专利名称：：与病毒相关肿瘤的成像和疗法的利记博彩app与病毒相关肿瘤的成像和疗法相关申请案交叉引用本案主张2007年4月10日递交的序列号为60/922，755的美国临时申请案和2007年5月25日递交的序列号为60/931，921的美国临时申请案的权益，上述两案的整体内容以引用形式倂入本发明。联邦资助研究下进行的发明的权利声明此项工作部分由NIH基金US24CA92871和P50CA96888资助。美国政府享有本发明部分权利。
技术领域：
：本发明涉及与病毒相关肿瘤的成像与治疗方法，尤其涉及用于检测、选择用于监控以及治疗与病毒感染相关瘤形成的治疗方法的组合物及方法。
背景技术：
：尽管很多人将EB病毒(Epstein-Barrvirus,EBV)与传染性单核细胞增多症关联起来，EBV是一种牵涉多种人类癌症包括伯基特淋巴瘤(Burkitt'slymphoma)、AIDS患者的淋巴瘤和全部何杰金症(Hodgkin'sdisease)的半数病例的肿瘤病毒。包括人类乳突瘤病毒、乙肝病毒和EBV在内的肿瘤病毒为造成人类所有癌症中接近15%的原因。现存用于诊断、监控和治疗与病毒相关瘤形成的方法并不充分，因此急需改进的方法。
发明内容如下文所述，本发明特色为用于诊断、监控和治疗与天然发生的感染(如病毒感染或细菌感染)相关的瘤形成的组合物和方法。一方面，本发明特色为用于治疗病毒天然感染瘤形成的经标记药物组合物。所述组合物包括有效量的裂解诱导试剂，如蛋白酶体抑制齐ll(proteasomeinhibitor)、微管石皮坏齐U(microtubuledisruptingagent)、糖皮质素(glucocorticoid)或甾类(steroid)激素、核苷类似物和抗炎剂，其用量优选为足以在给予该组合物的受验者体内诱导病毒基因表达或病毒复制。此外，用以诱导病毒基因表达或病毒复制所需的量优选为非细胞毒性的。裂解诱导试剂包括，但不限于，硼替佐米(Bortezomib)、曲尼司特(Tranilast)、来氟米特(Leflunomide)、甲苯达唑(Mebendazol)、阿糖胞苷(Cytarabine)和吲哚洛芬(Indoprofen)。一具体实施例中，所述药物组合物可进一步包括2'-氟-2'-脱氧-e-D-5-碘尿嘧啶-呋喃阿拉伯糖苷(FIAU)的经放射性标记的类似物。所述组合物可用于治疗与诸如EB病毒(EBV)或卡波西氏肉瘤疱疹病毒(K即osi'ssarcomaherpesvirus)感染相关的瘤形成，所述瘤形成如淋巴瘤、胃癌、卡波西氏肉瘤或鼻咽癌。另一方面，本发明特色为用于诊断与天然发生的感染(如病毒感染或细菌感染)相关的瘤形成的药物组合物。所述药物组合物包括有效量的2'-氟-2'-脱氧-13-D-5-碘尿嘧啶-呋喃阿拉伯糖苷(FIAU)的经放射性标记的类似物。所述经放射性标记的组合物6可经标记而通过SPECT或PET看见，如使用碘-123I、124I或125I。所述经放射性标记的组合物可包括使用具有病毒裂解诱导试剂的组合物的说明书。—方面，本发明特色为用于治疗与感染(如病毒感染或细菌感染)相关的瘤形成的药物组合物。所述组合物包括有效量的2'-脱氧-5-碘-I-13-D-呋喃阿拉伯糖基尿嘧啶(FIAU)的经放射性标记的类似物。所述标记可以是a、13或Y粒子辐射体，如^Y、^Re、188Re、64CU、67CU、212Pb、212Bi、123I、211At、213Bi或131I。放射性核素优选放射至少约0.5至2戈雷(Gy)，且以约0.001至约0.1毫克/公斤(mg/kg)或约0.01至约0.lmg/kg浓度给予受验者。所述组合物可用于治疗与病毒(诸如EB病毒(EBV)或卡波西氏肉瘤疱疹病毒)感染相关瘤形成，所述瘤形成如淋巴瘤、胃癌、卡波西氏肉瘤或鼻咽癌。所述经放射性标记的组合物可包括使用具有病毒裂解诱导试剂的组合物的说明书。—方面，本发明特色为用于鉴定病毒裂解诱导试剂的方法。所述方法包括使具有潜在病毒感染的肿瘤细胞与试剂接触，再检测细胞内病毒裂解多肽的表达或活性的增加或病毒复制的增加。可通过一种或多种ZTA表达、RTA表达、病毒胸苷激酶表达或活性的增加，来检测细胞中病毒裂解多肽或基因的表达或活性。通过检测诸如处于BZLFIE启动子序列或Zta启动子序列控制之下的报告体多肽或基因表达的增加，可测定所述病毒裂解多肽或基因的表达或活性。报告体包括，但不限于，例如使用微量培养盘判读器检测且与对照组相比较的相对荧光单位(RFU)的增加可予以检测的荧光素酶(luciferase)或绿色荧光蛋白。病毒裂解诱导试剂包括，但不限于，蛋白酶体抑制剂、微管破坏剂、糖皮质素或甾类激素、核苷类似物和抗炎剂。另一方面，本发明特色为用于检测受验者体内与感染(如细菌感染或病毒感染)相关瘤形成的方法。所述方法包括给予受验者有效量的病毒裂解诱导试剂和2'-脱氧-5-碘-I-P-D-呋喃阿拉伯糖基尿嘧啶(FIAU)的经放射性标记的类似物，再使所述瘤形成可见化(文中另外有称为视觉化或是可看见情况)。例如，所述经放射性标记的类似物是使用碘-123I、124I或125I标记的，并使用如SPECT或PET而看见。所述方法可用于治疗与病毒(诸如EB病毒(EBV)或卡波西氏肉瘤疱疹病毒)感染相关的瘤形成，所述瘤形成如淋巴瘤、胃癌、卡波西氏肉瘤或鼻咽癌。—方面，本发明特色为选择用于具有与感染相关的瘤形成的受验者的治疗方法。所述方法包括给予受验者有效量的病毒裂解诱导试剂和2'-脱氧-5-碘-D-呋喃阿拉伯糖基尿嘧啶(FIAU)的经放射性标记的类似物；以及检测受验者体内裂解诱导存在与否。裂解诱导的增加鉴定出受验者为可接受裂解诱导试剂治疗和酶靶向放射性疗法。另一方面，本发明特色为用于治疗和预防受验者体内与感染(如病毒感染或细菌感染)相关瘤形成的方法。所述方法包括给予受验者有效量的病毒裂解诱导试剂和2'-脱氧-5-碘-D-呋喃阿拉伯糖基尿嘧啶(FIAU)的经放射性标记的类似物。—方面，本发明特色为用于杀灭受病毒或细菌感染的肿瘤细胞的方法。所述方法包括使所述细胞与有效量的病毒裂解诱导试剂和2'-脱氧-5-碘-D-呋喃阿拉伯糖基尿嘧啶(FIAU)的经放射性标记的类似物接触。本发明的多个具体实施例中，举例来说，所述裂解诱导试剂是蛋白酶体抑制剂、微管破坏剂、糖皮质素或甾类激素、核苷类似物或抗炎剂。举例来说，用于本发明的裂解诱导试剂的更具体实例包括硼替佐米、曲尼司特、来氟米特、甲苯达唑、阿糖胞苷和吲哚洛芬。本发明的多个具体实施例中，用于本发明的治疗方法及组合物的放射性核素标记可以是a、P或Y粒子辐射体，如9QY86Re、腦Re、64Cu、67Cu,2pb、21281、1231、21^、21381举例来说，本发明的多个具体实施例中，用于在SPECT或PET中成像用途的放射性核素标记是碘_1231、1241或1251。本发明的多个具体实施例中，与受如FB病毒(EBV)或卡波西氏肉瘤疱疹病毒感染相关的瘤形成，所述瘤形成为例如淋巴瘤、胃癌、卡波西氏肉瘤或鼻咽癌。—方面，本发明特色为用于诊断或监控受验者体内与感染相关瘤形成的试剂盒。所述试剂盒包括有效量的病毒裂解诱导试剂和2'-脱氧-5-碘-D-呋喃阿拉伯糖基尿嘧啶(FIAU)的经放射性标记的类似物，以及使用所述试剂盒诊断瘤形成的说明书。所述试剂盒可用于诊断或监控与病毒感染或细菌感染(如与受诸如EB病毒(EBV)或卡波西氏肉瘤疱疹病毒感染)相关的瘤形成，所述瘤形成如淋巴瘤、胃癌、卡波西氏肉瘤或鼻咽癌。所述与感染相关瘤形成可以碘-123I、124I或125I作为放射性核素而使用SPECT或PET成像。所述裂解诱导试剂可以是蛋白酶体抑制剂、微管破坏剂、糖皮质素或甾类激素、核苷类似物或抗炎剂，如硼替佐米、曲尼司特、来氟米特、甲苯达唑、阿糖胞苷或吲哚洛芬。—方面，本发明特色为用于治疗受验者体内与病毒相关瘤形成的试剂盒。所述试剂盒包括有效量的病毒裂解诱导试剂和2'-脱氧-5-碘-D-呋喃阿拉伯糖基尿嘧啶(FIAU)的经放射性标记的类似物，以及使用所述试剂盒诊断瘤形成的说明书。所述裂解诱导试剂可以是蛋白酶体抑制剂、微管破坏剂、糖皮质素或甾类激素、核苷类似物或抗炎剂，如硼替佐米、曲尼司特、来氟米特、甲苯达唑、阿糖胞苷和吲哚洛芬。所述与感染(例如EB病毒(EBV)或卡波西氏肉瘤疱疹病毒)相关的瘤形成例如为淋巴瘤、胃癌、卡波西氏肉瘤或鼻咽癌。—方面，本发明特色为杀灭细菌的方法，包含使细菌与2'-脱氧-5-碘-I-!3-D-呋喃阿拉伯糖基尿嘧啶(FIAU)的经放射性标记的类似物接触。所述放射性标记可以是a、P或Y辐射体，如9QY86Re88Re、64Cu、67Cu，Pb，Bi3l、2"ACi或1311。细菌包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两者。另一方面，本发明特色为治疗受验者体内细菌感染的方法，所述方法包含给予受验者有效量的2'-脱氧-5-碘-1_|3-0-呋喃阿拉伯糖基尿嘧啶(FIAU)的经放射性标记的类似物。所述放射性标记可以是a、13或Y辐射体，如^Y、^Re、，Re，Cu,Cu、^Pb、212Bi、123I、211At、213Bi或mI。细菌包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两者。定义"天然感染(naturallyinfected)"指未经人为干涉辅助即出现的感染。人为干涉的实例包括基因疗法、细胞转化或细胞转染。"蛋白酶体抑制剂"指降低蛋白酶体活性(如使泛素化蛋白降解)的化合物。示例性蛋白酶体抑制剂包括，但不限于硼替佐米、乳胞素(Lactacystin)和MG132。"微管破坏剂"指中断微管的生物功能、稳定性或生长的试剂。示例性试剂包括秋水仙碱(colchicine)、脱羰秋水仙碱(demecolcine)、长春碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)、鬼臼毒素(podophyllotoxin)禾口诺考达唑(nocodazole)。"糖皮质素"指合成或天然存在的皮质甾类药物或激素，是肾上腺所产生的内源性8糖皮质素的结构性或功能性类似物。示例性糖皮质素包括脱氢皮质醇(prednisolone)、甲基皮质醇(methylprednisolone)、氢化可的松(hydrocortisone)、倍他米松(betamethasone)禾口地塞米松(dexamethasone)。"甾类激素"指具有四环的环戊烷并菲(cyclopent即henanthrene)骨架的合成或天然存在的药物或激素。"核苷类似物"指具有糖和嘌呤或嘧啶碱基的合成或天然存在的化合物。示例性核苷类似物包括2'-氟-2'-脱氧-13-D-5-碘尿嘧啶_呋喃阿拉伯糖苷，以及各种脱氧腺苷类似物(如去羟肌苷(Didanosine)、阿糖腺苷(Vidarabine))、脱氧胞苷类似物(如阿糖胞苷、恩曲他滨(Emtricitabine)、拉米夫定(Lamivudine)、扎西他滨)(Zalcitabine)、脱氧鸟苷类似物(如阿巴卡韦(Abacavir))、脱氧胸苷类似物(如司他夫定(Stavudine)、齐多夫定(Zidovudine)、叠氮胸苷(Azidothymidine,AZT))和脱氧尿苷类似物(如碘苷(Idoxuridine)、曲氟尿苷(Trifluridine))。来氟米特、卩引哚洛芬、甲苯达唑"抗炎剂"指抑制发炎及其症状的试剂。示例性抗炎剂包括，但不限于N-(3，4-二甲氧基肉桂酰)邻氨基苯甲酸(曲尼司特)、N-(4'-三氟甲基苯基)-5-甲基异恶唑-4-甲酰胺(来氟米特)、和非甾类抗炎药(NSAIDs)。"改善"指降低、抑压(su卯ression)、减毒、縮小、阻止或稳定疾病的发展或进展。"类似物"指非同一但具有类似的功能或结构特点的分子。"改变"指经如本文所阐述的那些
技术领域：
中已知的标准方法所检测的基因或多肽表达水平或活性的变化(增加或降低)。本文所使用的改变包括表达水平的10%变化，优选为表达水平的25%变化，更优选为表达水平的40%变化，最优选为表达水平的50%或更大变化。术语"瘤形成"包括以细胞过度增殖或生长、或细胞死亡减少为特征的恶性肿瘤。特定的具体实施例中，术语"癌症"包括但不限于癌、肉瘤、白血病和淋巴瘤。术语"癌"还包括原发性恶性肿瘤，如肿瘤细胞尚未转移至除原始肿瘤部位外的受验者身体其他部位的恶性肿瘤；以及继发性恶性肿瘤，如由转移所产生的恶性肿瘤，该肿瘤细胞转移至不同于原始肿瘤部位的继发性部位。化合物"疗法有效量"或"疗法有效剂量"指对至少一种与待治疗状态、不适(disorder)或疾病有关或造成的症状提供可检测的改进所必需或足够的量。所述疗法有效量可作为单剂或分时多剂给予。可同时使用两种或多种化合物提供"疗法有效量"来提供可检测改进，其中单独使用相同量的任一化合物均不足以提供疗法有效量。术语"成像化合物"旨在包括能被视觉化的化合物或可用于视觉化细胞、组织或器官的化合物。例如，通过平面伽马成像(planargammaimaging)、单光子发射型电脑断层显像(singlephotonemissioncomputedtomography，SPECT)或正电子成像术(positronemissiontomogr即hy，PET)。所述化合物可以是经放射性标记的化合物或荧光化合物。特定的具体实施例中，所述化合物是结合至激酶，如胸苷激酶的核苷或核苷类似物。术语"病毒裂解诱导试剂"理解为诱导病毒改变其基因表达图谱并开始表达与病毒粒子产生有关的RNA和蛋白质的试剂。已经诱导病毒裂解的迹象包括，但不限于，病毒多肽或多核苷酸(如与裂解阶段有关的多肽)表达的增加或病毒复制的增加。用于测定多肽表达水平的方法包括，但不限于，用以测量多肽水平的免疫测定(如ELISA、蛋白质印迹(Westernblot)或放射性免疫测定)。用于测定多核苷酸表达的方法为
技术领域：
已知方法和/或本文所阐述的方法。这些方法包括使用自所述核酸分子制备的任意合适片段作为杂交探针的微阵列分析、RNA印迹分析(Northernblotanalysis)和即时PCR(RT-PCR)。比较候选化合物存在下的基因表达水平和缺少候选分子的对照培养基中测得的水平。术语"药物学可接受载剂"是
技术领域：
可认知的，包括适用于给予受验者(如哺乳动物)本文所阐述方法中使用的化合物的药物学可接受材料、组合物或运载子(vehicle)。所述载剂包括参与将目标试剂从一个器官或身体部分担载或运输到另一器官或身体部分的液体或固体填料、稀释剂、赋形剂、溶剂或胶囊化材料。从与配方的其他成分相容性且不伤害患者角度来看，各载剂必须是"可接受的"。可作为药物学可接受载剂的材料的某些实例包括糖，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、以及乙基纤维素和醋酸纤维素；粉末化黄芪胶凌芽糖；明胶；滑石粉；赋形剂，如可可脂和栓蜡；油，如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和豆油；二醇类，如丙二醇；多元醇类，如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；酯类，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；褐藻酸；无生脓原水；等渗盐水；林格溶液；乙醇；磷酸盐缓冲溶液；以及其他用于药物配方的无毒性相容物质。本文所使用术语"成像"指于给予细胞、组织或器官后，使用技术可见的可检测化合物。一个具体实施例中，通过在给予后化合物的局部化来测量该化合物发射的能量来完成成像。所应用的成像技术如正电子成像术(PET)、SPECT-CT等。本文所使用的"正电子成像术成像"或"PET"涵盖所有正电子成像术成像系统或等同者，以及所有能进行正电子成像术成像的装置。本发明方法可藉由使用任何一种此类装置、或PET装置或等同者的变体、或与任何已知PET方法协同实施。如，见美国专利案US6，151，377;US6，072，177;US5，900，636;US5，608，221;US5，532，489;US5，272，343;US5，103，098，上述各专利均以引用方式并入本文。包括动物成像模态如微正电子成像术(micro-PETs)(CorcordeMicrosystems,Inc.)。图1提供AGS细胞内荧光素酶活性的四张定量图。荧光素酶是在Zta启动子(-5787+13)控制下被表达的。所述Zta启动子在AGS细胞内经TPA、丁酸盐和2-丙基戊酸盐(valproate)活化。Zta启动子不能被DNA转甲基酶抑制剂5'-氮脱氧胞嘧啶(5，-Azadeoxycytidine)活化。图2A至2C显示重组病毒EBV诱导后AKATA-BX1细胞内的GFP信号。图2A包括4张显示通过抗免疫球蛋白G抗体(anti-IgG)处理来诱导的重组EB病毒内的GFP信号的显微照片。使用倒置荧光显微镜检查相位差和GFP表达。以anti-IgG诱导时，AKATA-BX1内的GFP信号亮得多。通过微量培养盘判读器检测使用EBV裂解诱导的GFP信号提升。图2B显示诱导信号被抑制裂解性感染的药物抑压的的图。PurvalanolA抑制EBV即刻早期基因(immediatelyearlygene)ZTA表达。图2C是显示GFP驱动的CMV启动子未经TPA、anti-IgG或5'-氮脱氧胞嘧啶活化的Hela细胞中GFP信号的图。图3是显示AKATA-BX1细胞内5_氮脱氧胞嘧啶诱导裂解性感染的GFP信号图。图4显示GFP整体病毒测定的典型读出。中间10列是80种库存药物。右边平台是没有细胞或药物的素基质，以减少背景。左边平台上，前4孔是未经任何处理的细胞，作为负对照；后4孔是以裂解诱导药物处理的细胞，作为正对照。于第O天进行GFP读数，以消除药物的自发荧光。第3天，所述正对照孔已经显示急剧增加的GFP信号，任意与之相当的读数均作为命中物。培养更长时间后显示，某些孔的读数低于平均值。io天后挑出抑压命中物。图5是显示在上述两种测定中核实已知用以诱导EBV内裂解性感染的药物的范氏图(Vendiagram)。图6显示化合物曲尼司特和来氟米特能将AGS中BZLF1启动子诱导高达至15倍。图7A至7C显示阿糖胞苷(Ara-c)结果。于体外(invitro)Ara-c诱导B细胞和上皮细胞中EBV裂解性感染。图7A显示Ara-c的结构式。图7B是显示荧光素酶测定中Ara-c诱导BZLFl启动子的图。图7C是显示LCL细胞中Ara-c诱导ZTA表达的蛋白质印迹。图8A至8D显示Ara-C结果。于体外Ara-c诱导B细胞和上皮细胞中EBV裂解性感染。图8A是显示以1yMAra-c处理48小时的EBV阳性细胞株AKATA、LCL和SNU719的结果的蛋白质印迹，并随后通过蛋白质印迹测定BZLF1蛋白质进行EBVIE基因表达的测定。免疫印迹显示Ara-c诱导EBV阳性细胞株中BZLF1蛋白质的表达。图8B提供6张显示以1iiMAra-c处理48小时的EBV-阳性淋巴细胞样细胞的显微照片。进行免疫荧光测定以检测BZLF1蛋白。将细胞以BZLF1(红)染色，并用DAPI(蓝)染色细胞核。通过1PMAra-c将40%的LCL细胞诱导为裂解性感染。图8C使显示Ara-c诱导EBV早前裂解基因TK表达的蛋白质印迹。图8D提供两张显示Ara-c不活化EBV病毒复制的图。以1yMAra-c处理LCL和SNU719细胞48小时。即时PCR表明，经Ara-c处理后，EBV病毒DNA拷贝数并未扩增。图9A至9D显示吲哚洛芬结果。图9A显示吲哚洛芬的结构式。图9B是AGS中荧光素酶测定的定量结果图，显示吲哚洛芬能在10yM诱导BZLFl启动子。图9C是显示吲哚洛芬诱导SNU719细胞中ZTA表达的蛋白质印迹。图9D是显示吲哚洛芬不诱导SNU719细胞中EBV病毒复制的图。图IOA至IOC显示硼替佐米结果。图10A显示两张图。图IOA(左边)显示AGS细胞中荧光素酶测定的定量结果，显示硼替佐米在10nM诱导BZLF1启动子。图10B(右边)显示在10nM，硼替佐米诱导AKATA-BX1细胞中GFP测定的GFP信号。图10B显示Rael细胞内硼替佐米诱导的ZTA表达。图10C显示Rael细胞中硼替佐米诱导的EBV病毒复制。以20nM硼替佐米处理Rael细胞8小时，48小时后收集DNA。即时PCR表明，EBV病毒DNA拷贝数增加20倍。图IIA至IIE显示甲苯达唑结果。图IIA显示甲苯达唑的结构式。图11B是显示AGS细胞中荧光素酶测定的定量结果。这些结果显示甲苯达唑在1PM诱导BZLF1启动子。图11C显示，在liiM，甲苯达唑诱导AGS-BXl细胞中GFP测定中的GFP信号。图IID是显示甲苯达唑诱导LCL细胞和AKATA细胞中ZTA表达的蛋白质印迹。甲苯达唑还诱导LCL细胞和Rael细胞中的EBV病毒复制。图11D显示即时PCR量化结果。以lyM甲苯达唑处理细胞48小时，收集DNA。即时PCR表明，EBV病毒DNA拷贝数增加20倍。图12A至12D显示硼替佐米诱导EBV-TK和Zta表达。图12A和12B是显示以硼替佐米处理后的EBV(+)伯基特细胞(Burkitt，scell)株(Rael)中之EBV-TK(A)和Zta(B)表达的免疫印迹。分离总细胞蛋白，并以每泳道10pg蛋白质通过12XSDS-PAGE分离。图12C是显示以硼替佐米剂量依赖方式之Zta荧光素酶活性增加的图。以硼替佐米处理表达Zta启动子的AGS-HC13细胞，且测量荧光素酶活性(图12C)。以硼替佐米处理后，EBV(+)伯基特细胞[EBV(+)Akata、EBV(+)Real而非EBV(-)伯基特细胞[EBV(-)Akata]中，[14C]FIAU的蓄积增加(图12D)。"BL"指代伯基特淋巴瘤。图13A至13D显示硼替佐米上调GFP表达(13A和13B)禾PEBV病毒负载(13C)。图13A是显示以硼替佐米处理表达GFP的BX-1细胞48小时的效果的图。图13B包括两张显示48小时Rael细胞GFP表达的显微照片。图13C使显示通过即时PCR测量的病毒负载的量化图。图13D为显示由即时PCR测量的被担载IkB超阻抑子IkB(sr)的表达载体和对照载体转染的EBV(+)Rael细胞内病毒负载的量化图。图14A和14B是显示经硼替佐米治疗后，通过体内平面伽马闪烁扫描评估的伯基特淋巴瘤异种移植物[EBV(H-)Akata]摄入[125I]FIAU的时间进程的图像。大箭头指出肿瘤。黑色区域(图14A，小箭头)表示膀胱的铅遮罩以改进所述图像动态范围。每一动物具有置于后肢内的一个肿瘤。图14A中，仅以PBS预处理的动物(对照组)中，没有明显的肿瘤摄入。图14B中，在较晚时间点上，可见预处理动物(2iig/g硼替佐米)的肿瘤。离体(exvivo)生物分布图像得自被牺牲的代表性动物，详细的定量数据如表l。图15A和15B显示通过单光子发射型电脑断层显像/电脑断层显像(SPECT/CT(SPECT-CT))体内评估的另一种EBV(+)伯基特淋巴瘤异种移植物(Akata)摄入[1251]FIAU的时间进程的图像。箭头指示肿瘤(直径-lcm)。每一动物具有置于侧腹部的一个肿瘤。图15A显示注射放射性药物72小时后的[125I]FIAU肿瘤摄入。图15B显示96小时后的[^1]FIAU摄入。在给予放射性药物24小时前，用硼替佐米(2yg/g，ix.)治疗动物。肿瘤组织显示为蓝色，而骨(来自CT)显示为红色。图16A至16D是显示SPECT/CT(SPECT-CT)获得的体内骨肉瘤摄入[125I]FIAU的图像。图16A禾口16B显示设计(engineered)成构成式表达(constitutivelyexpress)EBV-TK(TK143b)的骨肉瘤143b。图16C和16D显示以空载体(V143b)进行假工程化的骨肉瘤143b。如大箭头所示，每一动物中均存在两个肿瘤。黑色区域(图16A，小箭头)表示膀胱的铅遮罩以改进所述图像动态范围。预先以硼替佐米(2iig/g)治疗图16C和16D中所显示的动物，从而确定所述试剂是否导致可能是FIAU磷酸化原因的细胞激酶的上调。图17是鼠科异种移植物模型中[125I]FIAU组织分布的图。向植入EBV-TK(+)肿瘤的严重联合免疫缺陷(severecombinedimmunodeficient，SCID)小鼠静脉给予[125iiCi]FIAU。杀死动物(每一时间点3至4只)，并测量组织分布。显示每公克组织之注射剂量(injecteddose，ID)的百分比。图18A至18C是显示肿瘤生长的曲线图。图19A是显示具有对照肿瘤(具有空载体的人类骨肉瘤143B)或TK表达肿瘤(表达EBVTK的人类骨肉瘤143B细胞)的肿瘤生长小鼠的图，其中，以1.6mCi[mi]FIAU的IV或缓冲盐水处理。图19B显示肿瘤生长剂量回应。以缓冲盐水、lmCi[mi]FIAU或3mCi[mi]FIAU处理具有EBV-TK表达肿瘤的小鼠。图18C显示以1.7mCi[wi]FIAU处理通过植入EBV-TK表达肿瘤细胞和对照肿瘤细胞混合物得到的肿瘤内的肿瘤生长。每一时间点对应3只动物。绘制均值、SEM，并做最小二乘线性回12归。肿瘤生长曲线最适线性回归的斜率的可靠区间(CI，95%)见图例说明的圆括号内。图19A至20显示鼠科异种移植物中的肿瘤生长。图19A显示EBV(+)伯基特淋巴瘤(Rael);图20B显示EBV(+)胃腺癌(KT);图19C显示KSHV(+)原发渗出性淋巴瘤(BCBL1);上述肿瘤均经过如下处理静脉注射缓冲盐水、静脉注射缓冲盐水24小时后静脉注射[^1]FIAU、静脉注射硼替佐米、或静脉注射硼替佐米24小时后静脉注射[131I]FIAU。每一时间点对应3只动物。绘制均值、SEM，并做最小二乘线性回归。肿瘤生长曲线最适线性回归的斜率的可靠区间(CI，95%)见图例说明的圆括号内。图20A和20B显示硼替佐米治疗后肿瘤的[125I]FIAUSPECT-CT成像。图20A显示72小时p.i.的EBV(+)胃腺癌(KT)肿瘤。图20B显示48小时p.i.的KSHV(+)淋巴瘤(BCBL1)。黄色箭头指示肿瘤位置。彩条指示以％ID/g((a)中0.68%，(b)中1.53%)计的「51]FIAU摄入范围。图21显示KSHV肿瘤(BCBL1)的酶促分子放射性疗法。图22是显示以[131I]FIAU和硼替佐米治疗后KSHV肿瘤尺寸减小的图。图23是显示"旁观者效应"的示意图。图24是用于蒙特卡罗细胞水平放射量计算(MonteCarlocell-leveldosimetrycalculation)的几何模型图。以通过细胞簇中部的横截面上的细胞水平活性分布显示10%、50%和100%的细胞摄取活性。为检查与总摄入形成对照的活性分布，使所述肿瘤中的总活性保持恒定。因此，如彩色程度所示，处于10%情境的细胞比100%模型的细胞具有更高的单细胞活性(红色分量vs灰色)；每一细胞内活性均匀分布。图25显示10%(顶行)、50%(中间行)禾口100%(底行)转染细胞自两千五百万131I衰变的剂量体积直方图(第一列)和吸收剂量空间散点图(第二列)。所述剂量体积直方图(第一列)显示已接受特定吸收剂量(x轴)的细胞数(y轴)；垂直虚线对应分布的均值，所述均值还列于该图上方。散点图(第2列)中的各点对应该处个体细胞所接受的吸收剂量；虚线对应球形肿瘤表面的位置。图26提供可用于本发明方法的细菌及其相应胸苷激酶的序列。具体实施方式本发明特色为可用于下述用途的组合物和方法用于肿瘤成像、用于治疗和预防与感染(如病毒感染或细菌感染)相关的瘤形成、用于为患有瘤形成的受验者选择有效疗法、和用于监控疗效。在其他具体实施例中，本发明可用于治疗细菌感染(如治疗含有细菌胸苷激酶的细菌)。特定具体实施例中，为了对肿瘤组织进行靶向放射治疗，本发明提供用以调节病毒基因表达的试剂。本发明至少部分基于下文将详细报导的大量发现。这些发现包括裂解阶段诱导化合物的鉴定及其在用于肿瘤成像中的用途；患有与潜在病毒感染相关疾病且可接受裂解疗法治疗的患者的鉴定和监控这些患者疗效；以及对于可用放射性药物治疗的肿瘤表达病毒多肽的发现。EB病毒(EBV)与多种恶性肿瘤相关。EBV相关肿瘤中，EBV胸苷激酶(TK)不被表达或以极低水平表达。如本文所述，可使用若干种促进病毒裂解诱导的试剂进行体外诱导EBV-TK表达。使用[2—14C]2'-氟-2'-脱氧-|3_D_5-碘尿嘧啶-呋喃阿拉伯糖苷(["C]FIAU)的体外测定和使用[^1]FIAU的离体生物分布研究显示，经放射性标记的FIAU的摄入和留存是表达EBV-TK的细胞所特有的。SCID小鼠内EBV(+)伯基特淋巴瘤异种移植物的平面伽马成像证明，经这种诱导试剂之一(硼替佐米)治疗后，[^1]FIAU位在肿瘤内。这些结果表明通过基于放射性药物的技术如单光子发射型电脑断层显像(SPECT)和正光子成像(PET)而将化学疗法介导(chemother即y-mediated)的病毒裂解诱导成像的可行性。此外，如本文所述，使用鼠科异种移植物模型，发现[1251]2'-氟_2'-脱氧-e-D-5-碘尿嘧啶-呋喃阿拉伯糖苷([125I]FIAU)可以表达EB病毒(EBV)-胸苷激酶(TK)的肿瘤为靶标。表达这病毒多肽的肿瘤可为治疗用放射性药物(如[mI]FIAU)的靶标，而减缓或停止肿瘤的生长或实现肿瘤退化。这些结果是在具有构成式表达EBV-TK的肿瘤的异种移植物和天然感染EBV的肿瘤细胞株的异种移植物实现的。伯基特淋巴瘤和胃癌需要以硼替佐米预处理所完成的病毒基因表达的活化。也可在硼替佐米活化后在天然感染卡波西肉瘤疱疹病毒(K即osi'ssarcomaherpesvirus,KSHV)的肿瘤中达到肿瘤生长的显著变化。以受硼替佐米诱导酶为靶标的靶向放射(bortezomib-inducedenzyme-targetedradiation,BETR)的疗法表明了通过药理学调节肿瘤基因表达来影响耙向放射疗法的可行性。尽管特殊的实例显示曲尼司特、来氟米特、吲哚洛芬、阿糖胞苷、甲苯达唑和硼替佐米作为EBV裂解诱导试剂，且可用于治疗与EBV相关的肿瘤，本发明并不局限于此。本发明方法可使用任何病毒裂解诱导试剂进行实践。所属
技术领域：
的技术人员应意识到，以与EBV相关肿瘤获得的结果通常可实际用于与病毒感染相关的任何瘤形成。此外，由于实施例阐述以FIAU和病毒(EBV/KSHV)胸苷激酶实现的结果，这些结果可外推至其他病毒和病毒激酶。与病毒相关的瘤形成EB病毒(EBV)与多种淋巴瘤和癌相关。卡波西肉瘤疱疹病毒(KSHV，HHV-8)与肉瘤和淋巴瘤相关。患有这些肿瘤的患者中，只要这些病毒通常感染极低百分比的淋巴细胞且患者体内几乎所有被感染细胞均为肿瘤细胞，则此病毒基因组作为几乎肿瘤特异性的靶标。因此，与病毒相关的代谢途径近乎为肿瘤特异性代谢途径。通过使用以l型单纯疱疹(HSV1)胸苷激酶(TK)基因进行设计的载体来监控使用放射性标记的核苷酸类似物的基因疗法环境中的基因表达，研究者已证明放射性同位素以疱疹病毒代谢途径为靶标的能力。发展以细胞和病毒代谢途径为靶标的新疗法的可能性已受限于肿瘤细胞内实际不存在TK和大多数其他由EBV基因组编码的酶的表达。使放射性药物以特殊组织为靶标提供了一种恶性肿瘤疗法的重要工具。藉由单克隆抗体的放射性结合体来靶标组织特异性表面抗原(如B细胞上的CD20)已将放射疗法的应用拓展至超出体外放疗或其他空间指向方法所能实施的疗法之外。这些方法可能受表达水平或抗体与靶向分子的亲和性或抗体的药物动力学所限制。即使在B细胞谱系的淋巴瘤中，一般来说，CD20表达程度不适用抗体靶向疗法。其他例子中，抗体结合体的物理特性阻碍其向大肿瘤内或被保护的隔室(如中枢神经系统)内的细胞输送。以代谢途径为靶标(如涉及以碘同位素的浓縮腺体内碘的代谢途径)是已建立的另一种方法，其更常规应用已受到其鉴定适当肿瘤特异性途径的能力所限制。如本文所述，若使用病毒TK的药理学诱导试剂，可使用经放射性标记的核苷类似物来成像携带EBV的天然发生肿瘤细胞(Fu，D.X.，etal.Virus-associatedtumorimagingbyinductionofviralgeneexpression.ClinCancerRes13，1453-1458(2007))。这发现已拓展至提供用于治疗携带病毒的瘤形成的新颖组合物和方法如同在EBV和KSHV异种移植物模型中使用携带病毒的肿瘤细胞的体内实验所证明者。所述方法包括使具有放射治疗性核苷类似物的诱导试剂靶标携带病毒的瘤形成细胞。用于本发明组合物和方法的放射性核素的物理和化学性质对其用于放射性疗法的选择非常重要，如必须考虑粒子发射的类型。a粒子具有有效杀死细胞的高线性能量转移(linearenergytransfer,LET)，和若干细胞直径的范围40-80ym。P粒子离子化密度较低，具有比a粒子发射体更长的范围，因此对肿瘤分布的需求限制较低。Y射线的能力和丰度也是重要的物理性质，因为Y射线的存在提供体外成像的可能性，但也增加了整体放射剂量。本发明方法在治疗瘤形成的应用并不局限于与EBV和HSV相关的瘤形成，实际上也能适用于与瘤形成相关的任何病毒感染。例如，与宫颈癌发展相关的人类乳突状病毒感染；与结肠癌发展相关的JC病毒；与肝癌发展相关的乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒；以及与T-细胞白血病发展相关的人类T-淋巴细胞病毒(humanT-lymphotrophicvirus)。治疗方法的选择受验者经诊断患有与病毒感染相关的瘤形成之后，选择治疗方法。将患有与可诱导进入裂解阶段的病毒感染相关的瘤形成的受验者鉴定为可接受本发明方法的治疗。通过扫描这些受验者的身体来鉴定该受验者体内瘤形成(例如肿瘤)的病毒裂解存在与否，从而鉴定出这些受验者。已将具有可视觉化的肿瘤(即其内病毒裂解已被诱导)的受验者鉴定为可接受本发明方法的治疗。已将具有不能视觉化的肿瘤(即其内病毒裂解未被诱导)的受验者鉴定为对本发明方法的治疗具有抗性。患者监控本发明诊断方法也可用于监控患者瘤形成进程或评估疗法规则(therapeuticregimene)的实效。于一具体实施例中，本发明诊断方法用于周期性监控与病毒相关肿瘤的尺寸。于一实施例中，在给予疗法之前使用本发明的诊断测定来表征化所述瘤形成。这测定提供阐述所述肿瘤尺寸或阐述肿瘤对病毒裂解诱导试剂治疗的易感性的基线。在疗法进程中给予其他诊断测定以监控所选疗法规则的实效。当本发明诊断方法检测到所述肿瘤细胞中病毒裂解诱导的增加或检测到肿瘤尺寸的减小，则鉴定所述疗法有效。本发明的裂解诱导化合物设计病毒基因以作为各种基因疗法模型中的报告体(r印orter)。尤其尤其已经广泛使用单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶(TK)。HSV-TK同系物是由EB病毒(EBV)所编码，EBV为与多种肿瘤(包括地方性伯基特淋巴瘤、移植后淋巴瘤(post-transplantlymphoma)、AIDS淋巴瘤、何杰金淋巴瘤(Hodgkin'slymphoma)、鼻咽癌和胃癌)相关的疱疹病毒。EBV-TK将选择性磷酸化核苷类似物2'-氟-2'-脱氧-13-D-5-碘尿嘧啶-呋喃阿拉伯糖苷(FIAU)。然而，由于潜在的病毒感染，酶不被表达或以非常低的水平被表达，因此使用FIAU的经放射性标记之类似物对EBV相关肿瘤进行直接平面伽马成像或PET成像是不可能的。裂解诱导造成细胞凋亡和病毒产生。故意的裂解诱导已被提议为EBV相关肿瘤的潜在疗法。理论上，这一策略可在若干水平产生作用EBV的裂解性感染可直接杀灭宿主细胞，所表达的裂解基因能将更昔洛韦(Ganciclovir)变成更昔洛韦的细胞毒性形式并杀灭宿主细胞，且裂解抗原能被CTLs识别，CTL将帮助自体内清除所述宿主细胞。因为，那些已报导来用作诱导EBV裂解周期的药物具细胞毒性的，且不能以足以15在足够数量细胞内诱导EBV裂解周期进而产生治疗效果的量给予，所以EBV裂解诱导作为EBV相关肿瘤特异性疗法的想法并未进一步实践。使用传统的细胞毒性的疗法来重新活化内源性EBV基因组丧失了特异性疗法的原始目的和杀灭病毒/宿主肿瘤细胞而不伤害正常细胞的优势。本发明提供诱导病毒裂解诱导的组合物和方法。EBV对上皮细胞的感染造成产毒感染，其伴随病毒的复制和被感染细胞的溶解。即刻早前基因对病毒基因表达的调节者(包括BZLF1和BRLF1蛋白)进行编码，其作为用以启动裂解性感染的开关。BZLF1蛋白抑制干扰素-Y受体的表达并抑制干扰素-Y的活性。早前基因对涉及病毒DNA合成的蛋白质(如病毒DNA聚合酶和胸苷激酶)进行编码。晚期基因对病毒的结构蛋白(包括病毒衣壳抗原和主要的包膜糖蛋白gp350)进行编码。原始感染期后，EBV病毒、疱疹病毒和其他病毒科进入潜伏期，此时活性病毒产生停止，但病毒仍然存在。某些条件下，病毒退出潜伏期并再次进入裂解阶段。本发明提供诱导病毒进入裂解阶段的试剂。这些试剂以"病毒裂解诱导试剂"指代。优选地，这些试剂对诱导病毒裂解有效而不具有对宿主或正常组织产生细胞毒性的不良反应。病毒裂解诱导试剂包括蛋白酶体抑制剂、抗微管蛋白药物、糖皮质素和载体激素、核苷类似物和抗炎药。可将这些试剂给予具有与潜在病毒感染相关的瘤形成的受验者，从而诱导所述病毒进入裂解阶段。病毒成像剂病毒裂解阶段的诱导造成病毒多肽的产生。这些多肽可用作诊断和/或监控与病毒相关瘤形成的特异性记号。特定的具体实施例中，本发明提供病毒酶的底物(substance)。因为所述底物容许成像或包括允许其被成像的部分，可使用传统成像方法如PET或SPECT-CD视觉化该底物。病毒酶在肿瘤细胞内浓縮所述底物，从而允许肿瘤细胞被视觉化。于体内使肿瘤代谢成像的能力具有广泛应用，典型如使用[18F]氟脱氧葡萄糖(FDG-PET)的正光子成像术的临床应用增加。当然，这种用于肿瘤组织的扫描的特异性局限在多种组织和快速代谢葡萄糖的恶性肿瘤范围内。因此，脑、心肌和发炎病灶全部导致FDG-PET成像的信号。化合物的"成像有效量"是提供足以视觉化肿瘤存在与否的信号所必需或足够的量。肿瘤可使用
技术领域：
中已知的或本文所述的任何方法成像，如平面伽马成像、单光子发射型电脑断层显像(SPECT)和正光子成像(PET)。所述有效量可依据诸如受验者尺寸及重量、疾病类型或特定化合物的因子而变动。例如，化合物的选择能影响"成像有效量"的构成。所属
技术领域：
的技术人员能得知本文所含的因素并不经过度实验即可进行所述化合物有效量的确定。成像能允许检测结合至诸如胸苷激酶的成像剂的存在和/或位置。存在可包括低于检测水平或不存在，位置可包括没有。本发明尤其提供试剂，包括于有机体内特异性结合至多肽的试剂(如结合至病毒胸苷激酶多肽的胸苷激酶结合化合物)，所述试剂产生可用于获得受验者图像及确定受验者体内胸苷激酶(优选为病毒胸苷激酶)的存在和位置的可检测信号。胸苷激酶尤其适合本发明的方法。病毒胸苷激酶具有激酶催化结构域的共有序列，而哺乳动物胸苷激酶的激酶催化结构域不具有此序列。因此，对病毒胸苷激酶具高亲和性的化合物对哺乳动物胸苷激酶的亲和性大量降低。本发明使用容易合成、且可被成像装置(如PET或SPECT仪器)检测的胸苷激酶结合化合物。一具体实施例中，所述化合物是结合至激酶的核苷类似物。特定具体实施例中，所述激酶是胸苷激酶。举例来说，W02006/002142提供了用于本发明方法的胸苷激酶结合化合物，该专利以弓I用形式并入本发明。成像通常，成像技术包括给予受验者可在受验者体外检测的化合物。凭借成像剂在受验者体内各种部位蓄积的空间分布的不同，产生图像。本发明的方法，成像技术依赖被优先结合至受验者体内如病毒胸苷激酶的化合物。可使用任何合适手段(如平面伽马成像、单光子发射型电脑断层显像(SPECT)和正光子成像(PET))测量在受验者体内(如肿瘤体积内)蓄积的成像剂的空间分布。或者，本发明方法可使用检测荧光的成像技术。可用于本发明方法的示例性化合物包括2'-氟_2'-脱氧-1-13-D-呋喃阿拉伯糖基_5-碘-尿嘧啶([125I]-FIAU)、2'-氟-2'脱氧-1-13-D-呋喃阿拉伯糖基_5-碘-尿嘧啶(n]-FIAU)、9-(4」8F-氟-3-[羟甲基]丁基)鸟嘌呤([，]-FHBG)、(18)F-l-(2'-脱氧-2'-氟-13-D-呋喃阿拉伯糖基)胸腺嘧啶([18F]-FMAU)、18F-2'_氟_2'脱氧-1P_D_呋喃阿拉伯糖基-5_乙基-尿嘧啶([18F]-FEAU)和l-(2'-脱氧-2'-氟-P-D-呋喃阿拉伯糖基)-5-[，]碘尿嘧啶([18F]-FIAU)。近来，Golankiewicz等((2001)J.Med.Chem.44:4284-7)和Goslinski等((2002)J.Med.Chem.45:5052-7)阐述了可用于本发明方法的示例性荧光化合物。Goslinski等阐述的荧光三环阿昔洛韦(acyclovir)和更昔洛韦类似物，尤其是GCV3被预期用于权利要求所请方法中作为胸苷激酶结合化合物。术语"胸苷激酶结合化合物"理解为具有足够的胸苷激酶亲和性的化合物，因此该化合物能用作成像剂和/或治疗剂。一具体实施例中，胸苷激酶结合化合物可以是病毒胸苷激酶结合化合物。病毒胸苷激酶结合化合物对病毒胸苷激酶的亲和性比其对哺乳动物胸苷激酶的亲和性高至少10倍、优选100倍、优选1000倍。举例来说，胸苷激酶结合化合物包括FIAU、FHBG、FMAU、FEAU、三环阿昔洛韦和更昔洛韦类似物(如GCV3)。胸苷激酶结合化合物可改性为包括官能团者，以利于其作为成像剂和/或治疗剂使用。特定具体实施例中，本发明提供核苷类似物，如l-(2'-脱氧-2'_氟-13-D-呋喃阿拉伯糖基)-5_碘尿嘧啶(FIAU)，例如，该化合物阐述在美国专利第4，211，773号中作为抗病毒和抗肿瘤试剂。底物是否用于成像或治疗仅仅依赖于所使用的放射性核素如用于成像的I-123、I-124或I-125以及用于治疗的I-131或At-211。使用放射性同位素如碘、氟、钇、铋或砹的放射性同位素标记核苷类似物。另一具体实施例中，所述核苷类似物可以是荧光的。本发明优选的经放射性标记的化合物为容易合成且限于体内代谢的核苷类似物。如美国专利第5，879，661号和第6，331，287号所阐述的化合物可用于本发明方法中。PET中所使用的最普通的正电子放射核是"C、13N、150和18F。通过俘获电子和/或Y放射而衰变的同位素用于SPECT中，且包括如123I和124I。本发明的方法包括PET。具体地，通过使用检测系统扫描患者整体或患者的特定区域进行成像，并检测信号如所述放射性同位素信号。随后将所检测的信号转变为图像。所得图形应由有经验的观察者如内科医生读取。本文将上述过程指代为对患者"成像"。通常在给予本发明方法所使用的化合物1分钟至约48小时后进行成像。所属
技术领域：
的技术17人员可轻易获知，精确的成像时间将依赖于多种因素如所给予化合物的清除率。—旦已经获得图像，所属
技术领域：
的技术人员将能确定所述化合物的位置。使用这一资讯，技术工作者能确定例如，是否存在肿瘤、是否病毒已经进入裂解阶段、肿瘤的程度、或受验者正在经历的治疗的实效。不同时间点(如12小时、24小时、36小时、48小时或更长时间)时间点所获得的图像尤其可用于确定治疗(如裂解疗法和/或化学疗法治疗)实效。与当前所使用的方法不同，临床医生可通过本文所阐述的成像方法辨别潜在阶段病毒感染的肿瘤和裂解阶段病毒感染的肿瘤。筛选测定本发明提供用于鉴定可用于病毒裂解诱导的试剂、用于肿瘤成像的试剂，或可作为用于治疗瘤形成的试剂(如作为放射性药物)的方。本文所阐述的实施例具体探讨FIAU作为病毒胸苷激酶底物的应用，所属
技术领域：
的技术人员理解本发明的方法并不局限于此。实际上，本发明的方法可使用能作为病毒多肽底物的任何试剂，和能通过改性而包括提供在成像技术中可见部分的试剂，或如通过给予肿瘤细胞释放致死剂量的放射物提供细胞死亡诱导的试剂(如作为放射性药物)。本发明的方法适用于候选试剂(适于作为成像剂、病毒诱导试剂或放射性药物)的高通量低成本筛选。本发明的方法可使用经分离或在体外测定或体内测定测试活性的试剂。所属
技术领域：
的技术人员应意识到，候选试剂对细胞的影响典型是通过与相应的不与所述候选试剂接触的对照细胞比较而得出的。因此，一具体实施例中，所述筛选方法包括将与候选试剂接触的裂解诱导(于具有潜在病毒感染的细胞内)与未处理的对照细胞内观察到的诱导相比较。其他具体实施例中，将以候选试剂处理的细胞内病毒多肽的表达或活性与未经处理的对照样品相比较，而鉴定出于接触细胞内增加病毒多肽的表达或活性、或增加病毒复制的候选化合物。可通过该技术中广为人知的过程如蛋白质印迹、流式细胞术、免疫细胞化学、结合至磁性和/或CD137特异性抗体包覆微珠、原位杂交、荧光原位杂交(fluorescenceinsituhybridization，FISH)、ELISA、微阵列分析、RT-PCR、RNA印迹、或比色测定(如考马斯亮蓝法(BradfordAssay)和福林酚试剂法(LowryAssay))来比较多肽表达或活性。—工作实施例中，将不同浓度的一种或多种候选试剂加入含有具有潜在病毒诱导的细胞的培养基中。将促进病毒多肽表达或报告体基因表达(于细胞内表达的病毒启动子控制下表达)的试剂视为可用于本发明；例如，这种试剂可用作预防、推迟、改善、稳定或治疗与病毒感染相关的瘤形成疾病的治疗剂。一旦得以鉴定，本发明的试剂(如特异性结合至病毒多肽和/或剌激病毒裂解诱导的试剂)可用于受验者体内肿瘤的成像和治疗。也可以选择或另外通过下述方式鉴定候选化合物首先测定特异性结合至且活化病毒多肽的候选化合物，再如本文所述测试候选化合物对病毒裂解诱导的作用。一具体实施例中，候选试剂的实效依赖于其与胸苷激酶相互反应或作为胸苷激酶底物的能力。这一相互反应可使用任何数量的标准结合技术和功能测定(如前文所述Ausubel等所阐述的方法)轻易测定。例如，可体外测试候选化合物与本发明多肽的相互反应性和结合性，以及候选化合物调节潜在病毒感染的能力。—特定实施例中，结合至病毒多肽的候选化合物可使用基于色谱的技术予以鉴定。例如，重组病毒多肽可通过标准技术而从设计成表达所述多肽的细胞中纯化或可通过化学合成，所述多肽一旦纯化即固定化于柱上。随后使候选试剂溶液通过该柱，基于所述试剂结合病毒多肽和固定于柱上的能力来鉴定特异性结合所述病毒多肽或其片段的试剂。为了分离所述试剂，洗涤该柱以除去非特异性结合的分子，随后从柱上释放感兴趣的试剂并收集。如果需要，通过这种方法(或任何其他适当方法)分离的试剂可进一步(如通过高效液相色谱)纯化。此外，可测试这些候选试剂作为病毒诱导试剂或作为病毒多肽底物(如本文所述)的能力。举例来说，通过这方法分离的试剂也可用来作为治疗或预防与病毒相关瘤形成发作(onset)的治疗剂。被鉴定为以小于或等于lnM、5nM、10nM、100nM、lmM或10mM的亲和常数结合至病毒多肽的化合物尤其适用于本发明。例如，这些试剂可用作抗击瘤形成的治疗剂。视需要而定，任何上述测定所鉴定的试剂可被认为在任何标准动物模型(如啮齿目动物异种移植物模型)中有效，并且，如果成功，可用作抗瘤形成的治疗剂。测试化合物和提取物通常，根据
技术领域：
已知方法，从大量天然产物或合成(或半合成)提取物库、或化合库、或从多肽或核酸库中鉴定出作为病毒裂解诱导试剂的试剂、作为病毒多肽底物的试剂或特异性结合至病毒多肽的试剂。熟悉药物发现和发展领域的人士将理解，测试提取物或化合物的确切来源对本发明筛选过程并不起决定性作用。筛选中所使用的试剂可包括已知作为治疗病原体感染的治疗剂的试剂。或者，实际上可使用本文所阐述的方法筛选任何数量的未知的化学提取物或化合物。这些提取物或化合物的实例包括，但不限于，基于植物、真菌、原核生物或动物的提取物、发酵液和合成化合物，以及现存多肽的改性物。通过商业手段可从大量来源处包括英国生物技术公司(Biotics，Sussex,區)、英国克赛诺瓦公司(Xenova，Slough，區)、圣卢西亚港海洋研究分所(HarborBranch0ceangraphicsInstitute,Ft.Pierce,Fia.)禾口马尔制药美国公司(PharmaMar，U.S.A.，Cambridge,Mass.)获取细菌提取物、真菌提取物、植物提取物和动物提取物形式的天然多肽库。可使用本文所述的该
技术领域：
已知方法将这些多肽改性为包括蛋白质转导结构域。此外，如果需要，根据该
技术领域：
已知方法(如标准萃取和分馏方法)生产天然或合成地生产的库。分子库合成方法的实例可从
技术领域：
中找到(如DeWittetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:6909，1993;Erbetal.，Proc.Natl.Acad.Sci./7X491:11422，1994;Zuckermannetal.，J.Med.Chem.37:2678，1994;Choetal.，Science,261:1303，1993;Carrelletal.，Angew.Chem.INt.Ed.Engl.33:2059，1994;Carelletal.，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33:2061，1994;和Gallopetal.，J.Med.Chem.37:1233，1994)。再者，如果需要，使用标准化学、物理学或生物学方法可轻易进行任合库或化合物的改性。也有多种方法可用于随机或指向性合成(如半合成或全合成)任何数量的多肽、化学化合物，包括但不限于基于糖、脂类、肽和核酸的化合物。合成化合物库可自布兰登联合共色(BrandonAssociates,Merrimack,N.H.)禾口奥德里奇化学(AldrichChemical,Milwaukee,Wis.)通过商业手段获取。或者，作为候选化合物的化学化合物可使用具有该
技术领域：
具有通常知识的人士所知的标准合成技术和方法从易于获取的起始材料合成。用于合成通过本文所阐述方法鉴定的化合物的合成化学转变和保护基团的方法(保护和去保护)是
技术领域：
中已知者，包括例如R.Larock着《综合有机转变》(ComprehensiveOrganicTransformations，VCHPublishers(1989))、T.W.Greene禾口P.G.M.Wuts着《有机合成中的保护基》(第二片反)(ProtectiveGroupsinOrganicSynthesis,2nded.，JohnWileyandSons(1991))、L.Fieser和M.Fieser着《费歇尔和费歇尔的有机合成试剂》(FieserandFieser'sReagentsforOrganicSynthesis,JohnWileyandSons(1994))，禾口L.Paquette编着《有机合成试齐U百禾斗全书》(EncyclopediaofReagentsforOrganicSynthesis,JohnWileyandSons(1995))及其后续版本中所阐述的。化合物库可存在于溶液内(如Houghten，Biotechniques13:412-421，1992)，或微珠上(Lam，Nature354:82-84，1991)、晶片上(Fodor，Nature364:555-556，1993)、细菌上(Ladner，美国专利第5，223，409号)、孢子上(Ladner，美国专利第5，223，409号)、质粒上(Culletal.，ProcNatlAcadSciUSA89:1865-1869,1992)或噬菌体上(ScottandSmith,Science249:386_390，1990;Devlin，Science249:404_406，1990;Cwirlaetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.87:6378—6382，1990;Felici，J.Mol.Biol.222:301—310，1991;上述Ladner的著述)。此外，熟悉药物发现和发展的人士轻易理解，只要可能，就应使用去重复(der印lication)(如分类学去重复、生物学去重复和化学去重复或其任意组合)方法或消除活性已知的材料的复制物和重复的方法。当发现粗提取物具有病毒多肽结合和/或病毒裂解诱导活性时，需要进一步分馏(fractionation)正向提取物(positiveleadextract)，以分离出导致所观察到的效果的分子构成。因此，提取、分馏和纯化过程的目标是对可用作成像剂、病毒裂解诱导试剂或瘤形成治疗剂的所述粗提取物内的化学个体进行仔细的表征和鉴定。这些异源提取物的分馏和纯化方法是
技术领域：
中已知的。如果需要，根据
技术领域：
已知方法对可用作治疗剂的化合物进行化学改性。治疗方法被鉴定起病毒裂解诱导试剂作用、起病毒多肽底物作用、起病毒多肽结合作用和/或起放射性药物作用的试剂可用于预防或改善与病毒感染(如潜在病毒感染)相关的瘤形成疾病。与病毒感染相关的癌包括，但不限于，与EB病毒相关的地方性伯基特淋巴瘤、移植后淋巴瘤、AIDS淋巴瘤、何杰金淋巴瘤、鼻咽癌和胃癌，以及与疱疹病毒相关的卡波西肉瘤肿瘤。与病毒相关的瘤形成可使用本发明的方法和组合物进行治疗、诊断、成像和监控。—治疗方法中，将经本文所述鉴定的试剂给予可能的或真实的患病组织或进行系统给予。所给予试剂的剂量依赖于大量因素包括患者个体的尺寸和健康状况。对于任何特定受验者，具体剂量规则应根据个体需要和给予组合物或监督给予组合物的人的专业判断随时间进行调整。药物治疗本发明提供用于鉴定能结合至病毒多肽或起病毒多肽底物作用、能诱导病毒裂解阶段、或能起治疗或预防瘤形成的治疗剂作用的组合物(包括核酸、肽、小分子抑制剂和抗体)的简单手段。因此，使用本文所述方法发现的具有医学价值的化学个体科用作药物或用作现存化合物结构改性如通过推理性药物设计进行改性的资讯。这些方法可用于筛选对病毒感染相关的各种瘤形成有效的试剂。对于疗法用途，使用本文所述方法鉴定的组合物或试剂可进行系统给予，如配制入药物学可接受的缓冲剂如生理盐水中。举例来说，优选的给予路径包括向患者体内提供连续的相同水平的药物的静脉注射、腹腔内注射、肌肉注射或皮内注射。将使用位于生理性可接受的载体内的疗法有效量的本文所鉴定的治疗剂进行人类患者或其他动物的治疗。举例来说，E.W.Martin的《雷明登氏制药科学》(Remington'sPharmaceuticalSciences)阐述了适用的载体及其配方。待给予的治疗剂的量依赖于给予方式、患者年龄和体重、以及病原体感染或瘤形成的临床症状而改变。尽管某些例子因为化合物的特异性增加而需要较低量，但所述量通常处于用于治疗其他病原体感染或瘤形成的其他试剂的用量范围内。以通过熟悉该技术的人士已知的方法或使用任何测量病毒启动子、病毒多肽或病毒复制的表达或生物活性的测定所确定的有效诱导病毒裂解(如诱导被感染肿瘤细胞的至少约3%至5%、5%至10%、10%至15%、15%至20%、20%至30%、30%至50%、50%至75%或75%至100%进行裂解)的剂量给予化合物。可通过任何适当手段给予用于治疗瘤形成的化合物，得到所述化合物与其他成分组合的治疗浓度，对改善、降低或稳定瘤形成有效。所述化合物可以任何合适的量包含在任何适当的载体物质中，且通常以所述组合物总重量的1%至95%存在。可以适用于非肠道给予路径(如皮下给予、静脉给予、肌肉给予或腹腔给予)的剂型提供所述组合物。可根据传统药物实践配制所述药物组合物(如见A.R.Gennaro编着的第20版《雷明登制药科学与实践》(Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy(20thed.)，LippincottWilliams&Wilkins,2000)以及J.Swarbrick和J.C.Boylan编着的《药物技术百科全书》(EncyclopediaofPharmaceuticalTechnology,1988-1999，MarcelDekker，NewYork))。细菌感染病毒并不是唯一的表达胸苷激酶的病原体。很多细菌病原体也表达这些激酶。因此，细菌感染也对FIAU(包括经放射性标记的FIAU类似物)治疗敏感。革兰氏阳性菌包括，但不限于，巴斯德菌(Pasteurella)种species、葡萄球菌(Staphylococci)种和链球菌(Str印tococcus)属。革兰氏阴性菌包括，但不限于大肠杆菌(Escherichiacoli)、假单胞菌(Pseudomonas)种和沙门氏菌(Salmonella)种。感染性细菌的具体实例包括但不限于，幽门螺杆菌(Helicobacterpyloris)、伯氏疏螺旋菌(Boreliaburgdorferi)、嗜月市军团菌(Xegionell即neumophilia)、结核菌(Mycobacteria)种(如结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、鸟分枝杆菌(M.avium)、胞内分枝杆菌(M.intracellular)、堪萨斯分枝杆菌(M.kansaii)、戈登分枝杆菌(M.gordonae))、金黄葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、淋病双球菌(Neisseriagonorrhoeae)、脑膜炎双球菌(Neisseriameningitidis)、单核增生李其jf特氏菌(Listeriamonocytogenes)、化脓性链球菌(Str印tococcuspyogenes)(A族链球菌)、无乳链球菌(Str印tococcusagalactiae)(B族链球菌)、链球菌(草绿色)、粪链球菌(Str印tococcusfaecalis)、牛链球菌(Str印tococcusbovis)、链球菌(厌氧性菌种)、肺炎双球菌(Str印tococcuspneumoniae)、病原性弯曲菌(Campylobacter)禾中.、肠球菌(Enterococcus)禾中、流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)、炭疽杆菌(Bacillusantracis)、白喉杆菌(corynebacteriumdiphtheriae)、棒状杆菌(corynebacterium)禾中、猪红斑丹毒丝菌(Erysipelothrixrhusiopathiae)、产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringers)、破伤风梭菌(Clostridiumtetani)、产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)、月市炎克氏杆菌(Klebsiellapneumoniae)、多杀性巴氏杆菌(pasteurellamultocida)、拟杆菌(Bacteroides)禾中、具核梭杆菌(Fusobacteriumnucleatum)、念珠状链杆菌(Str印tobacill體oniliformis)、梅毒密螺旋体(Tr印o固apallidium)、细弱密螺旋体(Tr印onemaperte皿e)、螺旋体(X印tospira)、立克次氏体(Rickettsia)禾口衣氏放线菌(Actinomycesisraelii)。其他细菌病原体包括产气杆菌(Aerobacter)、气单胞菌(Aeromanas)、不动杆菌(Acinetobacter)、衣氏方文线菌、土壤杆菌(Agrobacterium)、杆菌(Bacillus)、炭疽杆菌、拟杆菌(Bacteroides)、巴尔通氏体(Bartonella)、博代氏杆菌(Bordetella)，鼠博代氏杆菌(Bortella)、疏螺旋体(Borrelia)、布鲁氏菌(Brucella)、伯克霍尔德氏菌(Burkholderia)、荚膜菌(Caly,tobacteri咖)、弯曲菌(Campylobacter)、拧檬酸杆菌(Citrobacter)、梭菌(Clostridium)、产气荚膜梭菌、破伤风梭菌、棒状杆菌(Cornyebacterium)属、白喉棒状杆菌、棒状杆菌属、肠杆菌、产气肠杆菌、肠球菌(Enterococcus)、猪红斑丹毒丝菌、埃希氏菌(Escherichia)、弗朗西斯氏菌(Francisella)、具核梭杆菌、力口德纳菌(Gardnerella)、嗜血杆菌(Haemophilus)、哈夫尼菌(Hafnia)、螺杆菌(Helicobacter)、克雷白氏菌(Klebsiella)、肺炎克氏杆菌、乳酸菌(Lactobacillus)、军团杆菌(Legionella)、螺旋体、利斯特氏菌(Listeria)、摩根氏菌(Morganella)、莫拉氏菌(Moraxella)、分支杆菌(Mycobacterium)、奈瑟氏菌(Neisseria)、巴斯德氏菌(Pasteurella)、巴斯德杆菌(Pasturellamultocida)、变形杆菌(Proteus)、普罗威登斯菌(Providencia)、假单胞菌(Pseudomonas)、立克次氏体、沙门氏菌(Salmonella)、沙雷氏菌(Serratia)、志贺氏菌(Shigella)、葡萄球菌、寡养单胞菌(Stentorophomonas)、链球菌、念珠状链杆菌、密螺旋体(Tr印onema)、梅毒密螺旋体、细弱密螺旋体、黄单胞杆菌(Xanthomonas)、弧菌(Vibrio)和耶尔森氏菌(Yersinia)。不经肠道给予的组合物所述药物组合物可以剂型、配方或借助适当运载装置或含有传统的非毒性药物学可接受载剂和辅剂的移植物型式通过注射、输液或植入(皮下、静脉、肌肉、腹腔等)而不经肠道给予。这些组合物的配方和制剂是药物配方
技术领域：
技术人员所熟知的。可在上述《Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy》中找至Ll配方。不经肠道使用的组合物可提供为单位剂型(如单剂量安瓿)或含有若干剂量的小瓶，其中，可加入适当的防腐剂(见下文)。所述组合物的形式可以是溶液、悬浮液、乳液、输液装置或用于植入的运载装置，或该组合物可以干粉形式存在，在使用前与水或其他适当运载子重构。除了包括降低或改善病原体感染或瘤形成的活性试剂外，所述组合物可包括适当的不经肠道给予可接受的载体和/或赋形剂。为了控制释放，可将所述活性治疗剂并入微球、微胶囊、纳米颗粒、脂质体等中。再者，所述组合物可包括悬浮剂、增溶剂、稳定剂、pH调节剂、等渗调节剂和/或分散剂。如上所述，本发明的药物组合物可以适用于无菌注射的形式存在。为了制备这种组合物，将适用的活性活性发炎性肠病病治疗剂溶解或悬浮于不经肠道给予可接受的液体运载子中。可使用的可接受的运载子和溶剂是水(通过加入适量盐酸、氢氧化钠或适当缓冲剂调节至适当pH的水)，l，3-丁二醇，林格溶液(Ringer'ssolution)和等渗氯化钠溶液和葡萄糖溶液。所述水性配方也可以含有一种或多种防腐剂(如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸正丙酯)。在所述化合物之一仅仅微溶或难溶于水的情形22下，可加入溶解促进剂或增溶剂，或所述溶剂可包括10%(w/w)至60%(w/w)的丙二醇等。控制释放的不经肠道给予的组合物控制释放的不经肠道给予的组合物的形式可以是水悬浮液、微球、微胶囊、磁性微球、油溶液、油悬浮液或乳液。或者，活性药物可并入生物相容载体、脂质体、纳米颗粒、移植物或输液装置内。用于微球和/或微胶囊制剂的材料是，例如生物降解/生物侵蚀聚合物如丙交酯乙交酯共聚物(polygalactin)、聚(氰基丙烯酸异丁酯)、聚(2-羟乙基-L-谷氨酰胺)(p0ly(2-hydroxyethyl-L-glutam-nine)和聚乳酸。可用于配制不经肠道给予的组合物的生物相容载体是碳水化合物(如右旋糖苷)、蛋白质(如白蛋白)、脂蛋白或抗体。用于移植物的材料可以是非生物降解的(如聚二甲基硅氧烷)或生物降解的(如聚己内酯、聚乳酸、聚乙醇酸或聚原酸酯或其组合)。口服用途的固体剂型口服制剂包括含有所述活性成分与非毒性药物学可接受的赋形剂的混合物的片剂。这些配方是所属
技术领域：
的技术人员所已知的。举例来说，赋形剂可以是惰性稀释剂或填料(如蔗糖、山梨醇、糖、甘露醇、微晶纤维素、淀粉(包括马铃薯淀粉)、碳酸钙、氯化钠、乳糖、磷酸钙、硫酸钙、或磷酸钠)；成粒剂和崩解剂(如纤维素衍生物包括微晶纤维素、淀粉包括马铃薯淀粉、交联羧甲基纤维素钠、褐藻酸盐或褐藻酸)；粘合剂(如蔗糖、葡萄糖、山梨醇、阿拉伯胶、褐藻酸、褐藻酸钠、明胶、淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、硅酸镁铝、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮或聚乙二醇)；以及润滑剂、助流剂和抗粘剂(如硬脂酸镁、硬脂酸锌、硬脂酸、二氧化硅、氢化植物油或云母)。其他药物学可接受的赋形剂可以是着色剂、芳香剂、增塑剂、润湿剂、缓冲剂等。所述片剂可以非包衣片，或可通过已知技术包衣，以视需要推迟在胃肠道内的崩解和吸收，从而在较长时期提供持续作用。所述包衣可适应以预定方式(如为了实现控制释放配方)释放所述活性药物，或可适应直到通过胃之前均不释放所述活性药物(肠衣)。所述包衣可以是糖衣、膜衣(如基于羟丙基甲基纤维素、甲基纤维素、甲基羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羧甲基纤维素、丙烯酸酯共聚物、聚乙二醇和/或聚乙烯吡咯烷酮)、或肠衣(如基于甲基丙烯酸共聚物、邻苯二甲酸醋酸纤维素、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素、醋酸琥珀酸羟丙基甲基纤维素、聚醋酸乙烯邻苯二甲酸乙烯酯、虫胶和/或以及乙基纤维素)。再者，可采用时间推迟材料如甘油单硬脂酸酯或甘油二硬脂酸酯。所述固体片剂组合物可包括适应保护所述组合物不经受非期望化学变化(如释放所述活性抗病原体或抗瘤形成的治疗性物质之前的化学降解)的包衣。可使用类似于上述《EncyclopediaofPharmaceuticalTechnology》中所阐述的方式将包衣施力口于固体剂型上。可将至少两种抗病原体或抗瘤形成治疗剂一起混合在所述片剂中或分开使用。一实施例中，在所述片剂中，将第一活性抗病原体或抗瘤形成治疗剂含于所述片剂内部，而将第二活性抗病原体或抗瘤形成治疗剂置于片剂外部，因此，在所述第一活性抗病原体或抗瘤形成治疗剂释放之前，所述第二活性抗病原体或抗瘤形成治疗剂的一实质部分已释放。口服用途的制剂形式也可以是咀嚼片；或硬胶囊，其中所述活性成分与惰性固体稀释剂(如马铃薯淀粉、乳糖、微晶纤维素、碳酸钙、磷酸钙或高岭土)混合；或软胶囊，其中23所述活性成分与水或油基如花生油、液体石蜡或橄榄油混合。可使用上述片剂和胶囊成分以传统方式使用诸如混合器、流动床仪器或喷雾干燥设备制备粉剂和颗粒剂。控制释放的口服剂型控制释放的口服组合物可以设计成例如通过控制活性物质的溶解和/或扩散来释放抗瘤形成治疗剂。可通过适当包覆化合物的片剂、胶囊、丸剂或颗粒配方，或通过将该化合物并入适当基质中实现控制释放溶解或扩散。控制释放包衣可包括一种或多种上述包衣物质和/或，例如虫胶、蜂蜡、甘油蜡(glycowax)、蓖麻蜡、硬脂醇、甘油单硬脂酸酯、甘油二硬脂酸酯、甘油棕榈酸硬脂酸酯、乙基纤维素、丙烯酸系树脂、(11-聚乳酸、醋丁纤维素、聚氯乙烯、聚醋酸乙烯酯、乙烯基吡咯烷酮、聚乙烯、聚甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸甲酯、2-羟基甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯水凝胶、1，3_丁二醇、甲基丙烯酸乙二醇酯和/或聚乙二醇。控制释放基质配方中，基质材料也可以包括，如水合甲基纤维素、巴西棕榈蜡和硬脂醇、卡波普934(carbopo1934)、硅酮、甘油三硬脂酸酯、丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸甲酯、聚氯乙烯、聚乙烯和/或卤代氟碳化合物。含有一种或多种治疗化合物的控制释放组合物可以是胃漂浮片或胶囊(即口服给予时在一定时期内漂浮于胃内容物的顶部的片剂或胶囊)。可通过将化合物和赋形剂的混合物以及20%(w/w)至75%(w/w)的水状胶体如羟乙基纤维素、羟丙基纤维素或羟丙基甲基纤维素造粒来制备所述化合物的胃漂浮片剂。接着可将所得粒剂压制成片剂。所述片剂与胃液接触后，形成环绕片剂表面的完全不透水凝胶屏障。这一凝胶屏障参与保持低于1的密度，从而允许所述片剂保持漂浮于胃液中。组合疗法视需要而定，抗瘤形成治疗剂可与任何其他标准抗瘤形成疗法组合给予；这些方法是所属
技术领域：
的技术人员所已知的，并在E.W.Martin着《Remington'sPharmaceuticalSciences》中有所阐述。[OH1]试剂盒本发明提供用于与病毒相关瘤形成的诊断性成像、治疗、预防或监控的试剂盒。一具体实施例中，所述试剂盒包括含有有效量(如单位剂型)的用于治疗瘤形成的试剂的组合物。另一具体实施例中，所述试剂盒包括含有病毒裂解诱导试剂的组合物。再一具体实施例中，所述试剂盒包括用于将瘤形成成像的试剂。一些具体实施例中，所述试剂盒包含无菌容器，该容器含有治疗性或预防性细胞组合物；这些容器可以是盒子、安瓿、瓶子、小瓶、管、袋、小袋、透明包装或
技术领域：
中已知的其他适用容器形式。这些容器可由塑胶、玻璃、层压纸、金属箔或其他适用于容纳药品的材料。如果需要，本发明试剂可与给予患有瘤形成或具有瘤形成倾向的受验者该试剂的说明书同时提供。所述说明书一般包括关于组合物用于将瘤形成成像、或用于治疗或预防瘤形成的资讯。其他具体实施例中，所述说明书包括下述至少一项治疗剂或成像剂的描述；用于治疗或预防瘤形成或其症状的用量和给予方法；注意事项；警告；适应症；禁忌症；用药过量资讯；不良反应；动物药理；临床研究和/或参考文献。所述说明书可直接列印在容器上(若存在容器)，或作为粘附在容器上的标签，或作为单页、册、卡或折页放入容器内或与容器同时提供。除特别说明外，本发明实践采用所属
技术领域：
的技术人员知识范围内的分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学传统技术。文献资料如《分子克隆实验室手册(第二版)》("MolecularCloning:ALaboratoryManual",secondedition(Sambrook，1989))、《寡核苷酸合成》("01igo薦leotideSynthesis，，(Gait，1984))、《动物细胞培养》("AnimalCellCulture"(Freshney，1987))、《酶学方法》("MethodsinEnzymology")、《实验免疫学手册》("HandbookofExperimentallmm皿ology"(Weir，1996))、《哺乳动物细胞的基因转移载体》("GeneTransferVectorsforMammalianCells"(MillerandCalos，1987))、《分子生物学实验室指南》("CurrentProtocolsinMolecularBiology"(Ausubel，1987))、《PCR:聚合酶链反应》("PCR:ThePolymeraseChainReaction",(Mullis，1994))、《免疫学实验室指南》("CurrentProtocolsinImmunology"(Coligan，1991))中完整解释了这些技术。这些技术科用于本发明聚核苷酸和多肽的生产，因此，本身可认为用来完成和实践本发明。下文将探讨对特定具体实施例尤其有用的技术。下列实施例的提出向所属
技术领域：
的技术人员提供如何完成和使用本发明的测定、筛选和治疗方法的完全公开，下列实施例并不用来对发明人认为是其发明的范畴作成限制。通过下列实施例进一步阐明本发明，该实施例不应被认为用以限制本发明。实施例实施例1:由荧光素酶测定所鉴定的Zta启动子活化试剂Zta是EBV裂解性感染中的关键反式启动因数。所有已报导的裂解诱导试剂均活化Zta的转录。为了鉴定诱导EBV中即刻早期基因表达的药物，评估胃癌细胞株背景下Zta启动子荧光素酶报告体的活性以检测已知的EBV裂解基因表达诱导试剂。如图l所示，这个启动子-上皮细胞测定中，使用佛波醇12-十四酸酯13-醋酸酯(phorboll2-tetradecanoate13-acetate，TPA)和丁酸酯(TPA/butyrate)以及丙戊酸进行处理导致剂量荧光素酶的表达以剂量依赖的方式增加，而5'-氮脱氧胞嘧啶不活化这个启动子(图1)。所述启动子-报告体系统可能不反映病毒游离基因环境中Zta启动子的调控。所示ZTA启动子-上皮细胞测定聚焦于无病毒系统中EBV复制的单一、明确定义的态样。在多水平上调整EBV裂解性感染，包括裂解启动子的后天修饰和潜在蛋白质抑压。ZTA荧光素酶不鉴定药物如5'-氮脱氧胞嘧啶。因此发展用于高通量筛选的基于互补病毒-细胞的测定。实施例2:用来鉴定EBV裂解诱导试剂的GFP-病毒基测定的发展BX-I是具有中断BXLF10RF的重组EBV，用来编码GFP，而AKATA-BX1细胞是具有这个重组EBV的Akata阴性细胞。显微镜方法显示，当以抗-IgG诱导AKATA-BX1细胞中EBV裂解性感染时，GFP信号将随着裂解诱导而增加(图2A)。由于GFP是通过EBV重组病毒编码的，病毒复制将产生更多GFP并获得更强的荧光信号。通过微量培养盘判读器检测这个GFP信号。在裂解诱导之后，检测相对荧光单位(RFU)的增加(图2A)。GFP信号被S阶段CDK抑制剂PurvalanolA特异性地抑制，有报导称PurvalanolA抑制EBV裂解诱导[7](图2B)。为了确定GFP信号诱导是否由CMV启动子活化或反射裂解性复制造成，使用具有GFP质粒驱动的CMV启动子的稳定Hela细胞株作为对照。此对照细胞株中，所研究的裂解诱导试剂无一显示增加的GFP信号(图2C)。与荧光素酶测定相比，Akata-BXl细胞内的GFP信号被5'-氮脱氧胞嘧啶以剂量依赖的方式诱导(图3)。以96-孔型式，所述GFP测定可轻易适应高通量测定。实施例3:基于临床化合物的库的药物筛选约翰霍普金斯临床化合物库(JohnsHopkinsClinicalCompoundLibrary，JHCCL)含有2720中化合物，以10iiM的最终浓度筛选该库中的化合物。将化合物溶解于匿S0或PBS中，加入96-孔盘中。图4显示GFP全病毒测定的典型读出。于一个或两个测定中，超过200中化合物被鉴定为潜在的裂解诱导药物。经鉴定具有活性的大部分试剂可被分成5大类蛋白酶体抑制剂、抗微管蛋白药物、糖皮质素和载体激素、核苷类似物、以及抗炎药。尽管很多命中物是共有的，淋巴瘤细胞株/全病毒测定中糖皮质素活性是最频繁被鉴定的，而在上皮细胞-启动子报告体测定中抗微管蛋白药物最常被发现。有意思的是，很多抑压命中物并不是通常为人所知为细胞毒性药物的药物。那些命中物中有辛伐他汀(simvastatin)和洛伐他汀(lovastatin)，近来，有报导称这两种药物诱导EBV转型类淋巴母细胞株的凋亡(Katanoetal.，ProcNatlAcadSciUSA，2004.101(14):4960-5)。这些试剂的进一步研究可能揭示EBV相关肿瘤的某些肿瘤特异性疗法。对先前已显示诱导EBV裂解周期的药物进行再鉴定，表示用于上述两种测定的方法的决定性确认。通过上皮细胞启动子报告体测定得以证实的药物仅为甲氨喋呤、顺铂、5-FU和紫杉醇。通过淋巴瘤细胞株/全病毒测定得以证实的药物仅为大部分糖皮质素药物和抗-IgG。通过两种测定均得以证实的药物是阿霉素、PMA和部分糖皮质素药物。通过两种测定均未得以证实的药物是丁酸钠、精氨酸丁酸酯和氯化钴(图5)。随后以5iiM、liiM、100nM和lOnM进行相同测定来进一步研究所述命中物，从而确定用于诱导裂解性感染的ECs。。接着在EBV阳性细胞株中测试有希望的命中物。对于这些进一步的科学研究，在该库中单独获得化合物。这些是部分基于所述试剂在进一步分析中的可用性，以及部分用以表示最初筛选中鉴定的化合物的多样性而选择的。对于在较低分子浓度具有活性的化合物和并非传统细胞毒性药物的化合物的兴趣较小。实施例4:被鉴定作为裂解诱导试剂的硼替佐米、甲苯达唑、阿糖胞苷启动子-上皮细胞测定揭示很多药物能诱导BZLF启动子。曲尼司特是抑压肥大细胞脱颗粒作用、组胺释放和纤维化过程的抗过敏性药物(图6)。所述抗炎效果是通过NF-KB功能的抑制达到的。来氟米特抑制二氢乳清酸酯脱氢酶(嘧啶生物合成中的第四种酶)，并于体外对抗生长因数介导的平滑肌细胞增殖。来氟米特用来治疗风湿性关节炎。治疗性血浆浓度的曲尼司特和来氟米特将BZLF启动子诱导高至15倍(图6)。有报导称仅即刻早期蛋白BZLF就足以触发整个裂解连锁反应。然而，能在荧光素酶测定中诱导BZLF启动子的药物不必诱导BZLF蛋白质表达。上述试剂不诱导EBV阳性细胞株如SNU719、AKATA、Raji、LCL和Rael细胞内的BZLF蛋白质表达。所述荧光素酶测定中的其他命中物诱导BZLF1蛋白质而非病毒的复制。这一类别的药物包括阿糖胞苷(Ara-C)(图7A)和吲哚洛芬(图9A)。Ara-C在荧光素酶测定中诱导BZLFI启动子(图7B)，且诱导LCL细胞中的ZTA表达(图7C)。阿糖胞苷和吲哚洛芬触发EBV即刻早期基因表达，但停止晚期的裂解连锁反应。阿糖胞苷诱导SNU719、LCL、AKATA-BX1细胞中的即刻早期蛋白ZTA(图8A和8B)，也诱导裂解基因RPA和TK表达(图8C)，但不诱导病毒复制(图8D)。喷哚洛芬诱导SNU719中的ZTA，但不诱导病毒复制(图9A至9D)。硼替佐米是两种测定中最突出的命中物(图IOA)。所述测定中，硼替佐米ECs。是纳摩尔规模的，这与治疗性血浆浓度一致。当在EBV(+)B细胞中测试时，硼替佐米不仅诱导裂解基因如ZTA(图10B)、RTA和EBV-TK，还诱导EBV复制(图10C)。甲苯达唑也能诱导EBV+细胞株内的BZLF1蛋白质表达和病毒复制(图11)。总而言之，通过在临床化合物库中应用两种测定，所述筛选鉴定很多具有强大EBV裂解诱导活性的FDA核准药物。已有报导称，被oriP稳定转染的质粒中Zta启动子的调整与EBV中内源Zta启动子的调整相似(Jenkinsetal.，JVirol，2000.74(2):p.710-20)。在oriP质粒中的染色质结构被保持在乙酰化期间时，Zp启动子区域不被甲基化。尽管该报导使用"规则的"pGL2质粒用于药物筛选，仍观察到相似的染色质结构。所述Zp启动子被丁酸盐(HDAC抑制剂)诱导，但不被甲基化抑制剂(5-氮脱氧胞嘧啶)诱导。所观察到的GFP信号对应于病毒复制，且是EBV裂解诱导的可靠报告体。GFP信号在复制过程中的连续产生和容易定量化是重要长处。GFP已经作为报告体用在很多病原体如结核菌(Mycobacteriumtuberculosis)(Collinsetal.，AntimicrobAgentsChemother,1998.42(2):p.3447)、HIV(Daelemansetal.，MolPharmacol,2005.67(5):p.1574-80)、CMV和HCF(Leeetal.，JVirolMethods,2004.116(1):p.27-33)的药物筛选测定中。本发明确立用于即时监控细胞内EBV复制的新颖测定，并使这个测定适应高通量筛选。在GFP和荧光素酶测定中发现的不同命中物反映两种测定的不同特点。而且，和使用其他高通量筛选的结果相同，所述测定的敏感度和特异性为筛选中所使用的药物浓度所限制。两种筛选均未检出精氨酸丁酸酯和丁酸钠，这是因为测试浓度(10PM)远远低于报导的有效浓度(0.5至2mM)。如本文所示，本发明提供诱导EBV裂解感染的试剂。EBV裂解感染也被认为在移植后淋巴增生疾病(Posttransplantationlymphoproliferativedisorders,PTU))中扮演重要角色。理解各种能再活化EBV复制的试剂可能对治疗这些病症有用。曲尼司特和来氟米特在治疗性浓度活化所述裂解启动子。尽管它们并不诱导B细胞或胃上皮细胞(SNU719)中的裂解蛋白表达或病毒复制，吲哚洛芬在以高剂量诱导SNU719细胞中的Zta蛋白质显示希望。我们的命中物中大多数是细胞毒性药物，可能与病毒回应压力而活化的观念一致。一组截然不同的药物是微管破坏药物。阿糖胞苷代表能诱导即刻早期和早期基因表达，但不诱导整个裂解复制的一类特殊药物。其作用可能归因于对病毒DNA聚合酶的抑制。这类药物能完成宿主细胞凋亡所需的主要步骤而不造成病毒血症，因此引起研究者兴趣。不仅是即刻早期基因BZLFl和BRLF1被诱导，裂解连锁反应可波及TK，这允许更昔洛韦和病毒成像能运作。发现现存药物的新用途是有希望的方法。现存化合物的筛选可能鉴定某些已知药物的新活性/适应症。此库的一个显而易见的优点是，所述筛选之后的临床试验绕开了确立毒性和药代动力学所需的费时费钱的过程。实施例5:硼替佐米诱导EBV-TK如免疫印迹(图12A和12B)、ZTA/荧光素酶活性(图12C)、和["C]FIAU蓄积所反映的TK功能活性(图12D)所评估的，硼替佐米治疗诱导EBV-TK和EBV-ZTA表达。不存在硼替佐米时或EBV(-)细胞株中，未检测到抗原或功能活性。如表达绿色荧光蛋白(GFP)的BX-I细胞株(图13A和13B)所示，硼替佐米的效果是剂量依赖的。通过即时DNAPCR测量的病毒拷贝数也随着治疗而增加(图13C)。良好识别的硼替佐米的效果之一是IkB的稳定化和由之而来的NF-kB的抑制。在确定之一路径对于裂解基因表达的诱导是否也重要的尝试中，以伯基特细胞株转染实验中的IkB超阻遏者(IkB(sr))研究硼替佐米的效果。如图13D所示，转染后，EBV病毒负载增加大约12倍。此外，在20nM硼替佐米存在下培养EBV(+)Akata细胞48小时后，67X的细胞进入裂解周期，且该诱导被证明是剂量依赖的。以硼替佐米或磷酸盐缓冲盐水(PBS)处理携带EBV(+)伯基特淋巴瘤异种移植物的小鼠，并在注射[^1]FIAU后的多个时间成像(图14)。总是在给予[125I]FIAU的24小时前，给予硼替佐米，也是静脉给予。早期时间点获得的图像仅揭示心血池、肝脏、膀胱和甲状腺，与所确立的[^1]FIAU生物分布一致。在注射放射性药物l天后，可以看见以硼替佐米处理的动物体内的肿瘤，且在注射4天后，被处理动物体内的肿瘤清晰可见，尽管膀胱内的放射活性非常丰富。此细胞株被处理96小时后，2iig/g的硼替佐米剌激最大靶标信号与非靶标信号的比例。如同时进行的离体伽马计算所述，图14B中96小时时间点上箭头所指的放射活性是肿瘤内的。携带另一EBV(+)伯基特细胞株(Rael)异种移植物的动物中也获得了相似结果。该例中，以硼替佐米而非PBS处理的肿瘤于放射性药物注射30小时后得以清晰视觉化。图15显示给予放射性药物72小时和96小时后，EBV(+)Akata细胞株异种移植物的SPECT-CT图像。该图像中，72小时和96小时的每克注射剂量百分比(％ID/g)分别是1.13±0.01和0.70±0.01。仅有一只鼠使用SPECT-CT成像，因此使用每一图像的多层扫描计算标准偏差(SD)值。实施例6:离体生物分布为了证实图14和15的图像中看起来位于肿瘤内部的放射活性实际上也位于肿瘤内并对摄入量定量，对携带EBV(+)异种移植物的动物进行附加实验来实现离体生物分布测定。以硼替佐米预处理的动物的肿瘤内，尽管更早期[^1]FIAU摄入的明显增加，峰值出现在注射后96小时。图14A显示96小时处，以PBS预处理的小鼠体内缺乏肿瘤摄入(0.039%ID/g);图14B显示以硼替佐米预处理的动物的肿瘤摄入的时间进程。以硼替佐米处理后，肿瘤对放射性药物的吸收从0.039%ID/g增加至0.85%ID/g，比基线值增加了几乎22倍(表1)。表l携带人类EBV(+)肿瘤(Akata)的严重联合免疫缺陷的小鼠体内[^1]FIAU的组织分布28<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>于其他组织即肝脏、脾、肾和肌肉内检测到的放射活性于24小时至96小时的时间点间减少。为了证实硼替佐米处理后的肿瘤成像能力并不反映导致FIAU蓄积的人类细胞激酶的诱导，还对EBV(-)骨肉瘤异种移植物进行成像。经或不经硼替佐米处理的肿瘤摄入都不明显。然而，被设计成构成式表达EBV-TK的相同细胞株可轻易成像(图16)。这些结果表明，与成像相关的病理学诱导效果是由病毒TK而非细胞激酶活性介导的。报告体转基因(r印ortertransgene)在确定感兴趣的内源性基因表达中的用途已经成为细胞和分子生物学的主干。那些先前仅用于体外研究的技术已经拓展至体内成像。体内分子-基因成像的相对较新领域使用各种模型，大部分对应临床使用的技术包括磁共振成像和PET。通过以适用的成像报告体(主要是但不限于HSV1-TK)转染细胞，并使用各种经放射性标记的物质和配体，研究者能测量各种细胞进程包括T-细胞运输(T-cellstrafficking)、免疫活化、对机理特异性抗癌剂的回应和蛋白质相互反应网的组装。两个报导使用分子-基因成像来鉴定患者体内被抗肿瘤基因治疗制剂中的HSVl-TK产生性转染的细胞。本发明将内源性TK表达成像，来研究结肠癌实验模型的联合细菌裂解治疗(combinedbacteriolytictherapy)禾口一般性细菌感染(Bettegowdaetal.，ProcNatlAcadSciUSA2005;102:1145，该文献以引用形式并入本文)。本文使用分子-基因成像来研究基因EBV-TK的表达(将EBV-TK作为诱导病毒裂解周期的替代标志)，从而可避免使用基因转染步骤。对EBV伯基特和Akata淋巴瘤异种移植物进行病毒TK表达的药理学诱导后，使用专门的伽马相机以「si]FIAU成像。与病原性病毒相关的肿瘤们本身即提供用于肿瘤直接成像的报告体基因。所述方法敏感度高，仅有占肿瘤质量5%的细胞需要诱导进入裂解周期即可通过特定EBV(+)细胞株的成像进行检测。尽管所使用的肿瘤模型是皮下的，Y射线显著衰变的缺乏暗示所述方法可用于身体内的肿瘤深处。如上所述，自2，700种食品和药物管理局(FoodandDrugAdministration)核准的药物中筛选，鉴定出硼替佐米作为诱导EBV裂解周期的最高活性药物，提供本研究的逻辑依据。抑制NF-kb路径会诱导所述ebv裂解周期。已知硼替佐米藉由抑制IkB的降解而具有抗NFkB活性。本文所报导的结果揭露了抗-NFkB活性与裂解诱导之间的连接，提供在所研究的与EBV相关淋巴瘤中观察到的结果的机理。基于这些发现，用于成像的肿瘤的病毒相关性很可能可用于癌症的治疗。值得注意的是，已有人探索一些涉及肿瘤中病毒基因表达调制的治疗策略(Jacobsetal.，Lancet2001;358:727-9;Yaghoubietal.，JNuclMed2006;47:706-15)。这些疗法可通过本报导所述的潜伏期模型进行非侵袭性监控；或使用已经临床使用的放射性标记的核苷类似物在患者体内进行非侵袭性监控(Jacobsetal.，Lancet2001;358:727-9;Yaghoubietal.，JNuclMed2006;47:706-15)。优化某些与病毒相关肿瘤治疗的方法是常规且为熟悉该技术的人士所知的方法。硼替佐米是先前已知对诱导裂解感染有效的众多新试剂之一，是可通过成像调整而用于具体患者的特定试剂。举例来说，引发治疗后，如果肿瘤不能在短期内被十分肯定地描绘在[mi]FIAU-PET扫描图上，应停止该患者的裂解诱导治疗而代之以另一潜在地更有益方法。在指示治疗有益效果的成像研究中的阳性信号与天然关于病毒基因组的特异性基因诱导机理性联系，而不需要所述成像报告体的病毒转染或其他转染，这证明可向抗癌疗法提供可轻易转译的优点。实施例7:设计成构成式EBVTK表达为了评价可能以病毒TK诱导实现的关于肿瘤组织中2'-氟-2'-脱氧-!3-D-5-碘尿嘧啶-呋喃阿拉伯糖苷(FIAU)的特异性，使用先前设计成表达EBV-TK的人类骨肉瘤细胞株(Moore，S.M.，Ca翻n，J.S.，Tanhehco，Y.C.，Hamzeh，F.M.&Ambinder，R.F.InductionofEpstein_Barrviruskinasestosensitizetumorcellsto皿cleosideanalogues.AntimicrobAgentsChemother45，2082-2091(2001))。将肿瘤细胞皮下移植入SCID小鼠的侧腹部。肿瘤可触知后，静脉给予[^1]FIAU，并在不同时间点杀死鼠进行组织分布研究(图17)。2小时处，TK(+)肿瘤内放射活性的选择浓度明显，且直到96小时的最后时间点为止，所述肿瘤内放射活性水平保持恒定，但非靶标组织内的放射活性水平降低。在较迟时间点进行的平行实验中，从2小时起至4天后的最后时间点，肿瘤内的放射活性稳定。肿瘤内放射活性与肌肉内放射活性的比值从输液后2小时的4.6爬升，输液后24小时升至峰值205，并在输液后96小时下降至114。为了确定肿瘤组织内EBV-TK介导的放射性同位素浓度是否足以实现治疗效果，以[mi]FIAU或缓冲盐水处理具有肿瘤的鼠(图18A至18C)。注射缓冲盐水的鼠体内的对照肿瘤与TK肿瘤、和注射[mi]FIAU的鼠体内的对照肿瘤显示相似的生长曲线，值得注意的是，这些生长曲线的斜率(线性回归确定)的95%可靠区间重叠。注射[mi]FIAU的鼠体内TK肿瘤的生长斜率平坦(即以[mi]FIAU处理的TK的斜率可靠区间尤其包括零斜率评估值且不与其他生长曲线的可靠区间重叠)，表明所述处理的生长速度显著减缓。独立实验中，增加[131I]FIAU的剂量与提高肿瘤生长减缓效果相关(图18B)。当植入TK肿瘤细胞和对照肿瘤细胞的混合物以产生恶性肿瘤时，所述混合物中TK表达肿瘤细胞百分比的增加也与提高肿瘤生长减缓效果相关(图18C)。实施例8:EBV-伯基特淋巴瘤的硼替佐米诱导的酶靶向放射性治疗如上所述，蛋白酶体抑制剂硼替佐米被鉴定为体外伯基特淋巴瘤细胞株和鼠科异种移植物模型细胞株内裂解性EBV感染的诱导试剂。为了评价可能通过天然感染的肿瘤组织中的药理学诱导实现的特异性，将EBV(+)伯基特淋巴瘤细胞皮下移植入SCID小鼠的侧腹部。肿瘤可触知后，在给予硼替佐米24小时后静脉给予[mi]FIAU，并杀死鼠进行组织分布研究。这些肿瘤中，所测得的每克组织内放射活性的选择浓度明显(表l)。30表2注射后(p.i.)，携带人类肿瘤的小鼠体内[125I]FIAU(5iiCi)的组织分布<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>因此，进行治疗性同位素的评价。如上所述，移植入EBV伯基特淋巴瘤异种移植物的SCID小鼠接受缓冲剂或硼替佐米，并在第二天使用[mi]FIAU治疗或不进行治疗。由图19A可见，注射缓冲剂后接受[mI]FIAU的鼠的肿瘤生长曲线与仅注射缓冲剂的鼠的肿瘤生长曲线类似。接受硼替佐米而不使用[mi]FIAU者减缓肿瘤生长。接受硼替佐米再接受[^1]FIAU则停止肿瘤生长(95%可靠区间与0重叠，但不与仅接受缓冲剂或接受缓冲剂和[^1]FIAU的生长曲线斜率的95^可靠区间重叠)。使用第二种EBV(+)伯基特淋巴瘤细胞株(Akata)的实验得到平行(parallel)结果。因此，硼替佐米允许了具有治疗效果的[mi]FIAU的靶向性。其他蛋白酶体抑制剂也似乎有活性。部分已经在临床试验中。实施例9:EBV胃癌的硼替佐米诱导的酶靶向放射性治疗尽管EBV是在非洲伯基特淋巴瘤中发现的，且与很多AIDS相关的淋巴瘤和何杰金淋巴瘤有关，与EBV具有数量上最重要相关性的是上皮癌。EBV实际上与所有鼻咽癌(每年80，000例新病例)和将近10%的胃癌(每年93，000例新病例)相关。为了确定硼替佐米-诱导策略是否也可以用于上皮癌，在可移植与人类EBV相关胃癌(KT)的异种移植物模型中研究硼替佐米诱导的FIAU靶向性(Chong，J.M.etal.，Interleukin-lbetaexpressioninhumangastriccarcinomawithEpstein—Barrvirusinfection.JVirol76,6825-6831(2002))。移植入KT肿瘤后，以硼替佐米诱导并随后以[125I]FIAU处理SCID小鼠，使用单光子发射型电脑断层显像(SPECT)对肿瘤成像(图20A)。组织分布研究显示肿瘤组织中[125I]FIAU的选择浓度，尽管肿瘤组织内和其他组织内[^1]FIAU选择浓度的比不如伯基特株中的显著(表l)。当诱导之后进行[mi]FIAU处理时，肿瘤生长速度减弱(图19B)。实施例10:KSHV恶性肿瘤的硼替佐米诱导的酶靶向放射性治疗如对两种携带KSHV的原发渗出性淋巴瘤(PEL)细胞株的研究所示，在与EBV相关肿瘤中观察到的方法也可用于其他与KSHV相关肿瘤中。SCID异种移植物模型中，硼替佐米允许使用[^1]FIAU成像BCBL1和BC3两者(图20B)。使用硼替佐米之后的组织分布研究显示肿瘤组织内的选择浓度(表l)。最终，当以硼替佐米诱导之后使用[mi]FIAU处理后，肿瘤退化(图19C)。HSV1-TK已经作为工具用在癌症的基因治疗方法中。已经在临床科研究和动物模型中研究通过逆转录病毒载体、腺病毒载体等进入肿瘤细胞的引入。同样，已有报导使用组蛋白去乙酰化酶抑制剂诱导EBV-TK再使用KSHV进行治疗来诱发一些患者症状的缓解。本文所报导的结果提供一个新方法硼替佐米诱导的酶靶向放射性核素(bortezomib-inducedenzymetargetingofradionuclide,BETR)治疗。对鼠禾斗的人类肿瘤异种移植物的BETR疗法显示，BETR疗法在诱导淋巴恶性肿瘤和上皮癌的缓解方面更有效。1311标记的抗体对抗患者体内的淋巴瘤的结果表明，向肿瘤给予O.5至2Gy可实现临床回应。利用图17的生物分布数据评估每一给予活度下肿瘤和重要器官所吸收的剂量，图17的生物分布数据还暗示，对于[mi]FIAU，肾和红骨髓为剂量限制性器官。如在线增补中的详细叙述，向70kg患者体内的1克肿瘤输送0.5至2Gy具有重要器官剂量是低于细胞毒性。关于BETR治疗的潜在临床用途，与FIAU相关毒性成为讨论的依据。先前已经将FIAU作为抗病毒剂进行研究。FIAU的长期定量给予与肝损害和一些致命病理有关，显然是损害线粒体的结果。那些试验中，治疗时间少于4周、累积剂量小于200mg的治疗是与毒性的临床证据或生物化学证据无关。因此，FIAU的"无效剂量"可保守性评估为每次给予0.lmg/kg。已经给予患者[咖I]FIAU而成像而不会对肝功能有不良反应(Diazetal.，PloSONE2，el007(2007))。从异种移植物实验推知，似乎可给予比人体无效剂量低数个量级的倍数的剂量的FIAU来实现放射性治疗效果。上述结果显示，硼替佐米处理导致淋巴瘤和癌症异种移植物模型中FIAU的浓縮并影响每个所研究肿瘤的生长曲线(图19)。在所述淋巴瘤模型中，生长停止，而在所述胃癌模型中，生长减缓。使用常规方法优化胃癌中硼替佐米给予剂量和[mi]FIAU给予量，应能实现与淋巴瘤中所观察到的相类似的实效水平。由于阿拉伯糖基("直立")构造中含有2'-氟取代基的嘧啶核苷中，N-糖基链结的化学稳定性和代谢稳定性高而使得FIAU的生物转化(transformation)受到限制，因此FIAU不易于产生影响其他放射性药物效果的的安全问题(Jacobsetal.，JNuclMed42，467-475(2001))。24小时周期内的血清和全血研究中，97.8%±0.1%的经标记化合物未变化，表明优异的稳定性和低脱碘敏感度。FIAU还可以从血浆中更迅速清除。由于所给出的低脱碘水平和更快的清除速度，预期对健康组织的不良反应为最小。此外，必须在理解放射是治疗很多与EBV相关肿瘤(包括胃癌、鼻咽癌、何杰金淋巴瘤和非何杰金淋巴瘤)的主要方法的背景下评估放射的潜在不良反应。放射对肿瘤组织的特异代谢靶向性应已最小化关于暴露于其中的正常组织的不良反应。BETR疗法提供超越其他裂解诱导致死前药方法的优势。所有裂解诱导方法都受限于丙肝病毒潜伏趋势。当更昔洛韦或类似试剂介导细胞杀灭时，治疗效果将可能需要大部分肿瘤细胞表达病毒酶。尽管已经证实，旁观者杀灭(bystanderkilling)现像归因于通过缝隙连接(gapjunctions)的细胞之间进行的磷酸化核苷和核苷类似物的交换，这种杀灭仍受限。基因治疗中，已经进行尝试来设计基因载体中连接素蛋白的表达增加，从而增加这种杀灭。然而，这增加旁观者杀灭的方法在不涉及基因治疗的方法中不易使用。事实上，一些用于治疗肿瘤的治疗剂可干扰所述旁观者杀灭。[mI]FIAU旁观者杀灭不受连接素表达或缝隙连接的限制，但[mi]FIAU旁观者杀灭是最大能量为0.61MeV的P发射的函数，能量的90%沉积于半径为0.7mm[26的球内。此"交叉火力(cross-fire)"效果似乎是淋巴瘤放射免疫疗法实效的重要贡献者。使用[^1]FIAU的"交叉火力"可从图19C中推出，其中，当甚至10X的肿瘤细胞携带EBV-TK时，肿瘤生长速度被充分减缓。图24表示细胞水平放射剂量测定建模。裂解诱导致死前药方法的第二限制是更昔洛韦介导的杀灭依赖于细胞周期。几个科研组报导EBV和KSHV感染的细胞中裂解感染的活化导致细胞周期停滞，因此可能包含细胞周期依赖的肿瘤杀灭。相比之下，放射效果并不因裂解诱导而同样减轻。BETR疗法也可以提供超越放射免疫治疗方法的优势。放射免疫偶联物的内移可导致游离放射性同位素的降解和释放，结果丧失特异性。与之相反，注射FIAU后，放射性同位素与EBV-TK表达肿瘤稳定关联(图17A)。酶促磷酸化和DNA的并入(如已经在HSV1-TK表达细胞中报导的)提供在肿瘤组织内实现不被浓度梯度限制的高浓度的可能性。最后，因FIAU和硼替佐米两者都是小分子，因此可预期比抗体偶联物具有更好的肿瘤渗透性。FIAU不穿越血脑屏障，但确实到达脑部肿瘤，反映了血脑屏障的破坏。更广泛地，使用小分子来活化组织或肿瘤特异性代谢方法暗示，放射的代谢靶向性可能具有超出甲状腺癌的应用。实施例11:KSHV肿瘤治疗图22至24描述使用硼替佐米和[131I]FIAU治疗KSHV肿瘤。实施例12:将鼠类生物分布数据放大至人类并使用0LINDA软体进行MIRD放射剂量测定计算通过假设小鼠中器官或肿瘤内药物浓度与全身浓度的比值与人类相等，将鼠类生物分布数据换算为与之相当的人类数据而用于放射剂量测定。表3列出了重要正常器官的吸收剂量评估值。表3重要器官所吸收剂量评估值<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>假设对于人类的1公克(gm)肿瘤，从鼠类肿瘤1.95%ID/g的起始(即2_h)活性浓度换算为7X10—4%ID/g。如生物分布数据所示，假设这浓度下1311的生物清除可忽略，70kg人类的lgm肿瘤的每一给予活度吸收剂量(absorbeddoseperadministeredactivity)是0.lmGy/MBq(0.38rad/mCi)。使用131I_标记的抗体对抗患者体内淋巴瘤的实验暗示，以0.5至2Gy照射肿瘤即实现回应。实现这个剂量范围所需的5至20GBq(135to540mCi)恰当地处于表中所列的正常器官吸收剂量评估值所给出的正常器官耐受内。20GBq的总给予活度将分别造成对肾的0.2Gy和对红骨髓的0.02Gy。基于外部粒子束和放射肽实验，肾可耐受25至27Gy而不中毒；红骨髓的最大耐受剂量是2Gy。给予540mCi剂量将可能存在逻辑问题，但这些能通过3次或4次注射分批给予而加以避免。实施例13:细胞水平的放射剂量测定分析使用蒙特卡罗类比包GEANT4，构建呈不同尺寸(每边约10个细胞、约20个细胞、约50个细胞、约150个细胞)的六边形晶格(74%占据体积vs.52%立方晶格)的球形细胞的球形肿瘤模型。1311根据三个不同图形随机衰变-全部细胞都含有1311_50%的细胞含有1311_10%的细胞含有1311收集每个细胞中累积的能量，并(通常)在历经1千万次蒙特卡罗解析(MonteCarlohistories)之后计算每个细胞内的剂量。图24显示细胞簇内的活度分布。不顾表达TK的细胞的百分比，肿瘤细胞簇的平均吸收剂量约为每250万衰变4.3至4.4Gy。TK表达细胞的百分比较低时，每个细胞的剂量有轻微比例的增加，这是因为总活度分配至较少数目(随机选择)的细胞。因为相对于肿瘤细胞尺寸，1311的P粒子的发射为较长范围，每个细胞的平均剂量不依赖于接受活度的比例。下图描述不同百分比的TK表达细胞对肿瘤吸收剂量轮廓的影响。不顾表达TK的细胞的百分比，肿瘤细胞簇的平均吸收剂量约为每250万衰变4.3至4.4Gy。TK表达细胞的百分比较低时，每个细胞的剂量有轻微比例增加，这是因为总活度分配至较小数目(随机选择)的细胞。因为相对于肿瘤细胞尺寸，I-131的P粒子的发射为较长范围，每个细胞的平均剂量不依赖于接受活度的比例。使用下述方法和材料进行实施例1至6的实验。细胞株和质粒研究两种EBV(+)伯基特淋巴瘤细胞株，和一种缺少EBV的次株(Rael，AkataEBV(+)，AkataEBV(_))(Ambinderetal.，HematolOncolClinNorthAm2003;17:697-702，v-vi;andFengetal.，JVirol2004;78:1893-902)。在具有10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100iig/mL链霉素和lOOmML-谷氨酰胺的1640RPMI(LifeTechnologies)中维持月中瘤细胞株。如先前所述(Mooreetal.，AntimicrobAgentsChemother2001;45:2082-91)，以表达EBV-TK的质粒和对照载体(PCDNA3)稳定转染人类骨肉瘤细胞株(143B)。于溴脱氧尿嘧啶(BrdU，Sigma，St.Louis，M0)中传代所述143B细胞株以保存细胞TK(-)表现型。将TK-143B和V143B细胞维持在添加10%胎牛血清(GeminiBioProducts，Calabasas，CA)、100U/mL青霉素、100iig/mL链霉素、2mML_谷氨酸酰胺和400iig/mL用于选择的G418的杜伯克改性基本成分培养基(Dulbecco'smodifiedessentialmedium)(GibcoBRL，Gaithersburg，MD)中，在37°C、5%C02下培养。BX-I是编码GFP且具有BXLF10RF断裂的重组EBV细胞株。从CMV启动子转录GFP。Akata-BXl和AGS-BX1细胞分别是含有这种重组EBV的Akata细胞核AGS细胞(Wangetal.，JVirol11，9590-9612(2003))。基于IkBa的NF-kB超阻遏者(sr)IkBa(sr)是通过进行丝氨酸-32和丝氨酸_36的突变而产生的，该丝氨酸-32和丝氨酸-36是IkB激酶的耙标；或通过删除停靠至这些耙标的IkB的N端部分而产生的。IkBa(sr)通过防止其磷酸化和后续降解来阻遏剌激诱导的NF-KB活化。将DNA片段克隆至表达载体pEVRF中(Wangetal.，(1999)NatMed5，412-7;Fuetal.，(2004)JBiolChem279,12819-26)。化学药品硼替佐米由千禧预测医药公司(MillenniumPredictiveMedicinelnc.)(Cambridge,MA)提供。5-氮-2'_脱氧胞嘧啶、丁酸钠和更昔洛韦(GCV)自Sigma公司(St.Louis，MO)购买。[2-14C]2'-氟-2'-脱氧-|3-0-5-碘尿嘧啶-呋喃阿拉伯糖苷(["C]FIAU)、FIAU和2'-氟-2'-脱氧-尿嘧啶-e-D-呋喃阿拉伯糖苷(FAU)来自莫拉维克生化试剂公司(MoravekBiochemicals)(Brea，CA)。[125I]NaI自MP生化试剂公司(MPBiomedicals)(CostaMesa，CA)购买。根据Jacobs等报导的方法(Jacobsetal.，(2001)JNuclMed42,467-75)合成r5l]FIAU。简单地说，将30iigFAU(1.22mmol)溶解于170iiL2MHN03中。向所述溶液加入1至5mCi的[1251]亂在130。C加热内容物45分钟。以150iiL高效液相色谱(HPLC)流动相(20:79.9:0.1MeCN:H20:三乙胺)淬灭反应。使用PhenomenexLunaC18半制备柱(Phenomenex，Torrance,CA)(10um，4.6X250mm)和2mL/min流速的与上述流动相权利相等物的反相HPLC纯化所得[125I]FIAU。减压浓縮产物，配制于0.9%生理盐水中，以0.22iim针头过滤器无菌过滤。将配方保存在lmCi/mL，以最小化注射入vul3鼠尾静脉的体积。最终放射化学产率50%，且放射化学纯度>99%。比放射性始终^2，000Ci/,l。体外细胞摄入对于体外[14C]FIAU摄入研究，以5X105细胞/mL接种细胞，以10nM硼替佐米在37。C培养6至12小时。洗涤细胞，再以0.04iiCi/mL[14C]FIAU在37。C培养2、4、8、24、48、72小时。离心分离使细胞成球，用未标记的FIAU洗涤。随后通过以贝克曼库尔特LS5000TA闪烁计数器(BeckmanCoulterLS5000TAscintillationcounter)(Fullerton，CA)分别对所分离细胞的放射活度和合并有洗涤液的培养基的放射活度进行闪烁计数。通过在裂解缓冲液(0.05MTris，pH7.6，0.15MNaCl，l%triton-X100，2mMEDTA)中培养来提取总细胞蛋白，通过离心分离移除细胞碎片。收集上清液，使用BCA蛋白测定试剂盒(Pierce，Rockford，IL)根据制造商说明书确定蛋白浓度。以蓄积率表示细胞摄入，即每克细胞的每分钟计数(cpm/g)除以培养基的cpm/g(mL)。肿瘤产生将5X106个细胞再次悬浮于200iiL基质胶基质(MatrigelMatrix)(EDBiosciences,Bedford,MA)中，经皮下注入6至7周龄的雄性SCID小鼠的肩膀附近。当肿瘤直径达到大约1cm时进行后续研究。免疫印迹分析为了检测EBV-TK或EBV-ZTA的表达，首先在4。C将细胞以含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液(O.05MTris，pH7.6，0.15MNaCl，1%triton-X100，2mMEDTA)处理10分钟，提取总细胞蛋白。4°CT10分钟内将下列试剂加入lmL裂解缓冲液中2yL亮肽素(5mg/mL)、1iiL0.2MNa3V04、1iiLNaF、1PL抑肽酶(10mg/ml)、1PL抑肽素(2mM)和lOiiLPMSF(100mM)。离心分离，收集上清液并储存在_80°C。使用BCA蛋白测定试剂35盒(Pierce,Rockford，IL)根据制造商说明书确定蛋白浓度。在7.5%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上将总细胞蛋白的lOyg等分试样分级。将蛋白质转移至PROTRAN硝基纤维素膜(Schleicher&Schue11，Keene，NH)上。4。C下，在含有0.1%TWEEN-20(PBS-T)的PBS内以5%印迹级脱脂奶粉(Bio-rad，Hercules,CA)阻断该膜过夜。随后以PBS-T洗涤该膜两次，室温下，以来自兔子(经合成EBV-TK肽(GRHESGLDAGYLKSVNDAC)免疫兔)的兔抗TK血浆或抗ZTA单克隆抗体(Argene，NorthMass即equa，NY)的1/1，000稀释液培养1小时。洗涤后，以HRP偶合的羊抗兔IgG抗体或HRP偶合的羊抗小鼠IgG抗体(AmershamPharmaciaBiotech,Piscataway，NJ)的1/5，000PBS-T稀释液在室温下培养1小时。洗涤该膜两次，使用ECL蛋白质印迹测试试剂(AmershamPharmaciaBiotech)检测蛋白质。室温下将该膜曝光显影于X-OMAT胶片(Kodak,Rochester,NY)。用于EBV拷贝数的即时PCR使用QIAampDNA微试剂盒(Qiagen，CA)根据制造商说明书从被处理细胞中提取基因组DNA。使用TaqManPCR通用试剂盒(Perkin-ElmerCorp.，Branchburg,NJ)设定50iiL的PCRs。荧光探针是通过Perkin-Elmer应用生物系统定制合成的。PCR引物是GibcoBRL(Frederick,Md.)合成的。每一反应含有5iiL的10X缓冲液A(4mMMgCl2)、扩增引物(300nM)、荧光探针(25nM)、dATP、dCTP和dGTP(各200iiM)、dUTP(400uM)、0.25U的AmpliTaq金和0.5U的AmpErase尿嘧啶N糖基化酶。所提取的基因组DNA用于扩增。在DNAPerkin-Elmer应用生物系统7700序列检测器(Perkin-ElmerAppliedBiosystems7700sequencedetector)中的96孔反应盘内进行扩增。对每一样品进行二重复分析，每次分析中均包括多个负水空白。使用从EBV阳性细胞株Namalwa中提取的DNA作为标样，平行进行标准曲线且每次分析进行二重复。动物准备所有工作均在符合约翰*霍普金斯动物管理和使用委员会(JohnsHopkinsAnimalCareandUseCommittee)章程的条件下进行。成年雄性SCID小鼠(5至6周龄)自国立癌症研究所(NationalCancerlnstitute)(Frederick,MD)购买。成像的3天前，所有小鼠每天均接受lmL腹腔内(i.p.)注射的0.9%Nal溶液，连续注射3天，来阻断甲状腺对游离放射性碘核的摄入。注射[^1]FIAU的24小时之前，以硼替佐米引发裂解诱导。每只小鼠均i.P.注射剂量为2iig/g的硼替佐米。硼替佐米是溶解于PBS中的新鲜溶液，注射前方使用0.2iim针头过滤器(Millipore，Billerica，MA)无菌过滤。对照小鼠则仅i.p.注射PBS。注射放射性示踪剂当天，i.p.注射2.3mL/kg的混合物(25mg/mL克他命(ketamine)和2mg/mL乙酰丙嗪的0.9%盐水)进行麻醉。给予异氟烷(isoflurane)(0.5至1L/分，0.5%至1%)来保持麻醉。随后，将使用剂量校准器(CRC-15R，C即intec，Ramsey,NJ)测量的4.44MBq(1.2mCi)的[125I]FIAU注射入每只小鼠的尾静脉中。体外生物分布以硼替佐米处理后，通过尾静脉注射O.074MBq(2iiCi)的[125I]FIAUPBS溶液。每一指示时间通过颈脱位法杀死4只小鼠。移除肿瘤、肝、脾、肾、脂肪、血液和肌肉并称重，之后使用自动伽马计数器测量组织放射活度，。还收集O.lmL血液样品。通过与原始剂量的标准稀释样品比较，计算组织的每克注射剂量百分比(percentinjecteddosepergram(%ID/g))。还计算标准偏差(SD)。平面伽马成像和SPECT-CT作为离体生物分布研究的附属研究，进行成像。除了采用SPECT-CT的例子(见下文)之外，不从图像中获取定量数据。X-SPECT(GammaMedicaInstruments，Northridge，CA)具有尺寸为20.5cmX15cmX9em的y射线检测头和120mmX125mm的视野(F0V)。本研究所使用的高解析度平行孔型准直器具有下列规格1.22mm孔直径、0.20mm隔片厚度、25.4mm钻孔长度。检测头材料或闪烁晶体由NaI[Tl]构成，具有2mmX2mmX6mm的图元尺寸。将小鼠以俯伏状放置在该平行孔型准直器上，以使用精确喷雾器(VetEquip，Pleasanton，CA)输送的异氟烷保持麻醉。使用X-SPECT随附的LumaGEMTM软体的静态获取协定(staticacquisitionprotocol)。获得每只小鼠的十分钟高解析度扫描。使用上述Y射线检测器和CT检测器依续进行SPECT-CT，而不必从工作台上移除该小鼠。成像数据分析使用开源门户网站SourceForge(http://amide,sourceforge.net)提供的用于SPECT-CT的免费软体ImageJ1.30v(http:〃rsb.info.nih.gov/ij.NationalInstitutesofHealth,Bethesda，MD)或AMIDE(AMedicalImageDataExaminer)分析图像。细胞株Akata-BX-1细胞源自具有重组GFPEBV的AkataEBV(-)细胞。AGS-BX-I细胞是具有重组GFP-EBV的AGS细胞(Haubner，R.，Avril，N.，Hantzopoulos，P.A.，Gansbacher，B.&Schwaiger，M.Invivoimagingofherpessimplexvirustype1thymidinekinasegeneexprossion:earlykineticsofradiolabeledFIAU.EurJNuc1Med27，283-291(2000))。GFP转录自CMV即刻早期启动子。为了控制所述CMV启动子的非特异性活化，使用具有包含CMV启动子驱动的GFP的PegfpNi质粒(CL0NTECH)的稳定的Hela细胞株。在添加10%胎牛血清(FBS)禾P0.8mg/mlG418的RPMI1640培养基(Akata)、DMEM(Hela)或Ham'sF-12培养基(AGS-BX1)中生长细胞。质粒HC131含有链结至荧光素酶报告体基因的BZLFIE启动子序列(-578—13，相对于mRNA开始位点)。通过HC131和pBabc-puro对AGS细胞的共转染构建含有HC131质粒的稳定细胞株，并通过1pg/ml嘌呤霉素选择该细胞株。稳定表达适当基础水平(decentbasallevel)的荧光素酶的AGS细胞克隆体已用于药物筛选。在具有10%FBS和lug/ml嘌呤霉素的HamsF-12中生长AGSHC131。在具有10%FBS的RPMI1640培养基中生长LCL、Raji和SNU_719。所有细胞均在37°C、5%C02和100%湿度下生长。化学药品和库约翰霍普金斯临床化合物库(JHCCL)含有2720种化合物。将上述所有临床化合物溶于匿S0或PBS中，以200iiM浓度配制于96孔盘中。每盘包括80个药物孔和16个空白对照孔(每侧一列)。Anti-IgG自ABI获得。曲尼司特、甲苯达唑、吲哚洛芬、Ara-c、丁酸盐、2-丙基戊酸盐、来氟米特和TPA自Sigma(St.Louis，M0)获得。硼替佐米自千禧预测医药公司(Cambridge,MA)获得。PurvalanolA自Calbiochem获得。对于裂解诱导研究，以106/ml量接种细胞，以测试化合物处理48小时。平行培养未经处理的对照细胞。GFP微板读出对于GFP荧光扫描将AKATA-BX-I细胞以每孔2X10s细胞/200iil等分置入96孔盘(Costar3595)中。接着，对于每孔，将待测药物(10yl，200yM)从药物板转移至细胞板中并混合，得到10i!M的浓度。该板中除了含测试药物外，还包括含有培养基而不含细胞或药物的孔和含有细胞而无药物的孔。将anti-IgG加入4个孔中作为正对照。保持板达30天。每隔一天读一次板。以荧光计数微板荧光剂(FluorocountMicroplatefluorometer)(PackardBioscienceCompany,Weliesley,MA)扫描板。在485nm激发GFP，而在530nm测量发射量。将读数输出至Excel进行试算表分析。于加入该库中的药物30分钟后进行第一次读数，从而排除自发荧光的药物。第3天，正对照显示增加的GFP信号，将任何大于该正对照读数2/3的读数均视为采样数。荧光素酶报告体测定为完成荧光素酶测定，将AGS-HC131细胞以4X104/200的浓度接种入96孔盘中，放置过夜。接着，对于每个孔，均将lOiU的200iiM药物从药物板中转移到细胞板中，混合。向每个板的空白列中加入丁酸盐作为正对照。随后培养该板48小时，再进行荧光素酶测定。从Promega获得荧光素酶报告体基因测定试剂，根据制造商说明书进行所述测定。蛋白质印迹分析以PBS洗涤细胞两次。以裂解缓冲液提取总细胞蛋白。在聚丙烯酰胺中进行该蛋白的电泳，随后将该蛋白转移至PROTRAN硝基纤维素膜(Schleicher&Schue11，Keene，NH)上。在4t:，使用初级抗体(Ab)探针探测印迹过夜后。洗涤后，加入HRP偶联的二级Ab，并用增强化学发光系统(enhancedchemiluminescencesystem,ECU(Amersh咖)检测。使用下列抗体抗ZTA(Argene)、抗f3肌动蛋白(anti-f3-actin)(Sigma)和抗小鼠(Sigma)。IFA以1iiMAra-c处理LCL细胞48小时。随后以PBS洗涤所述细胞，再悬浮，并放置于多溶素载玻片上。进行间接免疫荧光测定和荧光显微测定。于-2(TC以甲醇固定所述载玻片，以PBS洗涤，以初级抗体抗ZTA(l:200)(Argene)培养，以PBS洗涤，再用若丹明偶联的驴IgG(donkeyrhodamine-conjugatedIgG)(JacksonPharmaceuticals,westGrove，Pa)进行二级抗体培养。使用含有4'，6'-二酰胺基-2-苯基吲哚(DAPI)(VectorShield)的封固液标示所述细胞的细胞核。使用Metamorph软体(UniversialImaging-MolecularDevices)以40X物镜的带有CCD镜头(PrincetonInstruments)的E800显微镜观察并拍照载玻片。定量PCR以使用ICycler系统(Biorad，Hercules,CA)的即时PCR对EBV基因组定量。使用小量血液DNA试剂盒(Qiagen，Valencia,CA)提取模板DNA。BamHI-W弓|物为BamH5'(5'-CCCAACACTCCACCACACC-3')和BamH3'(5'-TCTTAGGAGCTGTCCGAGGG3')和荧光探针(5'-(FAM)CACACACTACACACACCCACCCGTCTC3')。平行进行标准曲线且每次分析进行二重复，使用从每个细胞中含有两个完整病毒基因组的EBV阳性二倍体细胞株Namalwa中提取的DNA作为标准物。以MyiQ信号彩色即时PCR检测器(Biorad)收集扩增数据，并用Biorad研发的MyiQ软体分析该扩增数据。使用下列方法和材料实现实施例7至10所报导的结果。细胞株和质粒在含有10X胎牛血清、100units/mL盘尼西林、100iig/mL链霉素和100mmol/LL-谷氨酰胺的RPMI1640(LifeTechnologies,Gaithersburg，MD)中悬浮培养以维持淋巴瘤细胞株(如上所述的)。如先前所述(Mooreetal.，AntimicrobAgentsChemother45,2082-2091(2001))，TK-143B和V143B细胞为来自携带表达EBV-TK的质粒或对照载体(PCDNA3)的人类骨肉瘤(143B)细胞的稳定转染细胞株。将这些细胞维持在添加10%胎牛血清(GeminiBioProducts，Calabasas，CA)、100units/mL盘尼西林、100Ag/mL链霉素、2mmol/LL_谷氨酰胺和400Ag/mLG418的DMEM(LifeTechnologies)中以进行选择。将KT可移植EBV(+)胃腺癌在SCID小鼠中传代(Chongetal.，JVirol76，6825-6831(2002))。化学药品以1.67iig/克静脉给予硼替佐米。自MoravekBiochemicals(Brea，CA)获得FIAU和2'-氟_2'-脱氧-尿嘧啶-P-D-呋喃阿拉伯糖苷。自MPBiomedicals(CostaMesa，CA)购买[125I]和[131I]NaI。如先前所述合成『1]FIAU和[131I]FIAU。为了进行成像或治疗，在给予硼替佐米24小时后给予FIAU。在所述每次实验中，以单一剂量型式给予硼替佐米。肿瘤产生对所培养的细胞株进行支原体测试，并发现为阴性。再次将细胞(5X106)悬浮于200iiL基质凝胶基质(BDBiosciences,Bedford,MA)中，注入6至7周龄的雄性SCID小鼠中。每隔一天用卡钳测量一次最长垂直肿瘤直径。根据三维椭圆公式4^i/3X(宽度/2)2X(长度/2)(LeBlancetal.，CancerRes62，4996-5000(2002))计算肿瘤体积。当肿瘤直径达到1厘米尺寸时，进行治疗和成像研究。离体生物分布如先前所述，将溶解在PBS的r5l]FIAU注射入尾静脉中，在每个指示时间点杀死3至4只小鼠，移除器官并称重，使用自动伽马计数器测量组织放射活度。通过与原始剂量的标准稀释相比，计算组织的每克注射剂量百分比(％ID/g)。平面伽马成像、SPECT计算X射线断层摄影技术和成像分析如本文先前所述，作为离体生物分布研究的附属进行成像。X-SPECT(GammaMedicaInstruments,Northridge,CA)具有尺寸为20.5X15X9cm的y射线检测头和120X125mm的视野(FOV)。本研究所使用的高解析度平行孔型准直器具有下列规格1.22mm孔直径、0.20mm隔片厚度、25.4mm钻孔长度。由NaI[Tl]材料构成的检测头具有2X2X6mm的图元尺寸。将小鼠以俯伏状姿放置在该平行孔型准直器上，以异氟烷保持麻醉。获得每只小鼠的十分钟高解析度扫描。使用上述y射线检测器和CT检测器依续进行SPECT-CT，而不必从工作台上移除小鼠。以用于SPECT-CT的ImageJvl.30(NIH，Bethesda，MD)或AMIDE(AMedicalImageDataExaminer)(SourceForge所提供的免费软体)分析成像数据。生物统计学。使用GraphPadSoftware(SanDiegoCaliforniaUSA，www.graphpad.com)的Windows环境下的GraphPadPrism软体(version5.0)进行线性回归禾口曲线拟合。其他具体实施例从上述说明书可知，显然，可对本发明进行改动和变更以使其适应各种用途和条39件。这些具体实施例也落入权利要求的范畴内。本文中对于一个变数的任何定义的元件列表的叙述包括该变数作为任何单一元件或所列元件组合(亚组合)的定义。本文中具体实施例的叙述包括该具体实施例作为任意单一具体实施例或与其他具体实施例或其部分组合。本说明书中提及的全部专利和出版物均以引用形式并入本文，引用程度等同于具体且单独标示为通过引用形式并入。权利要求一种用于治疗病毒天然感染瘤形成(neoplasia)的经标记药物组合物，所述组合物包含有效量的病毒裂解诱导试剂，其中，所述试剂选自蛋白酶体抑制剂、微管破坏剂、糖皮质素或甾类激素、核苷类似物或抗炎剂。2.—种用于治疗与病毒相关瘤形成的药物组合物，所述组合物包含有效量的选自硼替佐米、曲尼司特、来氟米特、甲苯达唑、阿糖胞苷或吲哚洛芬的试剂。3.根据权利要求1所述的药物组合物，其中，所述组合物进一步包含2'-氟_2'-脱氧-p-D-5-碘尿嘧啶-呋喃阿拉伯糖苷(FIAU)的经放射性标记的类似物。4.根据权利要求1或2所述的药物组合物，其中，所述有效量为足以在受验者体内诱导病毒基因表达或病毒复制。5.根据权利要求1或2所述的药物组合物，其中，所述有效量为非细胞毒性的。6.根据权利要求1所述的药物组合物，其中，所述蛋白酶体抑制剂是硼替佐米。7.根据权利要求1所述的药物组合物，其中，所述瘤形成是受EB病毒(EBV)或卡波西氏肉瘤疱疹病毒天然感染形成的。8.根据权利要求1所述的药物组合物，其中，所述瘤形成是淋巴瘤、胃癌、卡波西氏肉瘤或鼻咽癌。9.一种用于诊断与天然发生的感染相关瘤形成的药物组合物，所述组合物包含有效量的2'-氟-2'-脱氧-13-D-5-碘尿嘧啶-呋喃阿拉伯糖苷(FIAU)的经经放射性标记的类似物。10.根据权利要求9所述的药物组合物，其中，所述感染是病毒感染或细菌感染。11.根据权利要求9所述的药物组合物，其中，所述组合物包含使用根据权利要求1至6项中任意一项所述的具有病毒裂解诱导试剂的组合物的说明书。12.根据权利要求9所述的药物组合物，其中，使用SPECT或PET可见所述放射性标记。13.根据权利要求9所述的药物组合物，其中，所述类似物包括碘-1231、1241或1251的放射性核素。14.一种用于治疗与感染相关瘤形成的药物组合物，所述组合物包含有效量的2'_氟-2'-脱氧-5-碘-D-呋喃阿拉伯糖基尿嘧啶(FIAU)的经放射性标记的类似物。15.根据权利要求14所述的药物组合物，其中，所述放射性核素为a、e或Y粒子辐射体。16.根据权利要求14所述的药物组合物，其中，所述放射性核素选自9°Y、186Re、188Re、64CU、67Cu、212Pb、212Bi、123I、211At、213B或131I。17.根据权利要求14所述的药物组合物，其中，所述放射性核素放射至少约0.5至2Gy。18.根据权利要求14所述的药物组合物，其中，所述FIAU的有效量为约0.001至0.lmg/kg之间。19.根据权利要求14所述的药物组合物，其中，所述FIAU的有效量为约0.01至0.lmg/kg之间。20.根据权利要求14所述的药物组合物，其中，所述瘤形成是受EB病毒(EBV)或卡波西氏肉瘤疱疹病毒天然感染形成的。21.根据权利要求14所述的药物组合物，其中，所述瘤形成的结果是淋巴瘤、胃癌、卡波西氏肉瘤或鼻咽癌。22.根据权利要求14所述的药物组合物，其中，所述组合物包含使用根据权利要求1至6项中任意一项所述的具有病毒裂解诱导试剂的组合物的说明书。23.—种用于鉴定病毒裂解诱导试剂的方法，所述方法包含使具有潜在病毒感染的肿瘤细胞与试剂接触和检测该细胞内病毒裂解多肽的表达或活性的增加或病毒复制的增加。24.根据权利要求23所述的方法，其中，所述方法鉴定一种或多种ZTA表达、RTA表达、病毒胸苷激酶表达或活性、和病毒复制的增加。25.根据权利要求23所述的方法，其中，通过检测报告体多肽表达的增加测定所述病毒裂解多肽的表达或活性。26.根据权利要求25所述的方法，其中，所述报告体受BZLFIE启动子序列或Zta启动子序列控制。27.根据权利要求26所述的方法，其中，所述报告体是荧光素酶或绿色荧光蛋白。28.根据权利要求27所述的方法，其中，所述方法包括检测病毒复制的增加。29.根据权利要求27所述的方法，其中，用微量培养盘判读器检测所述报告体。30.根据权利要求28所述的方法，其中，所述微量培养盘判读器检测相对荧光单位(RFU)的增加，所述相对荧光单位的增加鉴定出所述试剂为裂解诱导试剂。31.根据权利要求22所述的方法，其中，所述试剂选自蛋白酶体抑制剂、微管破坏剂、糖皮质素或甾类激素、核苷类似物或抗炎剂。32.—种用于检测受验者体内与感染相关的瘤形成的方法，所述方法包括给予所述受验者有效量的病毒裂解诱导试剂和2'-脱氧-5-碘-D-呋喃阿拉伯糖基尿嘧啶(FIAU)的经放射性标记的类似物，并可见所述瘤形成。33.根据权利要求32所述的方法，其中，使用SPECT或PET可见所述经放射性标记的类似物。34.根据权利要求32所述的方法，其中，所述类似物经碘-1231、1241或1251的放射性核素标记。35.根据权利要求32所述的方法，其中，所述感染是病毒感染或细菌感染。36.根据权利要求32所述的方法，其中，所述瘤形成是受EB病毒(EBV)或卡波西氏肉瘤疱疹病毒天然感染形成的。37.根据权利要求32所述的方法，其中，所述瘤形成的结果是淋巴瘤、胃癌、卡波西氏肉瘤或鼻咽癌。38.—种选择用于具有与感染相关的瘤形成的受验者的治疗方法，所述方法包括给予所述受验者有效量的病毒裂解诱导试剂和2'-脱氧-5-碘-D-呋喃阿拉伯糖基尿嘧啶(FIAU)的经放射性标记的类似物；以及检测所述受验者体内裂解诱导存在与否，其中，裂解诱导的增加鉴定出所述受验者为可接受裂解诱导试剂治疗和酶靶向放射性疗法。39.—种用于治疗或预防受验者体内与感染相关的瘤形成的方法，所述方法包含给予所述受验者有效量的病毒裂解诱导试剂和2'-脱氧-5-碘-I-13-D-呋喃阿拉伯糖基尿嘧啶(FIAU)的经放射性标记的类似物。40.根据权利要求39所述的方法，其中，所述感染是病毒感染或细菌感染。41.一种用于杀灭受病毒或细菌感染的肿瘤细胞的方法，所述方法包括使所述细胞与有效量的病毒裂解诱导试剂和2'-脱氧-5-碘-I-!3-D-呋喃阿拉伯糖基尿嘧啶(FIAU)的经放射性标记的类似物接触。42.根据权利要求38至41项中任意一项所述的方法，其中，所述裂解诱导试剂选自蛋白酶体抑制剂、微管破坏剂、糖皮质素或甾类激素、核苷类似物或抗炎剂。43.根据权利要求38至41任意一项所述的方法，其中，所述裂解诱导试剂选自硼替佐米、曲尼司特、来氟米特、甲苯达唑、阿糖胞苷或吲哚洛芬。44.根据权利要求38至41任意一项中所述的方法，其中，所述放射性标记选自9°Y、186Re、188Re、64CU、67CU、212Pb、212Bi、123I、211At、213Bi或131I。45.根据权利要求38至41中任意一项所述的方法，其中，所述瘤形成是受EB病毒(EBV)或卡波西氏肉瘤疱疹病毒天然感染形成的。46.根据权利要求38至41任意一项中所述的方法，其中，所述瘤形成是淋巴瘤、胃癌、卡波西氏肉瘤或鼻咽癌。47.—种用于诊断或监控受验者体内与感染相关瘤形成的试剂盒，所述试剂盒包含有效量的病毒裂解诱导试剂和2'-脱氧-5-碘-I-!3-D-呋喃阿拉伯糖基尿嘧啶(FIAU)的经放射性标记的类似物，以及使用所述试剂盒诊断所述瘤形成的说明书。48.根据权利要求47所述的试剂盒，其中，所述感染是病毒感染或细菌感染。49.根据权利要求47所述的试剂盒，其中，所述瘤形成是受EB病毒(EBV)或卡波西氏肉瘤疱疹病毒天然感染形成的。50.根据权利要求47所述的试剂盒，其中，所述瘤形成是淋巴瘤、胃癌、卡波西氏肉瘤或鼻咽癌。51.根据权利要求47所述的试剂盒，其中，使用SPECT或PET可见所述放射性标记的类似物。52.根据权利要求47所述的方法，其中，所述类似物经碘-1231、1241或1251的放射性核素标记。53.根据权利要求47所述的试剂盒，其中，所述裂解诱导试剂选自蛋白酶体抑制剂、微管破坏剂、糖皮质素或甾类激素、核苷类似物或抗炎剂。54.根据权利要求47所述的试剂盒，其中，所述裂解诱导试剂选自硼替佐米、曲尼司特、来氟米特、甲苯达唑、阿糖胞苷或吲哚洛芬。55.—种用于治疗受验者体内与病毒相关的瘤形成的试剂盒，所述试剂盒包含有效量的病毒裂解诱导试剂和2'-脱氧-5-碘-I-!3-D-呋喃阿拉伯糖基尿嘧啶(FIAU)的经放射性标记的类似物，以及使用所述试剂盒诊断该瘤形成的说明书。56.根据权利要求55所述的试剂盒，其中，所述裂解诱导试剂选自蛋白酶体抑制剂、微管破坏剂、糖皮质素或甾类激素、核苷类似物或抗炎剂。57.根据权利要求55所述的试剂盒，其中，所述裂解诱导试剂选自硼替佐米、曲尼司特、来氟米特、甲苯达唑、阿糖胞苷或吲哚洛芬。58.根据权利要求55所述的试剂盒，其中，所述瘤形成是受EB病毒(EBV)或卡波西氏肉瘤疱疹病毒天然感染形成的。59.根据权利要求55所述的试剂盒，其中，所述瘤形成是淋巴瘤、胃癌、卡波西氏肉瘤或鼻咽癌。60.—种杀灭细菌的方法，包括使所述细菌与2'-脱氧-5-碘-D-呋喃阿拉伯糖基尿嘧啶(FIAU)的经放射性标记的类似物接触。61.根据权利要求60所述的方法，其中，所述放射性标记选自9°Y、186Re、188Re、64CU、67CU、2，b，Bi3l、2"At、2"Bi或1311。62.—种治疗受验者体内细菌感染的方法，包括给予受验者有效量的2'-脱氧-5-碘-I-P-D-呋喃阿拉伯糖基尿嘧啶(FIAU)的经放射性标记的类似物。63.根据权利要求62所述的方法，其中，所述放射性标记选自9°Y、186Re、188Re、64CU、67CU、2，b，Bi3l、2"At、2"Bi或1311。全文摘要本发明特色为用于检测(detecting)、选择用于监控以及治疗与病毒感染相关瘤形成(neoplasia)的治疗方法的组合物及方法。文档编号A61K38/16GK101730538SQ200880019523公开日2010年6月9日申请日期2008年4月10日优先权日2007年4月10日发明者C·宗,J·K·刘,M·G·庞珀,R·F·安宾德申请人:约翰·霍普金斯大学