用于诊断和治疗癌症的vhz的利记博彩app

专利名称：：用于诊断和治疗癌症的vhz的利记博彩app
技术领域：
：本发明涉及医学、细胞生物学、分子生物学和遗传学领域。本发明涉及医学领域。具体地，它涉及疾病(诸如乳腺癌)的治疗和诊断，以及进行此类应用的组合物。
背景技术：
：VHZ是与人PRL-PTP共享约28%的氨基酸序列同一性的磷酸酶。先前报告了，VHZ在许多组织中表达，并且位于胞质溶胶和核仁中(Alonso等，2004a)。然而，VHZ的作用很大程度上是未知的；尽管它与蛙、鱼、苍蝇、和古细菌(Archaea)中的直向同系物(orthologue)在进化过程中是保守的。VHZ以及VHR属于VH1样PTP的不同亚组(Alonso等，2004b)。已经报告了，VHR具有调控细胞周期行进的功能(Rahmouni等，2006)。在西方世界和亚洲的发达国家，乳腺癌是女性中癌症相关死亡的第二位主要原因(Polyak，2001)。乳腺癌位于新加坡女性癌症目录的顶部，其中每年诊断700-800例新病例(SingaporeCancerRegistryReport,2000)在美国，每年180，000名女性被诊断为乳腺癌的新病例(Polyak，2001)。尽管有更好的诊断和例行的筛选，但1/4左右的病例仍会死于她们的疾病。因而，需要改良的乳腺癌检测和治疗。发明概述依照本发明的第一方面，我们提供了供在个体中治疗、预防或减轻癌症诸如乳腺癌的方法中使用的VHZ。依照本发明的第二方面，提供了一种用于治疗、预防或减轻癌症的抗VHZ齐IJ。所述癌症可以包括乳腺癌。所述癌症可以包括侵入性或转移性癌症诸如侵入性导管癌(InvasiveDuctalCarcinoma,IDC)。抗VHZ剂可以能够下调以GenBank登录号NM_017823或NP_060293显示的VHZ序列，或者与该序列具有至少90%序列同一性的序列的表达、量或活性的任意组合。所述抗VHZ剂可以包括抗VHZ抗体。所述抗VHZ抗体可以包括针对与人VHZ的氨基酸残基(126-140)对应的RRLRPGSIETYEQEK生成的抗肽抗体。所述抗VHZ抗体可以包括鸡抗人VHZ抗体(产品目录编号LS-C32281，氨基酸35至90，LS-C42458，LS-A6806和LS-A6803，LS-C32281，LifeSpanInc,Seattle,Washington,USA)、家兔抗人VHZ抗体(产品目录编号DS-PB-00676，RayBiotechInc,Norcross,Georgia,USA)、鸡抗人VHZ抗体(产品目录编号XW-7857，ProSciIncorporated,Poway,California,USA)、家兔抗人VHZ抗体(产品目录编号F4560和D9840-66A，UnitedStatesBiological,Swampscott,Massachusetts,USA)、鸡抗人VHZ抗体(产品目录编号D9840-66，UnitedStatesBiological,Swampscott,Massachusetts,USA)、家兔抗人VHZ抗体(产品目录编号AHP1142，AdBSerotec,Oxford,UnitedKingdom)、家兔抗人VHZ抗体(产品目录编号NB110-40452，NovusBiologicals,Littleton,Colorado,USA)、鸡抗人VHZ抗体(产品目录编号NB100-75328，NovusBiologicals,Littleton,Colorado,USA)。所述抗VHZ剂可以能够通过RNA干扰来下调VHZ。它可以包含小干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)或嵌合RNAi诸如DUSP23预先设计嵌合RNAi(产品目录编号H00054935-R01,NovusBiologicals,Littleton,Colorado,USA)。依照本发明的第三方面，我们提供了一种用于检测个体中的乳腺癌或个体对乳腺癌的易感性的试剂盒。所述试剂盒可以包含用于检测所述个体或自他或她采集的样品中的VHZ表达的手段。所述用于检测的手段可以选自下组VHZ多核苷酸或其片段；VHZ核酸或其片段的互补核苷酸序列；VHZ多肽或其片段，或如上文所列的抗VHZ抗体或抗VHZ剂，和任选地，使用说明书。它可以进一步包含用于治疗、预防或减轻乳腺癌的治疗药物，诸如包含他莫昔芬(Tamoxifen)或赫赛汀(Here印tin)。作为本发明的第四方面，提供了一种检测癌细胞诸如乳腺癌细胞的方法。所述癌细胞可以包括侵入性或转移性癌细胞诸如侵入性导管癌(IDC)。所述方法可以包括检测所述细胞中VHZ的表达、量或活性的调控。所述调控可以包括上调。可以比较所述VHZ表达与已知为非癌性的对照细胞中的VHZ的表达、量或活性。所述方法可以包括检测VHZ核酸。这可以是依靠包含如下核酸的至少一部分的探针，所述核酸具有以GenBank登录号NM_017823或NP_060293显示的序列或与此类序列具有至少90%序列同一性的序列，或者其中所述方法包括检测VHZ多肽，诸如依靠权利要求2中所列的抗VHZ抗体。所述方法可以进一步包括组织学分级。所述组织学分级可以依靠Elston-Ellis改良的Scarff，Bloom,Richardson分级系统(Nottingham分级系统(NGS))。依照本发明的第五方面，我们提供了一种测定细胞的增殖状态或者测定细胞会变为侵入性或攻击性的可能性的方法。所述方法包括检测所述细胞中的VHZ的表达、量或活性的调控。在第六方面，本发明提供了一种预测患有癌症的个体的存活率的方法。该方法包括检测所述个体的细胞中的VHZ表达调控。在本发明的第七方面，提供了一种为患有癌症的个体选择疗法的方法，该方法包括检测所述个体的细胞中的VHZ表达调控，基于所述癌症的攻击性来选择合适的疗法。所述疗法可以包含如上文所描述的抗VHZ剂。依照本发明的第八方面，我们提供了一种测定特定疗法在患有癌症的个体中成功的可能性的方法。该方法包括比较所述疗法与通过如上文所列的方法确定的疗法。这些方法之每一种可以进一步包括本发明的上文第一至第三方面之任一项中所列的特征。依照本发明的第九方面，我们提供了一种操作癌细胞诸如乳腺癌细胞的方法。所述癌细胞可以包括侵入性或转移性癌细胞诸如侵入性导管癌(IDC)。该方法可以包括调控所述细胞中的VHZ表达、量或活性。所述调控可以包括下调。所述方法可以包括将所述细胞暴露于能够特异性结合VHZ的siRNA或shRNA。它可以包括将所述细胞暴露于抗VHZ抗体诸如上文所列的。由于所述操作，所述癌细胞可以变为非癌性的或者所述侵入性或转移性癌细胞可以变为非侵入性的或非转移性的。依照本发明的第十方面，提供了一种操作细胞的方法，该方法包括下列步骤(a)检测细胞中VHZ表达、量或活性的升高；并(b)降低所述细胞中的VHZ水平。依照本发明的第十一方面，我们提供了一种鉴定能够结合VHZ多肽的分子的方法，该方法包括使VHZ多肽或与其具有至少90%序列同一性的序列与候选分子接触，并测定所述候选分子是否结合所述VHZ多肽或与其具有至少90%序列同一性的序列。依照本发明的第十二方面，我们提供了一种鉴定VHZ调控物的方法，该方法包括使细胞与候选分子接触，并检测所述细胞中的或所述细胞的VHZ的表达、量或活性的升高或降低。依照本发明的第十三方面，我们提供了一种鉴定适合于治疗、预防或减轻癌症的分子的方法，该方法包括测定候选分子是否是VHZ的或与其具有至少90%序列同一性的序列的激动剂或拮抗剂。所述方法可以包括将候选分子暴露于VHZ多肽或表达VHZ多肽的细胞，以便测定所述候选分子是否是其激动剂或拮抗剂。依照本发明的第十四方面，提供了一种鉴定VHZ的或与其具有至少90%序列同一性的序列的激动剂或拮抗剂的方法，该方法包括向动物施用候选分子，并测定所述动物是否展现出VHZ的表达、量或活性的升高或降低。依照本发明的第十五方面，我们提供了一种在个体中治疗、预防或减轻癌症的方法，该方法包括调控个体的细胞中的VHZ表达、量或活性。所述癌症可以包括乳腺癌，诸如侵入性或转移性癌症诸如侵入性导管癌(IDC)。所述方法可以是这样的，即使得所述VHZ的表达、量或活性在所述个体的乳腺细胞中降低。依照本发明的第十六方面，我们提供了一种在个体中诊断癌症或对癌症的易感性或者的患有癌症的个体预后的方法，该方法包括检测所述个体的细胞中的VHZ的表达、量或活性的调控。所述癌症可以包括乳腺癌，诸如侵入性或转移性癌症诸如侵入性导管癌(IDC)。依照本发明的第十七方面，我们提供了一种测定个体中的肿瘤是否是或者是否有可能是侵入性或转移性肿瘤的方法，该方法包括检测所述个体的肿瘤细胞中的VHZ的表达、量或活性的调控。依照本发明的第十八方面，我们提供了一种在个体中治疗、预防或减轻癌症的方法，该方法包括检测所述个体的细胞中的VHZ的表达、量或活性的调控，并基于所述肿瘤的攻击性来向所述个体施用合适的疗法。所述疗法可以包括抗VHZ剂，如上文所描述的。所述癌症可以包括乳腺癌，诸如侵入性或转移性癌症诸如侵入性导管癌(IDC)。通过评估肿瘤大小和/或淋巴结阶段，任选地与其它风险因素一起或组合，可以进一步确定所述诊断、预后或疗法的选择。通过评估所述肿瘤的雌激素受体(ER)状态，可以进一步确定所述诊断、预后或疗法的选择。依照本发明的第十九方面，我们提供了VHZ多肽的分子、激动剂或拮抗剂，其是通过如上文所列的方法或用途鉴定的。依照本发明的第二十方面，我们提供了一种供在治疗、预防或减轻癌症中使用的分子，其能够调控诸如下调VHZ的表达。所述分子可以包含针对与人VHZ的氨基酸残基(126-140)对应的RRLRPGSIETYEQEK生成的抗肽抗体。除非另有指明，本发明的实践会采用化学、分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，它们在本领域普通技术人员的能力范围内。文献中解释了此类技术。参见例如J·Sambrook,E.F.Fritsch,禾口Τ·Maniatis,1989,MolecularCloning:ALaboratoryManual,第二版，第1-3册，ColdSpringHarborLaboratoryPress；Ausubel,F.M.等(1995和定期补充；CurrentProtocolsinMolecularBiology，第9章、第13章、和第16章，JohnWiley&Sons，NewYork,N.Y.)；B.Roe，J.Crabtree，禾口A.Kahn，1996，DNAIsolationandSequencing:EssentialTechniques,JohnWiley&Sons;J.Μ·PoIak禾口JamesO'D.McGee,1990,InSituHybridizationPrinciplesandPractice；OxfordUniversityPress；Μ·J.Gait(编)，1984,OligonucleotideSynthesis:APracticalApproach,IrIPress；D.Μ.J.Lilley禾口J.Ε.Dahlberg,1992,MethodsofEnzymology:DNAStructurePartASynthesisandPhysicalAnalysisofDNAMethodsinEnzymology,AcademicPress；UsingAntibodies:ALaboratoryManual:PortableProtocolNO.IbyEdwardHarlow,DavidLane,EdHarlow(1999,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ISBN0-87969-544-7)；Antibodies:ALaboratoryManual,EdHarlow(IS),DavidLane(IS)(1988，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ISBN0-87969-314-2),1855.HandbookofDrugScreening,RamakrishnaSeethala,PrabhavathiB.Fernandes编(2001,NewYork,BY,MarcelDekker，ISBN0-8247-0562-9)；及LabRef:AHandbookofRecipes,Reagents,andOtherReferenceToolsforUseattheBench,JfaneRoskams禾口LindaRodgers编，2002，ColdSpringHarborLaboratory,ISBN0-87969-630-3。本文通过提及而收录这些通用教科书之每篇。附图简述图IA和图IB的图像显示了外源性VHZ位于中心体中，并遍及细胞质。间接的免疫荧光显示了中心体中的外源性VHZ。图1A。VHZ-EGFP(绿色)被转染入NRK细胞中，并展现出一定范围的亚细胞定位(a)。VHZ的主要定位是中心体，在那里它与红色的中心体标志物-粒周蛋白共定位(b)。使用To-pro-3碘化物来以蓝色显现细胞核(b)。合并的图像显示了VHZ-EGFP(绿色)与粒周蛋白共定位(c)。标尺，20μm。图IB。将VHZ-EGFP转染入NRK细胞中，并在处于各个细胞周期阶段的细胞中显现分裂间期(a)、前期(b)、中期(C)、和末期(d)。粒周蛋白以红色显示(a’_d’)，而细胞核用To-pro-3碘化物以蓝色显示(a’-d’)。如所显示的那样合并图像(a”_d”)。标尺，10μm。图2A和图2B的图像显示了内源性VHZ位于中心体和细胞质中。图2A。在NRK(a-c，标尺，10μm)和MCF-IOA(d-f，标尺，20μm)细胞中显现内源性VHZ，其通过用亲和纯化的家兔抗VHZ和小鼠抗Y-微管蛋白抗体，接着用偶联有抗家兔-FITC(绿色)的抗家兔IgG和偶联有抗小鼠-德克萨斯红的抗小鼠IgG进行的双重染色来实现。也在A431细胞(g-i，标尺，20μπι)中检测内源性VHZ，其通过用小鼠单克隆抗体抗VHZ(克隆编号25)和家兔抗粒周蛋白抗体，接着用偶联有抗小鼠-FITC(绿色)的抗小鼠IgG和偶联有抗家兔-德克萨斯红的抗家兔IgG进行的双重染色来实现。图2Β。在经过血清饥饿的NRK中显现内源性VHZ(a_c，标尺，20μm),其通过用家兔抗VHZ和小鼠抗Y-微管蛋白抗体，接着用偶联有抗家兔-FITC(绿色)的抗家兔IgG和偶联有抗小鼠_德克萨斯红的抗小鼠IgG进行的双重染色来实现。图3A、图3B和图3C的图像显示了VHZ具有蛋白质酪氨酸磷酸酶活性，并且牵涉细胞周期调节。图3A。我们对每种蛋白质(0.675皮摩尔)测试其PTP酶活性。通过在反应中添加10μM原钒酸钠(VHZ-GST+钒酸盐)或者通过将Cys95点突变成Ser[VHZ(C95S)-GST)]，完全消除VHZ的PTP酶活性。图3Β。a。三份全细胞溶胞物衍生自表达VHZ-EGFP、VHZ(C95S)-EGFP、或EGFP载体的MCF-7细胞。通过用抗EGFP抗体进行的Western印迹来分析蛋白质表达水平。使用GAPDH作为蛋白质加载对照。b。通过BrdU掺入和FACS分析来测量DNA含量。APC-BrdU向新合成的DNA的掺入(Rl对应于红色荧光的量)。图3C。稳定地表达相同的三种表达构建体的NRK细胞显示VHZ能减少Gl但增加S群体。所得的直方图由三种群体组成(按％计)M1:G1期、M2:S期和M3:G2/M期。该图形显示了对增殖中的细胞群体获得的典型结果，那时通过FACS分析测定其个体细胞的DNA含量。图4A和图4B的图像显示了VHZ增强MCF-7细胞中的G1/S转换。图4A。对表达EGFP载体、VHZ(C95S)-EGFP或VHZ-EGFP的MCF-7细胞分析牵涉G1/S细胞周期控制的数种分子。有在Ser780、Ser795和Ser807/811处磷酸化的p21Wafl/Cipl、Cdk4、和Rb。图4B。显示了一种提出的模型，用以例示VHZ如何可以在G1/S期转换中与这些分子协调。图5A、图5B和图5C的图像显示了过表达的VHZ蛋白分布于一些乳腺癌样品中的上皮肿瘤细胞的中心体中或细胞质中。对福尔马林固定的且石蜡包埋的乳腺癌样品评估VHZ蛋白表达。图5A。通过在相同的组织切片上进行的间接双重免疫荧光标记看到VHZ在乳腺癌中定位至细胞的中心体。VHZ(a)和Y-微管蛋白(b)共定位于中心体(c)，如白色箭头所标示的。图像c显示了合并的图像a和b。标尺100μπι。图5Β。为了进行免疫组织化学标记而处理乳腺癌样品的两份连续切片以分别检测VHZ和Y-微管蛋白。通过用3，3’-二氨基联苯胺色原(褐色)染色来检测阳性信号。VHZ(a)和Y-微管蛋白定位(b)的相似中心体标记样式以黑色箭标示。总貌图像(a’，b’)衍生自两份相邻切片。小图a’至C’(放大率x630)中框示的三个矩形区域进行进一步放大(x5)，并分别显示于小图a至c，其中中心体以黑色箭标示。小图C’和c显示了作为对照的VHZ阴性样品。最初的总貌图像显示于(图8A)。图5C。VHZ蛋白在一些乳腺癌样品中的弥散上皮的整个细胞质中过表达。最初的总貌图像显示于(图8B)。来自不同乳房样品的选定切片显示于总貌图像(a’和b’)。总貌图像(a’、b’和c’放大率x400)中框示的三个矩形区域进行进一步放大(x5)，并分别显示于小图a、b和C。小图c和C’是作为对照显示的VHZ阴性样品。图6A和图6B的图像显示了VHZ在E-钙粘着蛋白阴性细胞中的表达和VHZ的过表达增强MCF-7细胞的运动性。图6A。两份相邻的福尔马林固定的且石蜡包埋的乳腺癌样品组织切片显示了VHZ阳性细胞是E-钙粘着蛋白阴性的(a，放大率x400)，而VHZ阴性上皮是E-钙粘着蛋白阳性的(b，放大率x400)。图6B。为了评估MCF-7-VHZ-EGFP和MCF-7-VHZ(C95S)-EGFP细胞运动性，将细胞在盖玻片上以汇合的单层铺板。然后使经细胞包被的盖玻片颠倒，其中细胞侧向下至新鲜培养皿上。在0小时时和48小时时为MCF-7-VHZ-EGFP细胞(a，a’)和MCF-7-VHZ(C95S)-EGFP(b，b’)采集图像。小图a’显示了自覆盖的盖玻片下移动到外面的MCF-7-VHZ-EGFP细胞(箭标示的)。免疫荧光图像(a，b)。相差图像(a’，b’放大率x200)。图7A和图7B的图像显示了VHZmRNA在组织和细胞中广泛表达。人多组织阵列(产品目录编号7776-1)获自BDBioscience(SanJose,CA)。该阵列含有自65种不同人组织和8种人细胞系衍生的73份mRNA。图7A。依照制造商的说明书(产品目录编号1585584，Roche，Mannheim，Germany)用32P-dCTP放射性标记的人VHZCDNA探查点印迹。显示了VHZmRNA表达样式。VHZ主要在心脏(斑点4A、4C-4H)中和在许多其它组织中，以及在肺癌细胞系_A549(斑点-10H)中表达。图7B。人多组织阵列的完整图谱。图8A和图8B的图像通过免疫组织化学显示了VHZ蛋白在乳腺癌的中心体和细胞质中过表达。图8A。在乳腺癌的中心体中揭示了VHZ蛋白的过表达。中心体以黑色箭标示(放大率x400)。图8B。在乳腺癌细胞的细胞质中找到VHZ蛋白的过表达(放大率x200)。图9A和图9B的图像显示了家兔和小鼠抗VHZ抗体的表征。图9A。用家兔和小鼠抗VHZ抗体进行的Western印迹分析。全细胞溶胞物衍生自A431、HaLa、殿1(、和MCF-7细胞。将MCF-7全细胞溶胞物与2μgVHZ-GST—起预温育(第1道)。VHZ条带的检测被VHZ-GST特异性阻断(箭标示的)。图9B。VHZ单抗可用于ECL(A)、IF(B)和IHC(图5)。图10的图像显示了根据伤口愈合测定法，表达VHZ的MCFlOA细胞展示出比表达VHZ(C95S)的MCFlOA细胞增强的迁移特性。我们已经经由使用pBABEpuro载体进行的逆转录病毒介导的转导在MCFlOA细胞(5x10s)中表达VHZ和VHZ(C95S)。根据伤口愈合测定法，表达VHZ的MCFlOA细胞展示出比表达VHZ(C95S)的MCFlOA细胞增强的迁移特性。可以观察到开始时(0小时上部小图)和终点时(8小时下部小图)的细胞迁移的明显差异。发明详述本发明基于第一次证明了VHZ磷酸酶在癌症中发挥作用。VHZ是最小的已知的有活性的蛋白质酪氨酸磷酸酶(仅16kDa)，并且属于小牛痘病毒VHl相关双特异性磷酸酶组。编码VHZ的基因位于人染色体lq23.1上，并且仅由两个编码外显子组成(Wu等，2004，IntJBiochemCellBiol.36(8)1542-53)VHZ显示独特的针对对硝基苯基磷酸酯以及含有磷酸酪氨酸和磷酸苏氨酸残基的寡肽磷酸酶活性。此外，VHZ在体外能使p44ERKl而非p38和p54SAPK0去磷酸化(Alonso等(2004).JBiolChem.20；279(34):35768_74)。我们显示了VHZ主要与侵入性人上皮乳腺癌细胞有关。在所检查的人乳腺癌样品的中心体(6/65份病例)中或遍及细胞质(11/65份病例)找到VHZ蛋白的过表达。因而，可以使用VHZ作为标志物来检测乳腺癌。可以使用VHZ表达的水平作为癌症的指标，特别是乳腺癌诸如转移性、攻击性或侵入性乳腺癌。还可以使用VHZ表达的水平作为此类癌症可能性的指标。因此，我们提供了诊断或检测癌症，特别是乳腺癌的方法。我们进一步提供了诊断和检测此类癌症的攻击性或侵入性或转移状态，或者这些的任意组合的方法。该方法可以包括分析蛋白质水平(例如免疫组织化学)或RNA水平(例如通过原位杂交)。下文更为详细地描述了此类诊断和检测方法。使用间接免疫荧光，我们显示了外源性和内源性VHZ蛋白二者在其胞质分布外还定位于中心体中。因而，可以使用VHZ作为标志物来检测中心体结构。我们证明了VHZ调节细胞周期行进，并且它具有增强Gl-S期转换的能力。我们证明了VHZ的过表达促成乳腺癌形成。对BrdU标记的被工程化改造成表达VHZ的MCF-7细胞的FACS分析指明VHZ能够加速Gl期向S期转换。来自对稳定表达相同的三种表达构建体的NRK细胞的FACS分析的类似结果显示VHZ通过减少Gl但增加S群体来加速Gl向S期转换。因而，我们提供了治疗或预防患有癌症的个体的方法。还可以使用VHZ水平向那些在正常组织中的VHZ水平的恢复作为恢复乳腺细胞正常功能的手段。因此，我们提供了VHZ核酸和多肽治疗癌症(包括乳腺癌)的用途。可以使用我们的方法来治疗或预防乳腺癌或侵入性癌症诸如侵入性乳腺癌。我们还提供了VHZ在筛选针对癌症(例如乳腺癌)的药物中的用途。所述癌症可以包括侵入性乳腺癌。VHZ过表达或表达不足的细胞以及包含其的组织、器官和生物体可以用作癌症模型或者用于筛选抗癌剂。VHZ在MCF-7细胞中的过表达引起p21Cipl的下调和Cdk4的上调。结果，观察到磷酸化的(失活的)视网膜母细胞瘤蛋白(Rb)的积累，如通过用磷酸特异性抗体进行的免疫印迹所评估的。表达没有催化活性的VHZ(C95S)的细胞上文的VHZ介导的事件方面受到削弱，指明这些特性需要磷酸酶活性。VHZ中的催化性半胱氨酸残基的突变(C95S)消除其蛋白质酪氨酸磷酸酶(PTP)活性。在使用术语“VHZ”时，这应当被用于指任何VHZ序列，包括VHZ蛋白或VHZ核酸及其任何片段、变体同源物、衍生物、变体。VHZ的特性和活性记载于本文件中，例如在参考文献中。VHZ多月太这里所描述的方法和组合物利用下文详细描述的VHZ多肽。VHZ也称为DUSP23、M0SP、LDP-3、DUSP25、FLJ20442和RP11-190A12.1。如本文所使用的，术语“VHZ多肽”意图指具有GenBank登录号NP_060293.2、NP_081001.1、XP_341157.1、XP_001170819.1、XP_001170835.1、XP_545747.2、NP_001076078.1、NP_001011371.1、NP_783859.1、NP_001034709.1、XP_001480730.1、XP_001117253.1或XP_001117256.1的序列。"VHZ多肽”可以包含人VHZ多肽诸如具有登录号NP_060293的序列，或者由其组成。还包括任何、一些或所有这些多肽的其同源物变体和衍生物。VHZ多肽可以用于多种手段，例如，向患有或者怀疑患有乳腺癌的个体施用以进行治疗。它们还可以用于生成或筛选抗VHZ剂，诸如特异性VHZ结合剂，特别是抗VHZ抗体。这些在下文更为详细地进行描述。可以检测VHZ多肽的表达以诊断或检测癌症，特别是乳腺癌。“多肽”指任何包含两个或更多个彼此通过肽键或修饰的肽键(即肽等排体)相连接的氨基酸的肽或蛋白质。“多肽”指短链(通常称为肽、寡肽或寡聚物)和较长的链(通常称为蛋白质)两者。多肽可以含有20种由基因编码的氨基酸以外的氨基酸。“多肽”包括通过天然过程(诸如翻译后加工)或通过本领域中公知的化学修饰技术修饰的氨基酸序列。此类修饰详细记载于基础教科书和更详细的专著，以及多卷的研究文献中。修饰可以在多肽中的任何地方发生，包括肽主链、氨基酸侧链和氨基或羧基末端。应当领会的是，相同类型的修饰可以以相同或不同程度存在于给定多肽中的数个位点。还有，给定多肽可以含有许多类型的修饰。多肽可以由于遍在蛋白化而分支，并且它们可以是环状的、有分支的或没有分支的。环状的、分支的和分支环状的多肽可以源自翻译后天然过程或者可以通过合成方法制备。修饰包括乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、黄素的共价附着、血红素模块的共价附着、核苷酸或核苷酸衍生物的共价附着、脂质或脂质衍生物的共价附着、磷脂酰肌醇的共价附着、交联、环化、二硫键形成、脱甲基化、共价交联的形成、胱氨酸的形成、焦谷氨酸的形成、甲酰化、Y-羧化、糖基化、GPI锚形成、羟基化、碘化、甲基化、肉豆蔻酰化、氧化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊烯化、外消旋化、硒化(selenoylation)、硫酸化、转移RNA介导的氨基酸向蛋白质的添加(诸如精氨酰化)、和遍在蛋白化。参见例如Proteins-StructureandMolecularProperties,第2版，Τ.Ε.Creighton,W.H.FreemanandCompany,NewYork,1993禾口Wold,F.,PosttranslationalProteinModifications!PerspectivesandProspects,MM~M2Jit,于PosttranslationalCovalentModificationofProteins,B.C.Johnson,编，AcademicPress,NewYork,1983;Seifter等，"Analysisforproteinmodificaionsandnonproteincofactors",MethEnzymol,(1990)182626-646禾口Rattan等，“ProteinSynthesis:PosttranslationalModificationsandAging，，，AnnNYAcadSci(1992)663:48_62。术语“多肽”包括本领域已知的各种合成肽变异诸如逆反(retr0inVerS0)D肽。肽可以是抗原决定簇和/或T细胞表位。肽在体内可以是免疫原性的。肽可以能够在体内诱导中和性抗体。如应用于VHZ的，所得的氨基酸序列可以具有一种或多种活性，诸如与VHZ多肽(例如人VHZ多肽)共同的生物学活性。例如，VHZ同源物在乳腺癌细胞中比在正常的乳腺细胞中可以具有升高的表达水平。具体地，术语“同源物”涵盖关于结构和/或功能的同一性，只要所得的氨基酸序列具有VHZ活性。关于序列同一性(即相似性)，可以有至少70%，诸如至少75%，诸如至少85%，诸如至少90%序列同一性。可以有至少95%，诸如至少98%序列同一性。这些术语还涵盖自作为VHZ核酸序列等位变异的氨基酸衍生的多肽。在提及多肽诸如VHZ的“活性”或“生物学活性”时，这些术语意图指VHZ的代谢或生理学功能，包括类似的活性或改善的活性或者不想要的副作用降低的这些活性。还包括VHZ的抗原性和免疫原性活性。此类活性的例子及测定和量化这些活性的方法是本领域已知的，并且详细记载于本文件的别处。例如，此类活性可以包括任何下列一项或多项水解酶活性、蛋白质酪氨酸磷酸酶活性、蛋白质酪氨酸/丝氨酸/苏氨酸磷酸酶活性和蛋白质氨基酸去磷酸化。针对这些活性的测定法是本领域已知的，并且例如记载于Wu等(2004)，IntJBiochemCellBiol.36(8)1542-53和Alonso等(2004)·JBiolChem.20；279(34):35768_74。其它VHZ多肽VHZ变体、同源物、衍生物和片段也在本文所描述的方法和组合物中使用。涉及VHZ的术语“变体”、“同源物”、“衍生物”或“片段”包括一个(或多个)氨基酸自序列或向序列的任意替代、变异、修饰、替换、删除、或添加。除非上下文另有承认，提及“VHZ”包括提及VHZ的此类变体、同源物、衍生物和片段。如本文中所使用的，“删除”定义为核苷酸或氨基酸序列中分别缺失一个或多个核苷酸或氨基酸残基的变化。如本文中所使用的，“插入”或“添加”指与天然存在的物质相比分别已经导致一个或多个核苷酸或氨基酸残基的添加的核苷酸或氨基酸序列变化。如本文中所使用的，“替代”源自于一个或多个核苷酸或氨基酸分别被不同核苷酸或氨基酸替换。如本文所描述的VHZ多肽还可以具有产生沉默变化和导致功能等同氨基酸序列的氨基酸残基删除、插入或替代。可以基于残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性、和/或两亲性质的相似性来进行有意的氨基酸替代。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；而具有不带电荷的极性首基(headgroup)、具有相似的亲水性值的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。可以例如依照下表来进行保守的替代。第二栏中同一块中的和第三栏中同一行中的氨基酸可以彼此替代脂肪族的非极性的IGΑρ_ILV__极性-不带电荷的CSTM_NQ_极性-带电荷的DE__KR_^^族的|hFWYVHZ多肽可以进一步包含异源氨基酸序列，通常在N端或C端，诸如N端。异源序列可以包括影响胞内或胞外蛋白质靶向的序列(诸如前导序列)。异源序列还可以包括提高VHZ多肽的免疫原性和/或便于多肽的鉴定、提取和/或纯化的序列。可以使用的另一种异源序列是多氨基酸序列诸如多组氨酸，其可以是N端的。可以采用至少10个氨基酸，诸如至少17个氨基酸但少于50个氨基酸的多组氨酸序列。VHZ多肽可以处于“成熟的”蛋白质形式，或者可以是较大蛋白质诸如融合蛋白的一部分。通常有利的是包括额外氨基酸序列，其含有分泌或前导序列、前序列(pro-sequence)、有助于纯化的序列诸如多组氨酸残基、或为了重组生产过程中稳定性的额外序列。通过使用已知技术的重组手段来有利地制备如本文所描述的VHZ多肽。然而，还可以通过使用熟练技术人员公知的技术进行的合成手段诸如固相合成来制备它们。此类多肽还可以作为融合蛋白生成，例如以便帮助提取和纯化。融合蛋白配偶的例子包括谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、6xHis、GAL4(DNA结合和/或转录激活域)和β-半乳糖苷酶。也可能方便的是在融合蛋白配偶与感兴趣蛋白质序列之间包括蛋白水解切割位点以容许除去融合蛋白序列，诸如凝血酶切割位点。融合蛋白可以是不阻碍感兴趣序列的蛋白质的功能的融合蛋白。VHZ多肽可以处于基本上分离的形式。此术语意图指自天然状态的人为改变。若“分离的”组合物或物质在自然界中存在，则它已经自其最初环境改变和/或取出。例如，在本文中采用该术语时，活的动物中天然存在的多核苷酸、核酸或多肽不是“分离的”，但是与其天然状态的共存物质分开的该多核苷酸、核酸或多肽是“分离的”。然而，应当理解的是，VHZ蛋白可以与不会干扰蛋白质预期目的的载体或稀释剂混合，并且仍被认为是基本上分离的。VHZ多肽也可以处于基本上纯化的形式，在此情况中一般会在制备物中包含蛋白质，其中所述制备物中超过90%，例如95%、98%或99%的蛋白质是VHZ多肽。通过比对来自不同物种的VHZ序列，有可能确定氨基酸序列的哪些区域在不同物种间是保守的(“同源区”)，及哪些区域在不同物种间有变化(“异源区”)。因此，VHZ多肽可以包含至少对应同源区的一部分的序列。同源区在至少两个物种间显示高度的同源性。例如，使用上文所描述的测试，同源区可以在氨基酸水平显示至少70%，至少80%，至少90%或至少95%的同一性。可以在治疗策略中使用包含对应于同源区的序列的肽，如下文更详细解释的。或者，VHZ肽可以包含至少对应异源区的一部分的序列。异源区在至少两个物种间显示低度的同源性。VHZ同源物公开的进行使用的VHZ多肽包括自任何来源获得的同源序列，例如相关病毒/细菌蛋白质、细胞同源物和合成肽，以及其变体或衍生物。如此，多肽还包括那些编码来自其它物种(包括动物，诸如哺乳动物(例如小鼠、大鼠或家兔)，尤其是灵长类，更尤其是人)的VHZ同源物的。更具体地，同源物包括人同源物。在本文件的语境中，同源序列用于包括在氨基酸水平上，例如在至少50或100、110、115、120、125、130、135、140、141、142、143、144、145、146、147、148或149个氨基酸里，与相关VHZ序列的序列至少15、20、25、30、40、50、60、70、80或90%相同，诸如至少95或98%相同的氨基酸序列。具体地，同源性通常应当关于那些已知对蛋白质功能至关重要的序列区域而非不是至关重要的相邻序列进行考虑。这在考虑来自远亲生物体的同源序列时是特别重要的。一个例子是人VHZ蛋白残基号95处的或对应于人VHZ蛋白残基号95的半胱氨酸残基(其显示为对于磷酸酶功能是至关重要的)和周围的残基。虽然也可以根据相似性(即具有相似化学特性/功能的氨基酸残基)来考虑同源性，但是在本文件的语境中同源性可以根据序列同一性来表述。可以通过目视，或者更通常地，借助于容易获得的序列比较程序来进行同源性比较。这些公用的和商品化的计算机程序能在两种或更多种序列之间计算％同一性。可以在连续的序列里计算％同一性，S卩比对一种序列与另一种序列，并且直接比较一种序列中的每个氨基酸与另一种序列中的相应氨基酸，每次一个残基。这称作“无缺口的”比对。通常，仅在相对较短数目的残基(例如小于50个连续氨基酸)里实施此类无缺口比对。虽然这是非常简单而一致的方法，但是它不能考虑到例如，在其它方面相同的一对序列中，一处插入或删除会引起随后的氨基酸残基比对不成，如此在实施总体比对时潜在地导致％同源性的大量降低。因此，对大多数序列比较方法进行设计以产生最佳比对，其考虑到有可能的插入和删除，而不过度地对总体同源性得分进行罚分。这是通过在序列比对中插入“缺口”以设法使局部同一性或相似性最大化来实现的。然而，这些较复杂的方法将“缺口罚分”分配给比对中出现的每个缺口，使得对于相同数目的相同氨基酸，具有尽可能少的缺口的序列比对——反映两种比较序列之间的较高关联性——会比具有许多缺口的序列比对达到更高的得分。通常使用“仿射缺口代价”，其对缺口的存在要求相对较高的代价，而对缺口中的每个随后的残基要求较小的罚分。这是最常用的缺口评分系统。高缺口罚分当然会产生具有较少缺口的优化比对。大多数比对程序容许对缺口罚分进行修改。然而，可以在使用此类软件比较序列时使用缺省值。例如在使用GCGWisconsin最佳拟合包(参见下文)时，氨基酸序列的缺省缺口罚分是针对缺口的-12和针对每个延伸的_4。因此，最大限度％同源性的计算首先要求产生考虑到缺口罚分的最佳比对。适合于实施此类比对的一种计算机程序是GCGWisconsin最佳拟合包(UniversityofWisconsin，U.S.A;Devereux等，1984，NucleicAcidsResearchl2:387)。能实施序列比较的其它软件的例子包括但不限于BLAST包(参见Ausubel等，1999同上-第18章)、FASTA(Altschul等，1990，J.Mol.Biol.，403-410)和GENEffORKS比较工具套件。BLAST禾口FASTA两者都可进行离线和在线搜索(参见Ausubel等，1999同上，第7_58页至第7_60页)。可以使用GCG最佳拟合程序。虽然可以根据同一性测量最终的％同源性，但是比对方法自身通常并不是基于全有或全无的成对比较。代替地，一般使用定标的相似性得分矩阵，其基于化学相似性或进化距离将得分分配给每个配对比较。通常使用的此类矩阵的一个例子是BL0SUM62矩阵-BLAST程序套件的缺省矩阵。GCGWisconsin程序一般使用公共缺省值或自定义符号比较表，若提供的话(关于进一步的详情参见用户手册)。可以使用GCG包的公共缺省值，或者在其它软件的情况中，可以使用缺省矩阵，诸如BL0SUM62。一旦软件已经产生最佳比对，便有可能计算％同源性，诸如％序列同一性。软件通常将此作为序列比较的一部分进行，并产生数值结果。涉及氨基酸序列的术语“变体”或“衍生物”包括一个(或多个)氨基酸自序列或向序列的任意替代、变异、修饰、替换、删除、或添加，只要所得的氨基酸序列保留与未修饰的序列基本上相同的活性，诸如至少具有与VHZ多肽相同的活性。为了在本文所描述的方法和组合物中使用，可以修饰具有本文所公开的VHZ氨基酸序列的多肽，或其片段或同源物。通常，进行的修饰维持序列的生物学活性。可以进行氨基酸替代，例如自1、2或3至10、20或30处替代，只要经修饰的序列保留未修饰序列的生物学活性。或者，可以进行修饰以便有意地使本文所述多肽的一个或多个功能域失活。氨基酸替代可以包括使用非天然存在的类似物，例如以便延长治疗性施用的多肽的血浆半衰期。VHZ片段本文所述方法和组合物中使用的多肽还包括上文所鉴定的任何VHZ多肽的全长序列的片段。片段可以包含至少一个表位。鉴定表位的方法是本领域公知的。片段通常会包含至少6个氨基酸，诸如至少10、20、30、50或100个氨基酸。包括如下片段，其包含来自相关VHZ氨基酸序列的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145个或更多个残基，或由其组成。我们进一步描述了包含如本文所描述的VHZ多肽的一部分的肽。如此，包括VHZ及其同源物、变体或衍生物的片段。所述肽的长度可以在2个和200个氨基酸之间，诸如在4个和40个氨基酸之间。所述肽可以衍生自如本文所公开的VHZ多肽，例如通过用合适的酶诸如胰蛋白酶进行的消化来得到。或者，所述肽、片段等可以通过重组手段来制备，或者以合成法合成。可以使用此类VHZ片段来生成探针以优先检测VHZ表达，例如经由针对此类片段生成的抗体。这些抗体会特异性结合VHZ，并且在本文所公开的诊断和治疗方法中是有用的。可以通过重组手段来制备VHZ及其片段、同源物、变体和衍生物。然而，它们也可以通过使用熟练技术人员公知的技术进行的合成手段诸如固相合成来制备。所述蛋白质还可以作为融合蛋白生成，例如以便帮助提取和纯化。融合蛋白配偶的例子包括谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、6xHis、GAL4(DNA结合和/或转录激活域)和β-半乳糖苷酶。也可能方便的是在融合蛋白配偶与感兴趣蛋白质序列之间包括蛋白水解切割位点以容许除去融合蛋白序列。融合蛋白可以是不会阻碍感兴趣序列的蛋白质的功能的融合蛋白。还可以通过纯化来自动物细胞的细胞提取物来获得蛋白质。本文所公开的VHZ多肽、变体、同源物、片段和衍生物可以处于基本上分离的形式。应当理解的是，此类多肽可以与不会干扰蛋白质预期目的的载体或稀释剂混合，并且仍被认为是基本上分离的。VHZ变体、同源物、片段或衍生物也可以处于基本上纯化的形式，在此情况中一般会在制备物中包含蛋白质，其中所述制备物中超过90%，例如95%、98%或99%的蛋白质是蛋白质。可以用显示标记物(revealinglabel)标记本文所公开的VHZ多肽、变体、同源物、片段和衍生物。所述显示标记物可以是容许检测出多肽等的任何合适的标记物。合适的标记物包括放射性同位素(例如125I)、酶、抗体、多核苷酸和接头(诸如生物素)。可以在诊断规程诸如免疫测定法中使用经过标记的多肽以测定样品中的多肽量。也可以在血清学或细胞介导的免疫测定法中使用多肽或经过标记的多肽以使用标准方案来检测动物和人中针对所述多肽的免疫反应性。也可以将本文所公开的VHZ多肽、变体、同源物、片段和衍生物(任选经过标记的)固定至固相，例如免疫测定孔或浸渍片的表面。可以将此类经过标记的和/或固定化的多肽与合适的试剂、对照、说明书等一起在合适的容器中包装入试剂盒中。此类多肽和试剂盒可以在通过免疫测定法检测针对多肽或其等位或物种变体的抗体的方法中使用。免疫测定方法是本领域公知的，并且一般会包括(a)提供包含下述表位的多肽，该表位可被针对所述蛋白质的抗体结合；(b)在容许抗体-抗原复合物形成的条件下将生物学样品与所述多肽一起温育；并(c)测定是否形成包含所述多肽的抗体_抗原复合物。可以在体外或体内细胞培养系统中使用本文所公开的VHZ多肽、变体、同源物、片段和衍生物以研究它们相应的基因及其同源物在细胞功能(包括它们在疾病中的功能)中的作用。例如，可以将截短的或经修饰的多肽导入细胞中以破坏细胞中发生的正常功能。可以通过自重组表达载体原位表达多肽来将多肽导入细胞中(参见下文)。任选地，表达载体携带诱导型启动子，以便控制多肽的表达。合适的宿主细胞诸如昆虫细胞或哺乳动物细胞的使用提供此类翻译后修饰(例如肉豆蔻酰化、糖基化、截短、脂化和酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸磷酸化)，其可能是对重组表达产物赋予最佳生物学活性所需要的。可以在测定系统中使用其中表达本文所公开的VHZ多肽、变体、同源物、片段和衍生物的此类细胞培养系统，以鉴定干扰或增强多肽在细胞中的功能的候选物质。本文所描述的方法和组合物可以采用VHZ多核苷酸、VHZ核苷酸和VHZ核酸，以及这些中任一种的变体、同源物、衍生物和片段，作为用于检测VHZ表达水平的手段。另外，我们公开了对于本文所描述的诊断方法有用的特定VHZ片段。VHZ核酸还可以用于所描述的治疗或预防方法。术语“VHZ多核苷酸”、“VHZ核苷酸”和“VHZ核酸”可以互换使用，并且应当理解为明确包括cDNA和基因组VHZ序列两者。这些术语还意图包括能够编码VHZ多肽和/或其片段、衍生物、同源物或变体的核酸序列。在提及VHZ核酸时，这应当理解为提及VHZ核酸家族的任何成员。特别感兴趣的是选自下组的VHZ核酸NM_017823.3、NM_026725.2、XM_341156.3、XM_001170819.1、XM_001170835.1、XM_545747.2、NM_001082609.1、NM_001011371.1、NM_175732.1、NM_001039620.1、XM_001480680.1、XM_001117253.1或XM_001117256.1。还包括如下文“其它VHZ核酸序列”所列的任何一种或多种核酸序列。例如，VHZ核酸可以包含具有GenBank登录号NM_017823.3的人VHZ序列。VHZ核酸可以用于多种手段，例如，向患有或者怀疑患有乳腺癌的个体施用以进行治疗。可以检测VHZ核酸的表达以诊断或检测癌症，特别是乳腺癌。也可以使用VHZ核酸来表达或生成VHZ多肽。“多核苷酸”一般指任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸，其可以是未修饰的RNA或DNA或经修饰的RNA或DNA。“多核苷酸”包括但不限于单链和双链DNA，作为单链区和双链区的混合物的DNA、单链和双链RNA、及作为单链区和双链区的混合物的RNA、包含DNA和RNA的杂合分子，其可以是单链或者，更通常的是双链或单链区和双链区的混合物。另外，“多核苷酸”指包含RNA或DNA或RNA和DNA两者的三链区。术语多核苷酸还包括含有一个或多个经修饰的碱基的DNA或RNA和具有出于稳定性或其它原因而修饰的主链的DNA或RNA。“经修饰的”碱基包括例如三苯甲基化碱基和不常见碱基诸如肌苷。已经对DNA和RNA进行多种修饰；如此，“多核苷酸”涵盖多核苷酸的以化学方式、酶促方式或代谢方式修饰的形式，如通常在自然界中找到的，以及病毒和细胞特征下的DNA和RNA化学形式。“多核苷酸”还涵盖相对较短的多核苷酸，通常称为寡核苷酸。熟练技术人员应当理解的是，许多核苷酸序列可以由于遗传密码的简并性而编码相同多肽。如本文中所使用的，术语“核苷酸序列”指核苷酸序列、寡核苷酸序列、多核苷酸序列及其变体、同源物、片段和衍生物(诸如其部分)。核苷酸序列可以是基因组或合成或重组起源的DNA或RNA，其可以是双链的或单链的，无论表示有义链还是反义链或其组合。可以通过使用重组DNA技术(例如重组DNA)来制备术语核苷酸序列。术语“核苷酸序列”可以指DNA。其它核酸我们还提供了如下的核酸，其是VHZ核酸的片段、同源物、变体或衍生物。涉及VHZ核酸的术语“变体”、“同源物”、“衍生物”或“片段”包括一个(或多个)核酸自VHZ核苷酸序列的序列或向该序列的任意替代、变异、修饰、替换、删除或添加。除非上下文另有承认，提及“VHZ”和“VHZ”包括提及VHZ的此类变体、同源物、衍生物和片段。所得的核苷酸序列可以编码具有任何一种或多种VHZ活性的多肽。术语“同源物”可以意图涵盖关于结构和/或功能的同一性，使得所得的核苷酸序列编码具有VHZ活性的多肽。例如，VHZ的同源物等在乳腺癌细胞中比在正常的乳腺细胞中可以具有升高的表达水平。关于序列同一性(即相似性)，可以有至少70%，至少75%，至少85%或至少90%序列同一性。与相关序列(例如具有GenBank登录号NM_017823.3的VHZ序列)可以有至少95%，诸如至少98%的序列同一性。这些术语还涵盖所述序列的等位变异。变体、衍生物和同源物VHZ核酸变体、片段、衍生物和同源物可以包含DNA或RNA。它们可以是单链的或双链的。它们还可以是如下的多核苷酸，所述多核苷酸在其内包括合成的或经修饰的核苷酸。对寡核苷酸进行的许多不同类型的修饰是本领域已知的。这些包括膦酸甲酯和硫代磷酸酯主链、在所述分子的3’和/或5’末端添加吖啶或多赖氨酸链。出于本文件的目的，应当理解的是，可以通过本领域中可用的任何方法来修饰多核苷酸。可以实施此类修饰以增强感兴趣的多核苷酸的体内活性或寿命。若多核苷酸是双链的，则本文所描述的方法和组合物涵盖双链体的两条链，或是个别地或是组合地。若多核苷酸是单链的，则应当理解的是，还包括该多核苷酸的互补序列。涉及核苷酸序列的术语“变体”、“同源物”或“衍生物”包括一个(或多个)核酸自序列或向序列的任意替代、变异、修饰、替换、删除、或添加。所述变体、同源物或衍生物可以编码具有生物学活性的多肽。VHZ的此类片段、同源物、变体和衍生物可以包含经调控的活性，如上文所列的。如上文所指明的，关于序列同一性，“同源物”与相关序列(例如具有GenBank登录号NM_017823.3的VHZ序列)可以具有至少5%同一性、至少10%同一性、至少15%同一性、至少20%同一性、至少25%同一性、至少30%同一性、至少35%同一性、至少40%同一性、至少45%同一性、至少50%同一性、至少55%同一性、至少60%同一性、至少65%同一性、至少70%同一性、至少75%同一性、至少80%同一性、至少85%同一性、至少90%同一性、或至少95%同一性。可以有至少95%同一性、至少96%同一性、至少97%同一性、至少98%同一性或至少99%同一性。可以如上文所描述的那样进行核苷酸同一性比较。可以使用的序列比较程序是上文所描述的GCGWisconsin最佳拟合程序。缺省评分矩阵具有如下的匹配值针对每个相同核苷酸的10和针对每个错配的-9。缺省缺口产生罚分是-50，而缺省缺口延伸罚分是针对每个核苷酸的-3。杂交我们进一步描述了能够与本文中呈现的任何序列，或其任何变体、片段或衍生物，或与上文任一种的互补物选择性杂交的核苷酸序列。核苷酸序列的长度可以是至少15个核苷酸，诸如至少20、30、40或50个核苷酸。如本文中所使用的，术语“杂交”应当包括“核酸链经由碱基配对而与互补链结合的过程”以及如聚合酶链式反应技术中所实施的扩增过程。能够与本文中呈现的核苷酸序列，或与其互补物选择性杂交的多核苷酸可以与本文中呈现的相应核苷酸序列(例如具有GenBank登录号NM_017823.3的VHZ序列)至少40%同源、至少45%同源、至少50%同源、至少55%同源、至少60%同源、至少65%同源、至少70%同源、至少75%同源、至少80%同源、至少85%同源、至少90%同源、或至少95%同源。一般而言，此类多核苷酸可以在至少20个，诸如至少25或30个，例如至少40个、60个或100个或更多个连续核苷酸的区域里与相应的核苷酸序列至少70%、至少80或90%或至少95%或98%同源。术语“可选择性杂交的”指在如下条件下使用作为探针使用的多核苷酸，在所述条件下发现靶多核苷酸以显著高于背景的水平与探针杂交。可能发生背景杂交，这是由于在例如所筛选的cDNA或基因组DNA文库中存在其它多核苷酸。在此事件中，背景暗示通过探针与文库的非特异性DNA成员之间的相互作用产生的信号水平，其是用靶DNA观察到的特异性相互作用的强度的不到1/10，诸如不到1/100。例如，可以通过用例如32P或33P放射性标记探针或者用非放射性探针(例如荧光染料、生物素或洋地黄毒苷)测量相互作用的强度。杂交条件基于核酸结合复合物的解链温度(Tm)，如Berger和Kimmel(1987，GuidetoMolecularCloningTechniques,MethodsinEnzymology，第152卷，AcademicPress,SanDiegoCA)中所教导的，并且赋予限定的“严格性”，如下文所解释的。最大限度的严格性通常于约Tm_5°C(探针的Tm下5°C)发生；高严格性在Tm下约5°C至10°C发生；中等严格性在Tm下约10°C至20°C发生；而低严格性在Tm下约20°C至25°C发生。如本领域技术人员应当理解的，可以使用最大限度的严格性杂交来鉴定或检测相同的多核苷酸序列，而可以使用中等(或低)严格性杂交来鉴定或检测相似的或相关的多核苷酸序列。我们提供了可以能够在严格条件(例如65°C和0.IxSSC(IxSSC=0.15MNaCl、0.015M柠檬酸三钠pH7.0))下与VHZ核酸、片段、变体、同源物或衍生物杂交的核苷酸序列。同源物、变体和衍生物的生成可以以许多方式来获得与相关序列(例如具有GenBank登录号NM_017823.3的人VHZ序列)不是100%相同但是也包括在内的多核苷酸，以及VHZ的同源物、变体和衍生物。可以通过例如探查自一系列个体例如来自不同群体的个体制备的DNA文库来获得所述序列的其它变体。例如，可以自其它个体或其它物种鉴定VHZ同源物。可以如下生成别的重组VHZ核酸和多肽，即鉴定同源物中的相应位置，并合成或生成所述分子，如本文件中别处描述的。另外，可以获得VHZ的其它病毒/细菌、或细胞同源物，特别是哺乳动物细胞(例如大鼠、小鼠、牛和灵长类细胞)中找到的细胞同源物，并且一般而言，此类同源物及其片段会能够与人VHZ选择性杂交。可以使用此类同源物来设计非人VHZ核酸、片段、变体和同源物。可以通过本领域已知的手段来实施诱变以产生别的种类(variety)。可以如下获得VHZ同源物的序列，即探查自其它动物物种制备的cDNA文库或来自其它动物物种的基因组DNA文库，并在中等至高严格性条件下用包含VHZ核酸、片段、变体和同源物之任一种的或VHZ的其它片段的整个或部分的探针探查此类文库。类似的考虑适用于获得本文所公开的多肽或核苷酸序列的物种同源物和等位变体。也可以使用简并PCR来获得变体和品系/物种同源物，所述简并PCR会使用设计用于靶向变体和同源物内编码VHZ核酸序列内保守氨基酸的序列的引物。可以通过例如比对来自数种变体/同源物的氨基酸序列来预测保守序列。可以使用本领域已知的计算机软件来实施序列比对。例如，广泛使用GCGWisconsinPileUp程序。简并PCR中使用的引物会含有一个或多个简并位置，并且会在如下的严格条件使用，所述严格条件低于那些用于用针对已知序列的单一序列引物克隆序列的严格条件。熟练技术人员应当领会的是，来自远亲生物体的序列之间的总体核苷酸同源性有可能是非常低的，并且如此在这些情况中简并PCR可以是选择的方法，而不是用经过标记的VHZ序列片段筛选文库。另外，可以通过使用搜索算法诸如BLAST程序套件搜索核苷酸和/或蛋白质数据库来鉴定同源序列。或者，可以通过对已表征序列(例如VHZ核酸、或其变体、同源物、衍生物或片段)的定点诱变来获得此类多核苷酸。这在如下情况中可以是有用的，即例如序列需要沉默密码子变化来针对表达多核苷酸序列的特定宿主细胞优化密码子偏爱。其它序列变化可能是想要的，以便引入限制酶识别位点，或改变由多核苷酸编码的多肽的特性或功能。可以使用本文所描述的多核苷酸来生成引物，例如PCR引物，用于备选(alternative)扩增反应的引物，探针，例如使用放射性或非放射性标记物通过常规手段用显示标记物标记的探针，或者可以将多核苷酸克隆入载体中。此类引物、探针和其它片段的长度会是至少8个、9个、10个、或15个，诸如至少20个，例如至少25个、30个或40个核苷酸，并且也包括在术语“多核苷酸”内，如本文中所使用的。可以以重组方式、合成方式、或者通过本领域技术人员可用的任何手段来生成多核苷酸诸如DNA多核苷酸和探针。它们也可以通过标准技术来克隆。—般而言，会通过合成手段来生成引物，牵涉逐步制备想要的核酸序列，每次一个核苷酸。用于使用自动化技术实现此制备的技术是本领域容易获得的。包含VHZ片段的引物在检测VHZ表达诸如VHZ表达的上调(例如如与乳腺癌有关的)的方法中是特别有用的。可以自任何合适的VHZ区段生成适合于扩增VHZ的引物。可以使用的引物包括那些能够扩增特异性的VHZ序列的引物。虽然可以独立地提供VHZ引物，但是它们作为引物对(包含正向引物和反向引物)提供是最有用的。一般而言，会使用重组手段例如使用PCR(聚合酶链式反应)克隆技术来生成较长的多核苷酸。这会牵涉制备一对引物(例如有约15至30个核苷酸)，使引物与自动物或人细胞获得的mRNA或cDNA接触，在引起想要的区域扩增的条件下实施聚合酶链式反应，分离所扩增的片段(例如通过在琼脂糖凝胶上纯化反应混合物)，并回收所扩增的DNA。引物可以设计成含有合适的限制酶识别位点，使得能将所扩增的DNA克隆入合适的克隆载体中。多核苷酸或引物可以携带显示标记物。合适的标记物包括放射性同位素诸如32P或35s、洋地黄毒苷、荧光染料、酶标记物、或其它蛋白质标记物诸如生物素。可以将此类标记物添加至多核苷酸或引物，并且可以通过使用本身已知的技术来检测。本领域技术人员可以在基于核酸的测试中使用标记的或未标记的多核苷酸或引物或其片段以检测人体或动物体中的多核苷酸或对其测序。此类用于检测的测试一般包括使含有DNA或RNA的生物学样品在杂交条件下与包含多核苷酸或引物的探针接触，并检测探针与样品中的核酸之间形成的任何双链体。可以使用诸如PCR的技术或者如下来实现此类检测，即在固体支持物上固定化探针，除去样品中不与探针杂交的核酸，然后检测已经与探针杂交的核酸。或者，可以在固体支持物上固定化样品核酸，并可以检测与此支持物结合的探针量。这种和其它形式的合适测定方法可以参见例如W089/03891和W090/13667。用于对核苷酸(例如VHZ核酸)测序的测试牵涉使含有靶DNA或RNA的生物学样品在杂交条件下与包含多核苷酸或引物的探针接触，并通过例如Sanger双脱氧链终止方法(参见Sambrook等)来测定序列。此方法一般包括在存在合适的试剂的情况中通过合成与靶DNA或RNA互补的链来延伸引物，并在一个或多个A、C、G或T/U残基处选择性终止延伸反应；容许发生链延伸和终止反应；依照大小将所延伸的产物分开以测定已经发生选择性终止的核苷酸的序列。合适的试剂包括DNA聚合酶，脱氧核苷酸dATP、dCTP、dGTP和dTTP，缓冲液和ATP。使用双脱氧核苷酸进行选择性终止。VHZ控制区出于一些目的，可能有必要利用或调查VHZ的控制区。此类控制区包括启动子、增强子和基因座控制区。控制区指能够调控与其可操作连接的编码序列的表达的核酸序列或结构。例如，控制区在生成表达VHZ的转基因动物中是有用的。此外，可以使用控制区来生成VHZ的表达构建体。这在下文更为详细地进行描述。VHZ控制区的鉴定是直接的，并且可以以多种方式实施。例如，可以如下自生物体获得VHZ的编码序列，即使用人或小鼠VHZcDNA序列作为探针来筛选cDNA文库。可以通过筛选合适的基因组文库，或者通过如本领域中已知的引物延伸来获得5’序列。也可以采用基因组数据库的数据库搜索。特别感兴趣的此类5’序列包括非编码区。可以通过目视或者借助于计算机程序来检查5’区以鉴定指明启动子和/或增强子区存在的序列基序。此外，可以进行来自两种或更多种生物体的VHZ核酸序列的序列比对。通过比对来自不同物种的VHZ序列，有可能确定氨基酸序列的哪个区域在不同物种之间是保守的。此类保守区可能含有所讨论的基因(即VHZ)的控制区。出于此目的可以采用如本文所公开的小鼠和人基因组序列，例如小鼠VHZ基因组序列。此外，可以使用标准的筛选方法来获得来自其它生物体的VHZ同源物，其使用自小鼠和人VHZ序列生成的合适探针来实现。也可以筛选河豚(红鳍东方飩(Takifugurubripes))或斑马鱼的基因组来鉴定VHZ同源物；如此，已经鉴定出数种斑马鱼VHZ序列(上文所记录的)。可以使用河豚或斑马鱼VHZ基因与小鼠或人基因组VHZ序列的5’非编码区比较来鉴定含有控制区的保守区。也可以进行删除研究来鉴定VHZ的启动子和/或增强子区。可以通过分子生物学实验来证实推定的控制区的身份，其中将候选序列与报告基因连接，并检测报告物的表达。检测和诊断方法VHZ表达的检测我们在实施例中显示了，在与正常的乳腺组织相比时，乳腺癌组织中的VHZ表达是上调的。因而，我们提供了一种诊断癌症(包括乳腺癌诸如转移性、攻击性或侵入性乳腺癌)的方法，包括在个体的细胞或组织中检测VHZ表达的调控，诸如VHZ表达的上调。可以使用VHZ表达、活性或量的检测来提供一种测定细胞增殖状态的方法。如此，增殖性细胞是与正常细胞相比具有高水平的VHZ表达、活性或量的细胞。类似地，非增殖性细胞可以是与正常细胞相比具有低水平VHZ表达、活性或量的细胞。也可以使用此检测来测定细胞是否会变为侵入性的或攻击性的。如此，在细胞中检测出高水平的VHZ表达、量或活性可以指明该细胞有可能是或有可能变为攻击性的、转移性的或侵入性的。类似地，若细胞具有低水平的VHZ表达、量或活性，则所述细胞不是或者不太可能是攻击性的、转移性的或侵入性的。应当领会的是，若VHZ的水平随肿瘤的攻击性而变化，则也可以使用VHZ表达、量或活性的检测来预测患有癌症的个体的存活率，即高水平的VHZ指明较低的存活率或概率，而低水平的VHZ指明较高的存活率或概率，两者都如与具有正常水平的VHZ的个体或关联群体相比的。因此，VHZ表达、量或活性的检测可以作为对患有癌症的个体预后的方法使用。可以使用VHZ表达、量或水平的检测来测定特定疗法在患有癌症的个体中成功的可能性。它可以在测定个体中的肿瘤是否是或者是否有可能是侵入性或转移性肿瘤的方法中使用。本文件中所描述的诊断方法可以与所描述的治疗方法组合。如此，我们提供了一种在个体中治疗、预防或减轻癌症的方法，该方法包括检测所述个体的细胞中的VHZ的表达、量或活性的调控，并基于所述肿瘤的攻击性来向所述个体施用合适的疗法。所述疗法可以包含如上文所描述的抗VHZ剂。典型地，使用对乳房身体检查和乳房X线照相术来检测乳腺癌。通常采集肿瘤活检来进行组织病理学检查以诊断乳腺癌。可以使用VHZ表达、量或活性的检测与标准的组织病理学规程一起来诊断乳腺癌，或进一步证实乳腺癌的诊断。这在组织病理学分析没有产生清晰结果时可以是特别有用的。可以在样品中检测VHZ多肽和核酸的存在和数量，如下文更为详细地描述的。如此，可以通过如下方法来诊断VHZ相关疾病(包括乳腺癌)，所述方法包括从自受试者衍生的样品测定VHZ多肽或VHZmRNA的异常降低或升高的表达、量或活性，诸如升高的表达、量或活性。所述样品可以包含来自患有或怀疑患有与升高的、降低的或在其它方面异常的VHZ表达、量或活性(包括表达、量或活性的水平或样式的空间或时间变化)有关的疾病的生物体或个体的细胞或组织样品。比较患有或怀疑患有此类疾病的生物体中的VHZ表达、量或活性的水平或样式与正常生物体中的表达、量或活性的水平或样式可以有效作为诊断疾病的手段。所述样品可以包含来自患有或怀疑患有乳腺癌的个体的细胞或组织样品，诸如乳房组织或细胞样品。在一些实施方案中，在样品中检测出VHZ的表达、量或活性水平升高。在与正常细胞或已知不是癌性的细胞相比时，VHZ的水平可以是程度显著地升高的。可以自所测试的个体，或另一名个体诸如那些与所测试个体在年龄、体重、生活方式等方面匹配的个体获得此类细胞。在一些实施方案中，VHZ的表达、量或活性水平升高10%、20%、30%或40%或更多。在一些实施方案中，VHZ的表达、量或活性水平升高45%或更多，诸如50%或更多，如通过cDNA杂交所判断的。可以以多种方式来检测VHZ的表达、量或活性，如本领域中已知的，和如下文更为详细地描述的。通常，测量来自个体的组织样品中的VHZ量，并与来自不受影响的个体的样品比较。可以测量VHZ核酸以及VHZ多肽水平两者。可以使用VHZ量、活性或表达的检测来对乳腺癌分级。例如，高水平的VHZ量、活性或表达可以指明攻击性、侵入性或转移性癌症。类似地，低水平的VHZ量、活性或表达可以指明非攻击性、非侵入性或非转移性癌症。此分级系统可以与已经建立的分级系统诸如Elston-Ellis改良的Scarff，Bloom，Richardson分级系统(也称为Nottingham分级系统(NGS))(5,6,Haybittle等，1982)一起使用。此系统是研究最多且广泛使用的乳房肿瘤分级方法。NGS基于表型评分规程，其牵涉对肿瘤细胞的形态学和细胞学特征进行显微镜检查评估，包括小管形成的程度、细胞核多形性和有丝分裂计数(6)。这些得分的总和将乳房肿瘤分层成等级I(Gl)(充分分化的、缓慢生长中的)、等级II(G2)(中等分化的)、和等级III(G3)(较差分化的、高度增殖性的)恶性肿瘤。可以使用许多不同技术来测定VHZ基因表达的水平。在RNA水平测量VHZ的表达可以在RNA水平检测VHZ基因表达。因此，在一个实施方案中，我们公开了一种在样品中检测包含VHZ核酸的核酸的存在的方法，其如下进行，即使所述样品与对VHZ核酸特异性的至少一种核酸探针接触，并对所述样品监测VHZ核酸的存在。例如，所述核酸探针可以特异性结合VHZ核酸，或其一部分，并检测两者之间的结合；也可以检测复合物自身的存在。如此，在一个实施方案中，可以在样品中测量VHZmRNA形式的VHZ核酸的量。可以通过原位杂交、Northern印迹和逆转录酶-聚合酶链式反应来测定VHZmRNA。可以通过原位杂交、Southern印迹、单链构象多态性、PCR扩增和DNA芯片分析来鉴定核酸序列，其使用特异性引物(Kawasaki，1990；Sambrook,1992；Lichter等，1990；Orita等，1989；Fodor等，1993；Pease等，1994)。可以使用RNA提取技术(包括例如使用酸性酚/胍异硫氰酸盐提取(RNAzolB；Biogenesis)或RNeasyRNA制备试剂盒(Qiagen))自细胞提取VHZRNA。利用核糖核酸杂交的典型测定形式包括核连缀测定法(nuclearrun-onassay)、RT-PCR和RNA酶保护测定法(Melton等，Nuc.AcidsRes.127035)。可以采用的检测方法包括放射性标记物、酶标记物、化学发光标记物、荧光标记物和其它合适的标记物。这每一种方法容许进行定量测定，并且是本领域公知的。因此，可以使用本领域公知的对多核苷酸定量的任何方法在RNA水平测量降低的或升高的VHZ表达、量或活性。可以使用来自VHZ序列的任何合适的探针(例如合适的人VHZ序列的任何部分)作为探针。用于设计VHZ探针的序列可以包括具有登录号NM_015472的序列，或其部分。典型地，使用RT-PCR来扩增RNA靶物。在此方法中，使用逆转录酶来将RNA转变成互补DNA(cDNA)，然后可以扩增所述互补DNA以便于检测。许多DNA扩增方法是已知的，其中大多数依赖于酶促链式反应(诸如聚合酶链式反应、连接酶链式反应、或自主序列复制)或者复制它被克隆其中的载体的整个或部分。许多靶物和信号扩增方法已经记载于文献中，例如这些方法的一般性综述记载于Landegren,U.等，Science242:229_237(1988)禾口Lewis,R.,GeneticEngineeringNews101,54-55(1990)。例如，可以采用聚合酶链式反应来检测VHZmRNA。“聚合酶链式反应”或“PCR”是一种核酸扩增方法，其特别记载于美国专利号4，683，195和4，683，202。在诊断背景中可以使用PCR来扩增任何已知的核酸(Mok等，1994，GynaecologicOncology52:247-252)。自主序列复制(3SR)是TAS的变型，其牵涉经由由酶混合物和合适寡核苷酸引物介导的连续多轮逆转录酶(RT)、聚合酶和核酸酶活性来等温扩增核酸模板(Guatelli等，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA871874)。连接扩增反应或连接扩增系统使用DNA连接酶和4种寡核苷酸，每条靶链两种。此技术记载于Wu，D.Y.^Wallace,R.B.,1989,Genomics4:560。在Q3复制酶技术中，使用噬菌体Qβ的RNA复制酶(其复制单链RNA)来扩增靶DNA,如记载于Lizardi等，1988，Bio/Technology61197的。PCR规程基本上牵涉(1)处理所提取的DNA以形成单链互补链；(2)添加一对寡核苷酸引物，其中该对中的一条引物与有义链中的序列的一部分基本上互补，而每对中的另一条引物与互补反义链中的相同序列的不同部分基本上互补；(3)使配对引物与互补序列退火；(4)从每条引物的3’末端同时延伸退火的引物以合成与每条引物退火的链互补的延伸产物，其中所述延伸产物在与互补物分开后充当用于针对每对中的另一条引物合成延伸产物的模板；(5)分开所述延伸产物与所述模板以生成单链分子；并(6)通过重复至少一次所述退火、延伸和分开步骤来扩增所述单链分子。可以采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)。也可以使用定量RT-PCR。此类PCR技术是本领域公知的，并且可以采用来自VHZ序列的任何合适的引物。也可以利用备选的扩增技术。例如，滚环扩增(Lizardi等，1998，NatGenetl9225)是由DNA聚合酶驱动且能在等温条件下以线性或几何动力学复制环状寡核苷酸探针的商品化扩增技术(RCATTM)。一种别的技术，即链置换扩增(SDA;Walker等，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA80:392)以对特定靶物独特的明确限定的序列开始。在多肽水平测量VHZ表达可以在多肽水平检测VHZ表达。因此，在又一个实施方案中，可以通过检测样品中VHZ多肽的存在或量来检测VHZ表达、量或活性。这可以是通过使用结合VHZ多肽的分子来实现的。直接或间接结合VHZ多肽以便检测其存在的合适分子/试剂包括天然存在的分子诸如肽和蛋白质，例如抗体，或者它们可以是合成分子。如此，我们公开了一种检测VHZ多肽的存在的方法，即使细胞样品与能够结合所述多肽的抗体接触，并对所述样品监测所述多肽的存在。例如，可以使用抗VHZ抗体来检测VHZ多肽。可以通过本领域已知的手段(如下文更为详细地描述的)来制备此类抗体。例如，抗VHZ抗体可以包含任何针对VHZ的商品化抗体，诸如但不限于鸡抗人VHZ抗体(产品目录编号LS-C32281，氨基酸35至90，LS-C42458,LS-A6806和LS-A6803，LS-C32281,LifeSpanInc,Seattle,Washington,USA)、家兔抗人VHZ抗体(产品目录编号DS-PB-00676，RayBiotechInc,Norcross,Georgia,USA)、鸡抗人VHZ抗体(产品目录编号XW-7857，ProSciIncorporated,Poway,California,USA)、家兔抗人VHZ抗体(产品目录编号F4560和D9840-66A，UnitedStatesBiological,Swampscott,Massachusetts,USA)、鸡抗人VHZ抗体(产品目录编号D9840-66，UnitedStatesBiological,Swampscott,Massachusetts,USA)、家兔抗人VHZ抗体(产品目录编号AHPl142,AdBSerotec,Oxford,UnitedKingdom)、家兔抗人VHZ抗体(产品目录编号NBl10-40452,NovusBiologicals,Littleton,Colorado,USA)、鸡抗人VHZ抗体(产品目录编号NB100-75328，NovusBiologicals,Littleton,Colorado,USA)。这可以方便地通过监测抗体与多肽之间形成的复合物的存在，或者监测多肽与抗体之间的结合来实现。检测两个实体之间的结合的方法是本领域已知的，并且包括FRET(荧光共振能量转移)、表面等离振子共振等。可以使用标准的实验室技术诸如如上文所描述的免疫印迹来检测VHZ蛋白水平改变，如与相同细胞群体中的未处理细胞相比的。也可以通过检测VHZ多肽的翻译后加工或VHZ核酸的转录后修饰的变化来测定基因表达。例如，可以测量VHZ多肽的差异磷酸化、对VHZ多肽的切割或对VHZRAN的可变剪接等。可以使用专有的蛋白质测定法或技术诸如2D聚丙烯酰胺凝胶电泳来检测基因产物诸如VHZ多肽的表达水平以及它们的翻译后修饰。可以用于测定VHZ蛋白在自宿主衍生的样品中的水平的测定技术是本领域技术人员公知的。可以通过本领域已知的任何方法来对抗体测定免疫特异性结合。可以使用的免疫测定法包括但不限于使用如下技术的竞争性和非竞争性测定系统，诸如Western印迹、放射性免疫测定法、ELISA、三明治式免疫测定法、免疫沉淀测定法、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散测定法、凝集测定法、补体结合测定法、免疫放射计量测定法、荧光免疫测定法和蛋白A免疫测定法。此类测定法是本领域中常规的(参见例如Ausubel等编，1994，CurrentProtocolsinMolecularBiology，第1卷，JohnWiley&Sons，Inc.，NewYork，通过提及而完整收入本文)。可以通过免疫组织化学和免疫细胞化学染色来对标本测定多肽/蛋白质(一般参见Stites禾口Terr，BasicandClinicalImmunology，AppletonandLange，1994)、ELISA、RIA、免疫印迹、Western印迹、免疫沉淀、功能测定法和蛋白质截短测试。其它测定方法包括放射性免疫测定法、竞争性结合测定法、Western印迹分析和ELISA测定法。ELISA测定法是本领域技术人员公知的。可以在测定法中使用多克隆和单克隆抗体两者。若合适的话，可以使用本领域技术人员已知的其它免疫测定法，诸如放射性免疫测定法(RIA)。可用的免疫测定法广泛记载于专利和科学文献中。参见例如美国专利号3，791，932；3，839，153；3，850，752；3，850，578；3，853，987；3，867，517；3，879，262；3，901，654；3，935，074；3，984，533；3，996，345；4，034，074；4，098，876；4，879，219；5，011，771和5，281，521以及Sambrook等，1992。诊断试剂盒我们还提供了用于检测个体中的乳腺癌或个体中对乳腺癌的易感性的诊断试剂品.ο诊断试剂盒可以包含用于检测个体中的VHZ表达、量或活性的手段，其通过如本文件中所描述的任何手段来进行。因此，诊断试剂盒可以包含下列任何一种或多种VHZ多核苷酸或其片段；VHZ核酸的或其片段的互补核苷酸序列；VHZ多肽或其片段，或针对VHZ的抗体，诸如包含针对VHZ的抗VHZ抗体，例如抗肽抗体人VHZ抗体。诊断试剂盒可以包含使用指令或其它指示(indicia)。诊断试剂盒可以进一步包含用于治疗或预防乳腺癌的手段，诸如本文件中所描述的任何组合物，或本领域已知的用于治疗乳腺癌的任何手段。具体地，诊断试剂盒可以包含如所描述的抗VHZ剂，例如通过筛选获得的。诊断试剂盒可以包含治疗药物诸如他莫昔芬(Tamoxifen，Nolvadex)或其变体诸如他莫昔芬、柠檬酸他莫昔芬或任何其它的抗雌激素或雌激素阻断剂。治疗药物也可以包含抗VHZ抗体。预防和治疗方法我们公开了治疗与VHZ表达或活性的量不足有关的异常状况诸如乳腺癌的方法。预防乳腺癌(即防范)的方法也适合采用相同或类似的办法。一般而言，我们的方法牵涉通过调控(诸如下调)细胞中的VHZ表达、量或活性来操作癌细胞。可以在操作步骤前或后进行检测细胞中调控的VHZ表达、量或活性的步骤。检测步骤可以检测上调的或下调的VHZ表达、量或活性。可以使用调控或下调VHZ的任何方法，如本文件中别处详细描述的。所述方法可以包括将细胞暴露于合适的siRNA、shRNA或嵌合RNAi。例如，可以采用DUSP23预先设计嵌合RNAi(产品目录编号H00054935-R01，NovusBiologicals,Littleton,Colorado,USA)来下调VHZmRNA表达。嵌合RNA干扰(嵌合RNAi)是小干扰RNA/DNA嵌合物触发对初始基因mRNA的破坏的过程。嵌合RNAi详细记载于Ui-TeiK等，2008，NucleicAcidsRes·，2008年4月；36:2136_2151，Naito等NucleicAcidsRes.,2005年7月；33:W589-W591,Ui-TeiK等，2004，NucleicAcidsRes.2004年2月9日；32(3):936-48及Naito等NucleicAcidsRes.2004年7月1日；32(网络服务器期号)W124-9。所述方法可以包括将细胞暴露于能够特异性结合VHZ的抗VHZ抗体。此类抗体可以包括任何商品化的抗VHZ抗体，如上文所列出的。依照我们的方法，由于所述操作，癌细胞变为非癌性的或者侵入性或转移性癌细胞变为非侵入性的或非转移性的。具体地，癌症可以包括乳腺癌。它可以包括侵入性或转移性癌症诸如侵入性导管癌(IDC)。因为VHZ与癌症的攻击性和侵入性有关，可以在患有癌症的个体的细胞中、在癌或非癌细胞中检测VHZ的水平，并且评估癌症的攻击性。与正常的细胞相比高水平的VHZ量、表达或活性指明攻击性或侵入性癌症，因此可需要和选择更强的或更严厉的疗法。类似地，较低水平可指明攻击性或侵入性较小的疗法。—般而言，可以使用本文所描述的办法来治疗任何VHZ相关疾病。VHZ相关疾病包括增殖性疾病，并且特别包括癌症。例如，VHZ相关疾病可以包括乳腺癌，诸如转移性、侵入性或攻击性乳腺癌。若相对于对照而言与疾病有关的状况受到显著抑制(即达50%或更多)，则VHZ相关疾病被定义为得到“治疗”。所述抑制相对于对照而言可以达至少75%，诸如相对于对照而言达90%、95%或100%。所述状况可以包括细胞增殖，或者它可以包括细胞周期时间、细胞数目、细胞迁移、细胞侵入性等。术语“治疗/处理”还包括预防或减轻癌症。VHZ多肽表示疗法抑制其功能的靶物，特别是在肿瘤细胞和其它增殖性细胞中。术语增殖性病症在本文中以广义使用，包括需要控制细胞周期的任何病症。具体地，增殖性病症包括恶性的和肿瘤发生前的(pre-neoplastic)病症。本文所描述的方法和组合物涉及治疗或诊断腺癌是特别有用的，诸如小细胞肺癌、和肾癌、子宫癌、前列腺癌、膀胱癌、卵巢癌、结肠癌和乳腺癌。例如，可治疗的恶性肿瘤包括急性和慢性白血病(leukaemia)、淋巴瘤(lymphoma)、骨髓瘤(myeloma)、肉瘤(sarcomas)诸如纤维肉瘤(fibrosarcoma)、粘液肉瘤(myxosarcoma)、月旨肪肉瘤(Iiposarcoma)、淋巴管内皮肉瘤(Iymphangioendotheliosarcoma)、血管肉瘤(angiosarcoma)、内皮肉瘤(endotheliosarcoma)、软骨肉瘤(chondrosarcoma)、骨源性肉瘤(osteogenicsarcoma)、脊索瘤(chordoma)、淋巴管肉瘤(Iymphangiosarcoma)、滑膜瘤(synovioma)、间皮瘤(mesothelioma)、平滑肌肉瘤(Ieimyosarcoma)、横纹肌肉瘤(rhabdomyosarcoma)、结肠癌(coloncarcinoma)、卵巢癌(ovariancancer)、前列腺癌(prostatecancer)、胰腺癌(pancreaticcancer)、乳腺癌(breastcancer)、鳞状细胞癌(squamouscellcarcinoma)、基底细胞癌(basalcellcarcinoma)、腺癌(adenocarcinoma)、汗腺癌(sweatglandcarcinoma)、皮脂腺癌(sebaceousglandcarcinoma)、乳头状癌(papillarycarcinoma)、乳头状腺癌(papillaryadenocarcinomas)、囊腺癌间(cystadenocarcinoma)、髓样癌(medullarycarcinoma)、支气管癌(bronchogeniccarcinoma)、绒毛膜癌(choriocarcinoma)、肾细胞癌(renalcellcarcinoma)、肝瘤(hepatoma)、胆管癌(bileductcarcinoma)、精原细胞瘤(seminoma)、胚胎性癌(embryonalcarcinoma)、宫颈癌(cervicalcancer)、辜丸肿瘤(testiculartumour)、肺癌(lungcarcinoma)、小细胞月市癌(smallcelllungcarcinoma)、月旁月光癌(bladdercarcinoma)、上皮癌(epithelialcarcinoma)、胶质瘤(glioma)、星形细胞瘤(astrocytoma)、室管膜瘤(ependymoma)>松果体瘤(pinealoma)、成血管细胞瘤(hemangioblastoma)、听神经瘤(acousticneuoma)、髓母细胞瘤(medulloblastoma)、颅咽管瘤(craniopharyngioma)、少突神经胶质瘤(oligodendroglioma)、脑膜瘤(menangioma)、黑素瘤(melanoma)、成神经细胞瘤(neutroblastoma)和视网膜母细胞瘤(retinoblastoma)。一种有可能用于治疗此类病症的办法是表达针对如本文所描述的VHZ多核苷酸的反义构建体，并向肿瘤细胞施用它们，以便抑制基因功能，并阻止肿瘤细胞生长或行进。可以使用反义构建体来抑制基因功能以阻止增殖性细胞的生长或行进。反义构建体，即与有义核酸或mRNA互补的核酸诸如RNA构建体详细记载于US6，100，090(Monia等)及Neckers等，1992，CritRevOncog3(1-2):175_231，通过提及而明确收入所述文件的教导。在一个具体的例子中，可以如下治疗或预防乳腺癌，即通过例如能够结合和破坏VHZmRNA的siRNA来完全或部分降低VHZ的量、表达或活性。我们明确提供了一种通过RNA干扰来下调VHZ的抗VHZ剂。抗VHZ剂可以包含小干扰RNA(siRNA)或短发夹RNA(shRNA)。它可以包含嵌合RNAi诸如DUSP23预先设计嵌合RNAi(产品目录编号H00054935-R01，NovusBiologicals,Littleton,Colorado,USA)。RNA干扰(RNAi)是一种通过直接引入双链RNA(dsRNA)诱导的转录后基因沉默(PTGS)的方法，并且已经显现为用于敲除多种生物体中的特定基因的表达的有用工具。RNAi记载于Fire等，Nature391:806_811(1998)。PTGS的其它方法是已知的，并且包括例如引入转基因或病毒。一般而言，在PTGS中，所沉默的基因的转录物被合成但不积累，因为其被快速降解。用于PTGS的方法(包括RNAi)记载于例如Ambion.com万维网网站，在目录“/hottopics/”中，在“rnai”文件中。本文中描述了适用于体外RNAi的方法。一种此类方法牵涉引入siRNA(小干扰RNA)。当前的模型指明这些21-23个核苷酸的dsRNA能诱导PTGS。用于设计有效的siRNA的方法记载于例如上文所描述的Ambion网站。RNA前体诸如短发夹RNA(shRNA)也可以由整个或部分VHZ核酸序列编码。或者，双链(ds)RNA是一种干扰一系列生物体中的基因表达的有力方式，最近已经显示了其在哺乳动物中是成功的(Wianny和Zernicka-Goetz，2000，NatCellBiol270-75)。可以将对应于VHZ多核苷酸序列的双链RNA导入候选生物体的卵母细胞和细胞中或者在其中进行表达以干扰VHZ活性。调控VHZ基因表达的其它方法是本领域技术人员已知的，并且包括显性负性办法。如此，另一种办法是使用本文件中的VHZ多肽的非功能性变体，其与内源基因产物竞争，导致功能抑制。VHZ的非功能性变体的一个例子是人序列(或对应人序列)的第95位半胱氨酸突变。实施例显示磷酸酶和相关生物学活性缺陷的VHZC95S变体的生成和使用。也可以通过引入抑制基因表达或功能活性的肽或小分子来调控VHZ基因表达。如此，可以向肿瘤或增殖性细胞施用通过本文所描述的测定法鉴定为结合或调控诸如下调VHZ多肽的量、活性或表达的化合物以阻止VHZ多肽的功能。可以与药学可接受载体一起以有效下调VHZ表达或活性的量施用此类化合物，或者通过活化或下调控制VHZ表达、活性或量的第二信号，由此减轻异常状况。针对如本文中所描述的VHZ多肽的合适抗体也可以作为治疗剂使用。抗VHZ抗体可以包含针对VHZ的家兔抗VHZ抗体。此外，抗VHZ抗体可以包含下列任何一项或多项鸡抗人VHZ抗体(产品目录编号LS-C32281，氨基酸35至90，LS-C42458，LS-A6806和LS-A6803,LS-C32281,LifeSpanInc,Seattle,Washington,USA)、家兔抗人VHZ抗体(产品目录编号DS-PB-00676，RayBiotechInc,Norcross,Georgia,USA)、鸡抗人VHZ抗体(产品目录编号XW-7857，ProSciIncorporated,Poway,California,USA)、家兔抗人VHZ抗体(产BnngF4560禾口D9840—66Α，UnitedStatesBiological，Swampscott,Massachusetts,USA)、鸡抗人VHZ抗体(产品目录编号D9840-66，UnitedStatesBiological,Swampscott,Massachusetts,USA)、家兔抗人VHZ抗体(产品目录编号AHP1142，AdBSerotec,Oxford,UnitedKingdom)、家兔抗人VHZ抗体(产品目录编号NB110-40452，NovusBiologicals,Littleton,Colorado,USA)、鸡抗人VHZ抗体(产品目录编号NB100-75328，NovusBiologicals,Littleton,Colorado,USA)。或者，可以采用基因疗法来控制受试者中相关细胞诸如乳房细胞进行的VHZ内源生成。例如，可以工程化改造编码VHZsiRNA或其一部分的多核苷酸以在复制缺陷型逆转录病毒载体中表达，如下文所讨论的。然后可以分离逆转录病毒表达构建体，并导入用含有编码抗VHZsiRNA的RNA的逆转录病毒质粒载体转导的包装细胞中，使得所述包装细胞此刻生成含有感兴趣序列的感染性病毒颗粒。可以给受试者施用这些生产细胞以在体内工程化改造细胞，并在体内调控VHZ多肽的表达。关于基因疗法的综述，参见第20章，GeneTherapyandotherMolecularGenetic-basedTherapeuticApproaches,(及其中所弓I用的参考文献)于HumanMolecularGenetics,TStrachan禾口APRead,BIOSScientificPublishersLtd(1996)。在一些实施方案中，VHZ的水平在乳房细胞中降低。此外，在此类实施方案中，治疗可以靶向乳房细胞，或者是对乳房细胞特异性的。VHZ的表达可以仅在患病的乳房细胞(即那些癌性细胞)中特异性降低，而在其它不患病的乳房细胞中基本上不降低。在这些方法中，VHZ的表达在其它细胞(即非乳房细胞的细胞)中基本上不降低。如此，在此类实施方案中，VHZ的水平在治疗过程中或者在治疗后在非乳房细胞中保持基本上相同或相似。可以通过靶向施用，即仅向乳房细胞而非其它细胞应用治疗来实现乳房细胞特异性的VHZ水平降低。然而，在其它实施方案中，采用乳房细胞中(而基本上不在其它细胞或组织类型中)的VHZ表达下调。此类方法可以有利地利用乳房特异性表达载体来进行例如siRNA的乳房特异性表达，如下文更为详细地描述的。转基因(抗VHZsiRNA)的乳房特异性表达癌基因疗法不得不选择性靶向肿瘤组织从而降低正常组织中的不想要的副作用。将转基因表达靶向恶性组织需要使用特定的调控元件，包括基于肿瘤生物学的启动子、组织特异性启动子和诱导型调控元件(Al)。基于肿瘤生物学的启动子某些基因在乳腺癌中是上调的。可以使用这些基因的启动子来驱动转基因的肿瘤选择性表达，其使用重组复制缺陷型逆转录病毒载体来实现。此类基因的例子包括血管内皮生长因子(VEGF)、血管内皮生长因子受体-I(VEGFR-I)和VEGFR-2，已知它们在乳腺癌中以肿瘤阶段依赖性方式上调(A2)。c_erbB2癌基因在乳腺癌中选择性上调(A3，A6)。L-丝束蛋白(plastin)、人肌动蛋白结合蛋白在恶性上皮细胞中而不是正常组织中(只是在成熟的造血细胞中有低水平表达)进行组成型且丰富的表达(A4)。已经发现了抗凋亡基因Bcl-2在乳腺癌细胞中上调(A5)。与正常的乳房组织相比，人乳房肿瘤表达高水平的MUCl(A7)。组织特异性启动子某些基因在乳房组织中特异性表达。此类基因的例子是人α-乳清蛋白(ALA)和绵羊乳球蛋白(BLG)。可以使用此类基因的启动子来驱动腺病毒载体中的转基因以乳腺癌细胞特异性方式表达(Α8)。可以通过修改对此组织具有亲和力的病毒诸如小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)来进行乳腺癌的基因疗法。可以使用此逆转录病毒的糖皮质激素响应性长末端重复(LTR)作为启动子用于转基因的糖皮质激素诱导的表达(Α9)。诱导型启动子使用诱导型启动子作为瞬时转基因表达的介导物。放射或化学治疗处理后，多种应激基因在乳房肿瘤中是上调的。此类应激基因的例子是热休克蛋白(HSP)(AlO)和多抗药性基因-I(MDR-I)(All)0因此，可以使用这些基因的启动子来驱动转基因在已经进行过放射或化学疗法的乳腺癌中的肿瘤特异性表达。通常通过直接瘤内注射含有感兴趣转基因的复制缺陷型腺病毒表达载体来实现转录靶向的基因疗法(Α6，Α12，Α13)。也可以通过瘤内注射与阳离子脂质体形成的脂质复合物来投递转基因(Α14，Α15)。乳腺癌依照本文所描述的方法和组合物，VHZ对于诊断或治疗乳腺癌是有用的。若本文件提及“癌症”，则这应当理解成包括转移性、攻击性或侵入性癌症。例如，所述癌症可以是与VHZ过表达有关的癌症。这意味着所讨论的癌症的癌细胞与非癌细胞相比展示出水平升高的VHZ表达或活性(或两者)。有数种类型的乳腺癌。最通常的是导管癌，其在乳房乳管的衬里中开始。另一种类型(即小叶癌)在产生母乳的小叶中开始。若恶性肿瘤侵入邻近的组织，则其被称为浸润性或侵入性癌症。在乳腺癌在乳房外扩散时，通常在臂下的淋巴结中发现癌细胞。乳腺癌细胞可以扩散出乳房，诸如至其它淋巴结、骨、肝、或肺。公认的乳腺癌阶段包括0期极早期乳腺癌。此类型的癌症尚未在乳房内或乳房外扩散。它有时称作DCIS、LCIS、或乳腺原位癌症或非侵入性癌症。I期癌症的大小不大于约1英寸，并且尚未在乳房外扩散。(也描述为早期乳腺癌。)II期存在任何下列各项癌症不大于1英寸，但是已经扩散至臂下的淋巴结；癌症在1和2英寸之间。它可以已经或者可以尚未扩散至臂下的淋巴结；癌症大于2英寸，但是尚未扩散至臂下的淋巴结。III期和IIIA期存在任何下列各项癌症小于2英寸，并且已经扩散至臂下的淋巴结，癌症还正进一步扩散至其它淋巴结；癌症大于2英寸，并且已经扩散至臂下的淋巴结。IIIB期存在任何下列各项癌症已经扩散至乳房附近的组织(皮肤、胸壁，包括胸腔中的肋骨和肌肉)；癌症已经扩散至胸壁内沿着胸骨的淋巴结。IV期癌症已经扩散至身体的其它部分，最通常是骨、肺、肝、或脑。或者，肿瘤已经局部扩散至颈内的皮肤和淋巴结，在锁骨附近。炎性乳腺癌炎性乳腺癌是罕见的，但是是极严重的攻击型乳腺癌。乳房可以显红色，并且感觉温暖。在乳房上可以有脊(ridges)、风团(welts)、或荨麻疹(hives)；或者皮肤可以显得具皱。它有时被误诊为简单感染。复发性乳腺癌复发性疾病指癌症在其已经得到治疗后又回复(复发)。它可以在乳房中、在胸腔(胸壁)的软组织中，或者在身体的另一部分中回复。乳腺原位癌癌-DCIS和LCIS所找到的许多乳腺癌是称为乳腺原位癌症或非侵入性癌症的极早期癌症。大多数这些癌症是通过乳房X线照相术找到的。这些极早期细胞变化可以变为侵入性乳腺癌。两种类型的乳腺原位癌包括下列各项DCIS(原位导管癌)，其意味着仅在乳房乳管的衬里中找到异常细胞。异常细胞尚未在导管外扩散。它们尚未在乳房内扩散，尚未扩散出乳房，尚未扩散至臂下的淋巴结，或者尚未扩散至身体的其它部分。有数种类型的DCIS。若不除去，一些类型可随着时间而变化，并变为侵入性癌症。一些可能从未变为侵入性癌症。(DCIS有时被称作导管内癌)。LCIS(原位小叶癌)，其意味着在乳小叶的衬里中找到异常细胞。虽然认为处于此非侵入性阶段的LCIS不是实际的乳腺癌，但是它是形成侵入性癌症风险升高的警告症候。对在乳房X线照片上发现的另一处肿块或不常见变化进行活检时有时找到LCIS。患有LCIS的患者具有25%的机率在接下去的25年期间在任一乳房中形成乳腺癌。微钙化是不能感觉到，但是能在乳房X线照片上看到的极小的钙斑点。它们由正在快速分裂的细胞形成。在它们在乳房的一个区域中簇集时，这可以是乳腺原位癌症的早期症候。通过乳房X线照相术找到的约半数乳腺癌表现为微钙化簇。另一半表现为肿块。诊断我们的诊断方法可以与任何已知的乳腺癌诊断方法一起使用，包括检测已知的乳腺癌基因BRCAl和BRCA2之任一者或两者中的突变。或者/另外，可以如下实施诊断，即通过例如使用抗Her2抗体来检测Her2表达。治疗已知的针对乳腺癌的治疗可以由下列任何一项或多项组成手术、放射疗法、化学疗法、高剂量化学疗法、激素疗法和免疫疗法。因而，本文所描述的任何治疗方法可以与任何一种或多种在先已知疗法组合。另外，可以使用任何一种或多种已知对治疗或减轻癌症有效的下列一般疗法。非特异性免疫调节剂非特异性免疫调节剂是刺激或间接提升免疫系统的物质。通常，这些药剂靶向关键的免疫系统细胞，并引起次反应诸如升高的细胞因子和免疫球蛋白生成。癌症治疗中使用的两种非特异性免疫调节剂是卡介苗(BCG)和左旋咪唑(levamisole)。本文所描述的抗VHZ剂可以与任何此类非特异性免疫调节剂一起使用。生物学应答修饰剂可以在实验室中生成一些抗体、细胞因子、和其它免疫系统物质以在癌症治疗中使用。这些物质通常称作生物学应答修饰剂(BRM)。它们改变身体的免疫防御与癌细胞之间的相互作用以加强、指导、或恢复身体抵抗疾病的能力。BRM包括干扰素、白介素、集落刺激因子、单克隆抗体、和疫苗。本文所描述的抗VHZ剂可以与任何此类生物学应答修饰剂一起使用。干扰素(IFN)有三种主要类型的干扰素-干扰素α、干扰素β、和干扰素Y；干扰素α是癌症治疗中最广泛使用的类型。干扰素能改善癌症患者的免疫系统针对癌细胞起作用的方式。另外，干扰素可以直接对癌细胞起作用，其通过减缓它们的生长或促进它们形成更具正常行为的细胞来实现。一些干扰素还可以刺激NK细胞、T细胞、和巨噬细胞，加强免疫系统的抗癌功能。本文所描述的抗VHZ剂可以与任何此类干扰素一起使用。白介素(IL)与干扰素一样，白介素是身体中天然存在的细胞因子。已经鉴定出许多白介素；白介素-2(IL-2或阿地白介素)已经在癌症治疗中进行了最广泛的研究。IL-2刺激许多能破坏癌细胞的免疫细胞诸如淋巴细胞的生长和活性。本文所描述的抗VHZ剂可以与任何此类白介素一起使用。集落刺激因子(CSF)集落刺激因子(CSF)(有时称作造血生长因子)通常不直接影响肿瘤细胞；更确切地，它们促进骨髓干细胞分裂和发育成白细胞、血小板、和红细胞。骨髓对于身体的免疫系统是至关重要的，因为它是所有血细胞的来源。G-CSF(非格司亭(filgrastim))和GM-CSF(沙格司亭(sargramostim))能增加白细胞的数目，由此降低接受化学疗法的患者的感染风险。G-CSF和GM-CSF还能刺激干细胞的生成，为干细胞或骨髓移植作准备；(促)红细胞生成素能增加红细胞的数目，并降低接受化学疗法的患者对输注红细胞的需要；而奥普瑞白介素(Oprelvekin)能降低接受化学疗法的患者对输注血小板的需要。本文所描述的抗VHZ剂可以与任何此类集落刺激因子一起使用。单克隆抗体(单抗)使用赫赛汀来治疗患有生成过量的称作HER-2的蛋白质的肿瘤的患者中的转移性乳腺癌。(约25%的乳腺癌肿瘤生成过量的HER-2)。在具体的实施方案中，本文所描述的治疗方法可以与施用抗Her2抗体(例如赫赛汀)组合给所关注的个体使用。本文所描述的抗VHZ剂可以与任何此类单克隆抗体一起使用。Her2/NeuHER-2/neu(erbB-2)基因产物是185_kDA跨膜受体酪氨酸激酶，其属于表皮生长因子受体家族。其较为详细地记载于Reese，D.M.等，StemCells，15，1_8(1997)，通过提及而将其收入本文。最近，已经对HER-2/neu在乳腺癌中的重要性给予了极大的关注。20_30%的人乳腺癌中过表达HER-2/neu，并且已经将升高的表达与不良的预后联系起来。此项发现已经导致赫赛汀，即针对HER-2/neu的抗体的开发，在测试中已经发现其延长转移性乳腺癌中的缓解(remission)时间。HER-2/neu是将生长信号传送至细胞核的细胞表面受体。赫赛汀表现为阻断这些信号，由此明显抑制HER-2/neu阳性乳腺癌中由HER-2/neu介导的细胞增殖。也已经在卵巢癌、胃癌、子宫内膜癌、唾液腺癌(salivarycancer)、胰腺癌、前列腺癌、结肠直肠癌、和非小细胞肺癌的一部分中发现了HER-2/neu的过表达。可用赫赛汀潜在地治疗与HER-2-neu过表达有关的其它癌症。因而，我们的诊断方法可以与在个体中检测Her2的过表达组合。同样地，在降低VHZ的活性、量或表达外，本文所描述的治疗方法可以包括给个体施用赫赛汀。因此，我们提供了VHZ核酸或VHZ多肽与抗Her2抗体一起的组合。我们还提供了抗VHZ抗体与抗Her2抗体一起的组合。在一些实施方案中，所述抗Her2抗体包含赫赛汀。筛选抗VHZ剂鉴定VHZ调控剂、激动剂和拮抗剂可以使用拮抗剂，特别是小分子来特异性抑制VHZ以作为抗VHZ剂使用。因此，我们公开了VHZ拮抗剂和小分子VHZ抑制剂，以及用于筛选这些的测定法。可以通过检测对结合或其它VHZ活性的调控诸如下调来筛选VHZ拮抗剂。因此，我们提供了一种能够下调VHZ多肽的表达、量或活性的化合物。可以在本文所描述的方法和组合物中使用此类化合物以治疗或预防癌症，特别是乳腺癌。因此，可以在例如细胞、无细胞的制备物、化学文库、和天然产物混合物中使用VHZ来评估小分子物质和配体的结合。这些物质和配体可以是天然物质和配体，或者可以是结构或功能模拟物。参见Coligan等，CurrentProtocolsinImmunology1(2)第5章(1991)。此外，可以进行筛选以鉴定影响VHZ表达(特别是在乳房细胞中)的因子。一般而言，用于激动剂和拮抗剂的测定法依赖于测定候选分子对一种或多种VHZ活性的影响。测定法可以牵涉在存在候选分子的情况中，和任选地在没有候选分子的情况中，或者在存在已知抑制或活化VHZ活性的分子的情况中测定VHZ活性。我们已经证明了VHZ的表达在乳腺癌细胞中是升高的；因而，可以采用对VHZ表达的控制来治疗乳腺癌和其它癌症。因此，期望找到刺激VHZ的表达和/或活性，或者能抑制此蛋白质的功能的化合物和药物。一般而言，出于治疗和预防目的对任何已知癌症，特别是乳腺癌采用激动剂和拮抗剂。“下调”包括对所研究行为的任何负面影响；这可以是完全的或者部分的。如此，在检测结合的情况中，候选拮抗剂能够降低、改善、或消除两个实体之间的结合。与在没有候选分子的情况中的结合(或无论哪种活性)相比，候选分子实现的结合(或任何其它活性)的下调可以是至少10%，诸如至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或更多。如此，适合于作为拮抗剂使用的候选分子是能够降低大于10%的结合或其它活性的分子。术语“化合物”指化学化合物(天然存在的或合成的)诸如生物学大分子(例如核酸、蛋白质、非肽、或有机分子)，或自生物学材料诸如细菌、植物、真菌、或动物(特别是哺乳动物)细胞或组织制成的提取物，或者甚至无机元素或分子。化合物可以是抗体。潜在的VHZ拮抗剂的例子包括抗体、小分子、核苷酸及其类似物，包括嘌呤和嘌呤类似物，寡核苷酸或与VHZ的结合配偶紧密相关的蛋白质，例如结合配偶的片段，或如下的小分子等，所述小分子结合VHZ多肽，但不引发响应，使得该多肽的活性得到阻止。筛选试剂盒可以将要进行的此类筛选所必需的材料包装入筛选试剂盒中。此类筛选试剂盒对于鉴定VHZ多肽的激动剂、拮抗剂、配体、受体、底物、酶等或降低或增强VHZ生成的化合物是有用的。筛选试剂盒可以包含(a)VHZ多肽；(b)表达VHZ多肽的重组细胞；或(c)针对VHZ多肽的抗体。筛选试剂盒可以包含文库。筛选试剂盒可以包含筛选所需要的任何一种或多种成分，如下文所描述的。任选地，筛选试剂盒可以包含使用指令。还可以提供能够在核酸水平检测VHZ表达的筛选试剂盒。此类试剂盒可以包含用于扩增VHZ的引物，或一对用于扩增的引物。可以自任何合适的序列(例如VHZ序列的一部分)选择所述一种或多种引物。鉴定引物序列的方法是本领域公知的，并且熟练技术人员会能够容易地设计此类引物。试剂盒可以包含用于VHZ表达的核酸探针，如本文件中所描述的。任选地，试剂盒还可以包含使用指令。理性设计可能能够与VHZ相互作用的候选化合物的理性设计可以基于VHZ多肽的分子形状的结构研究。一种用于测定哪些位点与特定的其它蛋白质相互作用的手段是物理结构测定，例如X射线晶体学或二维NMR技术。这些会提供关于哪些氨基酸残基形成分子接触区的指导。关于蛋白质结构测定的详细描述，参见例如Blundell和Johnson(1976)ProteinCrystallography,AcademicPress,NewYork。多肽结合测定法可以通过本领域已知的任何手段来鉴定VHZ活性或表达的调控剂和拮抗剂。在它们的最简单形式中，测定法可以仅包括以下步骤，即混合候选化合物与含有VHZ多肽的溶液以形成混合物，测量混合物中的VHZ多肽活性，并比较混合物与标准品的活性。此外，可以在检测VHZ与推定分子之间的结合的测定法中通过对VHZ的结合来鉴定分子。一类用于鉴定结合本文所描述的VHZ多肽的物质的测定法牵涉使固定化在固体支持物上的VHZ多肽与非固定化的候选物质接触，测定感兴趣的VHZ多肽与候选物质是否彼此结合和/或以何种程度彼此结合。或者，候选物质可以是固定化的，而如本文件中所列出的VHZ多肽是非固定化的。所述物质与VHZ多肽的结合可以是瞬时的、可逆的或永久的。所述物质可以以如下的Kd值结合所述多肽，所述Kd值低于结合对照多肽(例如已知不涉及癌症生长或行进的多肽)的Kd值。所述物质的Kd值可以比结合对照多肽的Kd值小2倍，诸如比结合对照多肽的Kd小100倍的Kd值或小1000倍的Kd。在一个例示性的测定方法中，可以在珠诸如琼脂糖珠上固定化VHZ多肽。通常，这可以如下实现，即在细菌、酵母或高等真核细胞系中以GST-融合蛋白表达VHZ多肽，并使用谷胱甘肽_琼脂糖珠自粗制细胞提取物纯化GST-VHZ融合蛋白(Smith和Johnson，1988；Gene67(10):31_40)。作为对照，可以在没有VHZ多肽的情况中测定候选物质(其不是GST-融合蛋白)与固定化的多肽的结合。然后可以测定候选物质与固定化的VHZ多肽的结合。此类测定法在本领域中称为GST下拉(pulldown)测定法。再一次，候选物质可以是固定化的，而VHZ多肽是非固定化的。使用不同亲和纯化系统(例如Ni-NTA琼脂糖和加有组氨酸标签的成分)固定化成分之一来实施此类型的测定法也是有可能的。可以通过本领域公知的多种方法来测定多肽与候选物质的结合。例如，可以(用例如放射性标记物、表位标签或酶-抗体偶联物)标记非固定化的成分。或者，可以通过免疫学检测技术来测定结合。例如，可以对反应混合物进行Western印迹，并用检测非固定化成分的抗体探查印迹。也可以使用ELISA技术。通常添加候选物质至1至lOOOnmol/ml，诸如1至lOOnmol/ml的终浓度。在抗体的情况中，所使用的终浓度通常自100至500μg/ml，诸如自200至300μg/ml。也可以通过检测对VHZ与此多肽结合的任何分子之间的结合的调控，或对因此类结合或释放引起的任何活性的调控来鉴定VHZ的调控剂和拮抗剂。基于细胞的测定法基于细胞的测定法可以仅测试候选化合物的结合，其中借助于与候选化合物直接或间接关联的标记物或者在牵涉与经标记竞争剂竞争的测定法中检测对携带VHZ多肽的细胞的粘着。此外，这些测定法可以测试候选化合物是否导致通过结合VHZ多肽产生的信号，其使用适合于在其表面上携带多肽的细胞的检测系统来实现。一般而言，在存在已知激动剂的情况中测定活化的抑制剂，并观察候选化合物的存在对激动剂进行的活化的影响。另一种筛选化合物的方法利用用表达化合物文库的重组DNA分子稳定转化的真核或原核宿主细胞。可以使用此类细胞(或是活的或是固定的形式)来进行标准结合配偶测定法。还可参见Parce等(1989)Science246:243_247；和Owicki等(1990)Proc.Nat，1Acad.Sci.USA87；4007-4011，其记载了用于检测细胞应答的灵敏方法。竞争性测定法是特别有用的，其中使表达化合物文库的细胞与已知结合VHZ多肽的经标记抗体(诸如1251-抗体)、和测试样品诸如候选化合物(其就是要测量其对结合组分的结合亲和力的)接触或一起温育。然后分开结合的和游离的经标记VHZ多肽结合配偶以评估结合程度。所结合的测试样品量与结合VHZ多肽的经标记抗体量成反比。可以使用众多技术之任一种来分开结合的与游离的结合配偶以评估结合程度。此分开步骤通常可牵涉如下规程，诸如对滤器的粘着，接着进行清洗，对塑料的粘着，接着进行清洗，或细胞膜离心。所述测定法可以牵涉将候选分子暴露于细胞，诸如乳房细胞，并通过任何合适的手段来测定VHZ的表达。任选地，可以选择在此类测定法中下调VHZ表达的分子，用于进一步的研究，和作为下调VHZ表达的药物使用。可以有效地采用此类药物来治疗或预防乳腺癌。也可以使用编码VHZ蛋白的cDNA和针对所述蛋白质的抗体来配置用于检测添加的化合物对细胞中VHZmRNA和蛋白质生成的影响的测定法。例如，可以构建如下的ELISA，其用于通过本领域已知的标准方法使用单克隆和多克隆抗体来测量分泌的或细胞结合的VHZ多肽水平，并且这可以用于发现可抑制或增强自合适操作的细胞或组织生成VHZ蛋白的药剂(分别也称作拮抗剂或激动剂)。用于进行筛选测定法的标准方法是本领域中充分理解的。活性测定法用于检测调控剂或拮抗剂的测定法通常牵涉在存在候选分子的情况中检测对VHZ的任何活性的调控，任选地，以及在没有候选分子的情况中检测对活性的调控。可以使用检测VHZ特定生物学活性诸如磷酸酶活性的测定法。该测定法通常牵涉使候选分子(例如文库形式)与VHZ(无论以多肽、编码多肽的核酸、还是以包含其的细胞、细胞器、提取物或其它材料形式)及候选调控剂接触。可以检测VHZ的相关活性(诸如磷酸酶活性，如下文所描述的)，以建立候选调控剂的存在是否有任何效果。磷酸酶测定法是本领域已知的，并且记载于Wu等(2004)，IntJBiochemCellBiol.36(8)1542-53和Alonso等(2004).JBiolChem.20；279(34):35768_74。此类测定法包括测定VHZ使合适的底物诸如对硝基苯基磷酸酯，或者如含有磷酸酪氨酸和磷酸苏氨酸残基的寡肽去磷酸化的能力。可以在存在或没有候选调控剂的情况中实施测定法，并检测合适的活性以检测对VHZ活性的调控，因此鉴定VHZ的候选调控剂和/或拮抗剂。也可以使用用于检测能结合和/或影响VHZ的转录或表达的候选调控剂的启动子结合测定法。然后可以为进一步研究而选择或分离候选调控剂，或为了使用而分离候选调控剂。此类筛选规程的详情是本领域公知的，并且例如记载于HandbookofDrugScreening,RamakrishnaSeethala,PrabhavathiB.Fernandes编(2001,NewYork,NY,MarcelDekker,ISBN0-8247-0562-9)。本文所描述的筛选方法可以采用体内测定法，虽然它们可以为了体外使用而进行设定。体内测定法一般牵涉将包含VHZ的细胞暴露于候选分子。在体外测定法中，将VHZ暴露于候选分子，任选地，在存在其他成分诸如粗制的或半纯化的细胞提取物，或纯化的蛋白质的情况中。若进行体外测定法，则这些可以采用候选分子的阵列(例如阵列化的文库)。可以采用体内测定法。因此，VHZ多肽可包含在细胞中，诸如以异源方式。此类细胞可以是转基因细胞，其已经进行过工程化改造以表达如上文所描述的VHZ。若采用提取物，则它可以包含细胞质提取物或细胞核提取物，其制备方法是本领域公知的。应当领会的是，可以采用包含VHZ的细胞的任何成分，诸如细胞器。一个实施方案利用细胞质或细胞核制备物，例如包含细胞核，其包含如所描述的VHZ。细胞核制备物可以包含一个或多个细胞核，其可通过例如去污剂处理来透化(permeabilise)或半透化。如此，在一个具体的实施方案中，测定形式可以包括建立多孔微量滴定板，每孔中包括一个或多个表达VHZ多肽的细胞；可以将自例如文库衍生的个别候选分子，或候选分子的集合添加至各个孔，并测量对VHZ活性的调控。若使用集合，则可以将这些细分成进一步的集合，并以相同的方式测试。然后可以测定VHZ活性，例如结合活性或转录共活化活性，如本文件别处所描述的。作为上文所描述的测定方法的替代或附加，也可以使用“扣除”规程来鉴定VHZ的调控剂或拮抗剂。在此类“扣除”规程下，提供了多种分子，其包含一种或多种能够发挥调控剂功能的候选分子(例如细胞提取物、细胞核提取物、分子文库等)，并从所述多种分子除去、消减或扣除一种或多种成分。然后通过暴露于包含所述VHZ的细胞(或其成分)来对“扣除后的，，提取物等测定活性。如此，例如，可以进行“免疫消减”测定法来如下鉴定此类调控剂。可以自合适的细胞制备细胞质或细胞核提取物。可以消减或分级提取物来除去推定的调控剂，诸如通过使用用合适的抗体进行的免疫消减来实现。若提取物消减去调控剂，则它会丧失影响VHZ功能或活性或表达的能力。可能需要一系列扣除和/或消减来鉴定调控剂或拮抗剂。还应当领会的是，可以使用上文的“消减”或“扣除”测定法作为初步步骤来鉴定推定的调控因子以进行进一步筛选。此外/或者，可以使用“消减”或“扣除”测定法来证实通过其它手段(例如如本文件别处所描述的“正”筛选)鉴定为推定的调控剂的分子的调控活性。可以分离进行所述测定法并发现为感兴趣的候选分子，并进行进一步研究。分离感兴趣分子的方法会取决于所采用分子的类型、其是否处于文库形式、在任一时间测试多少候选分子、是否遵循分批规程等。可以以文库形式提供候选分子。在一个实施方案中，可以同时筛选超过一种候选分子。可以通过本领域已知的手段来生成候选分子的文库，例如，小分子文库、多肽文库、核酸文库、化合物文库(诸如组合文库)、反义分子诸如反义DNA或反义RNA的文库、抗体文库等。此类文库适合于高通量筛选。可以将包含VHZ的不同细胞暴露于文库的各成员，并测定对VHZ活性的影响。可以为此目的采用阵列技术。细胞在空间上可以是分开的，例如在微量滴定板的孔中。在一个实施方案中，采用小分子文库。“小分子”指其分子量可以小于约50kDa的分子。在具体的实施方案中，小分子可以具有小于约30kDa，诸如小于约15kDa或小于约IOkDa左右的分子量。此类小分子的文库(在本文称为“小分子文库”)可以含有多肽、小肽，例如20个氨基酸或更少(例如15、10或5个氨基酸)的肽、简单化合物等。或者/另外，可以对组合文库(如下文更为详细地描述的)筛选VHZ的调控剂或拮抗剂。上文描述了用于VHZ活性的测定法。文库可以在本文所描述的VHZ拮抗剂和抑制剂的筛选中采用候选分子的文库，诸如多肽或核酸的文库。将此类文库暴露于VHZ蛋白，并测定它们对蛋白质活性的影响，若有的话。用于分离大文库的想要成员的选择方案是本领域已知的，如噬菌体展示技术所代表的。已经证明了此类系统(其中多种多样的肽序列展示在丝状噬菌体的表面上(Scott和Smith(1990见上文))可用于创建抗体片段(和编码它们的核苷酸序列)的文库来体外选择和扩增结合靶抗原的特异性抗体片段。将编码Vh和\区的核苷酸序列与编码将它们指引至大肠杆菌(E.coli)的周质空间的前导信号的基因片段连接，因此所得的抗体片段展示在噬菌体的表面上，通常作为与噬菌体外壳蛋白(例如pill或pVIII)的融合物。或者，在λ噬菌体壳体上在外部展示抗体片段(噬菌体抗体(phagebody))。基于噬菌体的展示系统的优点在于，因为它们是生物学系统，所以能仅仅通过在细菌细胞中培养含有选定文库成员的噬菌体来扩增选定的文库成员。此外，因为编码多肽文库成员的核苷酸序列包含在噬菌体或噬菌粒载体上，所以测序、表达和随后的遗传操作是相对直接的。用于构建噬菌体抗体展示文库和λ噬菌体表达文库的方法是本领域公知的(McCafferty等(1990)见上文；Kang等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.Α.,884363；Clackson等(1991)Nature,352624；Lowman等(1991)Biochemistry,3010832；Burton等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.Α.,8810134；Hoogenboom^(1991)NucleicAcidsRes.，194133；Chang等(1991)J.Immunol.，1473610；Breitling等(1991)Gene,104147；Marks等(1991)见上文；Barbas等(1992)见上文；Hawkins和Winter(1992)JImmunol.,22867；Marksφ,1992,J.Biol.Chem.,26716007；Lerner等(1992)Science,258:1313，通过提及而收入本文)。若对于表达(一般是多肽文库的)必要的话，可以修改此类技术。一种特别有利的办法是scFv噬菌体文库的使用(Bird，R.Ε.等(1988)Science242423-6,Huston等，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.Α.，85:5879_5883；Chaudhary等(1990)Proc.Natl.Acad.SciU.S.A.,871066-1070；McCafferty^(1990)见上文；Clackson等(1991)见上文；Marks等(1991)见上文；Chiswell等(1992)TrendsBiotech.，1080；Marks等(1992)见上文)。展示在噬菌体外壳蛋白上的scFv文库的各种实施方案已经有记载。噬菌体展示办法的改进也是已知的，例如如记载于W096/06213、W092/01047(MedicalResearchCouncil等)和W097/08320(Morphosys,见上文)的，通过提及而将其收入本文。备选的文库选择技术包括噬菌体λ表达系统，其可以直接以噬菌体噬斑或者以溶源体菌落筛选，均如先前所记载的(Huse等(1989)Science,2461275；Caton^PKoprowski(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.Α.,87；Mullinax等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.Α.,878095；Persson等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.Α.,882432),并且在本文所描述的方法和组合物中使用。可以使用这些表达系统来筛选文库中约IO6或甚至更高阶的众多不同成员。其它筛选系统依赖于例如文库成员的直接化学合成。一种早期方法牵涉在一组针或棒上合成肽，诸如记载于W084/03564的。一种牵涉珠上的肽合成的类似方法(其形成肽文库，其中每粒珠是单个文库成员)记载于美国专利号4，631，211，而一种相关方法记载于W092/00091。基于珠的方法的显著改进牵涉用独特的标识标签诸如寡核苷酸给每粒珠加上标签，以便促进对每个文库成员的氨基酸序列的鉴定。这些改良的基于珠的方法记载于W093/06121。另一种化学合成方法牵涉以如下方式在表面上合成肽(或肽模拟物(peptidomimetics))的阵列，所述方式在阵列中在离散的、预定的位置处放置每个独特的文库成员(例如独特的肽序列)。每个文库成员的身份由其在阵列中的空间位置决定。测定阵列中发生预先确定的分子(例如受体)与反应性文库成员之间的结合相互作用的位置，由此基于空间位置来鉴定反应性文库成员的序列。这些方法记载于美国专利号5，143，854；W090/15070和W092/10092；Fodor等(1991)Science,251767；Dower和Fodor(1991)Ann.Rep.Med.Chem.，26271。用于生成多肽或核苷酸文库的其它系统牵涉使用无细胞的酶促机器(machinery)来在体外合成文库成员。在一种方法中，通过交替多轮的针对靶配体的选择和PCR扩增来选择RNA分子(Tuerk和Gold(1990)Science，249505；Ellington和Szostak(1990)Nature,346:818)。可以使用类似的技术来鉴定结合预先确定的人转录因子的DNA序列(Thiesen禾口Bach(1990)NucleicAcidsRes.，183203；Beaudry禾口Joyce(1992)Science,257635；W092/05258和W092/14843)。以类似的方式，可以使用体外翻译来合成多肽，作为一种用于生成大文库的方法。这些一般包含稳定化的多核糖体复合物的方法进一步记载于W088/08453，W090/05785,W090/07003,W091/02076,W091/05058，和W092/02536。不基于噬菌体的备选展示系统诸如那些披露于W095/22625和W095/11922(Affymax)的展示系统使用多核糖体来展示多肽以进行选择。也通过提及而将这些和所有上述文件收入本文。组合文库文库，特别是候选分子的文库可以适当地处于组合文库(也称为组合化学文库)的形式。“组合文库”在该术语在本文件中使用时指由随机选择的亚基组成的多种化学化合物的集合。可以对组合文库筛选能够抑制VHZ的分子。化学化合物的多种组合文库是目前可用的，包括对蛋白水解酶和非蛋白水解酶有活性的文库、G蛋白偶联受体(GPCR)的激动剂和拮抗剂的文库、对非GPCR靶物(例如整联蛋白、离子通道、域相互作用、细胞核受体、和转录因子)有活性的文库和全细胞肿瘤学和抗感染靴物的文库等。在Dolle和Nelson(1999)，JournalofCombinatorialChemistry，第1卷第4期，235-282中提供了组合文库，特别是其构建和用途的全面综述。还可参考Combinatorialpeptidelibraryprotocols(ShmuelCabilly编，Totowa,NJ.HumanaPress,cl998.MethodsinMolecularBiologyv.87)。特定的组合文库和其构建方法披露于美国专利6，168，914(Campbell等)，以及Baldwin等(1995)，"SynthesisofaSmallMoleculeLibraryEncodedwithMolecularTags,"J.Am.Chem.Soc.1175588-5589，及那些文件中所提及的参考文献。在一个实施方案中，筛选的组合文库是为了潜在地包括与细胞成分相互作用以影响基因表达的分子而设计的组合文库。例如，可以筛选针对染色质结构蛋白的组合文库。对于该实施方案有用的其它文库包括针对组蛋白修饰酶(例如组蛋白乙酰化或组蛋白甲基化酶)、或DNA修饰(例如DNA甲基化或脱甲基化)的组合文库。记载化学组合文库、其生成和用途的别的参考文献包括那些可自URLhttp://www.netsci.org/Science/Combichem/获得的，包括TheChemicalGenerationofMolecularDiversity.MichaelR.Pavia，SphinxPharmaceuticals，ADivisionofEliLilly(1995年7月出片反)；CombinatorialChemistry:AStrategyfortheFuture-MDLInformationSystemsdiscussestheroleitsProjectLibraryplaysinmanagingdiversitylibraries(1995年7月出片反)；SolidSupportCombinatorialChemistryinLeadDiscoveryandSAROptimization,AdnanM.M.Mjalli禾口BarryE.Toyonaga,OntogenCorporation(1995年7月出片反)；Non-PeptidicBradykininReceptorAntagonistsFromaStructurallyDirectedNon-PeptideLibrary.SarvajitChakravarty,BabuJ.Mavunkel,RobinAndy,DonaldJ.Kyle*，SciosNovaInc.(1995年7月出片反)；CombinatorialChemistryLibraryDesignusingPharmacophoreDiversityKeithDaviesandCliveBriant,ChemicalDesignLtd.(1995年7月出片反)；ADatabaseSystemforCombinatorialSynthesisExperiments-CraigJamesandDavidWeininger,DaylightChemicalInformationSystems,Inc.(1995年7月出片反)；AnInformationManagementArchitectureforCombinatorialChemistry,KeithDaviesandCatherineWhite,ChemicalDesignLtd.(1995年7月出片反)；NovelSoffwareToolsforAddressingChemicalDiversity,R.S.PearIman,LaboratoryforMolecularGraphicsandTheoreticalModeling,CollegeofPharmacy,UniversityofTexas(1996年6月/7月出片反)；OpportunitiesforComputationalChemistsAffordedbytheNewStrategiesinDrugDiscovery:AnOpinion,YvonneConnollyMartin,ComputerAssistedMolecularDesignProject,AbbottLaboratories(1996年6月/7月出片反)；CombinatorialChemistryandMolecularDiversityCourseattheUniversityofLouisville:ADescription,ArnoF.Spatola,DepartmentofChemistry,UniversityofLouisville(1996年6月/7月出版)；ChemicallyGeneratedScreeningLibraries:PresentandFuture.MichaelR.Pavia,SphinxPharmaceuticals,ADivisionofEliLilly(1996年6月/7月出版)；ChemicalStrategiesForIntroducingCarbohydrateMolecularDiversityIntoTheDrugDiscoveryProcess.MichaelJ.Sofia,TranscellTechnologiesInc.(1996年6月/7月出片反)；DataManagementforCombinatorialChemistry.MaryjoZaborowski,ChironCorporation禾口SheilaH.DeWitt,Parke-DavisPharmaceuticalResearch,DivisionofWarner-LambertCompany(1995^11^Hj)；及TheImpactofHighThroughputOrganicSynthesisonR&DinBio-BasedIndustries,JohnP.Devlin(1996年3月出片反)。组合化学中的技术在用于产生新的药学前导物(pharmaceuticallead)的现代方法中获得广泛的接受(Gallop,Μ.Α.等，1994，J.Med.Chem.37:1233_1251；Gordon,Ε.Μ.等，1994，J.Med.Chem.37:1385-1401)。使用的一种组合办法基于如下策略，其牵涉在每个固相支持物颗粒上合成含有不同结构的文库，使文库与可溶性受体相互作用，鉴定与大分子靶物相互作用的“珠”，并测定由鉴定出的“珠”携带的结构(Lam,K.S.等，1991，Nature35482-84)。此办法的一种备选是自固体支持物序贯释放化合物的确定等分试样，随后测定溶液中的活性，鉴定释放活性化合物的颗粒，并通过直接测序(Salmon，S.Ε.等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:11708-11712)，或者通过阅读其密码(Kerr,J.Μ.等，1993，J.Am.Chem.Soc.115:2529_2531；Nikolaiev,V.等，1993，P印t.Res.6:161_170；Ohlmeyer,M.H.J.等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA9010922-10926)来阐明其结构。可以使用由Furka首次记载的用于产生肽的等摩尔混合物的简单原理来合成(Furka,Α.φ,1988,XthInternationalSymposiumonMedicinalChemistry,Budapest1988；Furka,A.等，1988,14thInternationalCongressofBiochemistry,Prague1988；Furka,A.等，1991,Int.J.PeptideProteinRes.37487-493)。用于重复筛选的可溶性文库的构建也已经有记载(Houghten，R.Α.等，1991，Nature354:84_86)。K.S.Lam披露了使用不溶性随机组合文库的新的且有力得出乎意料的技术。Lam在固相支持物上合成随机组合文库，使得每个支持物具有一致分子结构的测试化合物，并在事先不从支持物除去测试化合物的情况中通过固相结合方案来筛选文库(Lam,K.S.等，1991，Nature354:82-84)。如此，候选分子的文库可以是合成的组合文库(例如组合化学文库)、细胞提取物、体液(例如尿液、血液、泪液、汗液、或唾液)，或者合成的或天然的产物的其它混合物(例如小分子的文库或发酵混合物)。分子文库可以包括例如氨基酸、寡肽、多肽、蛋白质、或肽或蛋白质的片段；核酸(例如反义的；DNA；RNA；或肽核酸，即PNA)；适体；或碳水化合物或多糖。文库的每个成员可以是单个的或者可以是混合物(例如压缩的文库)的一部分。文库可以含有纯化的化合物或者可以是“脏的”(即，含有显著数量的杂质)。也可以与本文所描述的方法一起使用商品化的文库(例如来自Affymetrix、ArQuleλNeoseTechnologies、SarcoΛCiddco、OxfordAsymmetry、Maybridge、Aldrich、Panlabs、Pharmacopoeia、Sigma、$Tripose)0在如上文所描述的文库外，可以使用称作多样性文件的特殊文库来评估新方法的特异性、可靠性、或再现性。多样性文件含有许多化合物(例如1000种或更多种小分子)，其代表多类能潜在导致测定法中的非特异性检测的化合物。多样性文件是商品化的或者也可以自购自上文所列厂商的个别化合物装配。抗VHZ抗体抗VHZ剂(包括VHZ的拮抗剂或调控剂)(其可以用于调节此蛋白质的活性，例如用于治疗或预防疾病诸如癌症的方法，如本文件中所描述的)可以包括针对VHZ蛋白的抗体。因此，我们提供了结合VHZ多肽、其片段、同源物、变体或衍生物的抗体。此类抗体在检测VHZ表达，并且特别在诊断VHZ相关疾病诸如乳腺癌中是有用的。其它抗体包括那些具有治疗活性的，即其可以以治疗方式用于治疗、管理或预防任何VHZ相关疾病(包括乳腺癌)。可以通过与人VHZ的氨基酸残基(126-140)对应的肽RRLRPGSIETYEQEK进行的免疫来生成针对VHZ的抗体，如实施例中所描述的。能够结合VHZ的抗体的例子包括鸡抗人VHZ抗体(产品目录编号LS-C32281，氨基酸35至90，LS-C42458,LS-A6806和LS-A6803，LS-C32281，LifeSpanInc,Seattle,Washington,USA)、家兔抗人VHZ抗体(产品目录编号DS-PB-00676，RayBiotechInc,Norcross,Georgia,USA)、鸡抗人VHZ抗体(产品目录编号XW-7857，ProSciIncorporated,Poway,California,USA)、家兔抗人VHZ抗体(产品目录编号F4560和D9840-66A，UnitedStatesBiological,Swampscott,Massachusetts,USA)>X|ifiAVHZJfi#(ΛβπD9840-66,UnitedStatesBiological,Swampscott,Massachusetts,USA)、家兔抗人VHZ抗体(产品目录编号AHP1142，AdBSerotec，Oxford，UnitedKingdom)、家兔抗人VHZ抗体(产品目录编号NBl10-40452，NovusBiologicals,Littleton,Colorado,USA)、鸡抗人VHZ抗体(产品目录编号NB100-75328，NovusBiologicals,Littleton,Colorado,USA)。此外，可以针对任何合适的表位(例如自VHZ蛋白衍生的表位)生成对VHZ特异性的抗体。合适的VHZ片段的序列可以包含VHZ的残基C95，并且可以使用来自此序列的任何表位来生成特异性VHZ抗体。出于本文件的目的，术语“抗体”指能够结合选定靶物的完整抗体或抗体片段。除非相反地规定，该术语包括但不限于多克隆的、单克隆的、天然的或工程化改造的抗体，包括嵌合的、CDR嫁接的和人源化的抗体，和使用噬菌体展示或备选技术生成的人工选择的抗体。该术语还包括单链、Fab片段和自Fab表达文库生成的片段。此类片段包括整个抗体中保留其对靶物质的结合活性的片段、Fv、F(ab’)和F(ab’)2片段，以及单链抗体(scFv)、包含抗体的抗原结合位点的融合蛋白和其它合成蛋白。小片段诸如Fv和ScFv由于其小尺寸和随后的卓越组织分布而在诊断和治疗应用方面拥有有利的特性。抗体及其片段可以是人源化抗体，例如如记载于EP-A-239400的。此外，也可以使用具有完全人的可变区的抗体(或其片段)，例如如记载于美国专利号5，545，807和6，075，181的。中和性抗体(即那些抑制VHZ的任何生物学活性的抗体)可以用于诊断学和治疗学。本文所描述的抗体可以是经过改变的抗体，其包含效应蛋白诸如标记物。可以使用容许在体内或在体外对抗体分布成像的标记物。此类标记物可以是放射性标记物或不透射线的标记物，诸如金属颗粒，其可容易地在胚胎或细胞团内显现。此外，它们可以是在组织样品上可显现的荧光标记物或其它标记物。可以通过标准技术诸如通过免疫或者通过使用噬菌体展示文库来生成抗体。此类抗体可能够特异性结合VHZ蛋白或同源物、片段等。多克隆抗体若多克隆抗体是想要的，则可以用包含VHZ多肽或肽的免疫原性组合物来免疫选定的哺乳动物(例如小鼠、家兔、山羊、马等)。根据宿主物种，可以使用各种佐剂来提高免疫学应答。此类佐剂包括但不限于弗氏，矿物凝胶诸如氢氧化铝，和表面活性物质诸如溶血卵磷脂、Pluronic多元醇、聚阴离子、肽、油乳剂、匙孔i成血蓝蛋白、和二硝基苯酚。BCG(卡介苗)和小棒杆菌(Corynebacteriumparvum)是潜在有用的人佐剂，如果出于刺激系统防御的目的给免疫学受损的个体施用纯化的物质氨基酸序列，那么其可以被采用。依照已知的规程收集和处理来自经过免疫的动物的血清。若含有针对自VHZ多肽可获得的表位的多克隆抗体的血清含有针对其它抗原的抗体，则可以通过免疫亲和层析来纯化多克隆抗体。用于生成和加工多克隆抗血清的技术是本领域中已知的。为了可以制备此类抗体，我们还提供了作为半抗原与另一种氨基酸序列联合(haptenise)的VHZ氨基酸序列或其片段以在动物或人中作为免疫原使用。单克隆抗体本领域技术人员也能容易地生成针对自VHZ多肽或肽可获得的表位的单克隆抗体。用于通过杂交瘤制备单克隆抗体的一般方法是公知的。可以通过细胞融合，并且也可以通过其它技术诸如用致癌性DAN直接转化B淋巴细胞，或者用埃巴病毒进行转染来创建永生的抗体生成细胞系。可以对针对眶表位(orbitepitope)生成的数组单克隆抗体筛选各种特性，即同种型和表位亲和力。可以使用提供由培养中的连续细胞系进行的抗体分子生成的任何技术来制备单克隆抗体。这些包括但不限于最初由Koehler和Milstein记载的杂交瘤技术(1975Nature256:495-497)、三源杂交瘤(trioma)技术、人B细胞杂交瘤技术(Kosbor等(1983)ImmunolToday472；Cote等(1983)ProcNatlAcadSci80:2026_2030)和EBV杂交瘤技术(Cole等，MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy,第77页-第96页，AlanR.Liss,Inc.,1985)。可以使用重组DNA技术来改善抗体，如本文所描述的。如此，可以构建嵌合抗体以在诊断或治疗应用中降低其免疫原性。此类技术包括将小鼠抗体基因剪接至人抗体基因以获得具有合适的抗原特异性和生物学活性的分子(Morrison等(1984)ProcNatlAcadSci816851-6855；Neuberger等(1984)Nature312:604_608；Takeda等(1985)Nature314452-454)。此外，可以如下使免疫原性最小化，即通过⑶R嫁接[参见欧洲专利申请0239400(Winter)]和任选地，框架修饰[EP0239400]来使抗体人源化。或者，可以改编为生成单链抗体而描述的技术(美国专利号4，946，779)以生成物质特异性单链抗体。针对自VHZ多肽或肽可获得的表位的抗体(单克隆和多克隆两者)在诊断中是特别有用的。具体地，可以使用单克隆抗体来制备抗独特型抗体。抗独特型抗体是携带所期望的保护针对的物质和/或媒介物的“内影像”(internalimage)的免疫球蛋白。用于制备抗独特型抗体的技术是本领域中已知的。这些抗独特型抗体在治疗中也可以是有用的。也可以如下生成抗体，即在淋巴细胞群体中诱导体内生成或者筛选重组免疫球蛋白文库或数组高度特异性的结合剂，如披露于Orlandi等(1989，ProcNatlAcadSci86:3833-3837)及WinterG和MilsteinC(1991；Nature349:293_299)的。还可以生成含有针对多肽或肽的特异性结合位点的抗体片段。例如，此类片段包括但不限于可以通过对抗体分子的胃蛋白酶消化而生成的F(ab’)2片段和可以通过还原F(ab’)2片段的二硫桥而生成的Fab片段。或者，可以构建Fab表达文库以容许快速且容易地鉴定具有想要的特异性的单克隆Fab片段(HuseWD等(1989)Science256:1275_1281)。也可以改编用于生成单链抗体的技术(美国专利号4，946，778)来生成针对VHZ多肽的单链抗体。还有，可以使用转基因小鼠或其它生物体(包括其它哺乳动物)来表达人源化抗体。可以采用上文所描述的抗体来分离或鉴定表达多肽的克隆或者通过亲和层析来纯化多肽。抗体生成的重组技术可以依照已建立的规程使用重组DNA技术在细菌或哺乳动物细胞培养物中生成抗体。选定的细胞培养系统可以分泌抗体产物。因此，我们公开了一种用于生成抗体的方法，包括培养宿主(例如大肠杆菌或哺乳动物细胞)，并分离所述蛋白质，所述宿主已经用包含如下表达盒的杂合载体转化，所述表达盒包含启动子、与其可操作连接的编码信号肽的第一DNA序列、与第一DNA序列以符合正确读码框的方式连接的编码所述抗体蛋白质的第二DNA序列。在合适的培养基中实施杂交瘤细胞或哺乳动物宿主细胞的体外增殖，所述合适的培养基是常规的标准培养基，例如Dulbecco氏改良Eagle培养基(DMEM)或RPMI1640培养基，任选地，补充有哺乳动物血清，例如胎牛血清、或痕量元素和生长维持补充物，例如饲养细胞诸如正常的小鼠腹膜渗出细胞、脾细胞、骨髓巨噬细胞、2-氨基乙醇、胰岛素、运铁蛋白、低密度脂蛋白、油酸等。同样在本领域已知的合适培养基中实施宿主细胞(其是细菌细胞或酵母细胞)的增殖，例如对于细菌，在培养基LB、NZCYM、NZYM、NZM、极端培养基(TerrificBroth)、SOB、S0C、2xYT、或M9基本培养基中，而对于酵母，在培养基YPD、YEPD、基本培养基、或完全极限撤除成分培养基(CompleteMinimalDropoutMedium)中。体外生成提供相对较纯的抗体制备物，并容许放大至给出大量的想要抗体。用于细菌细胞、酵母或哺乳动物细胞培养的技术是本领域已知的，并且包括均质悬浮培养，例如在气升式反应器中或者在连续搅拌器反应器中，或者固定化的或俘获的(entrapped)细胞培养，例如在空心纤维、微胶囊中、在琼脂糖微珠或陶瓷筒上。也可以通过在体内增殖哺乳动物细胞来获得大量的想要抗体。出于此目的，将生成想要的抗体的杂交瘤细胞注射入组织相容性哺乳动物中以引起抗体生成肿瘤的生长。任选地，用烃引发(prime)动物，尤其是矿物油诸如姥鲛烷(四甲基十五烷)，之后进行注射。1至3周后，自那些哺乳动物的体液分离抗体。例如，将通过融合合适的骨髓瘤细胞与来自Balb/c小鼠的抗体生成脾细胞获得的杂交瘤细胞，或自杂交瘤细胞系Sp2/0衍生的生成想要的抗体的经转染细胞腹膜内注射入任选地用姥鲛烷预处理的Balb/c小鼠中，并在1至2周后，自动物采集腹水。上述的和其它的技术记载于例如Kohler和Milstein,(1975)Nature256495-497；US4，376，110；Harlow禾口Lane，Antibodies:aLaboratoryManual,(1988)ColdSpringHarbor，通过提及而收入本文。用于制备重组抗体分子的技术记载于上文的参考文献中，并且还记载于例如EP0623679；EP0368684和EP0436597，通过提及而将它们收入本文。对细胞培养物上清液筛选想要的抗体，其优先通过对PGC或其它多能细胞诸如ES或EG细胞的免疫荧光染色、通过免疫印迹、通过酶免疫测定法(例如三明治式测定法或斑点测定法)、或放射性免疫测定法来进行。为了分离抗体，可以通过例如用硫酸铵进行的沉淀、针对吸湿性材料诸如聚乙二醇进行的透析、流过选择性膜的过滤等来浓缩培养物上清液中或腹水中的免疫球蛋白。若必要和/或想要的话，通过常规的层析方法，例如凝胶过滤、离子交换层析、流过DEAE-纤维素的层析和/或(免疫)亲和层析(例如用抗原或其片段)、或用蛋白A进行的亲和层析来纯化抗体。还提供了分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞。杂交瘤细胞可以是遗传方面稳定的，分泌具有想要的特异性的单克隆抗体，并可以通过融化和再克隆自深度冷冻培养物活化。还包括一种用于制备分泌针对VHZ多肽的单克隆抗体的杂交瘤细胞系的方法，其特征在于用一种或多种VHZ多肽或其抗原性片段免疫合适的哺乳动物例如Balb/c小鼠；融合经过免疫的哺乳动物的抗体生成细胞与合适的骨髓瘤细胞系的细胞，克隆在融合中获得的杂交细胞，并选择分泌想要的抗体的细胞克隆。例如，融合用VHZ免疫的Balb/c小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞系PAI或骨髓瘤细胞系Sp2/0-Agl4的细胞，对获得的杂交细胞筛选想要的抗体的分泌，并克隆阳性杂交瘤细胞。我们描述了一种用于制备杂交瘤细胞系的方法，其特征在于在数月(例如2个和4个月之间)里通过数次(例如4至6次)皮下和/或腹膜内注射10和107和108个之间的表达VHZ的细胞和合适的佐剂来免疫Balb/c小鼠，并在最后一次注射后2至4天采集来自经过免疫的小鼠的脾细胞，并在存在融合促进剂诸如聚乙二醇的情况中与骨髓瘤细胞系PAI的细胞融合。可以在含有约30%至约50%的分子量4000左右的聚乙二醇的溶液中融合骨髓瘤细胞与3至20倍过量的来自经过免疫的小鼠的脾细胞。融合后，如上文所描述的那样在合适的培养基中扩充细胞，以有规律的时间间隔补充选择培养基，例如HAT培养基，以便阻止正常的骨髓瘤细胞长得超过想要的杂交瘤细胞。还公开了包含插入物的重组DNA，所述插入物编码如上文所描述的针对VHZ的抗体的重链可变域和/或轻链可变域。根据定义，此类DNA包含编码单链DNA、由所述编码DNA构成及其互补DNA构成的双链DNA、或这些互补(单链)DNA自身。此外，编码针对VHZ的抗体的重链可变域和/或轻链可变域的DNA可以是以酶促方式或以化学方式合成的DNA，其具有编码重链可变域和/或轻链可变域的真实DNA序列或其突变体。真实DNA的突变体是编码上文所提及抗体的重链可变域和/或轻链可变域的DNA，其中删除一个或多个氨基酸或者一个或多个氨基酸用一个或多个其它氨基酸替换。修饰可以在抗体的重链可变域和/或轻链可变域的CDR外。还意图此类突变型DNA是沉默突变体，其中一个或多个核苷酸用其它核苷酸替换，新的密码子编码相同的氨基酸。此类突变型序列也是简并序列。简并序列在遗传密码的意义内是简并的，即不限数目的核苷酸用其它核苷酸替换，而不导致最初编码的氨基酸序列的变化。此类简并序列由于它们不同的限制性位点和/或特定宿主(特别是大肠杆菌)优选的特定密码子的频率(以便获得重链鼠可变域和/或轻链鼠可变域的最佳表达)而可以是有用的。术语突变体意图包括依照本领域已知的方法通过在体外诱变真实DNA来获得的突变体。为了装配完整的四聚体免疫球蛋白分子和表达嵌合抗体，融合编码重链和轻链可变域的重组DNA插入物与编码重链和轻链恒定域的相应DNA，然后转移入合适的宿主细胞中，例如在掺入杂合载体中后。还公开了包含如下插入物的重组DNA，所述插入物编码与人恒定域g，例如Yl、Y2、γ3或γ4，诸如Yl或Y4融合的针对VHZ的抗体的重链鼠可变域。同样的，还公开了包含如下插入物的重组DNA，所述插入物编码与人恒定域κ或λ诸如κ融合的针对VHZ的抗体的轻链鼠可变域。在另一个实施方案中，我们公开了编码重组多肽的重组DNA，其中重链可变域和轻链可变域经由间隔物基团而相连接，任选地，包含便于在宿主细胞中加工抗体的信号序列和/或编码便于纯化抗体的肽和/或切割位点和/或肽间隔物和/或效应分子的DNA。意图编码效应分子的DNA是编码在诊断或治疗应用中有用的效应分子的DNA。如此，特别指明如下的效应分子，其是毒素或酶，特别是能够催化前药活化的酶。编码此类效应分子的DNA具有天然存在的酶的序列或者毒素编码DNA，或其突变体，并且可以通过本领域公知的方法来制备。用途可以在检测生物学样品中存在的VHZ多肽的方法中使用抗VHZ抗体，其通过包括如下各项的方法来进行(a)提供抗VHZ抗体；(b)在容许形成抗体_抗原复合物的条件下将生物学样品与所述抗体一起温育；并(c)测定是否形成包含所述抗体的抗体-抗原复合物。合适的样品包括提取物组织诸如脑、乳房、卵巢、肺、结肠、胰、睾丸、肝、肌肉和骨组织或者来自自此类组织衍生的赘生性生长。具体地，样品可以包含乳房组织，诸如来自怀疑患有乳腺癌的个体的乳房组织。可以将抗体结合至固体支持物和/或在合适的容器中与合适的试剂、对照、指令等一起包装入试剂盒中。抗体投递可以依靠本领域已知的技术，例如通过使用脂质体、聚合物(例如聚乙二醇(PEG)、N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺(HPMA)共聚物、聚酰胺型胺类(polyamidoamine，PAMAM)树状聚物、HEMA、线性聚酰胺型胺类聚合物等)等将针对VHZ蛋白的抗体投递入细胞中。也可以将免疫球蛋白和/或抗体作为蛋白质融合物或与能够穿越质膜和/或核膜的蛋白质的偶联物投递入细胞中。例如，可以将免疫球蛋白和/或靶物与来自负责移位活性的此类蛋白质的域或序列融合或偶联。移位域和序列可以包括来自HIV-I反式活化蛋白(Tat)、果蝇(Drosophila)触角(Antennapedia)同源域蛋白和单纯疱疹_1病毒VP22蛋白的域和序列。药用组合物和施用虽然有可能单独施用抗VHZ剂，包括VHZ核酸、多肽、其片段、同源物、变体或衍生物，调控剂、激动剂或拮抗剂，结构相关化合物，或任一者的酸式盐，可以将活性成分配制为药学配制剂。因此，我们还公开了包含抗VHZ剂的药用组合物。此类药用组合物可用于向个体投递抗VHZ剂诸如以如所描述的组合物的形式以治疗或减轻症状，如所描述的。本文件的上下文中的药用组合物是至少包含抗VHZ剂(作为活性成分)的物质组合物。药学配制剂包含有效量的抗VHZ剂以及一种或多种药学可接受载体。“有效量”指足以减轻如所描述的疾病的至少一种症状的量。根据要治疗或减轻的特定疾病或综合征、以及其它因素，包括患者的年龄和重量、疾病等状态是何种程度的晚期、患者的一般健康、症状的严重程度、和抗VHZ剂是单独施用还是与其它疗法组合施用，有效量会有所变化。合适的药学可接受载体是本领域公知的，并且随药学配制剂的想要的施用形式和模式而变化。例如，它们可以包括稀释剂或赋形剂诸如填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、表面活性剂、滑润剂等。通常，载体是固体、液体或可蒸发的载体，或其组合。每种载体应当是“可接受的”，其意义为与配制剂中的其它成分是相容的而且对患者无害。载体应当是生物学可接受的，在给宿主施用时不会引发不利反应(例如免疫应答)。涵盖的是，药用组合物的活性成分在例如减轻癌症、肿瘤、新生物和其它相关疾病中展现出治疗活性。可以调整剂量方案来提供最佳的治疗响应。例如，可以每天施用数个分剂或者可以根据治疗状况的紧急事件所指明的按比例降低剂量。可以以方便的方式诸如通过口服、静脉内(在水溶性的情况中)、肌肉内、皮下、鼻内、皮内或栓剂路径或植入(例如使用缓慢释放分子)来施用活性化合物。根据施用路径，活性成分可能需要被包被在某种材料中以保护所述成分免于可灭活所述成分的酶、酸和其它天然条件的作用。可以单独地或与其它治疗剂组合地施用抗VHZ剂。适合于本文中使用的其它治疗剂是对预期目的有效的任何相容性药物或与药剂配制剂互补的药物。可以与其它治疗同时或者序贯施用联合疗法中利用的配制剂，使得实现联合效果。口服施用在一些实施方案中，以口服组合物形式提供并相应施用VHZ活性、表达或量的抑制剂。VHZ活性、表达或量的抑制剂的剂量可以在约Img/天至约IOmg/天之间。可以在片剂、胶囊或溶液形式的口服配制剂中施用药用组合物。每天给患者施用1至3次有效量的口服配制剂，直至疾病的症状得到减轻。药剂的有效量取决于患者的年龄、重量和状况。一般而言，药剂的日口服剂量小于1200mg，且大于lOOmg。日口服剂量可以是约300_600mg。方便地以单位剂量形式呈现口服配制剂，并且可以通过药学领域已知的任何方法来制备。组合物可以与合适的药学可接受载体一起配制成任何想要的剂量形式。典型的单位剂量形式包括片剂、丸剂、粉剂、溶液、悬浮液、乳液、粒剂、胶囊、栓剂。一般而言，如下制备配制剂，即均一且密切地达到药剂组合物与液体载体或细碎的固体载体或两者的关联，并在必要时，使产物成形。可以以液体、粉剂、片剂或胶囊形式将活性成分掺入各种基本材料中以给出有效量的活性成分来治疗疾病。可以适当地与例如惰性稀释剂或可同化的、可食用的载体一起口服施用组合物，或者它可以装入硬壳或软壳明胶胶囊中，或者它可以压制成片剂，或者它可以直接与饮食食物一起掺入。为了口服治疗性施用，可以将活性化合物与赋形剂一起掺入，并且以可摄食的片剂、口含片剂、锭剂、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆、速溶片(wafer)等形式使用。会获得此类合适剂量的此类治疗有用组合物中的活性化合物的量。片剂、锭剂、丸剂、胶囊等还可以含有下列成分粘合剂诸如黄蓍胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂诸如磷酸二钙；崩解剂诸如玉米淀粉、马铃薯淀粉、褐藻酸等；润滑剂诸如硬脂酸镁；并可以添加甜味剂诸如蔗糖、乳糖或糖精或调味剂诸如薄荷、冬青油、或樱桃调味剂。在剂量单位形式是胶囊时，在上述类型的材料外，它可以含有液体载体。多种其它材料可以作为涂层存在或者以其它方式修饰剂量单位的物理形式。例如，可以用紫胶/虫胶、糖或两者包被片剂、丸剂、或胶囊。糖浆或酏剂可以含有活性化合物、作为甜味剂的蔗糖、作为防腐剂的对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、染料和调味剂诸如樱桃或桔香料。当然，制备任何剂量单位形式中所使用的任何材料应当是药学上纯的，且所采用的量基本上无毒。另外，可以将活性化合物掺入持续释放制剂和配制剂中。可注射或静脉内施用在一些实施方案中，作为可注射或静脉内组合物提供并相应施用抗VHZ剂。抗VHZ剂抑制剂的剂量可以在约5mg/kg/2周至约10mg/kg/2周之间。可以以10_300mg/天之间，诸如至少30mg/天，小于200mg/天或30mg/天至200mg/天之间的剂量提供抗VHZ剂抑制剂。适合于可注射使用的药学形式包括无菌水溶液(在水溶性的情况中)或分散体和供即时制备无菌可注射溶液或分散体用的无菌粉剂。在所有情况中，所述形式必须是无菌的，而且必须有存在容易的可注射性的程度的流动性。它在制造和贮存条件下必须是稳定的，而且必须针对微生物诸如细菌和真菌的污染作用进行保存/防腐。载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(诸如甘油、丙二醇、和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物、和植物油。可以例如通过使用涂层诸如卵磷脂、在分散体的情况中通过维持所要求的粒度、及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。表面施用本文所公开的药用组合物包括那些适合于表面和口服施用的，其中表面配制剂在受累组织主要是皮肤或表皮(例如，银屑病、湿疹和其它表皮疾病)的情况中是优选的。表面配制剂包括如下那些药学形式，其中通过与要治疗的皮肤表面直接接触来外部应用所述组合物。供表面应用的常规药学形式包括浸泡液、软膏剂、乳剂、洗剂、糊剂、凝胶、贴片(stick)、喷雾剂、气雾剂、沐浴油、溶液等。通过各种媒介物投递表面疗法，媒介物的选择可以是重要的，并且一般涉及要治疗的是急性还是慢性疾病。作为一个例子，一般用水性干燥制剂治疗急性皮肤增殖疾病，而用水合制剂治疗慢性皮肤增殖疾病。浸泡液是干燥急性潮湿疹的最早方法。洗剂(水悬浮液中的粉末)和溶液(溶解于溶剂中的药疗)对于多毛和擦烂区域是理想的。软膏剂或油包水乳剂是最有效的水合剂，适合于干燥的鳞屑疹，但是是多脂的，并且取决于损伤位置有时是不想要的。在适当时，它们可以与绷带联合应用，特别在想要提高药剂组合物透入损伤中时。乳剂或水包油乳剂和凝胶是可吸收的，并且在美容方面是患者最可接受的(Guzzo等，于Goodman&Gilman’sPharmacologicalBasisofTherapeutics，第9版，第1593页-第15950页(1996))。一般而言，乳剂配制剂包括如下成分，诸如石油、羊毛脂、聚乙二醇、矿物油、甘油、棕榈酸异丙酯、硬脂酸甘油酯、鲸蜡硬脂醇(cetearylalcohol)、醋酸生育酷(tocopherylacetate)、肉豆蓮酸异丙酉旨(isopropylmyristate)、羊毛脂醇、西甲硅油(simethicone)、卡波姆(carbomen)、甲基氯异噻唑啉酮(methylchlorisothiazolinone)、甲基异噻唑啉酮(methylisothiazolinone)、环甲娃油(cyclomethicone)和羟丙基甲基纤维素，以及其混合物。供表面应用的其它配制剂包括洗发剂、肥皂、摇荡剂等，特别是那些配制成在下面的皮肤诸如头皮上留下残留物的(Arndt等，于DermatologyInGeneralMedicine22838(1993))。一般而言，表面配制剂中的组合物浓度为约0.5至50%(按组合物的重量计)，诸如约1至30%，约2-20%，或约5-10%的量。最初，所使用的浓度可以在范围的上部部分中，随着治疗继续，可以降低浓度或者配制剂的应用频率可以更小。表面应用通常每天应用两次。然而，较大剂量的每天一次应用或较小剂量的较频繁应用可以是有效的。角质层可以起贮器作用，并容许药物在延长的一段时间里逐渐渗透入活的皮肤层中。在表面应用中，足够量的活性成分必须渗透患者的皮肤，以便获得想要的药理学效果。一般了解的是，药物向皮肤中的吸收是药物性质、媒介物行为、和皮肤的函数。三个主要变量导致不同表面药物或不同媒介物中的相同药物的吸收或流出速率；媒介物中的药物浓度、角质层和媒介物之间的药物分配系数和角质层中的药物扩散系数不同。为了有效治疗，药物必须穿越负责皮肤屏障功能的角质层。一般而言，施加高的体外皮肤渗透的表面配制剂在体内是有效的。Ostrenga等(J.Pharm.Sci.,601175-1179(1971))证明了表面应用的类固醇的体内功效与体外类固醇进入取皮的(dermatomed)人皮肤中的渗透速率(rate)成比例。可以将皮肤病学可接受的且与药剂相容的皮肤渗透增强剂掺入配制剂中以提高活性化合物自皮肤表面进入表皮角质形成细胞中的渗透。提高活性化合物进入皮肤的吸收的皮肤增强剂降低有效治疗所需要的药剂量，并提供持续更长的配制剂效果。皮肤渗透增强剂是本领域公知的。例如，已知二甲亚砜(美国专利No.3，711，602)；油酸、1，2_丁二醇表面活性剂(Cooper,J.Pharm.Sci.,731153-1156(1984))；乙醇和油酸或油醇的组合(EP267，617)、2_乙基-1，3-己二醇(W087/03490)；癸基甲基亚砜和Azone.RTM.(Hadgraft,Eur.J.Drug.Metab.Pharmacokinet，21165-173(1996))；醇、亚砜、脂肪酸、酯、Azone.RTM.、吡咯烷酮、尿素和多元醇(polyoles)(Kalbitz等，Pharmazie,51:619_637(1996))；萜诸如1，8_桉油素、薄荷酮、柠檬烯和橙花叔醇(Yamane，J.Pharmacy&Pharmocology，47:978-989(1995))；Azone.RTM.禾口Transcutol(Harrison等，PharmaceuticalRes.13542-546(1996))；和油酸、聚乙二醇和丙二醇(Singh等，Pharmazie，51:741_744(1996))改善活性成分的皮肤渗透。可以通过本领域技术人员已知的技术来确定药剂或组合物的渗透水平。例如，对活性化合物放射性标记，接着测量皮肤吸收的放射性标记的化合物的量使本领域技术人员能够使用测定测试化合物的皮肤渗透的数种方法之任一种来测定所吸收的组合物的水平。涉及皮肤渗透研究的出版物包括Reinfenrath，WG和GSHawkins.TheWeaningYorkshirePigasanAnimalModelforMeasuringPercutaneousPenetration.于SwineinBiomedicalResearch(M.E.Tumbleson编)Plenum,NewYork,1986,禾口Hawkins,G.S.MethodologyfortheExecutionofInVitroSkinPenetrationDeterminations.于:MethodsforSkinAbsorption,BWKemppainen禾口WGReifenrath编，CRCPress,BocaRaton，1990，第67页-第80页；及W.G.Reifenrath，Cosmetics&Toiletries，1103-9(1995)。对于一些应用，可以使用本领域已知的配制剂诸如聚合物来施用长效形式的药剂或组合物。可以依照本领域已知的方法将药剂掺入皮肤贴片(Jimginger，H.E.，于ActaPharmaceuticaNordica4:117(1992)；Thacharodi等，于Biomaterials16:145-148(1995)；NiednerR.，于Hautarzt39:761-766(1988))或绷带中，以提高向要治疗的区域投递药物的功效。任选地，本文所描述的表面配制剂可以具有例如别的赋形剂；防腐剂诸如对羟基苯甲酸甲酯、苯甲醇、山梨酸或季铵化合物；稳定剂诸如EDTA，抗氧化剂诸如丁羟甲苯或丁羟茴醚，和缓冲剂诸如柠檬酸盐和磷酸盐。胃肠外施用也可以胃肠外或腹膜内施用活性化合物。也可以在甘油、液体聚乙二醇、及其混合物中和在油中制备分散体。在一些实施方案中，可以在30%Capsitol(CyDex，Inc.,Lenexa,Kansas,USA)中制备分散体。Capsitol是一种聚阴离子β_环糊精衍生物，其中磺酸钠盐通过丁基醚间隔基团，或磺丁基醚(SBE)与亲脂性空穴分开。环糊精可以是SBE7-3-CD。佐剂组合物可以在佐剂中施用，与酶抑制剂共施用或者在脂质体中施用。佐剂以其最广义使用，并且包括任何免疫刺激化合物诸如干扰素。本文中所涵盖的佐剂包括间苯二酚、非离子表面活性剂诸如聚氧乙烯油基醚和正十六烷基聚乙烯醚。酶抑制剂包括胰腺胰蛋白酶。脂质体包括水包油包水CGF乳剂以及常规的脂质体。微生物生长的预防在贮存和使用的通常条件下，这些制剂可以含有防腐剂以阻止微生物生长。可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、酚、山梨酸、硫柳汞等来引起对微生物作用的预防。在许多情况中，有可能包括等张剂，例如糖或氯化钠。可以通过在组合物中使用延迟吸收的药剂例如单硬脂酸铝和明胶来引起可注射组合物的吸收延长。如下制备无菌可注射溶液，即在根据需要含有上文所列举的各种其它成分的合适溶剂中掺入需要量的活性化合物，接着进行过滤灭菌。一般而言，分散体通过将经过灭菌的活性成分掺入无菌媒介物中而制备，所述无菌媒介物含有基础分散介质和来自那些上文所列举的成分的所需其它成分。在供制备无菌可注射溶液用的无菌粉剂的情况中，制备方法可以包括真空干燥和冷冻干燥技术，其自先前经过无菌过滤的溶液产生含有活性成分加任何别的所需成分的粉末。药学可接受载体如本文中所使用的，“药学可接受载体和/或稀释剂”包括任何和所有溶剂、分散介质、涂层、抗细菌剂和抗真菌剂、等张剂和吸收延迟剂等。对药学活性物质使用此类介质和药剂是本领域公知的。除非任何常规的介质或药剂与活性成分不相容，涵盖其在治疗性组合物中的应用。还可以将补充性的活性成分掺入组合物中。剂量单位形式为了容易施用和剂量的一致性，以剂量单位形式配制药用组合物是特别有利的。如本文中所使用的，剂量单位形式指物理上离散的单元，适合作为要治疗的受试者的单一剂量；每个单元含有与所需要的药学载体联合的，预先确定数量的活性材料，其根据计算，产生想要的治疗效果。新的剂量单位形式的规格由下述各项规定，并直接取决于下述各项(a)所述活性材料的独特特性和要达到的具体治疗效果，和(b)本领域配合此类活性材料以治疗身体健康受损的具有患病状况的活受试者中的疾病所固有的限制。为了方便且有效的施用，主要的活性成分以有效量与合适的药学可接受载体在剂量单位形式中配合。在含有补充性的活性成分的组合物的情况中，通过参照施用所述成分的通常剂量和方式来确定剂量。实施例实施例1:VHZ-EGFP、VHZ(C95S)-EGFP,VHZ-GST、和VHZ(C95S)-GST表达构建体的生成在VHZ片段的生成中使用人通用快速克隆IIcDNA文库(BD，产品目录编号637260)作为模板。使用正向弓I物A:5，gcgaattcaccatgggcgtgcagccccccaacttctcc3，禾口反向引物B:5’gtggatcccgtttcgttcgctggtag3，来实施PCR(94，55，72°C，40个循环)。然后将VHZPCR片段插入pEGFP-Nl载体的EcoRI和BamHI位点中，产生C端加有EGFP标签的VHZ(VHZ-EGFP)。为了构建VHZ(C95S)，如先前所描述的那样(Zeng等2003)在类似的策略中使用上述正向引物A和反向引物B以及中部反向引物5’gccaaagcccagagcagagtgcactcccacagc3，和中部正向弓丨物5，gcgaattcaccatgggcgtgcagccccccaacttctcc3，以制备没有催化活性的VHZ(C95S)。然后将VHZ(C95S)PCR片段插入pEGFP-Nl载体的EcoRI和BamHI位点中以形成C端加有EGFP标签的突变型VHZ，即VHZ-(C95S)-EGFP。分别将VHZ和VHZ(C95S)PCR产物插入pGEX-KG中以形成VHZ-GST和VHZ(C95S)-GST。通过对编码区进行DNA测序来确认所有克隆。实施例2稳定表达VHZ-EGFP、VHZ-EGFP(C95S)和单独的EGFP载体的MCF-7禾口NRK细胞集合的生成使用Lipofectamine2000(Invitrogen)来将三种表达构建体分别转染入人乳腺癌细胞系MCF-7(ATCCHTB-22)或正常大鼠肾细胞NRK(ATCCCRL-6509)中。将细胞在补充有10%胎牛血清和2mML-谷氨酰胺(Invitrogen)的RPMI1640培养基中培养。在Img/mlG418中选择细胞达20-30天以建立稳定细胞集合。然后通过FACSVantage，SE模式(BectonDickinson)对稳定集合(IO6个细胞/ml)进行EGFP分选以选择EGFP阳性细胞。实施例3对VHZ-EGFP亚细胞定位进行的共焦显微术和分析将用VHZ-EGFP表达载体转染的NRK细胞在盖玻片上培养，并用PBSCM(含有ImMMgCl2和ImMCaCl2的PBS)清洗一次。然后在2.7%低聚甲醛中于室温(RT，24°C)固定细胞达20分钟。用PBSCM再清洗两次后，用PBSCM中的0.12%皂苷透化细胞达15分钟，并与来自Covance，Inc(Princeton,NJ)的家兔抗粒周蛋白抗体一起于RT温育1小时，然后于4°C过夜。用PBSCM温和地清洗细胞三次，并与偶联有德克萨斯红的抗小鼠IgG(Sigma)—起于RT温育4小时。通过荧光显微术来直接显现VHZ-EGFP(绿色)。实施共焦成像(ZeissLSM510图像浏览器)。实施例4小鼠单克隆和家兔多克隆抗VHZ抗体的生成先前描述了该方法(Li等，2005)。我们使用CIonaCeIItm-HY杂交瘤克隆试剂盒(StemcellTechnologiesInc.)来生成VHZ杂交瘤。融合自用VHZ-GST免疫的小鼠衍生的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞后，分离出506个存活的杂交瘤克隆，并培养。首先通过ELISA对所有克隆测试VHZ结合。80个克隆显示出与VHZ的良好反应，而选择具有最强反应性的两个特定VHZ克隆，因为这两个克隆能在数种应用中使用(图10)。生成家兔多克隆抗VHZ血清(GenemedSynthesis，Inc.)。通过用与人VHZ的氨基酸残基(126-140)对应的合成肽CRRLRPGSIETYEQEK免疫家兔来生成抗体。通过蛋白A，然后通过肽亲和层析来纯化抗体。在对自数种细胞系衍生的细胞溶胞物的免疫印迹分析中通过此抗体检测出具有预期大小(16kDa)的特定条带，并且此条带的检测受到VHZ-GST融合蛋白特异性阻断(图10A)。实施例5对NRK、MCF_10A、和A431细胞中的内源性VHZ进行的共焦显微术和分析将NRK细胞、人乳房上皮细胞MCF-10A(ATCCCRL-10317)、和人上皮癌瘤细胞A431(ATCCCRL-1555)在盖玻片上培养，并用PBSCM(含有ImMMgCl2禾口ImMCaCl2的PBS)清洗一次。然后在100%甲醇中于-20°C固定细胞达15分钟。用PBSCM再清洗两次后，用PBSCM中的0.12%皂苷透化细胞达15分钟，并与小鼠抗γ-微管蛋白(Sigma)和家兔抗VHZ抗体(1150稀释)一起于RT温育1小时，然后于4°C过夜。用PBSCM温和地清洗细胞三次，并与偶联有德克萨斯红的抗小鼠IgG(Sigma)和偶联有FITC的抗家兔IgG(Sigma)一起于RT温育4小时。实施共焦成像(ZeissLSM510图像浏览器)。实施例6酪氨酸磷酸酶测定法使用EnzChek试剂盒(Invitrogen，R22065)。按照制造商的方案，在测定孔中用缓冲液重建荧光底物；将想要的潜在的PTP酶(每种蛋白质VHZ-GST、VHZ-GST+磷酸酶抑制剂、VHZ(C95S)-GST、和对照GST为0.675皮摩尔)添加至各孔，并分别温育30分钟或90分钟。然后使用GeminiXPS微量板荧光分光光度计(MolecularDevices)量化荧光。以10分钟的时间间隔分别在358和452nm的激发和发射波长测量荧光。在测定法中使用磷酸酶抑制剂原钒酸钠(10μM)作为阴性对照。实施例7通过BrdU标记来测量新合成的DNA通过使用APCBrdU流动试剂盒(BDPharmingen)依照制造商的方案测量新合成的DNA来评估细胞增殖。使用WinMDI2.8软件来分析FACS数据。测定APC标记的细胞(FL2)的百分比。实施例8=Western印迹分析详细的步骤如先前所描述的(Li等，2005)。以1500稀释度使用家兔抗VHZ抗体。磷酸-Rb(Ser780)、磷酸-Rb(Ser795)、磷酸-Rb(Ser807/811)、和b_肌动蛋白抗体来自CellSignalingTechnology(Beverly,MA)。GAPDH抗体来自SantaCruzBiotechnology(SantaCruz)。实施例9免疫组织化学(IHC)我们对人乳腺癌标本调查VHZ蛋白表达。用VECTASTAINABC试剂盒(OrtonSouthgate,Peterborough,England)，使用家兔抗VHZ抗体(1300稀释)来实施IHC实验。自HenanMedicalHospital病理科的档案收集原发性人乳腺癌样品的总共65份福尔马林固定的且石蜡包埋的手术标本。另外，人乳腺癌瘤组织阵列TMA(CC08-ll-008)购自Cybrdi(Frederick)以再次确认结果。先前描述了IHC方法(Li等，2005)。购买E-钙粘着蛋白抗体(CellSignalingTechnology)。实施例10:MCF-7-VHZ-EGFP和MCF-7-VHZ(C95S)-EGFP细胞运动性我们如先前所描述的那样进行评估(Sherri等，2006)。通过将细胞在盖玻片(12mm)上以汇合的单层铺片，然后将经细胞包被的盖玻片倒置，细胞一侧向下至新鲜的培养皿(35mm)。温和地将新鲜的培养基(2ml含10%FBS的RPMI)添加入该皿中。在O小时和48小时时拍摄图像。实施例11通过逆转录病毒生成和感染建立表达VHZ-EGFP和VHZ(C95S)-EGFP的MCF-IOA稳定集合分别将VHZ和VHZ(C95S)PCR片段克隆入逆转录病毒载体(pBABEpuro)的EcoRI和BamHI酶位点中。使用Lipofectamine依照制造商的指令(Invitrogen)分别用pBABEpuro-VHZ或pBABEpuro_VHZ(C95S)逆转录病毒载体转染双嗜性Phoenix包装细胞。48小时后，收集逆转录病毒上清液，过滤(0.4511111;1^11丨01^)，并在存在5118/1111Polybrene(Sigma-Aldrich)的情况中添加至靶MCFlOA细胞上达6_8小时。完成两次感染。感染后，用嘌呤霉素(lyg/ml)选择细胞达1周，之后进行分析。实施例12伤口愈合测定法中的MCF-IOA-VHZ-EGFP和MCF-IOA-VHZ(C95S)-EGFP细胞运动性通过用黄色移液头产生伤口来在细胞单层上实施测定法。用PBS清洗后，将细胞在新鲜的培养基中进行连续性温育。在测定法开始时(O小时，上部小图)和结束时(8小时，下部小图)为受伤区域拍照。实施例13内源性VHZ定位于中心体中并遍及胞质测定蛋白质的胞内定位有时能提供关于蛋白质可能的生物学功能的线索。为了评估VHZ的亚细胞定位，我们生成稳定表达VHZ-EGFP的NRK细胞。对这些细胞进行的共焦显微术显示，VHZ具有一系列亚细胞定位。在质膜和胞质处发现EGFP信号(图1A)。重要的是，加有EGFP标签的VHZ在中心体中的富集在细胞周期的所有阶段中都是明显的，因为它与中心体标志物-粒周蛋白共定位(图1B)。内源性VHZ定位于中心体和胞质中。加有EGFP标签的VHZ蛋白提供关于其亚细胞定位的有用信息。为了理解VHZ的因果性质(causalnature)，有必要检查内源性VHZ蛋白的亚细胞分布。使用用亲和纯化的家兔多克隆抗VHZ抗体连同小鼠单克隆(mAb)抗Y-微管蛋白(另一种中心体标志物)抗体进行的双重免疫荧光标记，在NRK细胞中(图2A，小图A-C)和在MCF-10A细胞中(图2A，小图D-F)在中心体中清楚地看到内源性VHZ与γ-微管蛋白共定位。另外，抗VHZ单抗与家兔多克隆抗粒周蛋白抗体一起再次显示，内源性VHZ在Α431细胞中被共定位至中心体(图2Α，小图G-I)。血清饥饿后，内源性VHZ从细胞质移位至细胞核，在中心体中富集。将NRK细胞进行血清饥饿过夜。用家兔抗VHZ抗体和抗Y-微管蛋白mAb进行双重免疫荧光标记，观察到内源性VHZ蛋白在中心体中是更集中的。此外，在NRK细胞中令人惊讶地观察到胞质分布的降低及伴随地细胞核中的升高(图2Β)。实施例14=VHZ是蛋白质酪氨酸磷酸酶为了证实VHZ确实是活性酪氨酸磷酸酶，我们测定VHZ-GST或没有催化活性的VHZ(C95S)-GST融合蛋白的PTP活性，与作为对照蛋白质的单独的GST比较。通过将Cys95突变成Ser或者通过将磷酸酶抑制剂(原钒酸钠)添加入测定法中，VHZ-GST的PTP酶活性被消除，其表现为渐增的蓝色荧光(激发/发射最大值约358/452nm)(图3A，小图A)。实施例15=VHZ通过促进G1/S转换来增强细胞增殖VHZ与中心体的关联给我们提示，VHZ可在控制细胞周期调控中具有潜在功能。为了对此进行测试，我们生成稳定表达三种不同表达构建体1.VHZ-EGFP；2.VHZ(C95S)-EGFP；和3.EGFP载体的MCF-7细胞。对3种稳定集合分析其细胞增殖。发现VHZ能够增强细胞增殖速率(数据未显示)。为了确认此观察结果，使用APC-BrdU进入新合成的DNA中的掺入来在这三种细胞系中测量DNA合成速率。实验显示表达VHZ-EGFP的细胞中的BrdU掺入显著高于表达VHZ(C95S)-EGFP或单独的EGFP载体的细胞(图3B)。通过对稳定表达相同的三种表达构建体的NRK细胞的FACS分析也获得类似的结果，并暗示VHZ能通过减少Gl但增加S群体来加速G/S转换(图3C)。这提出如下的可能性，即野生型VHZ可在G1/S期行进中具有作用。实施例16=VHZ能间接引起视网膜母细胞瘤蛋白(Rb)的超磷酸化为了了解VHZ如何能促进G1/S期转换和为了解决可能的分子机制，我们对调控细胞周期自Gl行进至S期中重要的数种主要分子实施免疫印迹研究。我们发现VHZ能下调肿瘤抑制蛋白p21Wafl/Cipl，及上调细胞周期蛋白依赖性激酶(Cdk)4。Cdk4是决定Gl向S期行进的主要参与物之一，并且能使视网膜母细胞瘤蛋白PRB磷酸化(Sherr和Roberts，1999)。与此一致，我们显示VHZ磷酸酶的过表达能间接导致Rb在残基Ser780、Ser795、和Ser807/811处的磷酸化积累，如通过磷酸特异性抗体所评估的(图4A，第3道)。实施例17在人乳腺癌上皮的中心体(约10%)或胞质(约17%)中找到过量生成的VHZ蛋白VHZ与PRL-3磷酸酶共享28%的氨基酸序列相似性。基于PRL-3是与结肠直肠癌转移有关的磷酸酶的实情(Saha等，2001)，我们假设VHZ磷酸酶可能具有牵涉一些癌症的转移的类似功能。为了调查VHZ与多份人癌症标本之间的关系，使用亲和纯化的抗VHZ家兔抗体来进行免疫组织化学以评估VHZ蛋白表达。我们发现VHZ过表达优先与乳腺癌有关。65份乳腺癌样品(30份IDC/ILCI期，35份IDCII期)中，6份在中心体中表达高水平的VHZ蛋白，这得到用家兔抗VHZ和中心体标志物小鼠抗Y_微管蛋白对癌症样品的同一切片进行的双重免疫荧光(图5A)和用家兔抗VHZ抗体或小鼠抗Y-微管蛋白抗体对两张相邻切片进行的单一免疫组织化学(图5B，小图A-B)两者的证明。免疫荧光和免疫组织化学两者都确认，VHZ在诊断为侵入性导管癌(IDC)或侵入性小叶癌(ILC)I期的一些乳腺癌样品的中心体中是过表达的(图8A)。除了VHZ的中心体染色，我们在诊断为IDCII期的乳腺癌样品的不同子集中找到VHZ的交替(alternate)染色样式。65份乳腺癌样品中，11份显示遍及扩散上皮肿瘤细胞的胞质分布的高水平VHZ蛋白，所述扩散上皮肿瘤细胞展示成纤维细胞样形态学(图5C，小图A-B)(图8B)。实施例18=VHZ的过表达与乳腺癌中丧失E-钙粘着蛋白表达相关联因为我们在VHZ蛋白在乳腺癌样品的扩散成纤维细胞样细胞中特异性过表达的一些微环境内捕获到一种出乎意料的现象，我们调查这些细胞是否正在经历上皮-间充质转换(EMT)。EMT在胚胎发育和肿瘤发生过程中发生，其中上皮细胞获得成纤维细胞样特性，并丧失上皮细胞粘附和细胞骨架成分(Thiery和Sleeman，2006)。E-钙粘着蛋白的丧失导致细胞-细胞粘着连接的分解和体内肿瘤细胞侵入性升高，并且是EMT的标志(Kang等，2004)。我们观察到，大多数VHZ过表达细胞(红色箭标示)已经丧失E-钙粘着蛋白的表达(黑色箭标示)(图6A)，提示这些癌细胞可已经经历整个EMT过程。实施例19:MCF-7细胞中的VHZ过表达增强细胞迁移因为在乳腺癌行进过程中VHZ表现为与EMT有关，然后我们测试VHZ是否能在触发癌细胞迁移中起作用。为了研究由VHZ驱动的细胞迁移，对表达VHZ-EGFP或VHZ(C95S)-EGFP的MCF-7细胞检查细胞迁移特性。因为MCF-7细胞的迁移难以使用常规的伤口愈合或Transwell腔式测定法来测量，我们使用备选的先前所描述的“倒置盖玻片”测定法(Sherri等，2006)。如显示的，MCF-VHZ细胞迁移出盖玻片(图6B，小图A，的白色箭)，但是MCF-VHZ(C95S)细胞保留在盖玻片内(图6B，小图B’的白色箭)。结果提示，VHZ能够促进细胞迁移。使用永生化的人乳房上皮-MCFlOA细胞来进一步调查VHZ在促进细胞迁移中的特性(图10)。实施例20讨论我们已经显示，VHZ是新的中心体磷酸酶。中心体是在细胞周期行进和细胞分裂中起关键作用的细胞器。它贯穿细胞周期组织微管排列，并且在减数分裂和有丝分裂细胞中在调控细胞分裂中发挥枢要作用。中心体细胞器的失调与人类遗传疾病和癌症有联系。实际上，许多人肿瘤显示中心体失常(Doxsey，2001；Nigg,2002)0我们的结果即VHZ在MCF-7细胞和NRK细胞中过表达支持如下结论，即VHZ磷酸酶可以在细胞周期行进过程中在促进G1/S转换方面起作用。在试图解决VHZ在促进MCF-7细胞生长中的机械学作用的尝试中，检查在G1/S细胞周期控制中起至关重要的作用的数种重要分子。我们发现，VHZ过表达能下调肿瘤抑制蛋白p21Wafl/Cipl，即细胞周期行进的一种抑制剂。p21Wafl/Cipl用来抑制激酶活性，并阻断通过G1/S的行进(Pestell等，1999)。VHZ对p21Wafl/Cipl的下调可以释放p21对细胞周期蛋白依赖性激酶(Cdk)4的抑制(Sherr和Roberts，1999)。与此相一致，我们发现，VHZ能上调Cdk4表达。真核细胞周期进行部分依赖于受到紧密调控的CDK活性。Cdk4活化能将视网膜母细胞瘤蛋白Rb靶向磷酸化(Lukas等，1996)。因此，VHZ间接引起Rb磷酸化的增强。已知Rb的超磷酸化使Rb经由细胞周期的Gl期内的限制点控制行进的功能失活(Lukas，等，1996，Sherr,1996)。如此，VHZ过表达能间接经由Rb失活来克服G1/S期限制点。虽然需要未来的研究，我们的结果使我们能够提出关于VHZ在细胞周期行进中的作用的工作模型(图4B)。在一些乳腺癌样品中，我们发现VHZ蛋白在上皮肿瘤细胞的中心体(约10%)或胞质(约17%)中过表达。VHZ更通常在展示迁移成纤维细胞样形态学的癌细胞中过表达。我们观察到，VHZ中心体阳性细胞显示就ILC或IDCI期乳腺癌样品而言的典型的上皮形态学；而VHZ胞质溶胶阳性细胞更通常与IDCII期样品中分散的上皮有关。结果可指明，VHZ可以首先在中心体中，且随后遍及获得细胞运动性的肿瘤细胞的整个胞质溶胶过表达。值得注意的是，强烈染色的VHZ胞质溶胶阳性细胞是E-钙粘着蛋白阴性。E-钙粘着蛋白的丧失在将上皮转变成迁移间充质细胞的EMT复杂过程中扮演(play)初始步骤(Kang等，2004)。E-钙粘着蛋白的丧失导致细胞_细胞粘着连接的分解，并提高肿瘤细胞侵入性。VHZ的上调能充当启动EMT，或改变典型的上皮现象以促进细胞迁移的驱动力之一。癌细胞需要获得增强的运动性来克服赘生性上皮邻近物的屏障；导致恶性细胞进入新位置的侵入和长出(Thiery和Sleeman，2006)。肿瘤细胞以多种多样的样式(包括个体和集合细胞迁移策略两者)浸润周围组织基质(Friedl，2003；Vogelstein和Kinzler，2004)。在我们的研究中，我们显示个体(图5C，小图A)和集合细胞迁移(图5C，小图B)两者均同时存在于VHZ胞质溶胶阳性细胞中。这些现象可以重演和代表由体内微环境内的VHZ驱动的局部侵入的相对早期发作。虽然不知道VHZ在肿瘤行进和癌细胞迁移中发挥的精确作用，我们的数据提示，VHZ的过表达或其升高的活性可以是局部侵入的至关重要的早期事件。与此假设相一致，我们能够显示，VHZ能增强MCF-7细胞迁移(图6B)。这里我们的研究提供了如下的证据，即VHZ是牵涉细胞周期调控和乳腺癌行进的磷酸酶。我们的发现揭示对此小磷酸酶作为未来诊断和治疗策略中的重要靶物的新了解。我们提出，对VHZ的抑制可以是在早期阻断乳腺癌转移的扩散的治疗办法的基础。参考文献PolyakK.Onthebirthofbreastcancer.BiochimBiophysActa.20011552(1):1_13.综述新加坡癌症登记报告No.5“CancerIncidenceinSingapore，1993-1997”2000年出版AlonsoA,BurkhalterS,Sasin,J,TautzL,BogetzJ,HuynhH等(2004a).Theminimalessentialcoreofacysteine-basedprotein-tyrosinephosphataserevealedbyanovel16-kDaVHl-Iikephosphatase,VHZ.JBiolChem279:35768-35774.AlonsoA,SasinJ,BottiniN,FriedbergI,OstermanA,Godzikk等(2004b).Proteintyrosinephosphatasesinthehumangenome.Cell117:699—711.BessetteDC,QiuD,PallenCJ.(2008).PRLPTPs:mediatorsandmarkersofcancerprogression.CancerMetastasisRevDOI10.1007/sl0555-008-9121-3.DoxseyS.(2001).Re-evaluatingcentrosomefunction.NatRevMolCellBiol2:688_698.FriedlP,Wolf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的抗VHZ抗体来进行，优选地，由于所述操作使得所述癌细胞变为非癌性的或者所述侵入性或转移性癌细胞变为非侵入性的或非转移性的。13.一种操作细胞的方法，该方法包括下列步骤(a)检测细胞中VHZ表达、量或活性的升高；并(b)降低所述细胞中的VHZ水平。14.一种鉴定能够结合VHZ多肽的分子的方法，该方法包括使VHZ多肽或与其具有至少90%序列同一性的序列与候选分子接触，并测定所述候选分子是否结合所述VHZ多肽或与其具有至少90%序列同一性的序列。15.一种鉴定VHZ调控物的方法，该方法包括使细胞与候选分子接触，并检测所述细胞中的或所述细胞的VHZ的表达、量或活性的升高或降低。16.一种鉴定适合于治疗、预防或减轻癌症的分子的方法，该方法包括测定候选分子是否是VHZ的或与其具有至少90%序列同一性的序列的激动剂或拮抗剂，优选地，通过将候选分子暴露于VHZ多肽或表达VHZ多肽的细胞，以便测定所述候选分子是否是其激动剂或拮抗剂来进行。17.一种鉴定VHZ的或与其具有至少90%序列同一性的序列的激动剂或拮抗剂的方法，该方法包括向动物施用候选分子，并测定所述动物是否展现出VHZ的表达、量或活性的升高或降低。18.一种在个体中治疗、预防或减轻癌症(例如乳腺癌，诸如侵入性或转移性癌症诸如侵入性导管癌(IDC))的方法，该方法包括调控个体的细胞中的VHZ表达、量或活性，优选地，其中所述VHZ的表达、量或活性在所述个体的乳腺细胞中降低。19.一种在个体中诊断癌症或对癌症(例如乳腺癌，诸如侵入性或转移性癌症诸如侵入性导管癌(IDC))的易感性或者对患有癌症的个体预后的方法，该方法包括检测所述个体的细胞中的VHZ的表达、量或活性的调控。20.一种测定个体中的肿瘤是否是或者是否有可能是侵入性或转移性肿瘤的方法，该方法包括检测所述个体的肿瘤细胞中的VHZ的表达、量或活性的调控。21.一种在个体中治疗、预防或减轻癌症(例如乳腺癌，诸如侵入性或转移性癌症诸如侵入性导管癌(IDC))的方法，该方法包括检测所述个体的细胞中的VHZ的表达、量或活性的调控，并基于所述肿瘤的攻击性来向所述个体施用合适的疗法，诸如抗VHZ剂。22.依照权利要求18至22任一项的方法，其中通过评估肿瘤大小和/或淋巴结阶段，任选地与其它风险因素一起或组合来进一步确定所述诊断、预后或疗法的选择，优选地，其中通过评估所述肿瘤的雌激素受体(ER)状态来进一步确定所述诊断、预后或疗法的选择。23.VHZ多肽的分子、激动剂或拮抗剂，其是通过依照权利要求14至17任一项的方法或用途鉴定的。24.一种供在治疗、预防或减轻癌症中使用的分子，其能够调控诸如下调VHZ的表达，诸如针对与人VHZ的氨基酸残基(126-140)对应的RRLRPGSIETYEQEK生成的抗肽抗体。25.一种方法或事物，如本文参照附图的图1至11所描述的，和如附图的图1至11中所显示的。全文摘要我们提供了在个体中治疗、预防或减轻癌症诸如乳腺癌的方法中使用的VHZ。我们提供了用于治疗、预防或减轻癌症的抗VHZ剂。我们进一步提供了用于检测个体中的乳腺癌或个体对乳腺癌的易感性的试剂盒，其包含用于检测个体或自他/她采集的样品中的VHZ表达的手段，以及检测癌细胞的方法，该方法包括检测细胞中的VHZ的表达、量或活性的调控。文档编号A61P35/00GK101820894SQ200880111036公开日2010年9月1日申请日期2008年8月8日优先权日2007年8月10日发明者曾琦申请人:新加坡科技研究局