脑膜炎疫苗制剂的利记博彩app

专利名称：：脑膜炎疫苗制剂的利记博彩app
技术领域：
：本发明属于免疫接种抵御脑膜炎的组合疫苗配制领域。
背景技术：
：单剂量中含有一种以上病原生物的抗原的疫苗被称为"多价"或"组合"疫苗，例如白喉、破伤风和百日咳("DTP")疫苗以及麻疹、腮腺炎和风疹("MMR")疫苗。组合疫苗对患者的益处在于能减少注射次数，从而带来顺应性提高的临床优势(例如参见参考文献1的第29章)，儿科接种时尤其如此。然而同时，由于以下因素其制造较为困难抗原和其他组分之间的物理和生化属性不相容；免疫干扰；以及稳定性。这些困难中的一些可通过适当配制疫苗而解决。例如，偶联的B型流感嗜血杆菌(/Zaewo;/n7w/^/7we"zae)("Hib")的PRP荚膜糖在水性条件下可能不稳定，因此INFANRIX顶系列中含Hib的疫苗(包括PEDIARIXtm)包含冻干的Hib组分，使用时用剩余的抗原水性制剂进行重建。参考文献2也描述了含Hib的疫苗制剂，Hib偶联物与脑膜炎球菌偶联物组合冻干，临用时重建。相反，参考文献3描述了脑膜炎球菌偶联物的全液体制剂，其他组分(例如Hib或肺炎球菌偶联物)可冻干并重建。参考文献22描述了脑膜炎球菌偶联物的组合，其中血清群A("MenA")偶联物冻干后用其他血清群偶联物的液体制剂重建。Hib和脑膜炎球菌是细菌性脑膜炎的两大原因，本发明的目的的提供另外且改良的Hib和脑膜炎球菌偶联物的疫苗制剂。
发明内容根据本发明的一些实施方式，用液体Hib组分重建冻干的脑膜炎球菌组分，从而制备脑膜炎组合疫苗。因此，本发明提供了一种试剂盒，其包括(i)水性组分，包含B型流感嗜血杆菌荚膜糖的偶联物；和(ii)冻干组分，包含脑膜炎萘瑟菌(A^'Mer^wem:"g/^fc)荚膜糖的偶联物。为给予患者，水性和冻干组分组合形成适合注射的组合液体疫苗。本发明还提供了制备组合疫苗的方法，该方法包括将(i)水性组分，包含B型流感嗜血杆菌荚膜糖的偶联物，和(ii)冻干组分，包含脑膜炎萘瑟菌荚膜糖的偶联物进行组合的步骤。本发明还提供了一种组合疫苗，其包含(i)B型流感嗜血杆菌荚膜糖的偶联物；和(ii)脑膜炎萘瑟菌荚膜糖的偶联物，通过将水性流感嗜血杆菌偶联物与冻干的脑膜炎萘瑟菌偶联物组合来制备。疫苗可包含冻干稳定剂(如下所述)。液体组分本发明的试剂盒和方法涉及使用包括Hib糖偶联物的水性抗原组分。给予Hib偶联物优选能使患者抗-PRP抗体浓度大于0.15微克/毫升，更优选大于l微克/毫升。这些是标准可接受的效应阈值。Hib糖抗原是众所周知的[例如，参考文献1的第14章]，其制备方法也己详细记载[例如，参考文献4-13]。Hib糖与载体蛋白偶联以提高其免疫原性，尤其是儿童中的免疫原性。本发明可使用任何合适的Hib偶联物。Hib偶联物的糖部分可以是多糖(例如，全长磷酸多核糖基核糖醇(PRP))，但也可以使用寡糖(例如，分子量为约1到约5kDa)。纯化PRP的片段化(例如水解)可方便地形成寡糖，然后通常纯化具有所需大小的片段。如果本发明的组合物包含偶联的寡糖，应先制备寡糖再偶联。水性组分中Hib偶联物的浓度通常在0.5微克/毫升到50微克/毫升的范围内，例如l-20微克/毫升，12-16微克/毫升等。浓度可约为15微克/毫升。水性Hib组分可以不含佐剂或者可包含佐剂。如果包含佐剂，佐剂通常是铝盐，例如磷酸铝或氢氧化铝。如果包含佐剂，Hib组分可吸附于铝盐或者未吸附。已报道在一些情况下吸附于磷酸铝佐剂是有益的[14]，而在另一些情况下未吸附是有益的[2]。已知各种不同的Hib偶联物。例如，参考文献1的表14-7给出了四种不同Hib偶联物的特征。它们由各种参数相区别，例如载体蛋白。本发明可使用任何合适的载体蛋白(如下所述)，如CRM197(在"HbOC"中)，破伤风类毒素(在"PRP-T"中)以及脑膜炎萘瑟菌的外膜复合物(在"PRP-OMP"中)。各种水性Hib偶联物市售可得并且可用于本发明。例如，惠氏(Wyeth)的HIBTITERTM产品有液体制剂可用。HIBTITERtm采用CRM197载体，每0.5毫升剂量(以小瓶供应)包含0.9%氯化钠配制的IO微克糖，不含佐剂。默克(Merck)的PEDVAXHIBTM产品也有液体制剂可用。PEDVAXHIBtm使用OMPC载体，每0.5毫升剂量包含0.9%氯化钠配制的7.5微克糖和225微克羟基磷酸硫酸铝佐剂。该制剂不含乳糖和硫柳汞。ACTHIBTM产品目前没有液体形式可用。另一种有用的Hib偶联物包含通过己二酸接头共价连接于CRM197的Hib寡糖[15,16]。Hib偶联物可以是水性组分中唯一的抗原成分，或者可以存在一种或多种其他抗原。例如，水性组分可包含以下一种或多种白喉类毒素，破伤风类毒素，无细胞百日咳抗原，灭活的脊髓灰质炎病毒抗原，乙型肝炎病毒表面抗原和/或肺炎球菌糖。如果水性组分包含佐剂并包括Hib偶联物、白喉类毒素、破伤风类毒素、无细胞百日咳抗原、灭活的脊髓灰质炎病毒抗原和乙型肝炎病毒表面抗原，可使用HEXAVACTM产品。如果水性组分包含佐剂并包括Hib偶联物、白喉类毒素、破伤风类毒素、全细胞百日咳抗原、乙型肝炎病毒表面抗原，可使用QUINVAXEMTM产品。如果水性组分包含佐剂并包括Hib偶联物、白喉类毒素、破伤风类毒素、无细胞百日咳抗原和脊髓灰质炎病毒，可使用PEDIACELTM产品。本发明优选使用市售液体单价Hib偶联物作为水性组分，如不含佐剂的HIBTITERtm疫苗。组合Hib和脑膜炎球菌偶联物时避免使用佐剂的明显优点在参考文献2中提及。7冻干组分本发明的试剂盒和方法涉及使用包括脑膜炎球菌荚膜糖偶联物的冻干抗原组分。给予脑膜炎球菌偶联物优选导致血清群(serogroup)杀菌抗体应答，用人补体测量时，相关血清群的血清杀菌试验(SBA)效价增加至少4倍，优选至少8倍。如果用兔补体测定SBA效价，那么效价优选提高至少128倍。针对血清群C的偶联单价疫苗已被批准用于人，其包含MENJUGATEtm[18]、MENINGITECtm和NEISVAC-CTM。已知血清群A+C的偶联物的混合物[19，20]，已报道了血清群A+C+W135+Y的偶联物的混合物[21-24]，并于2005被批准作为水性MENACTRATM产品上市。本发明所用冻干组分可包括一种或多种脑膜炎球菌偶联物。包括血清群A、C、W135和Y中的2、3或4种时，通常(例如)是A+C，A+W135，A+Y，C+W135，C+Y，W135+Y，A+C+W135，A+C+Y，A+W135+Y，A+C+W135+Y，等等。包含所有四种血清群A、C、W135和Y中的糖的组分是优选的。如果包括来自一种以上血清群的偶联物，它们可以基本上相等质量存在，例如各血清群糖的质量彼此在±10%内。冻干组分中每种血清群的典型含量在1微克到20微克之间，例如每个血清群2-10微克，或者约4微克。作为基本相等比例的替代形式，可试验双倍质量的血清群A的糖。血清群A脑膜炎球菌的荚膜糖是(a1—6)-连接的N-乙酰基-D-甘露糖胺-l-磷酸酯的均聚物，具有部分C3和C4位的O-乙酰基化。C-3位的乙酰化可以是70-95%。用于纯化糖的条件可导致脱-O-乙酰化(例如在碱性条件下)，但在C-3位保留OAc也是有用的。在一些实施方式中，血清群A糖中至少50%(例如，至少60%、70%、80%、90%、95%或更多)的甘露糖胺残基的C-3位被O-乙酰基化。乙酰基可被封闭基团取代以避免水解[25]，这种改性的糖仍然是本发明涵义内的血清群A糖。血清群C荚膜糖是(a2—9)-连接的唾液酸(N-乙酰基神经氨酸，或"NeuNAc")的均聚物。糖结构为—9)-Neu;NAc7/8OAc-(a2—。大多数血清群C株在唾液酸残基的C-7和/或C-8位具有O-乙酰基团，但约15%的临床分离物缺乏这些0-乙酰基[26，27]。OAc基团的存在与否产生独特表位，抗体与糖结合的特异性可影响其对0-乙酰化(OAc-)和脱-0-乙酰化(OAc+)菌株的杀菌活性[28-30]。本发明中使用的血清群C糖可以从OAc+或OAc-菌株获得。获得许可的MenC偶联物疫苗包含OAc-(NEISVAC-C頂)和OAc+(MENJUGATEtm和MENINGITECtm)糖。在一些实施方式中，用于制备血清群C偶联物的菌株是OAc+菌株，例如血清型16，血清亚型P1.7a,1等。因此，可使用C:16:P1.7a,1OAc+菌株。也可使用血清亚型Pl.l的OAc+菌株，例如Cll菌株。血清群W135糖是唾液酸-半乳糖二糖单元的聚合物。类似于血清群C糖，其具有可变的O-乙酰化，但在唾液酸7和9位[31]。结构如下44)-D-Neu/5Ac(7/90Ac)-a-(2—6)-D-Gal-a-("。血清群Y糖类似于血清群W135糖，只是二糖重复单元包括葡萄糖而非半乳糖。类似于血清群W135，在唾液酸7和9位具有可变的0-乙酰化[31]。血清群Y的结构如下—4)-D-Neu;5Ac(7/90Ac)-a-(2—6)-D-Glc-a-(1—。本发明中使用的糖可以如上所述O-乙酰化(例如，在天然荚膜糖中所见相同的o乙酰化模式)，或者可以在糖环的一个或多个位置部分或完全脱-o-乙酰化，或者与天然荚膜糖相比，它们可以超-o-乙酰化。偶联物中的糖部分可包括由脑膜炎球菌制备的全长糖，和/或可包括全长糖的片段，即比细菌中存在的天然荚膜糖短的糖。因此，糖可以解聚，解聚发生在糖纯化期间或者之后、但在偶联之前。解聚可降低糖链长度。一种解聚方法涉及使用过氧化氢[21]。将过氧化氢加入糖中(例如，11202终浓度为1%)，然后孵育混合物(例如在约55'C)直到实现所需的链长降低。另一种解聚方法涉及酸水解[22]。其他解聚方法是本领域已知的。用于制备本发明中使用的偶联物的糖可以通过任何这些解聚方法获得。可利用解聚获得对于免疫原性最佳的链长和/或出于糖的物理可操作性而降低链长。在一些实施方式中，糖具有以下平均聚合度(Dp):A=10-20;C=12-22;W135=15-25;Y=15-25。在分子量方面，而非Dp，对于所有血清群，有用的范围是<100kDa;5kDa-75kDa;7kDa-50kDa;8kDa陽35kDa;12kDa-25kDa;915kDa-22kDa。在一些实施方式中，脑膜炎球菌血清群A、C、W135和Y的糖的平均分子量各自超过50kDa，例如^75kDa，^100kDa，^110kDa，^120kDa，2130kDa，等等[32]，甚至最高达1500kDa，具体通过MALLS测定。例如MenA糖可以是50-500kDa，如60-80kDa;MenC糖可以是100-210kDa;MenW135糖可以是60-190kDa，如120-140kDa;和/或MenY糖可以是60-190kDa，如150-160kDa。有用的载体蛋白(如下所述)包括CRM197、白喉类毒素和/或破伤风类毒素.如果冻干组分包括来自一种以上脑膜炎球菌血清群的偶联物，则各偶联物可使用不同的载体蛋白(例如，一种血清群在CRM197上，另一种在破伤风类毒素上)或者它们可使用相同的载体蛋白(例如，来自两种血清群的糖分别偶联于CRM197，然后组合)。出于稳定性原因，冻干组分可包含稳定剂，例如乳糖、蔗糖和甘露醇、以及它们的混合物，例如乳糖/蔗糖混合物、蔗糖/甘露醇混合物等。因此，最终疫苗可包含乳糖和/或蔗糖。使用蔗糖/甘露醇混合物可加速干燥过程。冻干组分也可包含氯化钠。重建后冻干材料中的可溶性组分可保留在组合物中。冻干组分可包含或不含佐剂，例如铝盐。冻干组分优选不包含Hib糖。包装本发明的组合物本发明中使用的湿润和干燥组分必须在使用前保持相互分离。因此，它们以试剂盒形式分别包装。试剂盒可采取各种形式。在一些实施方式中，两种组分各自包装在独立的容器中。在其它实施方式中，两种组分包装在单一容器的不同腔室内，例如包装到多室注射器的不同室内。双室注射器能使两种单独的组合物在储存期间保持隔离，但在启动注射器栓塞时发生混合。冻干材料通常保存在密封小瓶中。该小瓶可具有开口(例如橡胶密封，可裂颈部等)，保持无菌的同时允许取出内容物和/或引入水性材料进行重建。小瓶可由各种材料制成，例如玻璃、塑料等。水性材料也可以保存在小瓶中，但作为可选形式也可以保存在(例如)注射器中。同样，容器能够在保持无菌的同时允许取出其内容物。注射器可施加有或未施加与其附连的针头，在没有针头的情况下，可将独立的针头与注射器一起包装以供组装和使用，注射器通常具有针尖帽以在附连针头之前封闭针尖。优选安全性针头。一般是l-英寸23-号、l-英寸25-号和5/8-英寸25-号针头。注射器的活塞可带有抑止装置，以防止活塞在吸出时偶然脱出。注射器可由各种材料，如玻璃、塑料等制成。药瓶可以有适合的帽(如Luer锁)，以便将预填装注射器插入该帽，可以将注射器的内容物推入药瓶(在其中重建冻干物质)，可以将药瓶的内容物吸回注射器中。从药瓶中拔出注射器后，可连上针头，将该组合物给予患者。该帽可以位于封口或盖子内侧，以便在封口或盖子打开后才能接触到该帽。如果将材料包装到容器内，通常在材料加入容器之前对容器进行灭菌。采用玻璃容器(如注射器或药瓶)时，可采用由硼硅酸盐玻璃，而非钠钙玻璃制成的容器。重建在给予患者之前，本发明涉及用水性组分(含有Hib偶联物)重建冻干的抗原组分(含有至少一种脑膜炎球菌偶联物)。重建可涉及各种步骤。如果组分保存在多室注射器中，则驱动注射器将导致水性和干燥材料的混合。如果组分保存在单独容器中，可使用不同的混合过程。在一些实施方式中，小瓶中的水性材料可以抽取到注射器内(例如通过针头)，或者已经位于注射器内。然后，将水性材料由注射器转移到含冻干材料的小瓶中(例如通过针头，可以是与先前从小瓶抽取水性材料所用针头相同或不同的针头)。因而重建冻干材料，将其抽取(例如，通过针头，同样可以与先前使用的针头相同或不同)到注射器内(例如，与先前使用的注射器相同或不同)，由该注射器注入患者(例如，通过针头，同样可以与先前使用的针头相同或不同)。一旦冻干材料和水性材料发生组合并位于递送装置内(通常是注射器)，可将该组合物给予患者。重建通常刚好在给予患者之前进行，例如注射前不超过30分钟。重建之后，给予患者的组合物将包含Hib和脑膜炎球菌偶联物。Hib偶联物源自最初的水性材料，而脑膜炎球菌偶联物源自最初的冻干材料。最初的水性材料也可包括脑膜炎球菌偶联物，例如冻干材料可包含来自血清群A和W135的偶联物，水性材料包含来自血清群C的偶联物(除了Hib偶联物之外)。本发明重建疫苗中Hib糖的质量通常为0.5-50微克，例如l-20微克，10-15微克，12-16微克。该量可以约为12.5微克。小于5微克的质量也是合适的[33]，例如l-5微克，2-4微克，或约2.5微克。重建疫苗中每种血清群的脑膜炎球菌糖的质量通常在1微克到20微克之间，例如每种血清群2-10微克，或约5-10微克。如果包括来自一种以上血清群的偶联物，它们可以基本上相等质量存在，例如各血清群糖的质量彼此在±10%内。作为相等比例的替代形式，可利用双倍质量的血清群A的糖。因此，疫苗可包含10微克MenA糖以及各5微克的MenC、W135和Y她鹏。在一些实施方式中，Hib糖的质量与特定脑膜炎球菌血清群糖的质量基本相同。在一些实施方式中，Hib糖的质量大于特定脑膜炎球菌血清群糖的质量(例如1.5倍)。在一些实施方式中，Hib糖的质量小于特定脑膜炎球菌血清群糖的质量(例如1.5倍)。如果组合物包含来自一种以上脑膜炎球菌血清群的糖，则每种血清群有平均糖质量。如果使用基本相等质量的各血清群，则平均质量与各个血清群的质量相同；如果使用非等量的血清群，则平均质量不同，对于10:5:5:5微克的MenACWY来说，平均质量为每血清群6.25微克。在一些实施方式中，Hib糖的质量与每血清群的脑膜炎球菌糖平均质量基本相同。在一些实施方式中，Hib糖的质量大于每血清群的脑膜炎球菌糖平均质量(例如，至少1.5倍)。在一些实施方式中，Hib糖的质量小于每血清群的脑膜炎球菌糖平均质量(例如，至少1.5倍)[34]。治疗方法和疫苗的给药本发明涉及并行给予组合疫苗形式的Hib和脑膜炎球菌偶联物。重建的组合物适合给予人类患者，且本发明提供了提升患者免疫应答的方法，该方法包括将本发明组合物给予患者的步骤。本发明也提供了用于药物中的本发明组合物。本发明还提供了(i)水性组分，包含B型流感嗜血杆菌荚膜糖的偶联物，和(ii)冻干组分，包含脑膜炎萘瑟氏菌荚膜糖的偶联物在制造用于给予患者的药物中的应用。本发明还提供了用于免疫接种的的组合，其包含(i)水性组分，包含B型流感嗜血杆菌荚膜糖的偶联物；和(ii)冻干组分，包含脑膜炎萘瑟氏菌荚膜糖的偶联物。本发明的重建组合物优选疫苗，用于减轻或防止细菌性脑膜炎，包括脑膜炎球菌性脑膜炎和Hib脑膜炎。接受本发明组合物的患者可以小于2岁，例如0-12个月。一类特定的患者为1到3个月大，过去未曾接受过脑膜炎球菌偶联物疫苗。为发挥充分功效，典型的儿童初次免疫方案可包括给予一次以上的剂量。例如，可在以下时间给予剂量第0，2和4个月(0时为首剂量)；第0，l禾口2个月；第0和2个月；第0，2和8个月；等等。首剂量(O时)可以在约2个月大时给予，或者有时(例如，在0-2-8个月方案中)在约3个月大时给予。组合物还可用作加强剂量，例如对儿童而言在其两岁时使用。可通过肌肉内注射到(例如)手臂、腿或臀部中给予本发明组合物。如果本发明组合物包含铝基佐剂，储藏过程中组分可能会沉淀。因此，在重建前后要震摇该混合物再给予患者。偶联本发明釆用Hib和脑膜炎球菌偶联物，其中荚膜糖偶联于载体蛋白。用于共价偶联的有用载体蛋白是细菌毒素或类毒素，如白喉类毒素或破伤风类毒素，或其衍生物如CRM197白喉毒素突变体[35-37]。其他合适的载体蛋白包括，脑膜炎奈瑟球菌外膜蛋白[38]、合成肽[39、40]、热激蛋白[41，42]、百日咳蛋白[43,44]、细胞因子[45]、淋巴因子[45]、激素[45]、生长因子[45]、含有各种病原体衍生抗原的多种人CD4+T细胞表位的人造蛋白[46]如N19[47]、流感嗜血杆菌的D蛋白[48-50]、肺炎球菌溶血素[51]、肺炎球菌表面蛋白PspA[52]、铁摄取蛋白[53]、艰难梭菌(C.^^"7e)的毒素A或B[54]等等。白喉类毒素(Dt)、破伤风类毒素(Tt)和CRM197是目前儿科疫苗中使用的主要载体，例如来自GSK的Hib偶联物使用Tt作为载体，HIBTITERTM产品使用CRM197，PREVENARTM中的肺炎球菌偶联物使用CRM197，MENJUGATEtm和MENINGITECTM产品使用CRM197，NEISVAC-Ctm使用Tt。可使用糖:蛋白质比例(w/w)在1:5(即蛋白质过量)和5:1(即糖过量)之间的偶联物，例如比例在l:2到5:1之间，比例在1:1.25至l」1:2.5之间。如参考文献55所述，混合物中不同的脑膜炎球菌血清群偶联物具有不同的糖:蛋白质比例，例如一种的比例为l:2到l:5之间，而另一种的比例在5:1到1:1.99之间。偶联物可与游离载体蛋白联用[56]。当本发明组合物中给定载体蛋白存在游离和偶联形式时，未偶联形式可不多于组合物中载体蛋白总量的5%，更常见少于2重量％。可采用任何合适的偶联反应，必要时采用任何合适的接头。一般在偶联前活化或官能化糖。活化可包括例如用氰化试剂如CDAP(如1-氰基-4-二甲基氨基四氟硼酸吡啶[57，58等])。其它合适技术采用活性酯、碳二亚胺、酰肼、降冰片烷、对硝基苯甲酸、N-羟基琥珀酰亚胺、S-NHS、EDC、TSTU(也参见参考文献11的引言)。可用任何己知方法，如参考文献59和60所述的方法通过接头基团进行连接。一种连接类型包括多糖的还原性胺化，将得到的氨基与己二酸接头基团的一端偶联，然后将蛋白质偶联于该己二酸接头基团的另一端[61，62]。其它接头包括P-丙酰胺基[63]、硝基苯基-乙基胺[64]、卤代酰基卤化14物[65]、糖苷键[66]、6-氨基己酸[67]、ADH[68]、C4-C12部分[69]等。也可使用碳二亚胺縮合反应[70]。作为采用接头的替代方法，可以采用直接连接。直接连接蛋白质可包括氧化多糖，然后与蛋白质迸行还原性胺化，如参考文献71和72所述。可以使用包括以下步骤的方法将氨基引入糖(如用-NH2取代末端-0基团)，然后用己二酸二酯(如己二酸N-羟基琥珀酰亚胺基二酯)衍生后，与载体蛋白反应。在另一个有用的反应中，用氰化试剂衍生化糖，然后与蛋白质偶联(直接，或者在载体中引入巯基或酰肼亲核基团之后)，无需使用接头。合适的氰化试剂包括l-氰基-4-(二甲基氨基)-吡啶鎗四氟硼酸盐("CDAP")，对硝基苯基氰酸酯和N-氰基三乙基铵四氟硼酸盐("CTEA")。如参考文献73所述，混合物可包含一种糖/蛋白直接连接的偶联物和另一种通过接头连接的偶联物。当使用来自不同脑膜炎球菌血清群的糖偶联物时这种设置尤其有用，例如MenA和MenC糖可通过接头偶联；而MenW135和MenY糖则直接偶联于载体蛋白。偶联后，可分离游离和偶联的糖。许多合适的方法可实现这种分离，包括疏水色谱、切向超滤、透析等。(例如，也可参见74和75等)。如果疫苗包含游离和偶联形式的给定糖，未偶联形式不超过组合物中全部糖总量的20重量。/。(例如，S15%，S10%，S5%，S2%，Si%)。各偶联物的载体量(偶联和未偶联)可以不超过100微克/毫升，例如各偶联物的载体蛋白<30微克/毫升。一些组合物中载体的总浓度小于500微克/毫升，例如<400微克/毫升，<300微克/毫升，<200微克/毫升，<100微克/毫升，<50微克/毫升，等等。本发明组合物的特征除了上述抗原组分，本发明组合物(混合前和混合后)通常还包含非抗原组分。非抗原组分可包括载体、佐剂、赋形剂、缓冲剂等，如下文更详细所述。本发明组合物通常包含一种或多种药物载体和/或赋形剂。无菌、无热原的磷酸盐缓冲生理盐水是一种典型载体。药学上可接受的赋形剂的全面讨论参见参考文献76。为了控制张力，包含生理性盐如钠盐是有用的。氯化钠(NaCl)是一种这样的盐，其浓度可以是l-20毫克/毫升。通常，水性组合物(冻干材料重建之前和/或之后)的重量克分子渗透浓度在200mOsm/kg至U400mOsm/kg之间，例如240-360mOsm/kg，或者290-320mOsm/kg。本发明组合物可包含一种或多种缓冲剂。缓冲剂一般包括磷酸盐缓冲剂；Tris缓冲剂；硼酸盐缓冲剂；琥珀酸盐缓冲剂；组氨酸缓冲剂；或柠檬酸缓冲剂。包含的缓冲剂的浓度一般是5-20mM。缓冲剂可包含在水性和/或冻干组分中。水性组合物的pH通常为5.0-7.5，更一般为5.0-6.0(最佳稳定性)，或者为6.0-7.0。本发明组合物优选为无菌组合物。本发明组合物优选无热原，如每剂量含有〈1EU(内毒素单位，标准量度)，优选每剂量〈0.1EU。本发明组合物可以不含谷蛋白。一些本发明的疫苗不含佐剂。其他本发明的疫苗包含佐剂。不含佐剂的疫苗可通过混合不含佐剂的组分进行制备。含佐剂的疫苗可通过组合多种含佐剂组分，通过组合含佐剂和不含佐剂组分，或者通过组合不含佐剂组分与佐剂而进行制备。如果抗原是吸附性的，组合物可以是具有混浊外观的悬浮液。这种外观意味着微生物污染不容易发现，因此疫苗可包含防腐剂。当疫苗包装在多剂量容器中时这点尤其重要。所包含的有用的防腐剂是2-苯氧基乙醇和硫柳汞。然而，如果可能的话，建议不用汞防腐剂(如硫柳汞)。本发明组合物优选包含小于约25ng/ml的汞。这种防腐剂可包含在水性和/或冻干组分中。以八13+表示的组合物中铝盐的浓度优选小于5毫克/毫升，例如S4毫克/毫升、S3毫克/毫升、S2毫克/毫升、Sl毫克/毫升、S0.85毫克/毫升等。本发明组合物可以0.5ml的剂量给予患者。应理解，0.5ml的剂量包括正常差异，如0.5ml土0.05ml。佐剂本发明组合物可包含佐剂，佐剂可包括一种或多种铝盐，具体是磷酸铝佐剂和/或氢氧化铝佐剂。用于制备本发明组合物的抗原组分可以在使用前包含铝佐剂，S卩"预先混合"或者"预先吸附"于佐剂。目前使用的铝佐剂通常称为"氢氧化铝"或"磷酸铝"佐剂。这些名称是为方便起见，但它们都不是所代表的实际化合物的准确描述[例如参见参考文献77的第9章]。本发明可采用通常用作佐剂的任何"氢氧化物"或"磷酸"盐。称为"氢氧化铝"的佐剂一般是羟基氧化铝盐(通常至少部分为晶体)。羟基氧化铝以分子式A10(0H)表示，其与其它铝化合物，例如氢氧化铝A1(0H)3的区别在于红外(IR)光谱，特别是在1070cm"处存在吸收带和在3090-3100cm"处存在强烈的肩峰[参考文献77的第9章]。称为"磷酸铝"的佐剂一般是羟基磷酸铝，这些佐剂也常含有少量硫酸根。可通过沉淀获得这些佐剂，沉淀期间的反应条件和浓度影响磷酸根取代该盐中羟基的程度。羟基磷酸盐中PCVA1摩尔比通常在0.3-0.99之间。羟基磷酸盐因存在羟基而有别于严格的A1P04。例如，3164cm"的IR光谱带(例如，当加热至20(TC时)表明存在结构性羟基[参考文献77的第9章]。磷酸铝佐剂的P04/A产摩尔比通常为0.3-1.2，优选为0.8-1.2，更优选为0.95±1。磷酸铝通常是无定形的，尤其是羟基磷酸盐。典型的佐剂是PCVA1摩尔比为0.84-0.92的无定形的羟基磷酸铝，包含0.6mgA产/ml。磷酸铝通常是颗粒。抗原吸附后颗粒直径一般是0.5-20jLim(如约5-10pm)。磷酸铝的PZC与磷酸对羟基的取代程度逆相关，这种取代程度可能取决于用于通过沉淀制备盐的反应条件和反应物浓度。也通过改变溶液中游离磷酸根离子的浓度(更多磷酸根-更多酸性PZC)或加入缓冲剂如组氨酸缓冲剂(使PZC碱性更强)改变PZC。本发明所用的磷酸铝的PZC通常为4.0-7.0，更优选为5.0-6.5，例如约为5.7。用于制备本发明组合物的磷酸铝溶液可以，但不一定含有缓冲液(如磷17酸盐或组氨酸或Tris缓冲液)。磷酸铝溶液优选为无菌和无热原。磷酸铝溶液可含有游离的水性磷酸根离子，如浓度为1.0-20mM，优选5-15mM，更优选约lOmM的磷酸根离子。磷酸铝溶液也可含有氯化钠。氯化钠的浓度优选为0.1-100毫克/毫升(例如0.5-50毫克/毫升，l-20毫克/毫升，2-10毫克/毫升)，更优选约3±1毫克/毫升。NaCl的存在有助于在抗原吸附前正确测定pH。可包含的其他抗原除了包含偶联的脑膜炎奈瑟球菌和Hib糖，组合物还可包含一种或多种其他抗原。例如，组合物可包含来自其他病原体(具体是细菌和/或病毒)的抗原。合适的其他抗原可选自白喉类毒素("D")破伤风类毒素("T")百日咳抗原("P")，通常是无细胞("aP")乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原("HBsAg")灭活的脊髓灰质炎病毒疫苗(IPV)甲型肝炎病毒(HAV)抗原来自肺炎链球菌的荚膜糖这些抗原通常源自本发明的水性组分。白喉类毒素白喉棒状杆菌导致白喉。可处理(例如用福尔马林或甲醛)白喉毒素使其脱毒，同时保留其在注射后诱导特异性抗毒素抗体的能力。参考文献1的第13章更详细地公开了白喉疫苗中使用的白喉类毒素。优选的白喉类毒素是经过甲醛处理的毒素。用可以补充牛提取物的生长培养基(如Fenton培养基，或Linggoud和Fenton培养基)培养白喉棒状杆菌，接着进行甲醛处理、超滤和沉淀，从而获得白喉类毒素。通过包括无菌过滤和/或透析的方法处理此类毒素化物质。白喉类毒素的量可表达为国际单位(IU)。例如，NIBSC提供的'吸附的白喉类毒素的第三国际标准1999'(DiphtheriaToxoidAdsorbedThirdInternationa!Standard1999)[78,79]含有160RJ/安瓿。除了IU系统，'Lf单位("絮凝化单位"或"临界絮凝化剂量")被定义为与1国际单位抗毒素混合产生最佳絮凝化混合物的类毒素的量[80]。例如，NIBSC提供的'简易白喉类毒素'(DiphtheriaToxoid,Plain)[81]，其含有300LF/安瓿，并还提供了'用于絮凝试验的白喉类毒素的第一国际参考试剂，(The1stInternationalReferenceReagentForDiphtheriaToxoidForFlocculationTest)[102〗，其含有900LF/安瓿。组合物通常包含20-80Lf的白喉类毒素，典型地约50Lf。通过IU测定，组合物通常包含至少30IU/剂量。白喉类毒素有用地吸附在氢氧化铝佐剂上。破伤风类毒素破伤风梭菌(C7oW〃W/"w/etom')导致破伤风。破伤风毒素经过处理得到保护性类毒素。参考文献1的第27章更详细地公开了破伤风疫苗中使用的类毒素。优选的破伤风类毒素是经过甲醛处理的毒素。用生长培养基(如衍生自牛酪蛋白的Latham培养基)培养破伤风梭菌(C化Mm')，然后进行甲醛处理、超滤和沉淀，从而获得破伤风类毒素。然后通过包括无菌过滤和/或透析的方法处理此物质。可用国际单位(IU)表示破伤风类毒素的量。例如，NIBSC提供了'吸附的破伤风类毒素的第三国际标准2000'[83,84]，其含有469IU/安瓿。作为IU系统的替代形式，'Lf单位("絮凝单位"或"边界絮凝剂量")定义为与一个国际单位的抗毒素混合时，产生最优絮凝混合物的类毒素量[80]。例如，NIBSC提供了'用于絮凝试验的破伤风类毒素的第一国际参比试剂'[85]，其含有1000Lf/安瓿。组合物通常包含5-50Lf的破伤风类毒素，典型地约20Lf。通过IU测定，组合物通常包含至少40IU/剂量。破伤风类毒素可以(但不一定)吸附于氢氧化铝佐剂(例如，吸附占破伤风类毒素总量0-10%)。百日咳抗原百日咳博德特菌可导致百日咳。疫苗中的百日咳抗原是细胞(全细胞，灭活的B.百日咳杆菌细胞)或无细胞形式。已经详尽记录了细胞百日咳抗原的制备(参见例如参考文献1的第21章)，例如，可通过加热灭活百日咳博德特菌的I期培养物获得该抗原。然而，作为替代形式，可采用无细胞抗原。如果使用无细胞抗原，优选使用一种、两种或(优选)三种以下抗原(1)解毒的百日咳毒素(百日咳类毒素或"PT");(2)丝状血细胞凝集素("FHA");(3)百日咳杆菌粘附素(也称为"69千道尔顿外膜蛋白")。优选从改良的Stainer-Scholte液体培养基培养的百日咳博德特菌培养物中分离制备这三种抗原。可从发酵肉汤中(如通过吸附于羟基磷灰石凝胶)分离PT和FHA，但可通过加热处理和絮凝(如采用氯化钡)从细胞中提取百日咳杆菌粘附素。可用连续的色谱和/或沉淀步骤纯化抗原。可通过疏水性层析、亲和层析和大小排阻层析纯化PT和FHA。可通过离子交换层析、疏水性层析和大小排阻层析纯化百日咳杆菌粘附素。在用于本发明之前，可用甲醛处理FHA和百日咳杆菌粘附素。可以通过甲醛和/或戊二醛处理使PT脱毒。作为这种化学脱毒方法的替代形式，PT可以是通过诱变降低了酶活性的突变PT[86]，但化学处理脱毒更加常见。无细胞百日咳抗原可吸附到一种或多种铝盐佐剂上。作为替代形式，它们也可以非吸附状态添加。如果加入百日咳杆菌粘附素，优选其已经吸附在氢氧化铝佐剂上。PT和FHA可吸附到氢氧化铝佐剂或者磷酸铝上。所有PT、FHA和百日咳杆菌粘附素都吸附于氢氧化铝是有用的。组合物通常包含l-50貼/剂量的PT;1-50pg/剂量的FHA;禾卩1-50吗百日咳杆菌粘附素。除了PT、FHA和百日咳杆菌粘附素之外，无细胞百日咳疫苗中还可包含噬菌体伞毛(fimbriae)(例如凝集原2和3)。乙型肝炎病毒表面抗原乙型肝炎病毒(HBV)是一种已知的可导致病毒性肝炎的物质。HBV病20毒颗粒由被外部蛋白质外壳或衣壳包裹的内部核心构成，病毒核心含有病毒DNA基因组。衣壳的主要成份是一种称为HBV表面抗原，或者更通常称为'HBsAg'的蛋白质，这通常是一种分子量约为24kDa的由226个氨基酸的蛋白质。所有现有乙肝疫苗均含HBsAg，当这种抗原被给予接种者时它能刺激产生抗-HbsAg抗体从而抵抗HBV感染。为制造疫苗，可用两种方法制备HBsAg。第一种方法涉及从慢性乙肝携带者的血桨中纯化颗粒形式的抗原，这是因为慢性乙肝携带者的肝脏中会合成大量HBsAg并在HBV感染期间释放到血流中。第二种方法涉及通过重组DNA法表达蛋白质。本发明方法中使用的HBsAg优选是在酵母细胞中重组表达的。合适的酵母包括例如酵母属(如酿酒酵母CS.ceWs&e))或汉森酵母属(如多形汉森酵母(/f.;w/y/na7^a))宿主。HBsAg通常是非糖基化的。不同于天然HBsAg(即质粒纯化产品中的HBsAg)，酵母表达的HBsAg通常是非糖基化的，且这是可用于本发明的最优选HBsAg形式，因为它是高度免疫原性的，且制造时没有血液产品污染风险。HBsAg通常是基本呈球形的颗粒形式(平均直径约为20nm)，包括含有磷脂的脂质基质。酵母表达的HBsAg颗粒可含有在天然HBV病毒颗粒中未发现的磷脂酰肌醇。该颗粒也可含有非毒性量的LPS以刺激免疫系统[87]。HBsAg可以是包括含有磷脂、磷脂酰肌醇和聚山梨酯20的脂质基质的颗粒形式。所有已知的HBV亚型都含有共同的决定簇'a'。与其它决定簇和亚决定簇联合，鉴定到九种亚型aywl，ayw2，ayw3，ayw4，ayr，adw2，adw4,adrq-和adrq+。除了这些亚型，已经出现其它变体，如在免疫个体中检测到的HBV突变体("逃逸突变体")。本发明常用的HBV亚型是亚型adw2。除'S'序列以外，表面抗原可包含所有或部分前-S序列，如所有或部分前-Sl和/或前-S2序列。HBsAg的量通常以微克表示，每个疫苗剂量中HbsAg的一般含量在5到5pg之间，例如10昭/剂量。虽然最终疫苗中HBsAg可吸附于氢氧化铝佐齐U(例如公知的ENGERIX-BTM产品)，或者可保持未吸附，但通常吸附于磷酸铝佐剂[88〗。灭活的脊髓灰质炎病毒疫苗脊髓灰质炎病毒可导致脊髓灰质炎。除了使用口服脊髓灰质炎病毒疫苗，本发明可使用IPV，如参考文献l第24章详细披露的。脊髓灰质炎病毒可在细胞培养物中生长，优选的培养物采用衍生自猴肾的Vero细胞系。Vero细胞宜作为培养的微载体。培养后，可用诸如超滤、渗滤和层析等技术纯化病毒颗粒。施用于患者之前，脊髓灰质炎病毒必需被灭活，这可通过甲醛处理来实现。脊髓灰质炎可能由三种类型的脊髓灰质炎病毒之一引起。这三种类型相似，并且引起相同的症状，但它们的抗原性差异很大，被一种类型感染后并不能保护其免受其它类型的感染。因此本发明优选采用三种脊髓灰质炎病毒抗原1型脊髓灰质炎病毒(例如Mahoney毒株)、2型脊髓灰质炎病毒(例如MEF-1毒株)，和3型脊髓灰质炎病毒(例如Saukett毒株)。优选将病毒单独培养、纯化和灭活，然后合并以得到用于本发明的散装三价混合物。IPV的量通常用'DlT单位("D-抗原单位"[89])表示。通常，每剂量每种病毒类型包含1-100DU，例如80DU的1型脊髓灰质炎病毒，约16DU的2型脊髓灰质炎病毒，约64DU的3型脊髓灰质炎病毒。在用于制备本发明组合物之前，脊髓灰质炎病毒抗原优选不吸附于任何铝盐佐剂，但它们可以在储存期间吸附到疫苗组合物中的铝盐佐剂上。甲型肝炎病毒抗原甲型肝炎病毒(HAV)是一种已知的可导致病毒性肝炎的物质。参考文献1的第15章公开了HAV疫苗。有用的HAV组分基于灭活病毒，可通过甲醛处理实现灭活。可以在人胚肺双倍体成纤维细胞，如MRC-5细胞上培养病毒。有用的HAV毒株是HM175，虽然也可使用CR326F。可以在允许病毒生长的条件下培养细胞。裂解细胞，可通过超滤和凝胶渗透层析纯化得到的悬液。以EU(Elisa单位)计，HAV抗原的含量一般为至少约500EU/ml。肺炎球菌糖偶联的肺炎球菌抗原包含偶联于载体蛋白的肺炎链球菌p"ewwom'ae)的荚膜糖抗原[例如，参考文献90-92]。通常包含来自肺炎链球菌一种以上血清型的糖广泛采用23种不同血清型的多糖的混合物，如同采用5-11中不同血清型的多糖的偶联疫苗[93]。例如，PREVNARtm[94]含有来自7种血清型(4、6B、9V、14、18C、19F和23F)的抗原，其中各糖通过还原胺化单独偶联于CRM197，每0.5ml剂量含有2吗各糖(4吗血清型6B)。本发明组合物至少包含血清型6B、14、19F和23F的糖抗原。其它血清型可选自1，3，4，5，7F，9V和18C。7-价(如PREVNARtm所述)，9-价(例如PREVNAR中的7种血清型加上1和5)，10-价(例如PREVNAR中的7种血清型加上1、5和7F)和ll-价(例如，PREVNAR中的7种血清型加上l、3、5和7F)覆盖度的肺炎球菌血清型尤其有用。通常，每剂量中组合物包含的各存在的血清型为l-20.ug(以糖计)。冻干偶联物与水包油乳液佐剂本发明其他方面的目的是提供包含脑膜炎球菌偶联物的改良疫苗制剂，使用水包油乳液重建包含来自多种脑膜炎球菌血清群的荚膜糖的冻干日^r日苗^T龙苗々RXV/jq/J乂人乂\^*J、I^LM^LX乂J0因此，本发明提供了一种试剂盒，其包括(i)水包油乳液组分；和(ii)冻干组分，包含来自一种以上脑膜炎萘瑟氏菌血清群的荚膜糖的偶联物。为给予患者，乳液和冻干组分组合形成适合注射的液体疫苗。本发明还提供了制备疫苗的方法，该方法包括组合以下组分的步骤(i)水包油乳液组分；和(ii)冻千组分，包含来自一种以上脑膜炎萘瑟氏菌血清群的荚膜糖的偶联物。本发明还提供了一种疫苗，其包含在水包油乳液中的脑膜炎萘瑟菌荚膜糖的偶联物，通过将水包油乳液组分与来自一种以上脑膜炎萘瑟菌血清23群的冻干的荚膜糖偶联物组合进行制备。疫苗可包含冻干稳定剂(如下所述)。本发明还提供以下组分在制备用于给予患者的药物中的应用(i)水包油乳液组分；和(ii)冻干组分，包含来自一种以上脑膜炎萘瑟氏菌血清群的荚膜糖偶联物。本发明还提供了用于免疫接种的组合其包含(i)水包油乳液组分；和(ii)冻干组分，包含来自一种以上脑膜炎萘瑟氏菌血清群的荚膜糖偶联物。本发明该方面的冻干组分的特征如上所述，只是总是包含一种以上血清群的偶联物。此外，如果使用水包油乳液，冻干组分通常不含佐剂。上文也描述了包装(例如试剂盒形式、独立容器、多室注射器、小瓶等)、重建、给予(例如患者、方案、注射等)、偶联(例如载体蛋白、糖:蛋白质比例、连接键等)以及最终组成((例如载体、重量克分子渗透浓度、缓冲剂、phl寺,|H'、」符仳。孔汲口」以与丄处爪'l王Hlt)祖or相问(、忭必安修止.)U'、J力工"叉用。牟反明该力囬tr、j組甘柳p」^包s-非胭腺灾坏囷饥尿，卯上尸/r还，例卯D、T、P、HBV、IPV、HAV和/或肺炎球菌抗原。如上所述，它们可以在水性组分中，例如在乳液佐剂中。除了脑膜炎球菌偶联物和乳液之外，本发明该方面的疫苗优选还包含Hib偶联物。Hib偶联物最初是冻干形式，例如与冻干的脑膜炎球菌偶联物组合，或者是水性形式。在一些实施方式中，Hib偶联物可与乳液混合，使用Hib/乳液混合物来重建冻干的脑膜炎球菌偶联物。本发明提供了一种疫苗，其在水包油乳液中包含来自两种或更多种(例如，2、3或4种)脑膜炎萘瑟菌血清群的荚膜糖的偶联物和B型流感嗜血杆菌荚膜糖。本发明该方面使用的Hib偶联物的特征在上文中详细揭示，例如关于(i)偶联，(ii)糖部分的长度，(iii)载体蛋白以及(iv)相对于脑膜炎球菌偶联物的剂量比。本发明所用的具体的水包油乳液包括但不限于*鲨烯、吐温80和司盘85的亚微米乳液。该乳液的体积组成可以是约5%鲨烯、约0.5%聚山梨酯80和约0.5%司盘85(或者对于2X浓縮物是双倍剂量)。以重量计，这些含量变为4.3%鲨烯、0.5%聚山梨酯80和0.48%司盘85。这种佐剂称为'MF59'。MF59乳液宜包含柠檬酸根离子，如10mM柠檬酸钠缓冲液。，鲨烯、生育酚和吐温80的乳液。该乳液可包含磷酸盐缓冲盐水。它也可含有司盘85(如1%)和/或卵磷脂。这些乳液可含有2-10%鲨烯、2-10%生育酚和0.3-3%吐温80，鲨烯:生育酚的重量比优选S1(例如0.90)，因为这能提供更稳定的乳液。角鲨烯和吐温80的体积比可以约为5:2，或者重量比约为11:5。可通过下述方法制备一种这样的乳液将吐温80溶解于PBS得到2%溶液，然后将卯ml该溶液与5gDL-a-生育酚和5ml鲨烯的混合物混合，然后使该混合物微流体化。得到的乳液可含有(如)平均直径为100-250nm，优选约180nm的亚微米油滴。该乳液也可包含3d-MPL禾卩/或皂苷(如QS21)。鲨烯、生育酚和曲通去污剂(如曲通X-100)的乳液。该乳液也可含有3-0-脱酰化单磷酰脂MA(:'3d-MPL')。该乳液可含有磷酸盐缓冲液。，含有鲨烯、普朗尼克F-68嵌段共聚物、卵磷脂酰胆碱、甘油和生育酚的乳液[95]。，含有鲨烯、聚山梨酯(如聚山梨酯80)、曲通去污剂(如曲通X100)和生育酚(如琥珀酸a-生育酚)的乳液。该乳液可包含这三种组分，其质量比约为75:11:10(如750微克/毫升聚山梨酯80、110微克/毫升曲通X-100和100微克/毫升琥珀酸a-生育酚)，这些浓度应包括抗原中这些组分的贡献。该乳液也可包含3d-MPL。该乳液也可包含皂苷，如QS21。水相可含有磷酸盐缓冲液。.含有鲨烯、水性溶剂、聚氧乙烯烷基醚亲水性非离子型表面活性剂(如聚氧乙烯(12)十六十八醚)和疏水性非离子型表面活性剂(如脱水山梨糖醇酯或二縮甘露醇酯，如失水山梨糖醇单油酸酯或'司盘80')的乳液。该乳剂优选为热可逆的和/或其中至少90。/。油滴(以体积计)的尺寸小于200nm[96]。该乳剂也可含有以下一种或多种物质糖醇；低温保护剂(例如，糖，如十二烷基麦芽苷和/或蔗糖)；禾B/或垸基聚糖苷(alkylpolyglycoside)。也可包含TLR4激动剂，如化学结构不含糖环的TLR4激动剂[97]。这类乳液可以被冻干。，角鲨烯、泊洛沙姆-105和Abil-Care的乳液[98]。含佐剂疫苗中这些组分的终浓度(重量)是5%鲨烯、4%泊洛沙姆-105(普流罗尼多元醇)和2%Abil-Care85(双-PEG/PPG-16/16PEG/PPG-16/16二甲硅油；辛酸/癸酸甘油三酯)。*鲨烯、聚山梨酯80和泊洛沙姆401("普流罗尼克TML121")的乳液。可以用磷酸盐缓冲盐水，pH7.4配制该乳液。该乳液是一种有用的胞壁酰二肽递送载体，已在"SAF-I"佐剂(0.05-l。/。Thr-MDP、5%鲨烯、2.5%普朗尼克L121和0.2%聚山梨酸酯80)中与苏氨酰基-MDP—起使用[99]。也可不与Thr-MDP—起使用，例如用"AF"佐剂(5。/。鲨烯、1.25。/。普朗尼克L121和0.2%聚山梨酸酯80)[100]。优选微流体化。含有0.5-50%油、0.1-10%磷脂和0.05-5%非离子型表面活性剂的乳液。如参考文献101所述，优选的磷脂组分是磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酸、鞘磷脂和心磷脂。优选亚微米液滴尺寸。不可代谢油(如轻质矿物油)和至少一种表面活性齐U(如卵磷脂、吐温80或司盘80)的亚微米水包油乳液。可包含添加剂，例如QuilA皂苷、胆固醇、皂苷-亲脂体偶联物(如通过葡糖醛酸的羧基将脂族胺加到脱酰基皂苷上而产生的GPI-0100,参见参考文献102)、二甲基二-十八垸基溴化铵和/或N,N-二-十八烷基-N,N-双(2-羟乙基)丙二胺。*皂苷(如QuilA或QS21)和固醇(如胆固醇)结合成螺旋胶束的乳液[103]。包含矿物油、非离子亲脂性乙氧基化脂肪醇和非离子亲水性表面活性剂(例如，乙氧基化脂肪醇和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)的乳液网。包含矿物油、非离子亲水性乙氧基化脂肪醇和非离子亲脂性表面活性剂(例如，乙氧基化脂肪醇和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)的乳液网。优选包含角鲨烯的乳液。26概述术语"含有"包括"包含"以及"由...组成"，例如"含有"x的组合物可仅由X组成或可包含其它物质，例如X+Y。术语"基本上"不排除"完全"，如"基本上不含"Y的组合物可能完全不含Y。必要时，可从本发明定义中省去术语"基本上"。与数值x相关的术语"约，，表示，例如X士100/0。除非另有说明，包括混合两种或更多种组分的步骤的方法不需要任何特定的混合顺序。因此，可以任何顺序混合这些组分。有三种组分时，两种组分可以彼此混合，然后将该组合再与第三种组分混合，等等。偶联物的浓度在这里定义为糖的质量，以避免由于载体选择而导致的差异。将抗原抗原描述为"吸附"于佐剂时，优选至少吸附了50重量％的该抗原，例如50。/。、60。/。、70°/。、80。/。、90°/。、95%、98%或更多。优选的是，白喉类毒素和破伤风类毒素均完全吸附，即上清液中检测不到。也优选HBsAg完全吸附。将动物(特别是牛)材料用于培养细胞时，它们应获自未患传染性海绵状脑病(TSE)，特别是未患牛海绵状脑病(BSE)的来源。本发明实施方式根据参考文献22所述制备脑膜炎球菌糖偶联物。在不含佐剂情况下组合各血清群A、C、W135和Y的偶联物，形成四价脑膜炎球菌偶联物的混合物。该混合物在稳定剂，例如蔗糖/甘露醇混合物的存在下冻干，形成以后在需要时可以重建的冻干脑膜炎球菌组分。冻干材料填充到小瓶内，剂量为重建后各5吗糖(血清群A是IO貼)。购得HIBTITER疫苗(惠氏(Wyeth))和液体PEDVAXHIBTM。HIBTITER疫苗不含佐剂，而液体PEDVAXHIBTM包含铝盐佐剂。两种疫苗均以玻璃瓶形式提供。通过针头将玻璃瓶内容物抽取到注射器中，并注入含冻干材料的小瓶中。轻柔混合后，通过针头将内容物抽取到新的注射器中。用注射针头更换注射器的针头，将重建的疫苗注入测试对象。在最初的动物研究中，使用8组CD1小鼠(每组10只)。组1接受将冻千的MenA偶联物与液体MenCWY混合物混合制备的MenACWY偶联物疫苗，如参考文献22所述。组2接受水性重建冻干的MenACWY而制备的MenACWY疫苗。组3-5接受与组2相同的疫苗，但用以下试剂重建(3)含羟基硫酸硫酸铝佐剂的Hib-OMPC偶联物，例如PEDVAXHIB;(4)吸附于磷酸铝的CRM197-Hib偶联物；或(5)未吸附的CRM197-Hib偶联物，例如HIBTITERtm。组6-8给予这三种液体Hib疫苗但不给予脑膜炎球菌偶联物，分别与组3-5配对。在第0、14和28天皮下给予200pl体积的疫苗。剂量是lpgMenCWY糖，2叫MenA糖和2.5pgHib糖。第0、28和42天取血清，测定对脑膜炎球菌菌株的杀菌活性以及抗-PRP应答。在这些实验的变型中，组4接受含佐剂但非吸附于磷酸铝的CRM197-Hib偶联物。在研究SS-07-02中，三次剂量后的免疫原性结果如下，对于5种偶联物，以应答对象％表示，对于脑膜炎球菌偶联物，以几何平均效价(GMT)表示MenAMenCMenW]MenYHibGMTGMT%GMT%GMT%%1272100154100146100111100-2656100239100106100233訓-18821001533100138010053010037.5411687.52051002311009187.587.51111007087.566753875756-------507-------62.58-------50因此，液体Hib与冻干MenACWY的组合可提供保留针对所有五种细菌效力的组合物。组3(用液体Hib偶联物与羟基磷酸硫酸铝佐剂重建)和组4(用液体Hib偶联物与磷酸铝佐剂重建)可见优良结果。组3抗-脑膜炎球菌效价最高，对所有血清群100%应答，但对Hib抗原的应答对象数量中等。组4可见最佳抗-Hib应答，抗-脑膜炎球菌应答也合理，尤其是针对血清群W135[3]。两次剂量后组3和4也显示优良的免疫应答(数据未显示)，与组1、2或5相比，这两组中抗-MenY应答尤其高(GMT和应答对象。/。都是这样)。2次剂量后，组4显示最高的抗-脑膜炎球菌效价，对所有血清群100%应答。在组4和5中，脑膜炎球菌偶联物的存在可提高对Hib糖的免疫应答(比较组8与组5，组7与组4)。在组3和4中，如果液体Hib抗原含佐剂，Hib偶联物的存在可提高抗-W135效价(与组2相比)，但在使用不含佐剂的Hib的组5中未见这种提高。在平行实验中，用水包角鲨烯乳液(MF59)重建偶联物。三组(9-ll)接受以下试剂(9)冻干的MenACWY偶联物，(10)CRM197-Hib偶联物或(ll)两者的混合物。3次剂量后的免疫原性结果如下所示<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>因此，水包角鲨烯乳液能改善脑膜炎球菌和Hib偶联物的效力，MenACWY+Hib+乳液组合可提供优异的免疫原性。室温下，采用NMR研究组合产品4和5中MenA和Hib糖偶联物在24小时期间的稳定性。这些糖均包含磷酸二酯键，因此，以水性形式储存期间易水解断裂。然而，用液体Hib重建冻干的MenACWY混合物之后，不论是否存在磷酸铝佐剂，MenA和Hib糖保持完全稳定，没有可检测的解聚。应理解，仅以举例的方式描述了本发明，可在本发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2007年6月4日发明者M·肯托尼,P·科斯坦蒂诺申请人:诺华有限公司