皮内hpv肽接种的利记博彩app

专利名称：：皮内hpv肽接种的利记博彩app
技术领域：
：本发明涉及源自HPV-E2、HPV-E6和/或HPV-E7蛋白的肽在制备治疗或预防HPV相关疾病的药物中的用途，其中该药物用于皮内给药。用在本发明中的肽的序列不是关键性的，只要其源于来自HPV16或18的HPV-E2、HPV-E6和/或HPV-E7蛋白。优选地，选择这些蛋白的最有免疫原性的区域之一中的肽。最优选地，该肽能够诱导和/或增强HPV-E2、HPV-E6和/或HPV-E7特异T细胞反应，由此该肽包含特异T细胞表位。长度超过I类和II类HLA表位长度(例如，具有本文所指出的长度)的肽对于用作药物是特别有利的，因为它们足够大而需要吞噬细胞机构进行抗原摄取，这存在于专职抗原呈递细胞(APC)、特别地DC内，其如W002/070006中所阐述，并且在所含I类和II类HLA表位的细胞表面呈递发生之前，于DC内加工。因此，通过使用具有本文指出的长度的肽(如Zwavelingetal.，2002，J.Immunol.169:350中显示的)防止了对T细胞耐受的不利诱导(如Toesetal.，1996，PNAS93:7855和Toesetal.，1996，J.Immunol.156:3911中所示)。因此，在优选的实施方案中，提供了本发明的用途，其中所述肽包含能够激活APC的序列。能够激活APC的序列指，能够至少部分地激活APC、优选专职APC的序列。所述激活优选导致所述肽的至少一个表位在所述APC的表面呈递。在特别优选的实施方案中，所述肽包含至少两个用于所述抗原的T细胞表位。两个用于所述抗原的T细胞表位的存在，使得能更有效诱导和/或增强所述抗原特异T细胞反应。优选地，至少一个所述表位包含用于所述抗原的T辅助细胞表位或用于所述抗原的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位。使该肽上存在至少一个或另一表位是有利的。当所述肽包含T辅助激活序列时，实现了有效的诱导和/或增强。T辅助激活序列在本文中指，能够至少部分地激活T辅助细胞的序列。所述激活优选导致对所述抗原特异T细胞反应的改善的诱导和/或增强。在一个实施方案中，所述肽包含至少一个用于所述抗原的T辅助细胞表位和至少一个用于所述抗原的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位。相应地，优选使用这样的肽，其中至少一个II类HLA(T辅助细胞)表位和/或至少一个I类HLA(细胞毒性T细胞)表位存在于来自高风险HPV血清型(如血清型16、18、31、33或45)的HPVE2或E6和/或E7蛋白的氨基酸的连续氨基酸序列内。更优选地，存在于所使用的肽内的连续氨基酸序列来自HPVE2、E6或E7蛋白的氨基酸，所述HPVE2、E6或E7蛋白的氨基酸来自HPV血清型16、18、31或33，甚至更优选来自HPV血清型16或18，以及最优选来自HPV血清型HPV16。HPV16和HPV18E2、E6和E7的氨基酸序列分别表示在SEQIDNo.1、2、3、4、5和6中。优选地，该连续氨基酸序列的长度不超过45个氨基酸，并包含选自HPV16或HPV18E2、E6和/或E7蛋白的氨基酸序列(例如，SEQIDNo.1、2、3、4、5、6)的至少19个氨基酸，其中该肽包含至少一个II类HLA表位和/或至少一个I类HLA表位，二者都来自HPV5E2、E6和/或E7蛋白的氨基酸序列。更优选地，在该肽中，至少一个II类HLA表位和/或至少一个I类HLA表位存在于来自HPVE2、E6和/或E7蛋白的氨基酸序列的连续氨基酸序列内。出于清楚的目的，用在本发明中的肽优选包含至少一个I类HLA表位和/或至少一个II类HLA表位，这些表位中的每一个都是可呈递的并且在如本文所述被加工后，将结合至存在于细胞上的对应特异HLA分子。因此，每个HLA表位也可以称为HLA结合和/或可呈递表位。更优选地，所使用的肽能够诱导和/或增强HPV-E2、HPV-E6和/或HPV-E7特异T细胞反应，其中该肽包含特异于所述HPV-E2、HPV-E6和/或HPV-E7蛋白的T细胞表位。甚至更优选地，该肽包含来自HPVE2、或E6和/或E7蛋白的22-45个连续氨基酸残基。该肽内所包含的来自HPVE2、E6和/或E7蛋白的连续氨基酸序列的长度，优选包含19-45、22-45、22-40、22-35、24-43、26-41、28-39、30-40、30-37、30-35、32-35、33-35、31-34个氨基酸。在另一优选的实施方案中，该肽包含22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、或45或45个以上的HPVE2、E6和/或E7蛋白的连续氨基酸残基。在另一优选的实施方案中，本发明的肽由本文定义的来自HPVE2、E6和/或E7蛋白的连续氨基酸序列的任一个组成。用在本发明中的肽可以容易地合成，并且足够大而能被专职APC摄取，被蛋白酶体加工，以及具有足够的物质容量和长度以含有至少一个I类HLA和/或一个II类HLA表位。相应地，按以上定义，在优选的实施方案中，该肽包含能够激活APC的序列。可选地或与前述优选实施方案联合，该肽包含T辅助激活序列。在甚至更优选的实施方案中，该肽包含用于所述抗原的至少两个T细胞表位。最优选地，在该肽中，至少一个所述表位包含用于所述抗原的T辅助细胞表位和/或用于所述抗原的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位。在另一优选的实施方案中，存在于该肽中的抗原衍生自HPVE2、E6和/或E7蛋白或其免疫原性部分、其衍生物和/或其类似物。蛋白的免疫原性部分、衍生物和/或类似物包含在性质上而不必在量上与所述蛋白本身相同的免疫原性能力。这种蛋白的衍生物可优选通过保守氨基酸置换来获得。更优选地，所述肽包含在这里鉴定为最具免疫原性的E2、E6和/或E7区域。另夕卜，已经鉴定了定位在该区域内的大量经天然加工的Th表位。分别包括源于健康血液供者的短期和长期PBMC培养物的方法可以被用于鉴定合适的肽。可以用待测试肽剌激该PBMC培养物。平行地，可以在健康个体以及在诊断具有HPV16+病变的个体中分析体内诱导的E2、E6和/或E7特异免疫，所述免疫如按IFNyELISP0T测定法检测。在优选的实施方案中，本文使用的药物包含至少两种不同的源于HPV-E2、E6和/或E7蛋白的肽。更优选地，至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8种或更多种肽作为混合物或池(pool)联合用在该药物中。这是有利的，因为采用单一类型的疫苗就可获得针对一种HPV蛋白E2、E6或E7内存在的几种免疫原性表位的接种和随后的保护。可选地或者与前述优选实施方案联合，该药物包含其连续氨基酸序列源于HPVE2、E6和E7蛋白中至少两种、更优选源于HPVE2、E6和E7蛋白的全部三种的肽。这也是有利的，因为采用单一类型的疫苗就可获得针对几种HPV蛋白E2、E6或E7内存在的几种免疫原性表位的接种和随后的保护。当所使用的药物包含一种以上的肽时，该几种肽的组合也可以称为肽池或肽混合物。在优选的实施方案中，该药物包含以下肽中的至少一种，每种肽包含源于HPV16的E2、E6或E7的以下序列或由其组成或与其重叠E231-60或SEQIDNO:7、E246-75或SEQIDNO:8、E2301-330或SEQIDNO:9、E2316-345或SEQIDNO:10、E61-32或SEQIDNO:11、E619-50或SEQIDNO:12、E641_65或SEQIDNO:13、E655_80或SEQIDNO:14、E671_95或SEQIDNO:15、E685-109或SEQIDNO:16、E691-122或SEQIDNO:17、E6109-140或SEQIDNO:18、E6127-158或SEQIDNO:19、E71-35或SEQIDNO:20、E722-56或SEQIDNO:21、E743-77或SEQIDNO:22、E764-98或SEQIDNO:23、E21-30、E216-45、E261-90、E251-70、E261-76、E276-105、E291-120、E2106-135、E2121-150、E2136-165、E2151-180、E2166-195、E2181-210、E2196-225E2211-240、E2226-255、E2241-270、E2256-285、E2271-300、E2286-315、E2316-330、E2311-325、E2331-365、E2346-355、E2351-365、E61-22、E611-32、E621-42、E631_52、E641_62、E651_72、E661_82、E671_92、E681-102，、E691-112、E6101-122、E6111—132、E6121—142、E6127—140、E6131—152、E6137—158、E71-22、E711-32、E721_42、E730_50、E731_52、E735_50、E741_62、E750_62、E751-72、E735-77、E761-82、E771-92、E777-98，其中E231-60或SEQIDNO:7、E246-75或SEQIDNO:8、E2301-330或SEQIDNO:9、E2316-345或SEQIDNO:10、E61-32或SEQIDNO:11、E619-50或SEQIDNO:12、E641_65或SEQIDNO:13、E655_80或SEQIDNO:14、E671_95或SEQIDNO:15、E685-109或SEQIDNO:16、E691-122或SEQIDNO:17、E6109-140或SEQIDNO:18、E6127-158或SEQIDNO:19、E71-35或SEQIDNO:20、E722-56或SEQIDNO:21、E743-77或SEQIDNO:22、E764-98或SEQIDN0:23是最优选的。这些肽中每种的序列可从对应的SEQIDNO:1、2或3中显示的HPV16的E2、E6或E7的全长序列推断出。在本发明上下文中，重叠指所用的肽的序列部分地或全部地与给定序列重叠。优选地，重叠指部分重叠。部分地优选指在该肽序列的5'端和/或3'端处一个或多个氨基酸的重叠，更优选5'端和/或3'端处两个或更多个氨基酸的重叠，或更多。还优选该重叠为该肽序列的5'端处一个或多个氨基酸和/或3'端处两个或更多个氨基酸的重叠，反之亦然。技术人员会理解，所有类型的重叠都包括在本发明中，只要获得的肽表现出如本文前面定义的期望的免疫原活性。在另一优选的实施方案中，用在药物中的肽通过保守氨基酸置换源自以上给出的序列。更优选地，该药物包含上文具体提及的所用肽的至少两种，或至少三种或至少四种，或至少五种，或至少六种或更多。在最优选的实施方案中，该药物包含以下肽池中的至少一种，其中每种肽包含以下序列或由其组成或与其重叠池1:E231-60和/或E246-75,和/或池2:E2301-330和/或E2316-345，和/或池3:E231-60和/或E246-75,和/或E2301-330和/或E2316-345，和/或池4:E61-32和/或E619-50，和/或池5:E641-65，E655—80和/或E671-95,和/或池6:E685-109，和/或E691-122和/或池7:E6109-140和/或E6127_158，和/或池8:E61-32和/或E619_50，和/或E641_65，和/或E655-80和/或E671-95,和/或E685-109，和/或E691-122和/或E6109-140和/或E6127-158，和/或池9:E71-35和/或E722-56,和/或池10:E743-77，和/或E764_98，和/或池11:E71-35和/或E722-56，和/或E743-77，和/或E764-98，和/或池12:以上定义的池3和池8，和/或池13:以上定义的池8和池11，和/或池14:以上定义的池3和池11，和/或池15:以上定义的池3、池8和池11。优选地，存在于该药物中的肽内包含的II类CD4+Th细胞表位能够在HPV诱导疾病患者和/或健康个体内激活CD4+Th细胞。该激活优选离体(exvivo)或体内评价，更优选在HPV诱导疾病患者内评价，该患者的HPV感染/转化细胞表达给定抗原。更优选地，该II类HLA表位能够激活CD4+Th记忆反应，即激活CD45R0阳性CD4+辅助T细胞。借助通过DC的CD40触发的"准许杀灭"信号(Lanzavecchia，1998，Nature393:413)，这将导致更强的CD8+效应子和记忆T细胞反应。本领域现在已知很多产生肽的方式。本发明并不限于任一形式的所产生的肽，只要所产生的肽包含最低限度的T细胞表位。举例而言，存在于药物中的肽可从蛋白E2、E6或E7获得，体内合成或通过细胞合成，例如凭借编码核酸。用在药物中的肽可作为单一肽存在或者并入融合蛋白中。在一个实施方案中，在所述肽侧翼连接加工位点，这使得能在细胞内加工所述肽，以便能转运和/或并入所述细胞表面上的MHC分子中。在优选的实施方案中，用在药物中的肽在加工后能与II类MHC分子形成复合物。II类MHC限制性T细胞免疫目前被认为在清除例如肿瘤细胞中是重要的，尽管所述肿瘤细胞一般并不表达II类MHC分子。用在药物中的肽特别地良好适合于诱发、诱导和/或剌激I类MHC和II类MHC依赖T细胞两者。用在药物中的肽还可以通过缺失或置换一个或多个氨基酸、通过以另外氨基酸或官能团在N末端和/或C末端延伸进行修饰，这可以改善生物利用度、耙向以及专职APC的摄取，或者包含或释放提供佐剂或(共)剌激功能的免疫调节物质。该在N末端和/或C末端的任选的另外氨基酸优选不存在于HPVE2、E6和/或E7氨基酸序列的相应位置中，更优选它们并非来自E2、E6或E7氨基酸序列(SEQIDNO.1、2、3、4、5、6)。在另一优选的实施方案中，所述药物不包含佐剂。更优选地，所述药物不包含目前已知与以下不希望的副作用至少之一相关的佐剂例如注射部位的局部肿胀、发红、肿胀的手、发热、呕吐、关节痛、类似于在流感感染期间经历的症状的全身疾病感觉。甚至更优选地，该佐剂不是例如不完全弗氏佐剂或IFA、MontanideISA-51或MontanideISA720(S印picFrance)的水包油乳剂类型的。甚至更优选地，该佐剂不具有储库功能(d印otfunction)和/或为生物可降解的。储库功能优选指，在注射部位长时间含有该肽并且仅在长时段内渗出。优选地，长时段为至少一个月，更优选至少两个或三个月。甚至更优选地，该佐齐怀是MontanideISA-51(S印picFrance)。在另一更优选的实施方案中，所述药物由前文定义的一种或多种肽和惰性的药物可接受载体和/或赋形剂组成。该惰性的药物可接受载体和/或赋形剂优选为这种意义上的惰性，即其不引起免疫反应和/或炎性反应或者以上针对佐剂描述的任何不希望的副作用。药物的配制以及药物可接受赋形剂的使用在本领域中是已知的和常规的，例如在Remington;TheScienceandPracticeofPharmacy(制药禾斗学与实践)，第21片反2005，UniversityofSciencesinPhiladelphia中有描述。用在本发明中的药物被配制为适合于皮内给药或使用。皮内对于技术人员是已知的。在本发明上下文中，皮内(intradermal)与皮内(intracutaneous)同义，与皮下不同。物质的最表面使用为皮上(印icutaenous)(皮肤上)，然后是皮内应用(皮肤内或进入皮肤)，接着是皮下应用(紧接皮肤下面的组织内)，然后是肌内应用(进入肌肉实体内)。通常，通过注射进行皮内应用。通常进行物质的皮内注射来测试对其可能的反应、过敏和/或细胞免疫。皮下应用一般也通过注射进行针注射进皮肤下的组织。在另一更优选的实施方案中，由于用在本发明中的药物不包含任何诸如MontanideISA-51的佐剂，因而这意味着该药物的配制更简单基于油_水的乳剂优选不存在于所使用的药物中。相应地，用在本发明中的药物不包含诸如MontanideISA-51的佐剂和/或不包含基于水包油的乳剂。因此，在优选的实施方案中，用在本发明中的药物为生理离子强度和/或渗透压下的缓冲水性溶液，例如包含前文定义的一种或多种肽或由其组成的PBS(磷酸盐缓冲盐水)。技术人员知道如何制备这种溶液。用在本发明中的药物具有另一优点通过皮内给予少量的前文定义的肽，仍可实现免疫原性效果。所使用的每种肽的量优选在1至1000yg的范围内，更优选5至500g，甚至更优选10至100iig。技术人员知道如何测试所设想的肽浓度是否是免疫原性的。优选地，按WO02/070006中所阐述的，以不同浓度的待测试肽在体外剌激PBMC。例如，当肽剌激的PBMC比未剌激的PBMC开始增殖的强度高2倍以上、和/或产生多2倍以上的细胞因子、和/或上调激活标志物(例如CD25、HLA-DR、CD69、CD154、CD137)时，实现了免疫原性效果。可选择地，如实施例中所述，进行皮试。简言之，所选择的肽被皮内注射，优选0.05ml的约0.1至约0.4mg/ml，更优选0.2mg/ml的肽，其位于20mM等渗磷酸盐缓冲液中的约10-20%、更优选约16XDMS0(v/v)中(10i!g/肽)。分别在上臂的单个皮试部位注射所述肽。在另一优选的实施方案中，所述药物包含前文定义的肽和至少一种佐剂，所述佐剂不配制为基于水包油的乳剂和/或不为前文定义的水包油乳剂类型。这种类型的药物可以作为单次给药而给予。可选择地，如果需要，可以重复给予前文定义的肽和/或佐剂，和/或可以顺序给予不同的肽和/或不同的佐剂。本发明还包括，本发明的肽为皮内给药，而本文所定义佐剂是顺序给药。该佐剂可以是皮内给药。但是，任何其它方式的给药也可以用于该佐剂。特别优选的佐剂为已知通过Toll样受体和/或通过RIG-1(视黄酸可诱导基因I)蛋白和/或通过内皮素受体起作用的那些。能够激活固有免疫系统的佐剂可通过包括TLR's1-10在内的Toll样受体(TLR's)特别良好地激活。能够激活TLR受体的化合物及其修饰和衍生物在本领域中有广泛记载。TLR1可以被细菌脂蛋白及其乙酰化形式激活，TLR2还可以被革兰氏阳性细菌糖脂类、LPS、LPA、LTA、菌毛、外膜蛋白、来自细菌或该宿主的热休克蛋白以及分枝杆菌脂阿拉伯甘露聚糖激活。TLR3可以被dsRNA(特别是病毒来源的)或者被化合物聚(I:C)激活。TLR4可以被革兰氏阴性LPS、LTA、来自该宿主或细菌来源的热休克蛋白、病毒外壳或包膜蛋白、紫杉醇或其衍生物、含有寡糖的透明质酸以及纤粘蛋白激活。TLR5可以被细菌鞭毛或鞭毛蛋白激活。TLR6可以被分枝杆菌脂蛋白和B组链球菌热稳定可溶因子(GBS-F)或葡萄球菌调控蛋白激活。TLR7可以被咪唑喹啉激活。TLR9可以被未甲基化的CpGDNA或染色质-IgG复合物激活。特别地，TLR3、TLR7和TLR9在介导抗病毒感染的固有免疫反应中起重要作用，并且能够激活这些受体的化合物特别地优选用于本发明中。特别优选的佐剂包括但不限于，合成产生的化合物，包括触发TLR3和TLR9受体的dsRNA、聚(I:C)、未甲基化的CpGDNA，TLR9激动剂IC31，TLR4激动剂IMSAVAC。已知RIG-1被ds-RNA激活，正如TLR3(Immunity(2005)，1:19-28)。在另一优选的实施方案中，所述佐剂物理上连接至前文定义的肽。佐剂和共剌激化合物或官能团与包含I类HLA和1I类HLA表位的肽的物理连接，通过同时剌激内化、代谢和展示抗原的抗原呈递细胞、特别地树突细胞，而提供增强的免疫反应。另一优选的免疫调节化合物为T细胞粘附抑制剂，更优选内皮素受体抑制剂，例如BQ-788(BuckanovichRJetal，，IshikawaK，PNAS(1994)91:4892)。BQ-788为N-顺式_2，6-二甲基哌啶基羰基-L-y-甲基亮氨酰-D-l-甲氧基羰基色氨酰基-D-正亮氨酸。但是，BQ-788的任何衍生物或经修饰的BQ-788化合物也包括在本发明范围内。另外，优选将W099/61065和W003/084999中指出的APC(共)剌激分子与本发明中使用的药物内存在的肽联合使用。特别地，4-l-BB和/或CD40配体、激动性抗体、0X40配体或其功能性片段和衍生物、以及具有类似激动活性的合成化合物的使用优选与药物中存在的肽分别地或联合地给予待治疗个体，以便进一步剌激该个体内固定最佳免疫反应。在优选的实施方案中，所述佐剂包含TLR(3，4，7，8，9)配体，例如单磷酰基脂A和/或CpG核酸，和/或APC共剌激分子，例如CD40配体，激动性抗体或其功能性片段和衍生物，和/或GM-CSF。在另一优选的实施方案中，为了促进专职抗原呈递细胞或树突细胞对肽的呈递，包含肽的药物还包含DC激活剂，如前文定义的TLR配体。在优选的实施方案中，作为疫苗的药物被给予人或动物。在更优选的实施方案中，所述人或动物患有HPV(持续的)相关疾病或有患HPV(持续的)相关疾病的风险。所述HPV相关疾病选自HPV感染，HPV相关恶性肿瘤，宫颈上皮内瘤变(CIN)，外阴上皮内瘤变(VIN)，肛门上皮内瘤变(AIN)，阴道上皮内瘤变(VAIN)，阴茎上皮内瘤变(PIN)，宫颈癌，头颈癌，特别是口咽癌和扁桃体癌，阴茎癌，肛门癌，阴道癌和外阴癌。优选地，所述HPV相关疾病可通过诱导和/或增强所述免疫反应而至少部分地治疗或预防。因此，本发明的方法非常适合于向个体提供针对所述抗原的免疫和/或增强所述免疫。本发明的方法适合于任何其它免疫策略的使用目的。以前的免疫用于接种目的，即预防疾病。但是，本发明的方法不仅适合于预防疾病。该方法可用于治疗现有疾病，当然限制是该疾病可通过诱导和/或增强抗原特异T细胞免疫而治疗。这种特征例如可被用于治疗与如HPV感染的病毒感染相关的疾病，例如一些癌症。在优选的实施方案中，所述人或动10物患有诸如HPV感染的疾病或者有患该疾病的风险，所述疾病可通过诱导和/或增强所述免疫反应来至少部分地治疗或预防。优选地，所述疾病包括HPV病毒性疾病和/或癌症。肽的皮内给药是非常有吸引力的，因为疫苗注射在疾病部位或者尽可能接近疾病部位实现，导致局部激活疾病引流淋巴结，产生免疫系统的更强局部激活。特别是对于VIN、VAIN、AIN、PIN、阴茎癌、外阴癌、肛门癌、头颈癌。在优选的实施方案中，直接在病变或疾病部位进行皮内给药。在病变部位在本文理解为在病变部位5、2、1、0.5、0.2或0.1cm以内。在皮内给予本文定义的药物后，不仅Th2，还有Thl反应都被触发。这是出乎意料的，因为已经发现经由基因枪的皮肤抗原致敏导致选择性Th2免疫反应(AlvarezD，etal，2005)。另外，所观察到的免疫反应并不仅限于基于AlvarezD.等人可预料到的皮肤。我们证实，分泌IFNY的特异T细胞循环流经次级淋巴系统，因为它们在攻毒后(postchallenged)夕卜周血中丰皮检测至U。本发明药物的另一决定性优点在于，可以在一次注射中以简单配方使用相对少量的肽，而没有任何已知会产生不希望的副作用的佐剂，如MontanideISA-51。不希望被任何理论所束缚，我们认为用在本发明中的HPV皮内肽特异地和直接地靶向存在于上皮中的表皮朗格汉斯细胞(LC)。朗格汉斯细胞为DC的特定亚型，其表现出起始初级免疫反应的出色能力(RomaniN.，etal，)。这些LC可以被看作用在本发明中的药物所募集的天然佐剂。在另一优选的实施方案中，本发明涉及源于HPV-E2、HPV-E6和/或HPV-E7蛋白的肽在制备用于治疗或预防HPV相关疾病的药物中的用途，其中该药物如前文定义的用于皮内给药，另外，源于HPV-E2、HPV-E6和/或HPV-E7蛋白的肽被进一步用于制备用于治疗或预防HPV相关疾病的药物，其中该药物用于皮下给药。用于皮内给药的药物在本文中已有定义。用于皮下给药的肽与用于皮内给药的相同，并且在本文中已有定义。技术人员知道如何配制适合于皮下给药的药物。优选地，适合于皮下给药的药物包含与佐剂联合的本文已经定义的肽。本文中已经提到了优选的佐剂。其它优选的佐剂为水包油型乳剂，例如不完全弗氏佐剂或IFA、MontanideISA-51或MontanideISA720(S印picFrance)。在另一优选的实施方案中，适合于皮下给药的药物包含前文定义的一种或多种肽和佐剂，以及惰性的药物可接受载体和/或赋形剂，都如前文所定义。药物的配制以及药物可接受的赋形剂的使用在本领域中是已知的和常规的，例如在Remington;TheScienceandPracticeofPharmacy(制药禾斗学与实践)，21ndEdition2005，UniversityofSciencesinPhiladelphia中有描述。用在本发明中的第二药物配制为适合于皮下给药。在该优选的实施方案中，适用于皮内给药的药物可以与适合于皮下给药的药物同时给药。可选择地，两种药物可以按顺序地皮内和随后皮下给药，或反之(先皮下给药，接着皮内给药)。在这种优选的实施方案中，如同在用于皮内给药的较早优选实施方案中，如果需要，前文定义的肽和/或佐剂的皮内和/或皮下给药可以重复进行，和/或不同肽和/或不同佐剂的皮内和/或皮下给药可以按顺序地皮内和/或皮下给药。本发明还包括，本发明的肽是皮内和/或皮下给药，而本文定义的佐剂是顺序给药。该佐剂可以是皮内和/或皮下给药。但是，任何其它方式的给药也可以用于该佐剂。我们预期本发明药物的皮内和皮下给药的组合是有利的。表皮中的DC显然不同11于真皮内和皮下组织内的DC。皮内免疫会引起抗原加工并激活通过其树枝状网络与角质形成细胞紧密接触的表皮DC(Langerin阳性朗格汉斯细胞)。这也将最佳地激活朗格汉斯细胞和角质形成细胞之间相互作用中的炎性途径，随后是负载了抗原并被激活的朗格汉斯细胞向皮肤引流淋巴结的移动。皮下给药将激活其它DC亚类，它们也将负载抗原并独立地迁移至皮肤引流淋巴结。可想像的是，可以皮内和皮下给药的药物的使用可以导致经由不同DC亚类协同剌激这些引流淋巴结中的T细胞。在本文及其权利要求书中，动词"包含"及其词形变化以其非限制性意义使用，指该词语之后的项目被包括在内，但是并不排除未明确提及的项目。另外，通过不定冠词"a"或"an"指出的元素不排除存在一个以上该元素的可能性，除非上下文明确要求该元素中的一个并仅有一个。因此不定冠词"a"或"an"—般指"至少一个"。通过以下实施例进一步说明本发明，它们不应被理解为限制本发明的范围。图1在19名健康供者(HD)和17例有宫颈瘤形成史的患者(P)组中数量、出现日和注射的诱导阳性皮肤反应的抗原概览。当注射后不少于两天，丘疹直径开始大于2mm时，认为皮肤反应为阳性。所给出的配置图是用于8肽池，指出了所用肽池的蛋白中第一和最后的氨基酸。以粗体印刷的配置图表明该时间表内至少一个阳性反应；填充的方块代表针对指出的肽池的新出现的阳性皮肤反应。图2通过IFNyELIspot对健康供者的攻毒前(pre-challenge)血液样品中HPV16特异T细胞的检测，与针对所识别肽池的早期(<13天)阳性皮肤反应的出现显著相关(p=0.0003，双尾Fisher精确检验(Fisher'sExtractTest))。通过从试验孔内平均斑点数减去培养基对照的平均斑点数+2XSD，来计算特异反应。给出了每100.000PBMC的特异斑点数量。如果肽池特异T细胞频率在100.000PBMC中>5，则反应被认为是阳性的。图3A.阳性皮肤反应的出现和同时在健康供者的攻毒后血液样品中检测(IFNyELIspot)到循环HPV16特异T细胞之间的关联性(p<0.0001，双尾Fisher精确检验)。总共88个皮试中，39个是阳性的。这39个反应中25个与ELIspot中的阳性反应(T细胞频率，100.000PBMC中>5)相关联。对于49个没有显示皮肤反应的皮试部位，10个与阳性ELIspot相关联。B.在第14天对肽池6(E6,14。，E6127—158)显示阳性皮肤反应的健康供者(HD10)的实例(左侧图)。阳性皮肤反应部位的钻取活检(右侧图)。图4A.通过IFNyELIspot在显示阳性皮肤反应的健康供者攻毒后血液样品中检测的HPV16特异T细胞反应。显示了每100.000PBMC的平均斑点数量。将记忆反应混合物(MRM)用作阳性对照。实心条表示取得钻取活检块并进行培养的阳性皮肤反应部位。B.在14至28天的细胞因子驱动的增殖之后，测试从钻取活检块渗出的T淋巴细胞在用肽(lOyg/ml)或蛋白(20iig/ml)加载的单核细胞剌激下增殖的能力，所用的肽如皮试中所注射。植物凝集素(PHA)用作阳性对照。通过[3H]胸苷掺入来测量增殖，剌激指数(SI)》3时，将增殖反应定义为特异的。健康供者17(HD17)为由非特异T细胞组成的阳性皮肤反应部位的实例。C.通过流式微珠阵列法(cytometricbeadarray)，分析B中增殖反应的上清液中IFNy、白介素4(IL4)、IL5和肿瘤坏死因子a、IL2、IL10(未示出)的存在。临界值(cutoffvalues)基于不同细胞因子(100pg/mlIFNy，剩下的细胞因子为20pg/ml)的标准曲线。抗原特异的细胞因子生成定义为细胞因子浓度高于临界水平且〉2X培养基对照的浓度。健康供者15(HD15)显示了高背景水平的IL5，但是在抗原剌激后增加〉2X。图5健康供者15(HD15)的池4(E641—65，E655—8。，E671—95)的皮肤活检组织的T细胞培养物由HPV16特异的CD4+和CD8+T细胞构成。在针对对应所注射皮试的蛋白(20yg/ml)和肽(lOi!g/ml)的胞内细胞因子染色(ICS)中，测试培养物的特异性。值得注意的是，4个活检组织中的3个，检测到CD8+HPV16特异T细胞。实施例材料与方法研究设计在患有子宫颈HPV相关病症的患者和健康个体中，进行了代表性初步研究，来分析HPV16E2、E6和E7特异T细胞反应，其通过在上臂中皮内注射临床级HPV16肽池来进行测量。由于迟发型超敏反应代表了记忆T细胞反应，因此在分析时没必要将HPV16阳性作为前提。个体在提供了知情同意书后，17名有宫颈癌(n=12)或CIN(n=5)史的女性(P)和一组19名健康个体(HD)参与了这项研究。表1中总结了患者的临床特征，包括HPV状况。患者年龄在28-72岁之间(年龄中位数，46岁)。健康个体组显示了31岁的年龄中位数(范围，20-51岁)，由80%的女性和20%的男性组成。从所有个体获得外周血单核细胞(PBMC)，然后立即进行皮试。健康个体中，晚出现的阳性皮试导致从19名健康志愿者之中的11名分离第二血液样品。该研究设计得到莱顿大学医学中心的医学伦理委员会的批准。DTH皮试基于迟发型超敏反应(DTH)的皮试可被用作灵敏和简单的方法来体内测量HPV特异的细胞免疫反应(Hopfl，2000;Hopfl，1991)。皮试制剂由长的临床级合成肽的8个肽池组成，所述合成肽跨越全部HPV16E6和E7蛋白以及HPV16E2蛋白的最具免疫原性区(deJong，2004)。这些临床级肽在LUMC的部门间GMP车间(interdivisionalGMP-Facility)内生产。每个皮试肽池由2或3种合成肽组成，以这些肽覆盖的蛋白区域的第一和最后氨基酸表示。池1:E231—6。，E246—75，池2:E23Q1—33。，E2316—345，池3:E6！—31，E619—5。，池4:E641—65，E655—80，朋71_95，池5:E685_109，E691-122，池6:E6109_14o，E6i27_158，池7:E7u，E722—56，池8:E743-77，E764_98。对于每个肽池，将0.05ml的0.2mg/ml肽皮内注射，所述肽位于含有16%DMS0的20mM等渗磷酸盐缓冲液中(10yg/肽)。将肽池和阴性对照(仅溶剂)分别注射在上臂的各个皮试部位处。皮试部位至少检查三次，在注射(Hopfl)肽后的72小时和7天时以及在最先的健康13个体之一中首次报告非常晚的皮肤反应后3周时进行。当注射后不少于两天，出现直径大于2mm的丘疹时，认为反应为阳性的。从阳性皮肤反应部位获得钻取活检块(4mm)，切成小片并在含有10X人AB血清、10XTCGF以及5ng/mlIL7和IL15的MDM中培养，让淋巴细胞移出皮肤组织。在培养2至4周后，收集增殖的T细胞并测试它们的HPV特异反应性。用于体外免疫测定的抗原类似于皮试中所使用的肽的一组肽被用于T细胞剌激测定和IFNy-ELISPOT测定。四种HPV16E2肽由重叠15个残基的30聚体肽组成，HPV16E6由32聚体组成，HPV16E7由35聚体组成，二者重叠14个残基。按之前所述(vanderBurg，1999)合成并溶解这些肽。值得注意的是，在IFNyELISPOT测定中，肽池4和肽池5与用于皮试中的肽池稍有不同，肽池4含有肽E637—68、E655—86、E673—鹏，肽池5含有肽E673—1Q4、E691—122。将由破伤风类毒素(0，75Limusflocculentius/ml;NationalInstituteofPublicHealthandEnvironment,Bilthoven，TheNetherlands)、结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)超声裂解物(5lig/ml;由P.Klatser博士，RoyalTropicalInstitute,Amsterdam,TheNetherlands惠贝曾)禾口白色念珠菌(Candidaalbicans)(0.15mg/ml，亂Allerge體Lab.，Haarlem，TheNetherlands)的混合物组成的记忆反应混合物(MRM50x)用作阳性对照。如之前所述(vanderBurg，2001)，在重组大肠杆菌中产生重组HPV16E2、E6和E7蛋白。通过IFNyELISP0T分析抗原特异的Th细胞通过ELISP0T分析HPV16特异Th细胞的存在，如之前所述(vanderBurg，2001)。简言之，将新鲜PBMC以2X106细胞/孔的密度接种在24孔板(Costar，Cambridge,MA)的lmlMDM(BioWhittaker，Verviers，Belgium)中，该MDM富含10%人AB血清，存在或不存在指出的HPV16E2、E6和E7肽池。肽以5yg/ml/肽的浓度使用。37。C孵育4天后，收集PBMC，洗涤并以4重复孔和每孔105细胞的密度接种在Multiscreen96孔板(Millipore，Etten-Leur，TheNetherlands)的富含10%FCS的100iiIIMDM中，该板被IFNy捕获抗体(MabtechAB，Nacha，Sweden)包被。其它的抗体孵育和ELISPOT显示按制造商(Mabtech)说明书进行。以全自动的计算机辅助视频图像分析系统(BioSys)对斑点记数。通过从试验孔中的平均斑点数减去培养基对照的平均斑点数+2XSD而计算特异斑点(vanderBurg，2001)。T细胞增殖测定在3天的增殖测定中，测试皮肤活检的T细胞培养物对特异肽和蛋白的识别(vanderBurg，2001)。简言之，37。C下在X-vivo15培养基(Cambrex)中，通过粘附至平底96孔板2小时，从PBMC分离自体单核细胞。将这些单核细胞用作APC，过夜负载10iig/ml肽和20iig/ml蛋白。将皮试浸润淋巴细胞以2-5乂104细胞/孔的密度接种在补加了10XAB血清的IM匿中。将单独的培养基用作阴性对照，将植物凝集素(0，5iig/ml)用作阳性对照。通过[3H]胸苷(5iiCi/mmo1)掺入来测量增殖。剌激指数(SI)>3时，增殖性反应定义为特异的。在孵育48小时后收集增殖测定的上清液，用于分析抗原特异的细胞因子生成。分析与HPV16特异增殖性反应相关的细胞因子根据制造商的说明，采用流式微珠阵列法(BectonDickinson)进行六种不同的Thl和Th2细胞因子的同时检测IFNy、肿瘤坏死因子a、白介素2(IL2)、IL4、IL5和ILIO。临界值基于不同细胞因子(100pg/mlIFNY，剩下的细胞因子为20pg/ml)的标准曲线。抗原特异的细胞因子生成定义为细胞因子浓度高于临界值且>2X培养基对照的浓度(deJong，2004)。细胞内细胞因子染色(ICS)按之前的报道(deJong，2005)，通过ICS测试源于阳性皮肤反应部位的T细胞培养物的特异性和特征。简言之，收集皮试浸润淋巴细胞，洗涤并悬浮在MDM+10%AB血清中，并将2-5Xl(^细胞添加至在Xvivo培养基中以50iU肽(10iig/ml)或蛋白(20yg/ml)加载过夜的自体单核细胞。将单独的培养基用作阴性对照，将植物凝集素(0，5iig/ml)用作阳性对照。用FITC标记的小鼠抗人IFNy(0.5g/ml，BDPharMingen)、PE标记的小鼠抗人IL5(0，2mg/ml，BDPharMingen)、APC丰示记的抗CD4(BDBioscience)禾口PerCP*示记的抗CD8(BDBioscience)同时对样品染色。孵育4小时后，清洗细胞，以1%多聚甲醛固定，并以流式细胞术(FACSscan，BDBiosciences)进行分析。统计分析将Fisher精确检验(双尾)用于分析PBMC中产生IFNy的HPV特异T细胞的检测与皮试反应的存在或皮肤活检块中HPV特异T细胞的存在之间的关系，以及这些组内皮肤反应的大小或数量方面在患者和健康对照之间的差异。采用Gr即hpadInstat软件(版本3.0)禾口GraphpadPrism4进行统计分析。结果对HPV16E2、E6和E7肽的皮内注射的皮肤反应我们研究了皮内注射HPV16E2、E6和E7肽后，健康个体和患有HPV诱导疾病的患者中的皮肤反应。阳性皮肤反应表现为直径2至20mm的扁平红色丘疹，在注射后2至25天内出现。对照组中在152个皮试的46个中检测到阳性皮肤反应，患者组中在136个皮试部位的30个中检测到阳性皮肤反应。皮肤反应的大小在两组之间没有差异。大体上，皮试中的每个肽池可以引起阳性皮肤反应。在对照组中观察到最高频率的针对E2^75(19个个体中的10个)、E637—1Q4(9/16)和E743—98(7/19)的反应。该反应模式类似于我们之前在PBMC中观察到的(deJong，2002;Welters，2003)，以及在患者组中观察到的模式(图1)。在健康志愿者和患者组之间，皮肤反应出现的时间有相当大的差异。仅在3个案例中观察到注射后24小时至72小时内的经典DTH反应2名患者和1名健康对照(图1)。患者组中大多数的皮肤反应在2至20天内出现，一周后达到最大值(图1)。值得注意的是，具有HPV16相关疾病史的9名患者中的5名在8天内显示出阳性反应。但是，对照组内，大多数的皮肤反应在第13至第25天之间检测到。健康供者中的皮肤反应与外周血中更高频率的HPV16特异T细胞相关。为了将皮试结果与循环的HPV16特异1型T细胞的存在进行比较，在给予皮内肽攻毒之前，以收集的PBMC进行IFNyELIspot测定。通过IFNy-ELIspot，能够在19名健康志愿者的5名中检测到HPV16特异免疫反应。在健康个体的攻毒前血液样品中，检测到的每100.000PBMC>5个循环HPV16特异T细胞与对相同肽序列的早(《13天)阳性皮肤反应相关(P=0.0003，双尾Fisher精确检验；图2)。在健康供体的攻毒前血液样品中，没有检测到针对诱导晚阳性皮肤反应(14至25天)的肽的HPV16特异循环T细胞。这提示循环的抗原特异细胞的频率决定了出现皮肤反应的延迟时间。为了评估晚皮肤反应出现时HPV特异T细胞的频率，收集了另外的来自ll名健康志愿者的血液样品。在这些个体中，88个皮试中的39个为阳性的。对于39个阳性皮肤反应中的25个以及49个阴性皮肤反应中的IO个，每100.000PBMC检测到^5个HPV16特异T细胞。这时，在攻毒后血样样品中检测到循环的HPV特异的IFNY生成T细胞和皮肤反应的存在之间，有显著关联性(p<0.0001，Fisher精确检验；图3A)。这显示以HPV16肽皮内攻毒后，健康志愿者的血液中HPV16特异T细胞的频率显著更高，表明皮内注射肽抗原增加了健康志愿者的血液中HPV16特异T细胞的数量。阳性皮肤反应部位的活检块由Thl/Th2-CD4+和CD8+HPV16特异T细胞组成。大约25X的健康志愿者的阳性皮肤反应不与血液中检测到HPV16特异的IFNY生成T细胞相关，提示皮内注射HPV16肽后，其它的非IFNy生成类型的T细胞可以浸润进皮肤。为了表征阳性皮肤反应部位的细胞，进行了钻取活检(图3B)。总计从7名健康对照的不同阳性皮肤反应部位获取8个活检块，并与细胞因子鸡尾酒(cocktail)培养，所述鸡尾酒使得T细胞能在无抗原性剌激物下体外生长。在8例中的7例，在3-4周内T细胞渗出组织并增殖。在短期增殖测定中，测试了增殖的T细胞的特异性。图4显示了用经肽池加载、也在皮试期间注射进该位点(HD2，HDIO，HD15)的自体单核细胞以及经HPV16E6蛋白加载的单核细胞剌激后，特异增殖的T细胞培养物的实例(图4AB)。这表明在抗原被天然加工并呈递后，这些T细胞能够识别它们的同源HLA-肽复合物。对这些增殖性T细胞培养物的上清液的分析揭示了混合的Thl/Th2细胞因子特征(profile)，由于HPV16特异的T细胞产生IFNy、IL-4和IL-5(图4C)。对于在活检培养物中检测到HPV特异的T细胞(8个中的4个)的每种情况，其都与通过ELIspot在攻毒后的血液样品中检测到循环的HPV16特异的IFNy生成T细胞一致(比较图4A和图4B)。在另外的4个阳性皮肤反应活检的3个(HD2，HD17，HD18)中，T细胞对HPV16肽无反应(图4;HD17)，并且在一例中完全没有T细胞渗出组织(HD13)。在这4例中，我们未能在攻毒后的血液样品中检测到循环的HPV16特异IFNy生成T细胞。通过CD4和CD8细胞表面标志物对活检组织T细胞的共染色显示，在HPV16肽皮内攻毒后，不仅HPV16特异的CD4+还有HPV16特异的CD8+T细胞都浸润皮肤部位(图5)。总体而言，在HPV16特异T细胞浸润的4个活检组织的3个中，我们能够检测HPV16特异的CD8+T细胞。综上所述，在以HPV16肽皮内攻毒后，迁移进皮肤的免疫细胞群包括HPV16-特异的CD4+Thl-、Th2-和CD8+细胞毒性T细胞。这种浸润与血液中循环的HPV16特异IFNy生成T细胞平行。讨论皮试通常被用作对细胞介导的免疫的体内测量的简单测定法。我们验证了使用皮试测定法来测量体内针对E2、E6和E7早期抗原的HPV16特异的细胞免疫反应，其通过将这些结果与通过体外测定法对T细胞反应性的平行测量进行比较来进行。具有HPV相关瘤形成的患者中大部分的阳性皮肤反应在进行皮试后的2至8天内出现，类似于H6pfl等人(Hopfl，2000)在CIN患者中所观察到的。健康志愿者组中，也在皮内抗原攻毒后的4至12天出现早的皮肤反应。在已知在体外显示HPV16特异的1型T细16胞反应(deJong，2002;Welters，2003)的该后者组中，早的皮肤反应(13天内)的出现与以每20.000PBMC至少1个的频率检测到IFNy生成HPV16特异T细胞显著相关(图2，p<0.001)。Jeffries等人(Jeffries,2006)推荐了相同的IFNyELIspot测定中阳性反应的临界标准，他们采用数学工具来定义与Mantoux试验相关的ELISPOT的适当临界值。较低的循环的记忆T细胞的数量(图2)可以解释为什么皮肤反应看起来与经典的DTH试验相比有某种程度的延迟。T细胞需要被剌激或再活化并开始分裂，直至产生足够的细胞而在引起局部炎症反应阳性皮试。实际上，在阳性皮肤反应出现时，可在外周血中检测到较高频率的HPV16特异Thl反应(图3)。与健康个体相比，患者群中的皮肤反应不与通过IFNYELIspot测量的循环HPV16特异1型T细胞相关，提示在患者中产生不同于IFNy的其它细胞因子的HPV16特异T细胞浸润皮试部位。在过去，假定Thl细胞诱导DTH反应，但是现在几项研究已经证实Th2细胞也浸润皮试部位(Wang，1999;Woodfolk，2001)。类似地，这项研究显示，健康志愿者的阳性皮试部位含有Thl和Th2类型的HPV16特异T细胞(图4和图5)。另外，阳性皮肤反应也可以为非特异T细胞内流(influx)的结果，从用于测定肾细胞癌或黑素瘤患者接种后特异免疫反应的两项阳性皮试部位的深入研究(Bleumer，2007)来看，这是明显的。这项研究还显示，健康个体的很多阳性皮试部位有对注射的HPV16抗原无反应的T细胞的浸润。迄今为止，仍不清楚特异的阳性皮肤反应的原因。但是，基于这些结果并考虑到表明大多数宫颈癌患者缺乏有功能的HPV特异CD4+T细胞免疫的我们之前的研究(deJong，2004)，我们认为癌症患者中阳性皮肤反应为循环的HPV特异非Thl细胞的结果或者非HPV16特异的浸润T细胞的结果。出人意料的是，我们观察到健康个体中大多数的皮肤反应在皮内注射抗原2至3周后出现。但是，这些晚的阳性皮肤反应不与攻毒前血液中检测到循环的HPV特异CD4+记忆T细胞相关联(图2)，这些皮试部位的免疫学构成类似于经典DTH试验(Platt，1983;Poulter，1982)，并且由HPV16特异CD4+Thl和Th2细胞以及HPV16特异CD8+T细胞构成(图4和图5)。我们设想这些反应可能是T细胞致敏的结果。这也在29%的患者中注意到，这些患者接受了2步结核菌素皮试方案并且仅在第二轮测试中为阳性(Akcay，2003)。一般而言，疫苗诱导的T细胞反应高峰在接种后的10至14天，而不是三周时。但是，我们应考虑到，在这个方案中注射了较高的抗原剂量以及强力佐剂。因此，有理由相信，通过皮内攻毒诱导的T细胞反应出现地更慢且在较晚时期出现高峰。由于健康志愿者的皮内肽攻毒导致诱导HPV16特异的CD4+和CD8+T细胞，因此它应被认为是单次、低剂量接种。本项初步研究的主要目的是验证HPV16特异的皮试在检测体内1型免疫反应方面的用途。对于健康志愿者，13天内的阳性皮肤反应的确与通过IFNyELIspot在体外检测的循环IFNy生成记忆T细胞的存在相关。重要的是，我们还观察到通过皮试和ELIspot获得的结果之间的差异。在很多例中，在攻毒后的血液样品中检测到HPV16特异的循环IFNY生成T细胞，但是没有伴随的皮肤反应，反之亦然(图3A)，这可以认为是假阴性或假阳性结果。为了充分了解这对解释针对HPV的1型免疫检测的影响，我们已开始在印度尼西亚对患者和健康志愿者大群体进行现场实验(fieldtrial)。表l患者特征17<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>a进行皮试前的治疗时间b按照FIGO的宫颈癌阶段E环形电切除术綠擅歹ll表Akcay，A.，Erdem，Y.，Altun，B.，Usalan，C.，Agca，E.，Yasavul，U.，Turgan，C.，andCaglar，S.Theboosterphenomenonin2_steptuberculinskintestingofpatientsreceivinglong-termhemodialysis(接受长期血液透析患者在2步骤的结核菌素皮试中的增强现象)Am.J.Infect.Control,31:371-374，2003.AlvarezD.etal，J.ofImm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