专利名称：干红细胞的分化促进剂和/或增殖促进剂以及用于预防或治疗老年性贫血的蛋氨酸应用 ...的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及干红细胞的分化促进剂和/或增殖促进剂及预防老化的技术领域。本 发明尤其涉及红细胞增殖中的造血干细胞等干红细胞功能低下的抑制和预防老化的技术。
背景技术：
因为老化和年龄增大，不仅出现皮肤皱纹，头发减少 白发等在身体的表面出现的 变化，身体的机能也逐渐降低，出现各种各样的症状。例如，高血压、心肌梗塞、心绞痛等疾 患、胰岛素合成降低而导致的糖尿病危险增高、骨质酥松、老年性白内障、老年性贫血等。作为这种老化的对策，开发了包括民间疗法在内的种种健康食品和治疗药。例如，随着老化会出现褪黑激素的减少，从而引起了对由于老化而引起的神经 变性性疾病的褪黑激素给予的研究，近年来有报道称褪黑激素或其类似物(美国专利第 5403851号)具有预防老化的作用。此外，此褪黑激素的作用是通过HGH来实现的，故也将 生长激素作为老化预防剂来使用(AnnuRev Med. 2003 ；54 513-33. Epub 2001Dec 3)。此外，在体内生成的活性氧可以引起细胞和DNA的损伤、脂质的过氧化等，具有和 多种疾病相关而引起的种种影响，故研究了以用于封闭活性氧的抗氧化剂的利用，例如，利 用维生素C、维生素E等，利用a生育酚及其类似物等(日本特开平8-277282号)、此外， 也开发有自由基清除剂(日本特开平9-241637号)。此外，有报告称随着老化而发生的各种症状中，在与贫血关系方面，体内产生的 “活性氧”会诱发贫血和免疫缺陷(Nature 431，997-1002)。就老年性贫血用而言，作为中药，已知有例如由人参、苍术或白术、茯苓、甘草、生 姜、大枣、酸枣仁、龙眼、远志、当归、黄芪、木香、柴胡及桅子组成的加味归脾汤。[专利文献1]美国专利第5403851号[专利文献2]日本特开平8-277282号[专利文献2]日本特开平9-241637号[非专利文献 l]Annu Rev Med. 2003，54，513-33. Epub 2001 Dec 3[非专利文献 2] Nature 431,997-100
发明内容
本发明所要解决的课题从伴随着老化而频现的贫血出发，以开发对老年性贫血的预防有效的治疗剂为第 1课题。并且从今以后老龄化会进一步发展出发，以提供副作用低、价廉有效的抗老化剂 为第2课题。此外以开发不仅限于老人，能够广泛适用的对预防贫血有效的治疗剂为第3课题。
最后，为了人工血液制造等，以有效地通过细胞培养来配制红细胞为第4课题。解决课题的方法本发明者在偶然中发现蛋氨酸(Met)及含有蛋氨酸的氨基酸组合物具有维持和 促进红细胞造血机能的效果，在改善老年性贫血上也很有效果。首次发现含有蛋氨酸的氨 基酸组合物具有改善回复老年性贫血的能力，具体而言，所述组合物为除蛋氨酸外还含有 甘氨酸(Gly)及谷氨酸(Glu)作为有效成分的氨基酸组合物。此外，本发明提供了体外的高效红细胞增殖和/或分化的方法。发明效果通过本发明的以蛋氨酸为有效成分的老年性贫血预防剂或老年性贫血治疗剂，对 于今后可能增多的老年性贫血，可以进行安全价廉的治疗。此外，通过本发明的干红细胞的 分化促进剂和/或增殖促进剂，能够对剧烈运动者的贫血、抗癌剂的副作用和肾脏疾患导 致的贫血等进行必要的造血，从而在大范围内治疗 改善贫血。且本发明可以预防伴随老 化的细胞功能低下，全面地预防老化现象。此外，本发明还可以对细胞培养的红细胞进行有 效的增殖和分化。本说明书包含作为本发明优先权基础的日本专利申请2007-300814号说明书和/ 或附图记载的内容。附图简述[
图1]氨基酸混合物给予开始前的各组小鼠外周血的血红蛋白量。用平均值士 标准偏差表示。* :P < 0. 0001 (对幼龄小鼠进行学生t检验(student，s t-test))。[图2]氨基酸混合物给予后的各组小鼠外周血的血红蛋白量。用平均值士标准 偏差表示。*:P<0.01(对老龄小鼠(酪蛋白)进行学生t检验)。[图3]氨基酸混合物对707fl.细胞增殖的效果。用平均值士标准偏差表示。* P < 0. 05 (对不添加氨基酸混合物的条件进行学生t检验)[图4]在从必需氨基酸混合物中除去特定的氨基酸的情况下，对707fl.细胞增殖 促进效果的影响。用平均值士标准偏差表示。* :P< 0.005 (对不添加氨基酸混合物的条 件进行学生t检验)[图5]蛋氨酸和苏氨酸对707fl.细胞增殖的影响。用平均值士标准偏差表示。
*:P < 0. 05 (对不添加氨基酸混合物的条件进行学生t检验)[图6]氨基酸混合物对源自于人的K562细胞的增殖促进效果。用平均值士标准 偏差表示。* :P < 0. 05 (对不添加氨基酸混合物的条件进行学生t检验)[图7]氨基酸混合物对源自于人的HEL92.1. 7细胞的增殖促进效果。用平均值 士标准偏差表示。* :P < 0. 05 (对不添加氨基酸混合物的条件进行学生t检验)[图8]蛋氨酸浓度对707fl.细胞增殖的影响。用平均值士标准偏差表示。[图9]氨基酸[苏氨酸(Thr)、或甘氨酸(Gly)及谷氨酸(Glu)的混合物]对高 浓度蛋氨酸引起的707fl.细胞的增殖抑制活性的缓解效果。用平均值士标准偏差表示。
*:P < 0. 05 (对对照组进行学生t检验)[图10]在抗癌剂放线菌素D诱导贫血模型中蛋氨酸的有效性 试验期间中的外 周血血红蛋白量的变化。用平均值士标准误差表示。[图11]在抗癌剂放线菌素D诱导贫血模型中蛋氨酸的有效性 放线菌素D给予开始17日后的外周血血红蛋白量。用平均值士标准误差表示。不同的文字间存在显著差别， P<0. 05 (单因素方差分析和纽曼-科尔事后分析(one-way ANOVA with Newman-Keuls ‘ s post hocanalysis))[图12]蛋氨酸的浓度和707fl.细胞的增殖量。用平均值士标准偏差表示。统 计解析使用学生t检验进行分析。[图13]随着蛋氨酸的浓度不同，红细胞相关基因的表达量的变化。用平均值士 标准偏差表示。统计解析使用学生t检验进行分析。[图14]蛋氨酸经时的浓度变化对红细胞分化相关基因表达量的效果-1。最初的 3日内、随后的24小时以及再后的24小时培养使用的培养基分别为含有下列浓度的蛋氨酸 等的培养基。图中从左至右1 :30iiM —30iiM —30iiM2 :30iiM— 150iiM— 150iiM3 :30iiM— 150iiM —30iiM4 :30iiM— 150iiM—> 3iiM5 :30uM^ 150uM+l% DMSO — 150 u M+l % DMSO用平均值士标准偏差表示。* :P < 0. 05 (对2进行学生t检验)[图15]蛋氨酸经时的浓度变化对红细胞分化相关基因表达量的效果_2。最初的 3日内、随后的24小时以及再后的24小时培养使用的培养基分别为含有下列浓度蛋氨酸等 的培养基。图中从左至右1 :30iiM —30iiM —30iiM2 :30iiM— 150iiM— 150iiM3 :30iiM— 150iiM —30iiM4 :30iiM— 150iiM—> 3iiM5 :30uM^ 150 u M+l % DMSO — 150 u M+l % DMSO用平均值士标准偏差表示。* :P < 0. 05 (对2进行学生t检验)实施发明的最佳方式1.前言贫血仅仅只是一种症状，直接地说，是由于红细胞的生成减少、血红蛋白的合成低 下、红细胞的破坏亢进等导致的，但原因也各不相同。例如，红细胞的生成减少可列举有(甲)肾功能不全等导致的促红细胞生成素的 生成减少，(乙)再生抑制性贫血等导致的造血干细胞的异常，(丙)白血病或癌症的骨髓 等原因。此外，血红蛋白的合成减少，可列举有缺铁等原因，有必要根据各自的原因来进行 治疗。2.老年性贫血及干红细胞的增殖促进及从干红细胞向红血球的分化促进(干红 细胞的分化增殖促进)早发性贫血多数是因为铁的缺乏。因为老化而发生贫血的原因还不完全明确，但 是和早发性贫血相比较，可列举有伴随着骨髓的老化的造血干细胞减少、所产生的红细胞 寿命短缩、伴随着胃粘膜萎缩的营养吸收量减少等原因。在现阶段的内脏出血和营养不良 等以外的原因中，认为由于年龄增大而导致血液干细胞的机能低下，尤其是自身再生能力低下以及向红细胞的分化诱导受到抑制或处于降低状态。此夕卜，认为红细胞是从造血干细胞分化为红细胞系爆裂样生成单 位(BFU-E :burst-forming-unit-erythroid)、红细胞系集落生成单位(CFU-E colony-forming-unit-erythroid)、原成红细胞、成红细胞、网织红细胞、红细胞而生成的。本发明中所谓的干红细胞包括有造血干细胞、红细胞系爆裂样生成单 位(BFU-E :burst-forming-unit-erythroid)、红细胞系集落生成单位(CFU-E colony-forming-unit-erythroid)、原成红细胞及成红细胞等祖红细胞(erythroid progenitor赤血球前馬区細胞)。3.蛋氨酸(Met)和老年性贫血的预防或治疗、细胞老化抑制、干红细胞的分化和 /或增殖的促进、伴随着老化的干红细胞的分化和/或增殖机能的降低、抗癌剂的副作用引 起的骨髓机能的抑制而导致的贫血的预防和改善(下文中，使用3字母的代码来表示氨基 酸。)3-1.本发明者通过实验发现Met及含有Met的氨基酸组合物有维持和促进红细胞 的造血机能的效果，在改善老年性贫血上也有效果。此外还发现，由于Met及含有Met的氨基酸组合物的给予，回复确认为伴随着老化 的表达量低下或亢进的基因表达量，故本特定组成的氨基酸组合物可以作为抑制伴随着老 化的细胞机能低下和不调的药剂，换言之，其可以作为细胞老化预防剂。3-2.需要说明的是，还发现Met及含有Met的氨基酸组合物对小鼠脾脏来源的作 为类成红细胞的707fl.细胞的增殖有促进的效果。同时，对使用Met促进了增殖的作为类 成红细胞的707fl.细胞的基因表达进行解析，结果显示，和老龄小鼠的情况一样，血红素 合成酶和红细胞构造蛋白质的基因表达增多，主要在白细胞中表达的白介素(IL)等的基 因的表达减少，故推断向红细胞的分化得到了促进。并且在此时，和DNA(cyt0Sine-5)-甲 基转移酶1基因(Dnmtl)和组蛋白去乙酰化酶(Hdac)等的外遗传改变(印igenetic change - ” ^ ^ r A V >7 ^変化)相关的基因表达出现了变化，故推测在Met导致的 707fl.细胞的细胞增殖促进中，在细胞内伴随有外遗传改变。事实上，加入作为DNA(胞 嘧啶-5)-甲基转移酶1 (DNMT1)的抑制剂Zebularine(7 V >)进行作用后，Met对 707fl.细胞的增殖促进活性受到了抑制。3-3.干红细胞的增殖促进和/或分化促进、对以下原因导致的贫血的预防和改 善伴随着老化的干红细胞的增殖和/或分化机能的降低或抗癌剂的副作用导致的骨髓功 能抑制现已明确Met可以促进干红细胞的增殖，还可促进干红细胞向红细胞的分化。也就是说，通过Met的干红细胞的分化和/或促进作用，可以在包括老年人在内的 正常人的贫血、剧烈运动者的贫血、抗癌剂的副作用或肾脏的疾病导致的贫血等必须进行 造血的大范围人群中，可通过给予Met或含有Met的氨基酸组合物预防并改善贫血等造血 机能的低下。此外，作为引起贫血作为副作用的抗癌剂，虽然以所引起的副作用为贫血的任何 抗癌剂为对象，但特别列举抑制骨髓机能而导致贫血的抗癌剂。例如可列举，顺钼和卡钼等 钼类、阿霉素和表阿霉素等蒽环类、紫杉醇和多西紫杉醇等紫杉烷类抗癌剂。本发明者等在使用了培养细胞的系统中，在发现了如上所述的Met对类成红细胞
6的增殖及分化的效果后，研究了 Met的有效浓度范围及浓度的影响。首先，对类成红细胞 的增殖促进有效的Met的浓度范围为25 ii M 50000 u M，优选30 y M 5000 u M，更优选 50 ii M 3500 u M，最优选50 y M 200 y M的范围。需要说明的是，Met的浓度在一定范围 内，在高浓度的2mM以下的范围，相对于约200 yM附近，对细胞增殖的效果减弱，不知这是 何种机制。或者也有可能由于蛋氨酸浓度而存在细胞增殖机制不同的增殖作用。此外还发现，Met的浓度不足25 ii M时，对类成红细胞的增殖作用变弱，但是对类 成红细胞的分化促进作用呈优势。同时还发现通过在一过性的Met浓度上升后进一步再次减少Met的浓度，会导致 Met在低浓度的状态下呈优势的分化促进作用进一步增强。也就是说，若给予Met剧烈的浓 度变化，能更有效率地调控干红细胞的增殖和分化。故认为，人和动物在摄取Met时，如发 生一过性的造血组织中的Met浓度的上升，则可促进干红细胞的增殖。认为若进一步再次 减少Met的浓度的场合下则进行分化，因此原本只使原干红细胞增殖的量可导致红细胞的 大量生成，其结果是红细胞数量增加。从以往的文献可知，过多的Met的摄取会导致溶血性 贫血，认为这是因为在过剩的Met的摄取时，祖红细胞的增殖得到持续促进的同时分化受 到抑制，其结果是未分化的红细胞大量产生，从而导致溶血性贫血。 4.含有Met的氨基酸组合物(氨基酸制剂)本发明使用的氨基酸组合物包括含有含Met的氨基酸组成物作为有效成分的干 红细胞的分化促进剂和/或增值促进剂、贫血预防剂、贫血治疗剂、老年性贫血预防剂、老 年性贫血治疗剂或是细胞老化预防剂。本发明优选包括含有如下氨基酸组合物作为有效成分的干红细胞的分化促进剂 和/或增殖促进剂、老年性贫血预防剂、贫血治疗剂或是细胞老化预防剂，所述组合物含有 除Met外还添加了 Gly及Glu。本发明包括含有如下氨基酸组合物作为有效成分的干红细胞的分化促进剂和/ 或增殖促进剂、贫血预防剂、贫血治疗剂、老年性贫血预防剂、老年性贫血治疗剂或是细胞 老化预防剂，所述组合物进一步含有异亮氨酸(lie)、色氨酸(Trp)、缬氨酸(Val)、组氨酸 (His)、苯丙氨酸(Phe)、赖氨酸(Lys)和/或亮氨酸(Leu)作为前述氨基酸组合物中的任意 添加成分。具体而言，包括含有如下氨基酸组合物作为有效成分的干红细胞的分化促进剂和 /或增殖促进剂、贫血预防剂、贫血治疗剂、老年性贫血预防剂、老年性贫血治疗剂或是细胞 老化预防剂，所述氨基酸组合物包含Met、Gly、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、lie、Trp、Val、 His、Phe、Lys 禾口 / 或 Leu。构成本发明的氨基酸组合物的各氨基酸为D-体或L-体均可，优选L-体。此外， 游离氨基酸也可，药学上或食品上允许使用的盐也可。例如，各氨基酸盐、盐酸盐、乳酸盐均 可。作为本发明的氨基酸组合物，可示例如下。4-1.含有如下氨基酸组合物作为有效成分的干红细胞的分化促进剂和/或增殖 促进剂、贫血预防剂、贫血治疗剂、老年性贫血预防剂、老年性贫血治疗剂或是细胞老化预 防剂，所述组合物除Met外还添加了选自Gly、Glu、Ser及Thr的1种以上氨基酸。本发明包括含有如下氨基酸组合物作为有效成分的干红细胞的分化促进剂和/或增殖促进剂、贫血预防剂、贫血治疗剂、老年性贫血预防剂、老年性贫血治疗剂或是细胞 老化预防剂，所述组合物除Met外还添加了选自Gly、Glu、Ser及Thr的1种以上氨基酸。 在合用Gly及Glu时，显示出了对Met过多摄取情况下造成的溶血性贫血的抑制效果。需要说明的是，本发明包括包含如下氨基酸组合物的干红细胞的分化促进剂和/ 或增殖促进剂、贫血预防剂、贫血治疗剂、老年性贫血预防剂、老年性贫血治疗剂、或是细胞 老化预防剂，所述组合物在Met中添加有Gly及Glu。合用Gly和Glu并添加至Met中和单 独添加Gly相比，能够缓和高浓度的Met对细胞的抑制作用。4-2.以如下氨基酸组合物作为有效成分的干红细胞的分化促进剂和/或增殖促 进剂、老年性贫血预防剂、老年性贫血治疗剂或是细胞老化预防剂，所述组合物除Met外还 添加了选自Ile、Trp、Thr、Val、His、Phe、Lys及Leu的1种以上的氨基酸。优选例如包含如下氨基酸混合物的干红细胞的分化促进剂和/或增殖促进剂、贫 血预防剂、贫血治疗剂、老年性贫血预防剂或细胞老化预防剂，所述混合物选自(1)含有 lie、Thr、Val、His、Met、Lys 及 Leu 的氨基酸混合物，(2)含有 Trp、Thr、His、Phe、Met 及 Lys的氨基酸混合物，(3)含有lie、Trp、Thr、Val、Phe、Met及Leu的氨基酸混合物。5.本发明的组合物的使用形态有关本发明的氨基酸组合物的使用形态并无特别限定，可以作为饮食用、营养辅 助饮食用，也可以作为医疗用。在作为食用的情况下，本氨基酸组合物可以直接食用，也可 在各种食品中作为添加物使用。此外，本发明的组合物也可在水中溶解后作为饮料饮用，在 这种情况下，也可以再添加其它的营养成分，例如水溶性维生素、牛磺酸等。此外，为了改善 适口性，可以加入氯化钠等盐类、枸橼酸等酸类和/或其它的适当的口味后作为饮料饮用。 出于稳定性的原因，也可添加PH调节剂、螯合剂等。在医疗用的情况下，可以通过口服给予、经管给予(経管投与)、直肠给予、注射、 输液给予等一般的给予途径来进行使用。作为口服给予，可以为上述组合物自身或为与药 学上允许的载体、赋形剂、稀释剂等混合而成的散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、含片剂、糖浆剂 等。此外，作为注射剂，可以使用添加有适当的缓冲剂、等渗剂等并在灭菌蒸馏水中溶解的 注射剂。优选口服给予。因为本发明的Met及含有Met的氨基酸组合物非常安全，故设定其给药量在非 常广的范围内，需要说明的是，给予方法依照使用目的不用也各不相同。例如，Met含量为 0. 的溶液在1日1ml 600ml的范围内可以口服给予。此外，例如，Met中添加 Gly和Glu作为组合物使用时，例如，Met Gly Glu的比率可以为10 1 10 1 10来使用。且将本发明的组合物和铁、叶酸、维生素B12等合用可期待更好的效果。此外，具体而言，可以列举例如10mg/50kg个体/天 100g/50kg个体/天左右 的范围，优选100mg/50kg个体/天 10g/50kg个体/天左右的范围，更优选130mg/50kg 个体/天左右的给药量。对干红细胞的增殖促进有效的Met的浓度范围可列举25 yM 50000 u M、优选 30 ii M 5000 u M、更优选 50 u M ~ 3500 u M、最优选 50 u M ~ 200 u M 的范 围。作为以成红细胞向红细胞分化为主的情况下的有效Met浓度范围可列举不足25 yM、优 选0. OliiM 2011] 、更优选0. liiM 1011] 、最优选0. liiM 5yM的范围。6.干红细胞的培养6-1.细胞培养添加剂
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本发明还包括含有Met作为有效成分的用于干红细胞的增殖促进或/和分化促进 的细胞培养培养基添加剂。 本发明中的以Met为有效成分的干红细胞的增殖促进剂和/或分化促进剂可以添 加入干红细胞，即红细胞系爆裂样生成单位(BFU-E :burst-forming-unit-erythroid)、红 细胞系集落生成单位(CFU-E :colony-forming-unit-erythroid)、原成红细胞及成红细胞 等祖红细胞的细胞培养培养基中来使用。这些干红细胞用的细胞培养培养基可以是任何培 养基，例如，市场上可购买到的单能性祖红细胞(单分化能赤血球前駆細胞)用培养基等。作为向前述培养基中添加的浓度，首先，作为对干红细胞的增殖促进有效的Met 的浓度范围，可列举25 ii M 50000 u M、优选30 ii M 5000 u M、更优选50 u M ~ 3500 u M、 最优选50 y M 200 y M的范围。此外，作为对干红细胞的分化促进有效的Met浓度范围， 可列举不足25 u M、优选0. 01 ii M 20 ii M、更优选0. 1 u M ~ 10 u M、最优选0. 1 u M ~ 5 u M 的范围。6-2.干红细胞的培养方法本发明含有包括以下工序的干红细胞的培养方法(1)使用含有高浓度Met的培 养基来使干红细胞增殖的工序，(2)使用含有低浓度Met的培养基来使干红细胞分化的工 序。而且，本发明含有包括以下工序的干红细胞的培养方法(1)使用含有高浓度的Met培 养基来使干红细胞增殖的工序，及(2)通过再次使用含有低浓度Met的培养基来使在前述 (1)工序中增殖的干红细胞分化的工序，从而进一步增强分化促进作用的工序。或本发明包 括含有如下工序的干红细胞的培养方法所述工序通过组合使用含有低浓度和高浓度Met 的培养基来有效率地控制干红细胞的增殖和分化。作为前述干红细胞，如前所述，包括造血干细胞、红细胞系爆裂样生成单 位(BFU-E :burst-forming-unit-erythroid)、红细胞系集落生成单位(CFU-E colony-forming-unit-erythroid)、原成红细胞及成红细胞等祖红细胞。作为前述(1)工序中含有的高浓度Met的浓度，可列举25iiM 50000iiM、优选 3011] 500011]\1、更优选5011]\1 350011]\1、最优选5011]\1 20011]\1的范围。此外，作为前 述⑵工序中含有的低浓度Met的浓度，可列举不足25 iiM、优选0.01 iiM 20 iiM、更优选 (S 0. lyM 1011] 、最优选0. liiM 5iiM 的范围。实施例1氨基酸的摄取导致老龄小鼠的外周血血红蛋白量的增加将ICR雄性小鼠在自由饮水、自由摄食MF饲料(Oriental酵母)的条件下饲育直 至20月龄，依照体重将其分为3组(老龄小鼠)。此外，使用5周龄的ICR雄性小鼠(幼龄 小鼠)作为对照。试验饲料如表1所示，使用如下饲料以AIN-93M精制饲料(酪蛋白含量 14% )为基本饲料，并将相当于此基本饲料所含有的14%酪蛋白的2%的量置换为氨基酸 组合物。试验期间自由摄食饲料。在氨基酸给予组中，设计了 2组，如表2所示，给予混合了 16种氨基酸的氨基酸混 合1(AAM1)组(老龄小鼠(AAM1))和给予以必需氨基酸为主的氨基酸混合2 (AAM2)组(老 龄小鼠(AAM2))。在作为对照的AIN-93M精制饲料给予组(酪蛋白给予组)设置有幼龄小 鼠和老龄小鼠(酪蛋白)各1组。[表1] 大豆油4.0000%同左 纤维素粉末 5.0000% 同左 ΑΙΝ-93Μ矿物质混合 3.5000% 同左 ΑΙΝ-93维生素混合 1.0000% 同左 酒石酸氢胆碱 0.2500% 同左 叔丁基对二笨酚 0.0008% 同左 氛基酸混合物 0.0000% 2.0000%[表 2]氨基酸混合物组成 从老龄小鼠及幼龄小鼠的各组的尾静脉中采集血液，使用血红蛋白B-测试 和光 (和光纯药)测定外周血的血红蛋白量。此时，幼龄小鼠为5周龄，各组老龄小鼠均为20月 龄。且幼龄小鼠的η = 9，老龄小鼠的η= 15。统计解析使用学生t检验，对幼龄小鼠进行 显著性检验。结果如图1所示。老龄小鼠的括号内的AMMl表示准备给予包含17种氨基酸的混 合物的组，AMM2表示准备给予12种氨基酸的混合物的组(氨基酸的种类参考表1)。在给 予前，和幼龄小鼠相比较，老龄小鼠的血红蛋白量出现了显著的降低，造血机能也有显著的 降低。随后，让各组的老龄小鼠在2个月内摄食表1所示的氨基酸混合AAMl或是AAM2。 随后，对尾静脉进行采血，使用同样的方法测定外周血中的血红蛋白量。此时和前述相同， 幼龄小鼠的η = 9，各组老龄小鼠均是η = 15。统计解析使用学生t检验，对酪蛋白给予组 的老龄小鼠进行显著性检验。结果如图2所示。未摄食氨基酸的老龄小鼠中并未发现血红蛋白量的回复，但摄 食氨基酸的老龄小鼠的外周血血红蛋白量则回复至和幼龄小鼠相同的水平。这显示，口服 氨基酸混合物会促进红细胞造血机能，并能有效地提高伴随老化而降低的外周血血红蛋白量。实施例2氨基酸混合物对小鼠类成红细胞(707Π.细胞)的细胞增殖的促进效果
为了确定在实施例1中由于年龄增大而降低的外周血血红蛋白量的增加是氨基酸的作用，使用707f 1.细胞(购买ECACC (欧洲细胞株、微生物保藏中心European Collection of Cell Cultures)标准株的细胞)进行研究。707fl.细胞是可以分化为红 细胞的小鼠脾脏来源的类成红细胞。此707fl.细胞使用在RPMI1640培养基(SIGMA)中 添加胎牛血清以使其最终浓度为5%而获得的培养基(含5%胎牛血清RPMI1640培养基) 进行培养。测定开始时，在96孔微量培养板中以约IX IO4细胞/孔来播种细胞，并在其中 加入各种浓度(0.5% 0.001%左右)的氨基酸混合物。此时，调整氨基酸混合物的pH至 中性附近进行添加。在这种状态下将细胞培养3日后，使用WST-I测定法来测定细胞的增 殖。即，在各孔(well)中加入10 μ 1的Premix WST-I试剂(Takarabio)，在二氧化碳培养
箱中孵育1 4小时，则活细胞线粒体中的脱氢酶导致的WST-I分解生成的甲臍量可以在 A450nm(参比A655nm)下进行测定。首先对作为以必需氨基酸为主的12种氨基酸的混合物的AAM2及作为9种必需氨 基酸的混合物的AAM3进行研究(氨基酸的种类等参照表2)。结果如图3所示。观察到了 AAM2及AAM3两者具有促进707Π.细胞增殖的效果。 上述的结果和实施例1中使用老龄小鼠得到的结果一致，显示该使用707fl.细胞的评价系 统对于氨基酸对干红细胞增殖促进效果的推测是有效的。实施例3确定作为对干红细胞的增殖促进活性的主体的氨基酸将从在实施例2中确认对类成红细胞有增殖促进活性的必需氨基酸混合物AAM3 中除去2至3种氨基酸得到的混合物溶解入作为细胞培养用培养基的含5%胎牛血清 RPMI1640培养基中。此处，除去氨基酸的组合为，支链氨基酸(Val、Leu、lie)、碱性氨基酸 (His、Lys)、芳族氨基酸(Trp、Phe)、其它氨基酸(Met、Thr)。而且，此时使每种氨基酸的 浓度和作为基础的AAM3的溶液中含有的浓度相等。将各氨基酸溶液以2倍稀释的系 列分别注入96孔微量培养板中，每孔50 μ 1。向其中加入适当稀释的细胞(约IX IO4细 胞)50μ 1，在二氧化碳培养箱中培养3天。随后在各孔(well)中加入10 μ 1的PremixWST-I 试剂，在二氧化碳培养箱中孵育1 4小时，并在A450nm(参比A655nm)下进行测定来确认 细胞增殖。结果如图4所示。在AAM3和大多数从AAM3中除去各氨基酸的混合物中，在浓度为 0. 004% 0. 008%的范围内均确认了对707f 1.细胞的增殖促进活性。然而，在除去Met和 Thr时，却并未观察到细胞增殖促进活性，这显示对类成红细胞的增殖促进活性的主体很有 可能是Met或Thr。在此，使用和上述同样的方法进一步研究了 Met和Thr对类成红细胞的增殖促进 活性。结果如图5所示。确认了 Met对类成红细胞的增殖促进活性，但是却并未确认到 Thr的增殖促进活性，这显示增殖促进活性大部分依赖于Met。此外，推测Met对类成红细 胞的增殖促进活性的最适浓度为约1 5yg/ml。一方面，在0.005% (W/V)附近观察到了 AAM3对类成红细胞的增殖促进活性，此时含有的Met量为整体的3. 3% (W/V) = 1.65 μ g/ ml，和这次的结果基本一致。在此，还有报告称若Met过度摄食，则会引起溶血性贫血的副作用。此外，也有报告称这种现象可由Gly、Ser、Thr等氨基酸抑制。从上述的现象和Met对类成红细胞的细胞 增殖促进效果可以推断在Met过度摄取的情况下，过度地促进造血组织中干红细胞的增 殖，产生不完全的红细胞从而促进溶血并诱导贫血。此外，认为通过Gly等氨基酸可以抑制由于Met过度摄食诱导的溶血性贫血的理 由是作为生物体成分的材料必要的氨基酸的添加作为在造血上的辅助要素而有效。也就 是说，认为以下物质在Met的细胞增殖促进诱导中的添加是造血的辅助要件作为红细胞 中必需的谷胱甘肽、作为红细胞中血红素的材料的生物体成分Gly和琥珀酰CoA、以及作为 琥珀酰CoA的材料的生物体成分支链氨基酸(BCAA)和作为Met、Gly的合成材料的SerJt 为涉及枸橼酸循环的生物体成分的材料的氨基酸(这是由于琥珀酰CoA是从枸橼酸循环中 供给的)。认为氨基酸的参与不仅是作为用于红细胞合成的生物体成分的材料，而且例如 Gly和琥珀酰CoA在量上平衡地摄取也具有效果。此外，Gly也是细胞分裂中必要核酸的合 成、谷胱甘肽和肌酸的生物合成的材料。实施例4 氨基酸对源自于人的血细胞系细胞的增殖促进作用对人细胞也同样地研究了 Met的细胞增殖促进的效果。人细胞选用源自于慢性骨 髓性白血病(红白血病)的K562细胞和源自于成红细胞性白血病的HEL92. 1.7细胞(两 种均是购买ECACC(EuropeanCollection of Cell Cultures)标准株的细胞。)。无论哪 种细胞，均有报告称可分化为红细胞。测定开始时，在96孔微量培养板中以约IX IO4细胞 /孔来播种细胞，并在其中加入各种浓度(0.5% 0.008%范围)的氨基酸混合物。此时， 调整氨基酸混合物的PH至中性附近之后添加。在这种状态下将细胞培养3 4日后，使用 WST-I测定法来确认细胞的增殖。结果如图6和图7所示。和707fl.细胞同样，确认了氨基酸混合物对K562细胞 和HEL92. 1. 7细胞也有增殖促进效果。而且，作为必需氨基酸混合物的AAM3和AAM2相比， 确认了对细胞增殖更高的效果。从上述的研究可知，人和小鼠一样，必需氨基酸对红细胞造 血显示出了促进的效果。实施例5对707fl.细胞增殖必需的Met量研究707fl.细胞增殖所必需的蛋氨酸的浓度的影响。在从作为基本培养基的RPMI1640中除去蛋氨酸的培养基(不含Met的RPMI1640 培养基)(Funakoshi)中以5%终浓度加入胎牛血清(含5%胎牛血清不含Met的RPMI1640 培养基)。此外，还用含5%胎牛血清不含Met的RPMI1640培养基配制IOOmM Met溶液。 在含5%胎牛血清不含Met的RPMI1640培养基中制备上述Met溶液的2倍稀释系列，以 50μ1/孔分别注入96孔微量培养板中。并将707fl.细胞用含5%胎牛血清不含Met的 RPMI1640培养基进行浑悬，以使其浓度为2X IO5细胞/ml，并注入加入了 50 μ 1/孔的Met 稀释系列的孔中。在二氧化碳培养箱中培养3天后，使用WST-I测定法来确定细胞增殖的 情况。结果如图8所示。Met的浓度为25μΜ 50000μΜ时确认了对707fl.细胞的细 胞增殖促进效果，而在50 μ M 200 μ M的浓度中确认了最高的细胞增殖促进效果。实施例6
缓和高浓度Met导致的细胞增殖抑制效果的氨基酸的研究如实施例3所示，高浓度Met与最适于细胞增殖的Met浓度相比较，抑制707Π. 细胞的增殖。因此，为了标识缓和这种抑制作用，进行了缓和高浓度Met导致的增殖抑制活 性的氨基酸的研究。作为供试验的各种氨基酸，使用(甲)Thr或(乙)Gly和Glu，分别和 Met以相同重量混合来制备。将各氨基酸混合物溶解于作为细胞培养用培养基的含5%胎 牛血清的RPMI1640培养基，并将其稀释系列分别以50 μ1注入96孔微量培养板中。在其中 加入50 μ 1适当稀释了的细胞(大约5 X IO4细胞/50 μ 1)，在二氧化碳培养箱内培养3天。 随后，在各孔中加入10 μ 1的WST-I试剂，继续孵育2 4小时，在A450nm(参比A655nm) 下进行测定，并比较细胞增殖。结果如图9所示。Met在超过12. 5μ g/ml的浓度时，检测出细胞增殖抑制作用。 Thr和Met以相同浓度共存时，可以在12. 5 μ g/ml以上、不足25 μ g/ml的范围内延缓抑制 作用。与此相对，Gly及Glu分别和Met以相同浓度共存时，确认对50 μ g/ml以上的Met所 产生的增殖抑制效果的抑制，显示了比Thr更好的效果。实施例7抗癌药放线菌素D诱导贫血模型中Met的有效性的研究[方法]对购入的小鼠进行驯化10日。在驯化的第7日从尾静脉采血10μ 1，测定血红蛋 白(Hb)量。并测定体重，依照Hb量和体重进行分组。分组后，对小鼠进行2次连续5日的 放线菌素D的腹腔内给予，每次之间间隔2日。给药量为小鼠腹腔内连续给予5日的LD50 的一半量，即0. 07mg/kg体重/天。且放线菌素D用生理盐水溶解后，以100 μ 1/个体进行 给予。并将不含有放线菌素D的生理盐水按照100 μ 1/个体的给药量进行腹腔内给予，作 为阴性对照组。从开始给予放线菌素D时直至实验结束时，强制口服给予氨基酸水溶液或灭菌 水。Met水溶液的浓度为0.2%、l%、5%的水溶液。用灭菌水作为阴性对照。此外，用 Thr水溶液作为与造血效果相关的氨基酸水溶液的阴性对照。无论是氨基酸水溶液还是灭 菌水，给药量均为200 μ 1/个体/天。试验期间，以适当的频率对尾静脉进行10 μ 1的采血，并测定Hb量。上述试验结束后，小鼠在麻醉下进行全采血处死，并采集脾脏和骨髓组织进行基 因分析。需说明的是，组的构成(各组10只)如下所述。第1组生理盐水腹腔内给予、灭菌水口服给予组。第2组放线菌素D (0. 07mg/kg体重/天)腹腔内给予、灭菌水口服给予组。第3组放线菌素D(0. 07mg/kg体重/天)腹腔内给予、Thr水溶液口服给予组。第4组放线菌素D(0. 07mg/kg体重/天)腹腔内给予、0. 2% Met水溶液口服给予组。第5组放线菌素D(0. 07mg/kg体重/天)腹腔内给予、1. 0% Met水溶液口服给予组。第6组放线菌素D(0. 07mg/kg体重/天)腹腔内给予、5. 0% Met水溶液口服给予组。[结果]试验期间中测定的外周血Hb量的变动结果如图10所示。给予开始17日后Hb量降低的最大。给予开始17日后的外周血Hb量如图11所示。此时，确认了 Thr水溶液 给予组和给予灭菌水组之间无显著差异。与此相对，确认在0. 2% Met水溶液给予组中的 Hb量上升倾向，而且在和5% Met水溶液给予组中存在显著上升。通过本试验可再次确认Met对伴随骨髓机能抑制的贫血具有抑制或改善效果。为 了抑制或改善伴随骨髓机能抑制的贫血，现已明确Met浓度为的口服给予具有充分的 效果，但Met浓度为0. 2%时也可期待效果。Met的给药量在换算为人的情况下，按照 体表面积换算约为130mg/50kg个体/天。这对于人来说是可以完全给予的量。现已确认 了 Met的红细胞造血促进效果，不仅在老龄小鼠中可以恢复降低的外周血Hb量，对抗癌剂 的副作用导致的贫血也有效果。实施例8对给予Met的放线菌素D诱导贫血小鼠的脾脏和骨髓的基因表达量的分析[方法]采集供于实施例7的小鼠脾脏和骨髓组织，使用组织的约10倍体积的Ambion会 社生产的RNA Later试剂浸泡，在4°C下静置一夜。将处理后的组织保存于_80°C下直至提 取RNA。从保存组织中提取和纯化RNA是使用qiagen公司的RNeasy试剂盒并按照附带的 使用规程来进行的。使用Agilent公司的生物分析仪对纯化后的RNA的品质进行确认。并 且采用Affymetrix会社的GeneChip、小鼠430_2. 0列阵并使用经纯化的RNA来进行DNA微 列阵分析。如下研究对通过给予放线菌素D来诱导贫血的小鼠给予Met的效果(供于 实施例7第5组的小鼠)比较上述小鼠的基因表达量和通过放线菌素D诱导贫血并给予 灭菌水的作为氨基酸给予组之对照的小鼠(供于实施例7第2组的小鼠)的基因表达量。[结果]由Met给予导致的表达上升的红细胞相关基因如表3所示。需说明的是，相对 于放线菌素D诱导贫血并给予灭菌水的小鼠的各基因表达量的相对表达量在表3中用数值表不。与给予灭菌水的小鼠相比，作为小鼠的红细胞造血组织的脾脏和骨髓两者中的红 细胞相关基因的大多数均上升。此结果显示，Met的给予导致红细胞的分化得到促进。此 夕卜，表达上升的基因牵涉从骨髓干细胞至CFU-E中表达的c-kit (别名CD117跨膜型酪氨酸 激酶，表达于集落形成细胞等的造血祖细胞中，但并不表达于B细胞系的祖细胞中。CD117 和配体的相互作用对造血很重要)及其配体(干细胞因子也称SCF)乃至在CFU-E之后的 分化阶段中表达量增加的铁传递蛋白受体(CD71)、血红素合成酶和红细胞膜蛋白质。因此， Met的效果存在于决定红细胞分化的从单能干细胞到红细胞这一广泛范围内。[表 3]Met给予的放线菌素D诱导贫血的小鼠中上升的红细胞相关基因 实施例9Met的浓度和类成红细胞的分化及增殖促进效果之间的关系小鼠或人血浆中的Met浓度约为30 μ M左右。此外，在作为主要造血组织的骨髓 中，其组织液中的Met浓度在检测限之下(<3μΜ)。故认为，与体外的细胞培养条件下相 比，通常生物体的造血组织中的细胞外Met浓度小得多。且从前面的图8可以明确，Met在25 μ M 50000 μ M范围内对类成红细胞显示出增殖促进效果。因此，对以下两种情况下的707fl.细胞的基因表达进行比较研究存在对类成红 细胞显示增殖促进效果的150 μ M浓度的Met的情况和与骨髓液同样地Met基本不存在的 情况。[方法] 在不含Met的RPMI1640培养基中加入最终浓度为5%浓度的胎牛血清来配制培养 基(含5%胎牛血清不含Met的RPMI1640培养基)。并配制在上述培养基中添加了 Met的 培养基，以使Met呈各种浓度(含各浓度Met含胎牛血清的RPMI1640培养基)。将707fl.细胞在含30 μ M Met含5%胎牛血清的RPMI1640培养基中培养3日。 将培养后细胞分为2份来收集，一份使用含5%胎牛血清不含Met的RPMI1640培养基进行 再混悬，使其浓度为约5 X IO5细胞/ml。此处，因为含胎牛血清不含Met的RPMI1640培养基 加入了 5%的胎牛血清，故含有约1 3μ M左右的源自于血清的Met。另一份用含150 μ M 的Met含5%胎牛血清的RPMI1640培养基进行再混悬，使其浓度为约5X IO5细胞/ml。而 后将各条件下的细胞分为3份，分别培养24小时后，取细胞培养液的一部分，用WST-I测定 法来确定细胞增殖的程度。[结果]和含5%胎牛血清不含Met的RPMI1640培养基中培养的细胞(> 3 μ M的Met)相 比较，含150 μ M Met含5%胎牛血清的RPMI1640培养基中培养的细胞(150 μ M Met)的细 胞数呈现显著的增加(图12)。而后从这些细胞中提取RNA，使用实时PCR(聚合酶链式反 应)来对红细胞相关标志基因的表达量进行比较研究。作为红细胞分化标志，测定血型糖 蛋白A和亚铁螯合酶的基因表达量，所述血型糖蛋白A是在红细胞的细胞膜状内丰富且特 异性存在的蛋白质，所述亚铁螯合酶是血红素生物合成系酶中的限速酶的一种。而且，此时 使用β肌动蛋白作为对照基因。其结果是，和含150μΜ Met含5%胎牛血清的RPMI1640 培养基中培养的细胞(150 μ M Met)相比较，含5%胎牛血清不含Met的RPMI1640培养基中 培养的细胞(> 3μΜ Met)的两基因的表达显著升高(图13)。故结果显示，在比通常浓度 高的Met存在的情况下，较之干红细胞的分化，更促进干红细胞的增殖；而与此相反，在浓 度低的Met存在的情况下，较之增殖，更促进分化。根据上述结果可知，干红细胞内存在感 受Met浓度的感受机能，能够根据细胞外Met浓度巧妙地控制增殖和分化。实施例10随着Met浓度变化的类成红细胞的分化和增殖促进效果之间的关系[方法]向含5%胎牛血清不含Met的RPMI1640培养基中添加Met，使其浓度为150 μ M，并 继续向其中添加终浓度为的二甲基亚砜(DMSO)来制备培养基(含150μΜ Met含5% 胎牛血清含DMSO的RPMI1640培养基)。使用含30 μ M Met含5%胎牛血清的RPMI1640培养基(30 μ Μ)将707fl.细胞分 为第1 5的5组，培养3天。随后，将第1组再次交换至含30 μ M Met含5%胎牛血清的 RPMI1640培养基(30 μ M)，分别将第2-4组分别交换至含150 μ M Met含5%胎牛血清的 RPMI1640培养基(150 μ M)，将第5组交换至含50 μ M Met含5%胎牛血清含1 % DMSO的 RPMI1640 培养基(150 μ M+1% DMS0)，并培养 24 小时。
随后分别将第1及第3组交换至含30 μ M Met含5%胎牛血清的RPMI1640培养 基(30 μ Μ)，将第2组交换至含150 μ M Met含5%胎牛血清的RPMI1640培养基(150 μ Μ)， 将第4组交换至含5%胎牛血清不含Met的RPMI1640培养基(> 3 μ M)，将第5组交换至 含150 μ M的Met含5%胎牛血清含DMSO的RPMI1640培养基(150 μ M+1% DMS0)，并培 养24小时。此处，DMSO是作为分化相关的阳性对照而加入的。培养结束后，从各组细 胞中提取RNA，使用实时PCR对作为红细胞相关标志基因的血型糖蛋白A及亚铁螯合酶的基 因表达量进行比较研究。此时，作为对照基因，使用β肌动蛋白。[结果]
和在Met浓度为30 μ M下继续培养的细胞相比较，在Met浓度为150 μ M下培养的 细胞中红细胞分化相关基因的表达减少，故认为较之分化，更促进增殖。与此相对，和继续 使用30 μ M Met培养基或由含有150 μ M Met的培养基交换至含有30 μ M Met培养基的情 况相比，若使Met的浓度降低至不足3 μ Μ,则分化相关基因的表达上升；和在1 % DMSO存在 下培养的情况相比，若使Met的浓度降低至不足3 μ Μ,则分化相关基因的表达达到基本相 同的水平(图14、图15)。这些结果显示，由于Met的浓度发生了剧烈变化，在作为类成红 细胞的707fl.细胞中，高效地进行了从细胞增殖向分化的诱导。因此，Met可以高效地调 控干红细胞的增殖和分化。产业上的利用可能性本发明提供了老年性贫血预防剂及老年性贫血治疗剂，在医药品制造业和食品制 造业上有使用的可能性。将本说明书中引用的全部出版物、专利或专利申请直接作为参考来引入本说明 书。
权利要求
干红细胞的分化促进剂和/或增殖促进剂，其含有Met作为有效成分。
2.权利要求1的干红细胞的分化促进剂和/或增殖促进剂，其进一步含有Glu及Gly。
3.权利要求1的干红细胞的分化促进剂和/或增殖促进剂，其进一步含有选自以下 (1) (3)的氨基酸混合物(1)lie、Thr、Val.His, Lys 及 Leu(2)Trp、Thr、His、Phe 及 Lys(3)lie、Trp、Thr、Val、Phe 及 Leu0
4.饮食品，其含有权利要求1-3中任一项的干红细胞的分化促进剂和/或增殖促进剂。
5.贫血预防剂或贫血治疗剂，其含有权利要求1-3中任一项的干红细胞的分化促进剂 和/或增殖促进剂。
6.老年性贫血预防剂或老年性贫血治疗剂，其含有权利要求1-3中任一项的干红细胞 的分化促进剂和/或增殖促进剂。
7.细胞老化预防剂，其含有Met作为有效成分。
8.权利要求7的细胞老化预防剂，其进一步含有Glu及Gly。
9.权利要求7的细胞老化预防剂，其进一步含有选自以下⑴ (3)的氨基酸混合物(1)lie、Thr、Val.His, Lys 及 Leu(2)Trp、Thr、His、Phe 及 Lys(3)lie、Trp、Thr、Val、Phe 及 Leu0
10.饮食品，其含有权利要求7-9中任一项的细胞老化预防剂。
全文摘要
从伴随着老化而频现的贫血出发，以开发对老年性贫血的预防有效的治疗剂为第1课题。并且从今后的老龄化发展出发，以提供副作用低、价廉有效的抗老化剂为第2课题。此外，以提供对骨髓机能抑制为原因的贫血、具体而言对作为抗癌剂给予而导致的副作用的贫血有效的治疗剂为第3课题。本发明者首次观察到，含有蛋氨酸(Met)的单体或含有选自蛋氨酸(Met)和甘氨酸(Gly)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)的一种以上的氨基酸组合物，此外，在含有选自(1)Ile、Trp、Thr、Val、His、Phe、Lys及Leu，(2)Ile、Thr、Val、His、Lys及Leu，(3)Trp、Thr、His、Phe及Lys，(3)Ile、Trp、Thr、Val、Phe及Leu的氨基酸混合物作为有效成分的药剂具有对老年性贫血具有改善回复能力等，从而提供老年性贫血预防剂、老年性贫血治疗剂及细胞老化预防剂。
文档编号A61K31/405GK101868230SQ20088011759
公开日2010年10月20日 申请日期2008年11月4日 优先权日2007年11月20日
发明者浅见幸夫 申请人:明治乳业株式会社