N和C末 端延长部分释放的肽(P1NP，PICP)和骨钙素(OstCa)。可商购获得几种试剂盒，以检测和 定量临床样品例如尿和血液中的标记。进一步在下列实施例中说明本发明。下列实施例只用于举例说明本发明，且无意 以任何方式限定本发明的范围。实施例1本实施例举例说明硬骨素抑制剂，即抗硬骨素单克隆抗体(Scl-mAb)增强骨愈合 的能力。外部固定的股骨截骨术模型(进一步描述于Murnaghan等人，Journal of Orthopaedic Research, 23 (3) :625_631 (2005)禾口 Connolly 等人，Journal of Orthopaedic Research, 21 =843-849(2003))用于检查小鼠中抗硬骨素抗体处理对骨折愈合的影响。将 80只雄性CD 1小鼠(9周龄)在右股骨上经历截骨术。在全身麻醉和无菌状态下，在从小鼠 的左膝至大转子(greater trochanter)的剃除毛发的皮肤和阔筋膜上进行侧切(lateralincision)。通过钝剥离以暴露股骨来打开股肌(vasti)与胭绳肌腱(hamstring)之间的平 面。钻4个近端小孔，并进行股骨的低能中骨干(middiaphyseal)截骨术。使用定制的钻 模和手锯确保内部2个小孔之间的横向截骨术的精确中心定位。使用4钉、单侧、单平面小 型外固定器来稳定骨折。用polyglactin可吸收缝线缝合阔筋膜和皮肤。手术后，用媒介 物、人甲状旁腺激素-(1-34) [PTH]或抗硬骨素单克隆抗体(Scl-mAb)如下皮下注射小鼠 盐水媒介物(5 μ 1/克体重)，每周2次(组1) ；PTH (40 μ g/kg)，每周5次，进行4周(组 2) ；Scl-mAb (25mg/kg)，每周 2 次，只进行第 1 周(组 3)；和 Scl-mAb (25mg/kg)，每周 2 次， 进行4周(组4)。在4周结束时对所有动物进行安乐死。处理的生物学效应通过每周1次的X射线 分析和机械试验来监控。切取各受试者的两个股骨以进行机械试验。股骨截骨术模型的技 术挑战导致一些不重合或不正确放置的股骨，其被排除在随后的分析之外。在三点弯曲试 验中使用总共10个来自媒介物处理组(组1)的股骨、14个来自PTH处理组(组2)的股 骨、15个来自第一周处理组(组3)的股骨和14个来自4周处理组(第4组)的股骨以获 得骨强度。对于Scl-mAb处理，在骨折的股骨上进行的机械试验显示强度参数的增加。与只 接受媒介物的组1相比，在4周处理组(组4)中最大负载和刚度分别增加117%和195% (P < 0. 05)。组1、组2 (PTH处理组)和组3 (只接受Scl-mAb —周)之间的最大负载和刚
度不存在显著差异。上述结果证明在小鼠的外部固定的股骨截骨术模型中，使用抗硬骨素抗体抑制硬 骨素改善了骨愈合和增加了骨折部位的骨强度。实施例2本实施例举例说明本发明的方法在体内增强骨愈合的用途。闭合股骨骨折模型(进一步描述于Bormarens等人，J Orthop. Res.，2 97-101(1984)和 Li 等人，J Bone Miner. Res. , 18(11) :2033_42 (2003))用于检查大鼠中 Scl-mAb (硬骨素结合剂)处理对骨折愈合的影响。在雄性SD大鼠(9周龄)的股骨中产生 标准的闭合中骨干骨折。简而言之，在麻醉后，将针(直径1.8mm)导入右股骨的髓管，用由 滴重驱动的钝截断器组成的装置产生中骨干骨折。手术后，用盐水媒介物( μ /克体重)， 每周2次，进行2周(组1)或4周(组2) ；Scl-mAb (25mg/kg)，每周2次，进行2周(组3)； Scl-mAb (25mg/kg)每周2次，进行2周(组4)；或Scl-mAb (25mg/kg)每周2次，进行4周 (组5)皮下注射大鼠。在2周结束时对组3中的受试者进行安乐死。在4周后对组4和5 中的受试者进行安乐死。通过每周1次的X射线分析监控对处理方法的生物学应答。切取两个股骨以进行 机械试验。闭合股骨骨折模型的技术挑战导致一些不重合或不正确放置的股骨，其被排除 在随后的分析之外。总共8个来自组1中的媒介物处理的受试者的股骨和8个来自组3的 Scl-mAb处理的股骨被认为适合用于强度实验。11个来自组2受试者的股骨、11个来自组 5受试者的股骨和10个来自组4受试者(即，“开/关处理组”)的股骨被认为适合用于强 度试验。对于Scl-mAb处理，骨折股骨的机械试验显示强度参数的增加。在第2周，与媒介 物处理组(组1)相比，在Scl-mAb处理组(组3)中最大负载和刚度分别增加34%和39%。在第4周，与匹配的媒介物处理组(组2)相比较，在开/关处理组(组4)中，骨折股骨的最 大负载和刚度分别显著增加105%和110%。类似地，与媒介物处理组(组2)相比较，在接 受Scl-mAb 4周的受试者(组5)中，骨折的股骨的最大负载和刚度分别增加54%和70%。该实施例的结果证明在闭合股骨骨折大鼠模型中，Scl-mAb (硬骨素结合剂)的施 用改善了骨愈合和增加了骨折股骨的骨强度。实施例3本实施例举例说明了硬骨素抑制剂即抗硬骨素抗体增强灵长类动物中的骨愈合 的用途。由于解剖学、皮质骨重建和愈合的时间过程上的相似性，非人灵长类动物提供了 人的骨折愈合的优良模型。稳定的腓骨截骨术模型(进一步描述于Seeherman等人，J Bone Joint Surg. Am. ,86 1961-1972 (2004) ；Seeherman 等人，J Bone Joint Surg. Am. , 88 144-160(2006)，和 Radomsky 等人，Journal of Orthopaedic Research, 17 607-614 (1999) 中)已用于食蟹猴和狒狒中以研究治疗剂对骨折愈合的影响。腓骨截骨术模型的创伤程度 最低，在已知的时间表中一致地愈合，并且可双侧(在两个腓骨上)进行。该模型用于检查 幼小雄性食蟹猴中在10周的时间内Scl-mAb对骨折愈合的影响。将44只雄性食蟹猴(4至5岁)经历双侧腓骨截骨术。简而言之，通过腓骨中段进 行单横向截骨术，使克氏针(Kirschner-wire)向下通过髓管(从腓骨的中段至远端方向)。 重新排列分成两段的腓骨，使髓内钉后退通过近端部分以稳定截骨术。手术后，用媒介物或 Scl-mAb (25mg/kg)皮下注射动物，每2周1次，进行10周。通过每2周1次的血清生物标 记和密度测定法(利用双能X射线吸收仪(DXA)和外周定量计算机体层摄影(pQCT))在基 线、6周和10周时监控Scl-mAb的药理学效应。通过每只猴一个腓骨的pQCT和扭曲试验离 体估量对骨折愈合的影响。在整个研究中，与媒介物处理的受试者相比较，骨形成标记骨钙素在Scl-mAb处 理的受试者中显著增加(ρ < 0. 05，在第2、4、6、8和10周)，在第2周达到50 %的峰值增 加。与只给予媒介物的对照动物相比较，骨形成标记PlNP也因Scl-mAb处理而显著增加 (P < 0. 05，在第2、4和10周)，在第2周达到62%的峰值增加。手术后10周，与在媒介物 处理的受试者中观察到的相比较，Scl-mAb处理显著增加了腰部骨矿物质密度的百分比变 化(相对于基线)(平均值士SE ；Scl-mAb 16. 6士 1. 2%，媒介物4. 4士0. 5% )。桡骨骨干 (radial diaphysis)上的皮质几何形状(cortical geometry)也受到Scl-mAb处理的积 极影响，如通过PQCT测量的。骨膜周边(periosteal perimeter)中与基线相比的百分比 变化从媒介物处理的受试者中的2. 5% (士0. 3)增加至Scl-mAb处理的受试者中的4. 1% (士 0. 4)。总共来自16个媒介物处理的受试者的腓骨和12个Scl-mAb处理的腓骨被认为适 合用于离体PQCT扫描和强度试验。外周QCT显示与媒介物处理组相比较，Scl-mAb处理组 中总骨痂骨质量显著增加23% (ρ < 0. 05)，而总骨痂面积非显著地提高20% (ρ = 0. 09)。 通过骨矿物质密度限定骨痂的阈值以区分密集区域(“硬骨痂”)(其反映后期骨痂成熟) 与较不密集区域(“软骨痂”)。与媒介物处理对照相比较，Scl-mAb处理的受试者中硬骨痂 面积和骨矿物质含量(BMC)分别增加26%和29%，而软骨痂面积和相关的BMC未改变。将扭曲强度试验和X射线分析经历由不相关的生物力学专家进行的盲态审核。从媒介物处理组中排除4个另外的试验，从而导致对于强度参数检测12个腓骨/组。对 于Scl-mAb处理，骨折的腓骨的破坏性扭曲试验显示强度参数的增加。与对照相比较，在 Scl-mAb处理组中，抗扭刚度显著增加48% (ρ < 0. 05)，而最大转矩(+32%,ρ = 0. 07)和 能量(+38%, ρ = 0. 12)未显著增加。这些结果显示抗硬骨素单克隆抗体在灵长类动物截骨术模型中改善了骨愈合。硬 骨素结合剂Scl-mAb的每两周1次的皮下注射增加了骨形成，如由增加的骨形成标记(其 在幼小雄性猴子中导致增加的骨密度和改善的皮质几何形状)所证明的。本实施例证明本 发明的方法用于在截骨术后10周增加骨折腓骨骨痂的骨质量和抗扭刚度的功效。本文中引用的所有参考文献，包括专利、专利申请、文献出版物等以它们的全文通 过引用合并入本文。虽然已通过强调优选实施方案来描述本发明，但对于本领域技术人员显然的是， 可使用优选化合物和方法的变型，且预期除了本文中明确描述的之外，可实施本发明。因 此，本发明包括由下列权利要求定义的本发明的精神和范围内包括的所有修饰。
权利要求
用于治疗受试者中的骨折的方法，所述方法包括以大约0.5mg/kg至大约10mg/kg的治疗有效量对所述受试者施用硬骨素结合剂，其中在持续至少2周并且开始于骨折的2周内的治疗期中进行一次或多次的硬骨素结合剂的施用。
2.权利要求1的方法，其中所述治疗期持续大约4周。
3.权利要求1的方法，其中所述治疗期持续大约8周。
4.权利要求1的方法，其中所述治疗期持续不超过4周。
5.权利要求4的方法，其中所述治疗期持续2周。
6.权利要求1至5的任一项的方法，其中药物以大约0.5mg/kg至大约2. 5mg/kg的量 包含硬骨素结合剂。
7.权利要求1至6的任一项的方法，其中以大约lmg/kg至大约2mg/kg的量施用所述 硬骨素结合剂。
8.权利要求1至8的任一项的方法，其中每周2次施用所述硬骨素结合剂。
9.权利要求1至8的任一项的方法，其中所述硬骨素结合剂交叉阻断抗体Ab-A、Ab-B、 Ab-C、Ab-D、Ab-1、Ab-2、Ab_3、Ab_4、Ab_5、Ab_6、Ab_7、Ab_8、Ab_9、Ab_10、Ab_ll、Ab_12、 Ab-13、Ab-14、Ab-15、Ab-16、Ab-17、Ab-18、Ab-19、Ab-20、Ab-21、Ab-22、Ab-23 和 Ab-24 中 的至少一个与硬骨素的结合。
10.权利要求1至9的任一项的方法，其中所述硬骨素结合剂与硬骨素的结合被抗体 Ab-A、Ab-B、Ab-C、Ab-D、Ab-I、Ab-2、Ab-3、Ab-4、Ab-5、Ab-6、Ab-7、Ab-8、Ab-9、Ab-IO、Ab-I1、 Ab-12、Ab-13、Ab_14、Ab_15、Ab_16、Ab_17、Ab_18、Ab_19、Ab_20、Ab_21、Ab_22、Ab-23 和 Ab-24中的至少一个交叉阻断。
11.权利要求1至10的任一项的方法，其中所述硬骨素结合剂是显示低于或等于 IXlO-7M的对SEQ ID NO=I的硬骨素的结合亲和力的抗体或其片段。
12.权利要求11的方法，其中所述抗体或其片段包含a)SEQIDNOs :54、55和56的⑶R 序列以及 SEQ ID NOs :51、52 和 53 的 CDR 序列；b) SEQ ID NOs :60、61 和 62 的 CDR 序列以 及 SEQ ID NOs :57、58 和 59 的 CDR 序列；c)SEQ ID NOs :48、49 和 50 的 CDR 序列以及 SEQ ID NOs :45、46 和 47 的 CDR 序列；d) SEQ ID NOs :42、43 和 44 的 CDR 序列以及 SEQ ID NOs 39、40 和 41 的 CDR 序列；e)SEQ ID NOs :275、276 和 277 的 CDR 序列以及 SEQ ID NOs 287、 288 和 289 的 CDR 序列；f)SEQ ID NOs 278、279 和 280 的 CDR 序列以及 SEQ ID NOs :290、 291 和 292 的 CDR 序列；g) SEQ ID NOs :78、79 和 80 的 CDR 序列以及 SEQ ID NOs :245、246 和 247 的 CDR 序歹Ij ；h) SEQ ID NOs :81、99 和 100 的 CDR 序列以及 SEQ ID NOs 248、249 和 250 的 CDR 序列；i) SEQ ID NOs 101、102 和 103 的 CDR 序列以及 SEQ ID NOs 251、252 禾口 253 的 CDR 序列；j) SEQ ID NOs 104、105 和 106 的 CDR 序列以及 SEQ ID N0s:254、255 和 256 的 CDR 序列；k) SEQ ID NOs 107、108 和 109 的 CDR 序列以及 SEQ ID N0s:257、258 和 259 的 CDR 序列；1) SEQ ID NOs :110、111 和 112 的 CDR 序列以及 SEQ ID NOs 260、261 禾P 262 的 CDR 序列；m) SEQ ID NOs :281、282 和 283 的 CDR 序列以及 SEQ ID N0s:293、294 和 295 的 CDR 序列；n) SEQ ID NOs :113、114 和 115 的 CDR 序列以及 SEQ ID NOs :263、264 禾口 265 的 CDR 序列；ο) SEQ ID NOs :284、285 和 286 的 CDR 序列以及 SEQ ID NOs :296、297 和 298 的 CDR 序列；ρ) SEQ ID NOs 116、237 和 238 的 CDR 序列以及 SEQ ID NOs:266、267 和 268 的 CDR 序列；q) SEQ ID NOs :239、240 和 241 的 CDR 序列以及 SEQ ID N0s:269、270 和· 271 的 CDR 序列；r) SEQ ID NOs 242、243 和 244 的 CDR 序列以及 SEQ ID N0s:272、273 和 274 的 CDR 序列；或 s) SEQ ID NOs :351、352 和 353 的 CDR 序列以及 SEQ ID NOs :358、359 和360的⑶R序列。
13.权利要求12的方法，其中所述抗体或其片段包含⑶R-H1、⑶R-H2、⑶R-H3、⑶R-L1、 CDR-L2 和 CDR-L3，其中(a) CDR-Hl 是 SEQID NO :245，CDR_H2 是 SEQ ID NO :246，CDR_H3 是 SEQ ID NO :247，CDR-Ll 是 SEQ ID NO :78，CDR-L2 是 SEQ ID NO 79 以及 CDR-L3 是 SEQID NO 80 ；或(b) CDR-Hl 是 SEQ ID NO :269，CDR_H2 是 SEQ ID NO :270，CDR_H3 是 SEQ ID NO 271，CDR-Ll 是 SEQ ID NO :239，CDR-L2 是 SEQID NO 240 以及 CDR-L3 是 SEQ ID NO :241。
14.权利要求11至13的任一项的方法，其中所述抗体是单克隆抗体。
15.权利要求11至14的任一项的方法，其中所述抗体是嵌合抗体。
16.权利要求11至15的任一项的方法，其中所述抗体是人源化抗体。
17.权利要求11至14的任一项的方法，其中所述抗体是人抗体。
18.有效量的硬骨素结合剂在制备药物中的用途，所述药物以大约0.5mg/kg至大约 10mg/kg的量用于治疗骨折，其中在持续至少2周并且开始于骨折的2周内的治疗期中进行 1次或多次的药物施用。
19.权利要求18的用途，其中所述治疗期持续大约4周。
20.权利要求18的用途，其中所述治疗期持续大约8周。
21.权利要求18的用途，其中所述治疗期持续不超过4周。
22.权利要求21的用途，其中所述治疗期持续2周。
23.权利要求18至22的任一项的用途，其中所述药物以大约0.5mg/kg至大约2. 5mg/ kg的量包含硬骨素结合剂。
24.权利要求18至23的任一项的用途，其中所述药物以大约lmg/kg至大约2mg/kg的 量包含硬骨素结合剂。
25.权利要求18至24的任一项的用途，其中每周2次施用所述药物。
26.权利要求18至25的任一项的用途，其中所述硬骨素结合剂交叉阻断抗体Ab-A、 Ab-B、Ab-C、Ab-D、Ab-I、Ab_2、Ab_3、Ab_4、Ab_5、Ab_6、Ab_7、Ab_8、Ab_9、Ab_10、Ab_ll、 Ab-12、Ab-13、Ab_14、Ab_15、Ab_16、Ab_17、Ab_18、Ab_19、Ab_20、Ab_21、Ab_22、Ab-23 和 Ab-24中的至少一个与硬骨素的结合。
27.权利要求18至26的任一项的用途，其中所述硬骨素结合剂与硬骨素的结合被抗 体 Ab-A、Ab-B、Ab-C、Ab-D、Ab_l、Ab_2、Ab_3、Ab_4、Ab_5、Ab_6、Ab_7、Ab_8、Ab_9、Ab_10、 Ab-ll、Ab-12、Ab-13、Ab-14、Ab-15、Ab-16、Ab-17、Ab-18、Ab-19、Ab-20、Ab-21、Ab-22、Ab-23 和Ab-24中的至少一个交叉阻断。
28.权利要求18至27的任一项的用途，其中所述硬骨素结合剂是显示低于或等于 IXlO-7M的对SEQ ID NO=I的硬骨素的结合亲和力的抗体或其片段。
29.权利要求28的用途，其中所述抗体或其片段包含a)SEQIDNOs :54、55和56的⑶R 序列以及 SEQ ID NOs :51、52 和 53 的 CDR 序列；b) SEQ ID NOs :60、61 和 62 的 CDR 序列以 及 SEQ ID NOs :57、58 和 59 的 CDR 序列；c)SEQ ID NOs :48、49 和 50 的 CDR 序列以及 SEQ ID NOs :45、46 和 47 的 CDR 序列；d) SEQ ID NOs :42、43 和 44 的 CDR 序列以及 SEQ ID NOs 39、40 和 41 的 CDR 序列；e)SEQ ID NOs :275、276 和 277 的 CDR 序列以及 SEQ ID NOs 287、.288 和 289 的 CDR 序列；f)SEQ ID NOs :278、279 和 280 的 CDR 序列以及 SEQ ID NOs :290、 291 和 292 的 CDR 序列；g) SEQ ID NOs :78、79 和 80 的 CDR 序列以及 SEQ ID NOs :245、246 和 247 的 CDR 序歹Ij ；h) SEQ ID NOs :81、99 和 100 的 CDR 序列以及 SEQ ID NOs 248,249 和.250的CDR序列 253的CDR序列 256的CDR序列 259的CDR序列 262的CDR序列 295的CDR序列 265的CDR序列 298的CDR序列 268的CDR序列 271的CDR序列 .274的CDR序列i)SEQ ID NOs 101、102 和 103 的 CDR 序列以及 SEQ ID NOs 251、252 禾口 j) SEQ ID NOs 104、105 和 106 的 CDR 序列以及 SEQ ID NOs :254、255 禾口 k) SEQ ID NOs 107、108 和 109 的 CDR 序列以及 SEQ ID NOs 257、258 禾口 1)SEQ ID NOs :110、111 和 112 的 CDR 序列以及 SEQ ID NOs 260、261 禾P m) SEQ ID NOs 281、282 和 283 的 CDR 序列以及 SEQ ID NOs:293、294 和 n) SEQ ID NOs :113、114 和 115 的 CDR 序列以及 SEQ ID NOs :263、264 禾口 o) SEQ ID NOs :284、285 和 286 的 CDR 序列以及 SEQ ID N0s:296、.297 和 p) SEQ ID NOs :116、237 和 238 的 CDR 序列以及 SEQ ID NOs :266、267 禾口 q) SEQ ID NOs :239、240 和 241 的 CDR 序列以及 SEQ ID NOs :269、270 和 r) SEQ ID NOs 242、243 和 244 的 CDR 序列以及 SEQ ID N0s:272、273 和 ；或 s) SEQ ID NOs 351、352 和 .353 的 CDR 序列以及 SEQ ID NOs 358、359 和360的⑶R序列。
30.权利要求29的用途，其中所述抗体或其片段包含⑶R-H1、⑶R-H2、⑶R-H3、⑶R-L1、 CDR-L2 和 CDR-L3，其中(a) CDR-Hl 是 SEQID NO :245，CDR-H2 是 SEQ ID NO :246，CDR-H3 是 SEQ ID NO :247，CDR-Ll 是 SEQ ID NO :78，CDR-L2 是 SEQ ID NO 79 以及 CDR-L3 是 SEQID NO 80 ；或(b) CDR-Hl 是 SEQ ID NO :269，CDR_H2 是 SEQ ID NO :270，CDR_H3 是 SEQ ID NO 271，CDR-Ll 是 SEQ ID NO :239，CDR-L2 是 SEQID NO 240 以及 CDR-L3 是 SEQ ID NO :241。-项的用途，其中所述抗体是单克隆抗体。 -项的用途，其中所述抗体是嵌合抗体。 -项的用途，其中所述抗体是人源化抗体。 -项的用途，其中所述抗体是人抗体。
31.权利要求28至30的任
32.权利要求28至31的任
33.权利要求28至32的任
34.权利要求28至31的任
全文摘要
本发明提供了增强骨折愈合的方法，其包括施用硬骨素抑制剂。在一个方面，本发明包括使用治疗有效量的硬骨素结合剂来治疗骨折，其中在持续至少2周并且开始于骨折的2周内的治疗期中进行1次或多次的硬骨素结合剂的施用。
文档编号A61P19/00GK101896201SQ200880120147
公开日2010年11月24日 申请日期2008年12月15日 优先权日2007年12月14日
发明者柯华珠 申请人:安进公司