含有用于刺激成骨细胞分化的骨形成肽1(bfp1)的合成肽及含有上述合成肽的药物组合物的利记博彩app

专利名称：含有用于刺激成骨细胞分化的骨形成肽1(bfp1)的合成肽及含有上述合成肽的药物组合物的利记博彩app
含有用于刺激成骨细胞分化的骨形成肽1 (BFP1)的合成肽 及含有上述合成肽的药物组合物
技术领域：
本发明公开了一中具备了有效功能的肽，尤其是一种源自 BMP (BoneMorphogenetic Protein) _7 而被命名为骨形成肽 1 (bone forming peptide KBFP 1))的合成肽、以上述合成肽为有效成分的药物组合物及培养基组合物。
背景技术：
骨质疏松症(osteoporosis)是一种骨组织的石灰减少而使骨致密质变薄、骨髓 腔变大的疾病，随着症状进展而使骨头变弱，即使受到较小的冲击也容易骨折。决定骨健康状态的骨量会受到遗传、营养摄取、激素变化、运动及生活习惯的差异 等各种因素的影响，尤其是老龄、运动不足、低体重、吸烟、爱吃低钙食物、停经或割除卵巢 等被认为是骨质疏松症的原因。虽然有个别差异，但黑人的骨再吸收度(bone resorption level)比白人低而骨 量较高，骨量通常在14岁到18岁时最高而到了老年阶段却会每年减少1%。尤其是女性 从30岁开始时持续减少，到了停经期更受到激素变化的影响而使得骨急剧减少。亦即，到 了停经期时雌激素浓度会急剧减少，此时会形成大量B-淋巴球(B-Iymphocyte)而在骨髓 (bone marrow)上积累前B细胞(pre_B cell)，进而促使IL-6量增加而提高破骨细胞的活 性，结果导致骨量减少。如前所述，骨质疏松症虽然在症状上会有轻重不同，但对于老年人(尤其是停经 期以后的女性)是无可避免的症状，发达国家随着人口老龄化而日益重视骨质疏松症及其 治疗药物。而且，骨相关疾病除了骨质疏松症以外还包括骨关节炎(osteoarthritis)及骨 缺损等疾病，骨关节炎是一种由于关节的软骨受损而在局部出现退行性变化的疾病，也称 为退行性关节炎。骨关节炎主要有下列两个原因关节的软骨或骨是正常的，但关节承受过 多负荷而使关节组织受损；或者承受的负荷是正常的，但关节的软骨或骨较弱。骨缺损疾病可以发生在人体的各个部位，其主要原因包括伴随骨质损失的急性外 伤、手术时清除组织而引起的伴随骨质损失的急性外伤、伴随骨切除(boneresection)的 慢性感染、伴随节段性骨缺损的慢性不愈合等。实际上，在上述骨疾病的治疗方面，全世界已经形成了高达1，300亿美元的庞大 市场，而且其规模还会增加，因此众多世界级研究机构与制药厂在骨疾病的治疗药物开发 上投入了庞大资本。以骨质疏松症为例，目前作为骨质疏松症的治疗剂使用的物质包括雌激素 (estrogen)、雄性合成类固醇(androgenic anabolic steroid)、钙剂、磷酸盐、氟剂、异丙 氧黄酮(Ipriflavone)及维生素D3等，作为骨质疏松症的治疗剂，美国默克大药厂在1995 年开发了氨基二膦酸(aminobisphosphonate)，美国礼来大药厂(Lilly Co.)则在1997年 开发了选择性雌激素受体调节剂(selective estrogen receptor modulator, SERM)雷洛昔芬(raloxifene)。另外，骨吸收抑制剂雌激素作为骨质疏松症治疗剂获得了广泛的应用，但频繁服 用雌激素会增加子宫内膜癌与乳房癌的发生频率，还可能导致血栓症、胆石症、高血压、浮 肿及乳房痛等，针对停经后同时服用雌激素与孕酮(progesterone)的女性进行跟踪的结 果表明，其乳房癌、脑卒中(cerebral apoplexy)及肺栓塞等疾病的发生率较高。此外，二膦酸制剂(阿仑膦酸钠、替膦酸钠)、维生素D制剂、降钙素制剂或钙剂等 也可以作为骨质疏松症的治疗剂使用，但二膦酸制剂的吸收率较低、服用方法不易而且容 易引起食道炎；维生素D制剂的价格较高且疗效不彰；降钙素制剂的价格较高且服用不易； 钙剂虽然副作用较少，但其主要作用在于预防而不注重治疗。而且，骨质疏松症无法靠短期服用药物而治愈，必须长期服用药物。因此，迫切需 要开发出一种即使长期服用药物也不会发生上述副作用且其药效足以替代现有治疗物质 的新物质。然而目前韩国国内对于骨质疏松症的认识较为不足而无法妥善地进行预防与治 疗，其中由于乱用药物而引起的继发性骨质疏松症逐渐呈现严重的趋势，却因为国内缺乏 相关的治疗临床资料而只得沿用国情与韩国不同的西欧治疗方法，因此迫切需要根据韩国 国情对骨质疏松症进行正确研究并且开发出符合韩国骨质疏松症患者的治疗剂。上述情形也同样适用于骨关节炎或骨缺损疾病。

发明内容发明需要解决的技术课题为了解决上述现有技术的诸多缺点与问题而努力研究的结果，本发明人对具有可 促进成骨细胞分化的序列的肽进行合成后完成了本发明。本发明的目的是提供一种合成肽，其被命名为bone forming peptidel(BFP 1)， 可以低成本合成，由源自可促进成骨细胞分化的BMP-7的15个氨基酸序列(Gly-Gln-Gly-Phe-Ser-Tyr-Pro-Tyr-Lys-Ala-Val-Phe-Ser-Thr-Gln)构成。本发明的另一个目的是提供一种药物组合物，其有效成分包括含BFP 1的合成 肽，其药效优异而没有副作用，生产成本相对较低，可以治疗骨质疏松症及/或骨关节炎。本发明的另一个目的是提供一种药物组合物，其有效成分包括含BFP 1的合成 肽，其药效优异而没有副作用，生产成本相对较低而骨修复效果卓越，可以有效地治疗骨缺 损疾病。本发明的另一个目的是提供一种成骨细胞分化培养基组合物，包括含BFP 1的合 成肽，可以调节成骨细胞的分化速度。本发明的目的不限于上述目的，本发明的技术人员可以从后述说明中准确地了解 到前文没有提到的其它目的。解决课题的技术方案为了实现上述目的，本发明提供一种成骨细胞分化或骨形成促进用合成肽，包括 了存在于BMP-7的序列号为1的下述肽或其相同物[boneforming peptide 1 (BFP 1)]。〈序列号1>Gly-Gln-Gly-Phe-Ser-Tyr-Pro-Tyr-Lys-Ala-Val-Phe-Ser-Thr-Gln
在本发明的较佳实施例中，每成骨细胞的上述合成肽的添加含量为0. 1到g/ ml。而且，本发明提供一种骨质疏松症治疗用药物组合物，其有效成分是包括了存在 于BMP-7的序列号为1的下述肽或其相同物[bone formingpeptide 1 (BFP 1)]的合成肽。〈序列号1>Gly-Gln-Gly-Phe-Ser-Tyr-Pro-Tyr-Lys-Ala-Val-Phe-Ser-Thr-Gln而且，本发明提供一种骨关节炎治疗用药物组合物，其有效成分是包括了存在于 BMP-7的序列号为1的下述肽或其相同物[bone formingpeptide 1 (BFP 1)]的合成肽。〈序列号1>Gly-Gln-Gly-Phe-Ser-Tyr-Pro-Tyr-Lys-Ala-Val-Phe-Ser-Thr-Gln而且，本发明提供一种骨缺损疾病治疗用药物组合物，其有效成分是包括了存在 于BMP-7的序列号为1的下述肽或其相同物[bone formingpeptide 1 (BFP 1)]的合成肽。〈序列号1>Gly-Gln-Gly-Phe-Ser-Tyr-Pro-Tyr-Lys-Ala-Val-Phe-Ser-Thr-Gln而且，本发明提供一种成骨细胞培养基组合物，其有效成分是包括了存在于BMP-7 的序列号为1的下述肽或其相同物[bone forming peptidel(BFP 1)]的合成肽。〈序列号1>Gly-Gln-Gly-Phe-Ser-Tyr-Pro-Tyr-Lys-Ala-Val-Phe-Ser-Thr-Gln有益效果本发明具有下列优异效果。首先，本发明含有BFP 1的合成肽可以在成骨细胞分化是促进成骨细胞的分化， 因此可适用于需要促进成骨细胞分化的各种领域。而且，本发明药物组合物的有效成分包括含BFP1的合成肽，在治疗骨质疏松症及 /或骨关节炎时，其药效优异而没有副作用，生产成本比现有治疗物质相对较低，以成骨细 胞分化促进效果为代表的优异疗效足以替代现有的治疗物质。而且，本发明药物组合物的有效成分包括含BFP1的合成肽，其药效优异而没有副 作用，生产成本相对较低而骨修复效果卓越。本发明培养基组合物添加了含有BFP1的合成肽，允许实验者调节成骨细胞的分 化速度而得以在各种实验条件下进行实验。

图1是本发明较佳实施例的源于BMP-7的BFP 1的氨基酸序列的顺序图；图2是图1所示源于BMP-7的BFP 1的结构图；图3是图1所示源于BMP-7的BFP 1的细胞毒性结果图；图4是利用茜素红染色法量测的图1所示源于BMP-7的BFP 1的成骨细胞分化积 累的矿化照片；图5是图1所示合成肽(BFP 1)所生成的成骨细胞特定基因I型胶原、碱性磷酸 酶、Runx 2基因的表达(expression)量测结果图；图6是是通过FACS分析方法对图1所示合成肽(BFP 1)在成骨细胞分化时的细
5胞表面标记表达(expression)进行调查的结果(浅灰色-ODM单独；浓灰色-0DM+BFP1)；图7是通过荧光显微镜对图1所示合成肽(BFP 1)所造成的细胞表面标记⑶44 的表达进行观察的照片；图8是使用源于图1所示合成肽(BFP 1)进行成骨细胞分化时利用商用诊断试剂 盒对成骨细胞特定酵素碱性磷酸酶(ALP)与钙浓度进行观察的结果图；图9是利用荧光显微镜对成骨细胞特定基因之一的骨钙素进行观察的照片；图10是利用荧光显微镜对成骨细胞特定基因之一的碱性磷酸酶进行观察的照 片；图11是利用荧光显微镜对成骨细胞特定基因之一的Rimx 2进行观察的照片；图12是本发明BFP 1和荧光物质FITC结合并且在细胞上处理后观察的照片；图13是间充质干细胞分化成成骨细胞时为了观察细胞的移动而进行趋化性 (chemotaxis)实验法后的结果图。发明的具体实施方式本发明所使用的术语是目前广泛应用的一般术语，但申请人也在特定情形下任意 选择了术语，此时该术语应该根据本发明的发明内容的记载内容或其所使用的意义而解释 其意义。下面结合附图与较佳实施例详细说明本发明的技术结构。但，上述说明无法限定本发明的范围，本发明也可以通过其他方式得到具体实践。 在此附带一提，本发明的说明书中同一图形标记表示同一构成要素。目前在发生骨形态的活性方面，已经针对属于TGF(转化生长因子)-β超家族的 骨形态发生因子 BMP 进行了报告(Science 150,893-897,1965 ；Science 242 ；1528-1534, 1988)。已知的BMP有BMP-I到BMP-14。其中，BMP-2到BMP-14被认为具有发生骨形态的 活性。BMP-2到BMP-14的BMP虽然被认为在各种骨功能障碍与骨疾病的治疗处治上具有效 果，但其自然界存量极少，因此为了大量获取上述处治用BMP-2到BMP-14而需要制造再组 合蛋白质。但再组合蛋白质的制造成本通常高于地分子量化合物，而且其蛋白质方面的特 性却在物性与服药方面使其在医药用途上受到了诸多限制。鉴于上述限制，如果能得到活 性等同于上述BMP蛋白质的低分子量有机化合物，将成为非常有益的医药。有鉴于此，本发明人针对BMP-7所含氨基酸序列进行了研究并发现了下列事实。 由BMP-7所含15个氨基酸构成且具有下述序列号1的肽具备了可引起人类BMP-7(骨形成 因子)表达的活性，还具备了和人类BMP-7相同的效能，呈现出很高的可用性，本发明人随 把其命名为 boneforming peptiede 1 (BFP 1)。〈序列号1>Gly-Gln-Gly-Phe-Ser-Tyr-Pro-Tyr-Lys-Ala-Val-Phe-Ser-Thr-Gln上述BFPl是一种由源于BMP-7的15个氨基酸构成的序列肽，可以使用公知方法 人为地合成。而且，使用成骨细胞分化培养基驱使成骨细胞(更准确的说法是鼠间充质干细 胞)分化时，和仅仅使用一般成骨细胞分化培养基进行分化相比，使用本发明的BFP更能使 成骨细胞分化。由此可知，本发明BFP 1可以在成骨细胞分化时促进成骨细胞的分化而提高分化潜能。由此可知，本发明的BFP 1具备了卓越的成骨细胞分化诱导活性，由于骨质疏松 症、骨关节炎或骨缺损疾病之类的骨疾病而造成骨损失时，把有效成分中包括含BFP 1的 合成肽的本发明药物组合物填入或投入骨缺损部位，即可对骨质疏松症、骨缺损疾病及/ 或骨关节炎发挥发挥治疗效果。下面结合实验例与附图对本发明较佳实施例，尤其是BFP 1的成骨细胞分化诱导 活性做进一步说明。图1到图3分别显示了本发明较佳实施例的源于BMP-7的BFP 1的氨基酸序列的 顺序、BFP 1的结构及BFP 1的细胞毒性。此时，具有图1所示序列信息的BFP 1是利用BMP-7的整体氨基酸合成的，通过聚 合作用使15个氨基酸具有后述序列。<序列信息>Gly-Gln-Gly-Phe-Ser-Tyr-Pro-Tyr-Lys-Ala-Val-Phe-Ser-Thr-Gln(G-Q-G-F-S-Y-P-Y-K-A-V-F-S-T-Q)使用商用程序检查图2所示的上述合成BFP 1的结构后得知，具有图1所示序列 的a-螺旋结构。此时为了调查合成后的BFP 1对细胞的毒性而在实验浓度范围内利用MTT方法进 行了细胞毒性实验，如图3所示可以得知没有出现细胞毒性。实验例1为了查看BFP 1的成骨细胞分化活性而进行了下列实验。1.成骨细胞及成骨细胞分化培养基的制备进行分注作业而把1X104个间充质于细胞(从Balb/c mouse bonemarrow cell 克隆)投入添加了 10%FBS的DMEM里后，在维持37°C左右温度且含有5% 二氧化碳的大气 中培养3天左右，制成了作为本实验所用成骨细胞的上述间充质干细胞。成骨细胞分化培养基(osteogenicdifferentiation medium，以下简称"ODM”) 是由添加了抗坏血酸50 u g/ml、地塞米松10_8M及3 -甘油磷酸10Mm等物的DMEM构成的。2.矿化作用的量测上述间充质干细胞分化成成骨细胞后就会积累钙，此时钙离子的积累程度可以指 出成骨细胞的分化程度，由于钙离子的积累程度可以通过茜素染色检查染红的程度即可得 知，因此利用茜素红染色方法量测了矿化作用。也就是说，成骨细胞分化程度越高，被茜素 红染红的部分越多。因此，把茜素红投入成骨细胞分化培养基后同时处理具有图1所示序列的BFP 1 后，即可根据茜素红的染色程度来判断成骨细胞分化程度。这是因为成骨细胞分化程度越 高，被茜素红染红的部分就越多。更具体地说，首先把事先备妥的成骨细胞，亦即间充质干细胞移到上述成骨细胞 分化培养基上培养3天后，分别添加0. 1 u g/mlUu g/ml,2 u g/ml的BFP 1后再多培养2天。然后，通过用冰冷却的70%乙醇使培养完毕的上述间充质干细胞固定一小时，利 用茜素红s (alizarin red-s)溶液染色10分钟左右后，通过钙的沉积程度确认无机化并把其结果显示在图4。通过茜素红染色对本发明的源于BMP-7的15个氨基酸序列肽(BFP1)在成骨细胞 分化过程积累的矿化作用进行了量测，图4是其结果照片。由图4得知，投入了 lyg/ml的 BFP 1的细胞的染色效果最强，利用BMP-7检查成骨细胞分化时，染色程度会低于合成后的 BFP 1。由此可以得知BFP 1可以促进成骨细胞分化。图5是源于BMP-7的15个氨基酸序列肽(BFP 1)所生成的成骨细胞特定基因I 型胶原、碱性磷酸酶、Rimx 2基因的表达量测结果图。分化成成骨细胞后成骨细胞特定基因就会得到表达，利用最新技术实时荧光定量 PCR(real-time PCR)检查上述基因表达后发现，以投入成骨细胞分化培养基后表达出来的 基因设定为100%时，I型胶原在1 y g/ml可以得到171%的基因表达，碱性磷酸酶在1 ii g/ ml可以得到241%的基因表达，Runx2在1 y g/ml浓度可以得到178%的基因表达。实验例2间充质干细胞含有可以分化成骨、软骨、脂肪组织、肌肉、腱、韧带、神经组织及血 管的各种表面蛋白质。本实验在各种表面蛋白质中选择了在上述间充质干细胞分化成成骨 细胞时出现的特定表面蛋白质⑶44、⑶51、⑶47及⑶45并且FACS分析对其表达程度进行 了量测，确认了本发明的BFP1所造成的影响，图6是其结果。首先，图6是通过FACS分析方法对源于BMP-7的15个氨基酸序列肽(BFP 1)在成 骨细胞分化时的细胞表面标记表达进行调查的结果(浅灰色-0DM单独；浓灰色-0DM+BFP 1)，如图6所示，间充质干细胞上表达的细胞表面标记CD44在添加成骨细胞分化培养基后 分化成成骨细胞的过程中会出现强烈的表达。而且，投入成骨细胞分化培养基与1 P g/ml的BFP 1时，⑶44的表达更为强烈。而且，在成骨细胞分化中表达的⑶51表达方面，把成骨细胞分化培养基BFP 1 一 起投入时的表达比仅投入成骨细胞分化培养基时的表达强了很多。图7是通过荧光显微镜对源于BMP-7的15个氨基酸序列肽(BFP 1)所造成的细 胞表面标记CD44的表达进行观察的结果。为了在细胞分化中通过查看⑶44的变化以确认细胞的生存，在荧光显微镜下通 过对核染色后呈蓝色的DAPI染色以及结合⑶44后呈红色的⑶44抗体进行观察。首先可以观察到核染色呈蓝色的染色现象，⑶44的染色较粗，经过对该染色的重 叠观察后得知CD44可以在细胞上表达。而且，与单独使用成骨细胞分化培养基的情形相 比，在成骨细胞分化培养基上投入BFP 1时⑶44可以更强烈地表达。使BMP-7的浓度与 BFP 1相同后置于荧光显微镜下观察后发现，其染色较弱于合成后的BFP 1。图8是使用源于BMP-7的15个氨基酸序列肽(BFP 1)进行成骨细胞分化时利用 商用诊断试剂盒对成骨细胞特定酵素碱性磷酸酶(ALP)与钙浓度进行观察的结果，可以得 知在BFP 1 lug/ml的浓度下显著地增加。图9是利用荧光显微镜对成骨细胞特定基因之一的骨钙素进行观察的照片，和具 有同一浓度的BMP7相比，BFP1可以更强烈地表达。此时，PI或DAPI通过对细胞核的观察 而显示出细胞的生存，目标因子则通过和FITC的结合而显示出在细胞上的表达。图10是利用荧光显微镜对成骨细胞特定基因之一的碱性磷酸酶进行观察的照 片，和具有同一浓度的BMP7相比，BFP1可以更强烈地表达。
图11是利用荧光显微镜对成骨细胞特定基因之一的Rimx 2进行观察的照片，和 具有同一浓度的BMP7相比，BFP1可以更强烈地表达。图12是本发明BFP 1和荧光物质FITC结合并且在细胞上处理后观察的照片，上 述实验的目的是对于由本发明合成的BFP 1在细胞上发挥的作用进行观察，使BFP 1和荧 光物质FITC结合并且在细胞上处理后观察，可以发现BFP 1如图12所示进入了细胞里面。图13是间充质干细胞分化成成骨细胞时为了观察细胞的移动而进行趋化性 (chemotaxis)实验法后的结果图。亦即，在间充质干细胞的各分化培养基上利用分化因子(BMP 7与BFP 1)进行处 理后观察BMP 7所驱动的细胞移动时，如图13所示，BFP1所驱动的分化细胞比BMP 7所驱 动的分化细胞移动的更多，亦即由本发明制作的BFP 1所分化的成骨细胞比利用BMP 7分 化的成骨细胞移动的更多，由此结果可知，可以在骨缺损之类的疾病中驱使成骨细胞快速 地移动到受伤部位。从上述实验结果得知，本发明骨形成促进用合成肽BFP 1比促进成骨细胞分化的 现有BMP-7更能促进成骨细胞分化，因此可以更加有效地诱导骨形成。因此，把含有BFP 1的合成肽作为有效成分的药物组合物投入发生了骨质疏松症 及/或骨关节炎的骨髓部位时，可以促进骨髓的成骨细胞分化及骨形成，从而有效地治疗 骨质疏松症及/或骨关节炎。而且，把含有BFP 1的合成肽作为有效成分的药物组合物填入或投入骨缺损疾病 的骨缺损部位，可以有效地进行骨修复。而且，把含有BFP 1的本发明骨形成促进用合成肽添加到成骨细胞分化培养基组 合物时，实验者可以在利用成骨细胞进行实验时调节实验速度，从而轻易地进行实验。产业上的用途前文结合附图与较佳实施例对本发明做了详细说明，但其仅是对本发明所做说明 而不是限定本发明，在本发明的技术思想范畴内，可以根据本发明的详细说明而实现各种 变形及修改，这对于本领域技术人员来说是非常明显的。序列表的非关键文字(Sequence Listing Free Text)Gly-Gln-Gly-Phe-Ser-Tyr-Pro-Tyr-Lys-Ala-Val-Phe-Ser-Thr-Gln
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权利要求
一种成骨细胞分化或骨形成促进用合成肽，其特征在于包括了存在于BMP-7的序列号为1的下述肽或其相同物[boneforming peptide 1(BFP 1)]。<序列号1>Gly-Gln-Gly-Phe-Ser-Tyr-Pro-Tyr-Lys-Ala-Val-Phe-Ser-Thr-Gln
2.根据权利要求1所述的成骨细胞分化或骨形成促进用合成肽，其特征在于 每成骨细胞的上述合成肽的添加含量为0. 1到g/ml。
3.一种骨质疏松症治疗用药物组合物，其特征在于其有效成分是包括了存在于BMP-7的序列号为1的下述肽或其相同物[bone forming peptide 1(BFP 1)]的合成肽。 〈序列号1>Gly-Gln-Gly-Phe-Ser-Tyr-Pro-Tyr-Lys-Ala-Val-Phe-Ser-Thr-Gln
4.一种骨关节炎治疗用药物组合物，其特征在于其有效成分是包括了存在于BMP-7的序列号为1的下述肽或其相同物[bone forming peptide 1(BFP 1)]的合成肽。 〈序列号1>Gly-Gln-Gly-Phe-Ser-Tyr-Pro-Tyr-Lys-Ala-Val-Phe-Ser-Thr-Gln
5.一种骨缺损疾病治疗用药物组合物，其特征在于其有效成分是包括了存在于BMP-7的序列号为1的下述肽或其相同物[bone forming peptide 1(BFP 1)]的合成肽。 〈序列号1>Gly-Gln-Gly-Phe-Ser-Tyr-Pro-Tyr-Lys-Ala-Val-Phe-Ser-Thr-Gln
6.一种成骨细胞培养基组合物，其特征在于其有效成分是包括了存在于BMP-7的序列号为1的下述肽或其相同物[bone forming peptide 1(BFP 1)]的合成肽。 〈序列号1>Gly-Gln-Gly-Phe-Ser-Tyr-Pro-Tyr-Lys-Ala-Val-Phe-Ser-Thr-Gln
全文摘要
本发明公开了一种成骨合成肽，其源自骨形态发生蛋白-7，并由15个氨基酸残基的序列构成(BFP-1)。本发明还提供了含有所述成骨合成肽的药物组合物及培养基组合物。由于在促进成骨细胞的分化方面具有显著活性，所述成骨合成肽在骨质疏松症、骨缺损疾病及/或骨关节炎的治疗方面非常有用。
文档编号A61K38/10GK101868245SQ200880012119
公开日2010年10月20日 申请日期2008年10月15日 优先权日2008年5月16日
发明者尹择林, 金亨根, 金枝贤 申请人:全南大学校产学协力团