多聚体缀合物的利记博彩app

专利名称：多聚体缀合物的利记博彩app
多聚体缀合物
本发明涉及一种多聚体试剂和由该多聚体试剂和生物活性试剂形成的 多聚体缀合物。所述多聚体缀合物与未修饰的生物试剂相比，具有较长的 体内寿命和提高的亲和力。本发明还涉及包含所述缀合物的药物或诊断组 合物，及其生产方法。本发明另外提供所述缀合物用于检测、确定、分开 和/或分离特异性结合配偶体以及用于诊断、预防和治疗其中直接或间接涉 及所述特异性结合配偶体的疾病的用途。
背景技术：
在过去的几十年中，作为应用于工业和科学的药物物质或生物技术产 品的生物药物的开发已经获得迅速进展。已经确定、开发、或已经市场销 售了许多选自肽、蛋白质、核酸或小分子类型的生物活性试剂。
治疗法开发的主要商业兴趣包括生长因子及其受体如TNF、 VEGF或 EGF。此外，具有抗原结合活性的生物活性试剂，如抗体、抗体片段、抗 体样分子、和支架蛋白己经获得了显著实用性。
多克隆抗体的生产普遍己知。详细流程可以在下列文献中发现例如， Green等，多克隆抗血清的生产(Production of Polyclonal Antisera)，在免瘦 化^"^"^^(/mwwwoc/7em/ca//Votoco/力中(Manson， 编辑),第1-5页(Human 出版社(Humana Press) 1992)以及Coligan等，兔、大鼠、小鼠和仓鼠中的 多克隆抗血清生产(Production of Polyclonal Antisera in Rabbits, Rats, Mice and Hamsters),在观/fj^疫学》^"徵CM;rew/ /VotocoAs /wwwno/ogy)中,第 2.4.1部分(1992)。另外，几种关于纯化和浓縮多克隆抗体以及单克隆抗 体的技术是熟知的(Coligan等，第9单元，观/f^疫学流荐(C鮮^ Pratoco/s/" 7mmw7o/ogv)， Wiley Interscience， 1994)。
单克隆抗体的生产也是普通已知的。实例包括杂交瘤方法(Kohler和 Milstein， 1975,,256:495-497, Coligan等.，第2.5.1 - 2.6.7部 分；禾卩Harlow等.，^"J^皇^^(J"^)oWeiv爿丄a60rato^y7Wi3m/a/),第726页(Cold Spring Harbor出版社(Cold Spring Harbor Pub.)1988).)、三体 瘤(trioma)技术、人B-细胞杂交瘤技术(Kozbor等.，1983，今日免疫学 (Immunology Today) 4:72)，以及用于生产人单克隆抗体的EBV-杂交瘤技 术(Cole,等.，1985，在单克隆抗体和癌症治疗(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy)中，Alan R. Liss, Inc.,第77-96页)。
尽管由抗体提供的成功和可能性，但是某些缺点可以限制实际应用。 因而，问题在于以充分的量提供它们功能性抗体的生产在真核细胞培养 系统中进行-特别高成本的方法。此外，分别由于其大尺寸和其在血清中的 长的保留时间(慢的血液清除)的抗体分子的低的组织渗透性妨碍许多治疗
应用。尽管较小的抗体片段诸如scFv或Fab片段(参见以上)可以在细菌中 制备并由此基本处于较低的成本，但是该重组生产的收率低于理想水平， 这归因于它们不利的折叠特性和需要形成若干二硫键。而且，重组抗体片 段与亲本抗体相比，通常不太稳定，并显示较低的结合活性。
为了规避所述限制，试图提供抗体结合的原理-即通过位于保守蛋白支 架上的高变表面-暴露区-与其它蛋白的结合(Skerra, 2000)。这意味着基本 可变环改变，从而产生人工结合性质。为了该目的，通常天然结合蛋白， 诸如脂笼蛋白(Beste等.，1999)或纤连蛋白III型结构域(Koide等.，1998)已 经被用作以类似于来自柔性"环"结构的抗体的方式形成结合位点的起始 点，所述柔性"环"结构的修饰容许识别不同于天然配体的配体。
除DNA衍生的结合分子即所谓的适体外，抗体的另一个备选方案可 以是选自由"泛蛋白-样蛋白"的蛋白超家族的蛋白组成的组中的结合分子， 具体地，具有泛蛋白-样折叠基序的那些，以及其各自具有泛蛋白-样折叠 基序的片段或融合蛋白。WO2004/106368涉及该"泛蛋白-样蛋白"的超 家族的修饰蛋白，即具有泛蛋白-样折叠的蛋白。作为所述修饰的结果，该 蛋白具有先前不存在的关于预定结合配偶体的结合亲和性。也通过参考将 WO2004/106368的内容引入本文。
对于支架衍生的结合蛋白，有效的是，由于在蛋白表面上形成邻近区 域的那些氨基酸的修饰，所述结合蛋白在该蛋白的至少一个表面-暴露区域 中优选具有先前不存在的关于预定结合配偶体的结合亲和性，同时维持原 始折叠基序。总之，证明的是，抗体或适体的可能备选方案因而是具有抗体样结合 行为的--组蛋白。
然而，仍存在关于抗体、抗体片段、和抗体样分子诸如支架蛋白治疗 用途的主要限制，原因在于其与天然人抗体相比的快速肾排泄、或弱溶解 性、或免疫原性、或降低的结合亲和性和/或亲和力。
由于该原因，进行了许多尝试，以改进所述常规具有远低于50,000道 尔顿的分子量的抗原结合蛋白的药理学性质。综述出版在自然生物技术 (Nature Biotechnology),第21巻，第4号，2006: 1126-36或自然综述免疫 学(Nature Reviews Immunology),第6巻，2006: 343 -357中。
PEG化(PEGylation)，即聚(乙二醇)(即PEG)与生物活性试剂的共价附 着，已经应用于许多蛋白和抗体片段中，从而降低其免疫原性并增加其在 血浆中的循环时间0^i^生激/f法^^i/丝药激(C47VC五i S/OT77EW户r & i /lD/0尸/^i M4C五LT/C4丄》，第"泰第4号，2W6: 2S5-3W」。然而， 在许多情形中，PEG化通过双阻断机理(dual blocking mechanism)导致减小 的靶缔合率(分7^"齊辨Afo/尸/zarmaco"，第68巻，2005: 1439-1454)。 Chapman, AP提供了关于PEG化对多种抗体或抗体片段的不同效果的详 细综述(观/f J ^^逮送《貢^^(^Aa"cedDrag De"veo; Aev^w」，第54巻，2002: 531-545)。
另一种用于增加抗体样片段的半衰期和亲和力的方法是两种以上的所 述制剂通过引入分子间二硫键、肽连接体或化学交联剂的多聚化。与单体 Fab相比，己经对二-和三聚'Fab片段示范了关于化学交联重组抗体片段的 改进的肿瘤靶向(targeting)。然而，Fab片段的半衰期不能通过该方法改善 (癌症研究(Cancer Res.)(1994); 54 (23):6176-85)。
多聚化和PEG化均代表调整治疗抗体的药物动力学性质的有用策略， 且它们的组合应用可以另外改进肿瘤靶向(生物化学杂志(JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY)第281巻，第46号，第35186—35201页，2006 年11月17日)。然而，随后的抗原结合试剂的交联和PEG化过程是复杂 的，且因此具有某些关于收率和成本的缺点。
因此，尝试在一种多聚体试剂中组合多聚化和PEG化。关于这方面， 公开了若干方法。
8US 2003/0211078涉及结合生物分子的新型制药用组合物及其使用方 法，所述组合物具有改进的循环半衰期，增加的亲和力，增加的亲和性， 或多功能性。公开了假-抗体，其包括与至少两个靶-结合部分共价偶联的 有机部分，其中所述靶-结合部分选自由与特异性靶向的生物分子结合的蛋 白、肽、肽模拟物(peptidomimetic)、禾口非-肽分子组成的组。这种假-抗体 构建体(constmct)的实例显示出具有若干靶结合分子的多聚体结构，其通过 一个单一的PEG部分连接。
WO03/093346涉及具有复杂支化结构的高分子量多官能聚乙二醇衍 生物。由合成方案1和2以及WO03/093346的权利要求1显而易见，这 种分子的核结构通过将活化的PEG与杂-三-官能分子诸如2-氨基-l,3-丙二 醇或1,3-二氨基-2-丙醇反应而产生。这样，所述多官能聚乙二醇衍生物的 应用受到限制。
由US2005/0175620已知所谓的价平台分子(valency platform molecules)
和其制备方法，所述价平台分子包括高分子量聚乙二醇部分以及其具有生 物活性分子的缀合物。高分子量聚乙二醇部分具有，例如，大于22,000 道尔顿，例如，至少40,000道尔顿的分子量。在一个实施方案中，提供包 括价平台分子的组合物，其中所述分子具有小于约1.2的多分散性。还提 供了价平台分子和生物活性分子如糖、聚(糖)、氨基酸、聚(氨基酸)、核酸 或脂质的缀合物。因此，该引用仅描述了用于延长较低分子量的生物活性 试剂的半衰期的高分子PEG试剂。然而，.这种高分子PEG试剂不适合于 增加生物活性结合分子如抗体或抗体样蛋白的亲和力。
WO2005/061005描述了支化分子支架，其能够将两个聚合物残基(例如 源自聚乙二醇)连接到2、 3或4个源自生物活性分子(例如，来自完整抗体 或来自其功能活性片段或衍生物)的残基，后者经由水解稳定键附着到所述 支架。
WO03049684提供了包括与至少2个靶-结合部分共价偶联的有机部分 的假-抗体，其中所述靶-结合部分选自由与特异性靶向的生物分子结合的 蛋白、肽、肽模拟物、和非肽分子组成的组。所述假-抗体可以在体外、原 位和/或体内影响特异性配体。
公开了一些多聚体试剂利用氨基酸诸如赖氨酸残基作为支化单元。Galande, A.K.等利用多抗原肽(MAP)体系作为核支化单元制备了多聚体成 像探针(,学众学^^志C/ M^. C7zem人第49巻，2006: 4715-4720)。这种多 聚体试剂的应用局限于特殊应用。Berna, M.等通过使多赖氨酸残基与PEG 反应制备了单分散的PEG-树枝状大分子(Dendrons)(全激大分7 (5z'omflcramo/ecw/e^，第7巻，第1号，2006: 146-153)。然而，随着赖氨酸 残基数量的增多，肽键数量增多。这些肽键可能易于被肽酶水解并且进而 被免疫系统识别，由此产生不理想的副作用。此外，氨基酸和肽的制备通 常涉及微生物生产过程。因此，那些原料具有被微生物物质诸如毒素污染 的风险。
基于PEG化的聚酰胺型胺类(PAMAM)的多聚体试剂由Yang， H.和 Lopina, S.T.公幵(生激,学^W,^ 染志A'omW. / 饥々，第76 巻，第2号，2006:398-407)。 PAMAM常规具有超过30个游离氨基并因此 仅用于大量生物活性分子的多聚化。此外，几乎不可能获得具有用于基于 PAMAM的生物活性分子的附着位点的规定数量的均匀质量。
公开了许多多聚体同官能(homofunctional)PEG分子，其基于多元醇作 为中心核单位，诸如甘油或季戊四醇。这种多聚体同官能PEG分子通过 威兼逊(Williamson)醚合成或通过中心单元的羟基的乙基氧化制备。这两种 合成策略均导致PEG和中心支化部分之间的醚键。相关专利引用如下
WO03/033028要求保护了一种包含非-蛋白聚合物如PEG的分子，其 具有至少3个与其连接的蛋白。中心非-蛋白聚合物的结构基于如实施例1 中公开的聚甘油(Shearwater聚合物公司(Shearwater Polymers Inc.))。关于 该非-蛋白聚合物的结构细节，我们参考WO01/62827。
Shearwater公司的WO01/62827公开了直接结合到N-马来酰亚胺基部 分的氮的同官能多聚体非-肽聚合物。支化单元选自由甘油、甘油低聚物、 季戊四醇、山梨醇、和赖氨酸组成的组。后者仅适合于制备二-或三价多聚 体试剂。所有其它的支化单元需要以上提到的反应并以醚键结束，如用于 制备4-臂10kDaPEG马来酰亚胺的WO01/62827的实施例4中所示的。
W095/25763公开了利用季戊四醇作为中心支化单元、通过威兼逊醚 合成制备的树枝状大分子(dentrimeric)-型的大分子。这种合成的收率相对 低，这使得该方法不太具有商业应用的吸引力。Stein等公开了通过使用来自Shearwater聚合物的8臂支化氨基-PEG 的多-肽缀合物的制备(f激缀合激众辨^'oco"y"ga&C72渭.)第14巻，第l 号，2003: 86-92)。后者通过聚甘油的乙氧基化制备(关于细节，参见 Shearwater产品目录，此外我们参考WO01/62827)。
之前引用的关于基于多元醇的多聚体试剂的公开内容均具有显著的由 结构确定的缺点
a) 威兼逊醚合成导致基本上均匀的多聚体试剂，然而，这种反应的收 率非常低并使得该方法不具商业应用的吸引力。
b) 乙氧基化导致高收率的最终产物，然而，由于多聚化过程，由此产 生的多聚体试剂常规显示出不利的高度质量变化，并且不可以以规定的低 分子量获得。
尽管上述成功，理论上，4个生物结合分子的多聚化可以通过利用四 官能PEG获得，这不是实践选项，因为适合于制药应用的均匀的四官能 化PEG不易获得(免疫学方法杂志(J Immunol. Methods)2006第310巻 (1-2): 100-16)。
总之，仍存在对具有四个或更多附着位点的多聚体试剂的巨大需求， 所述多聚体试剂具有均匀的性质，可变的连接体长度、和规定的反应基数 量，此外能够增加溶解性，调节分子量，以及改进缀合物与其生物活性分 子的亲和力。
发明概述
因此，本发明的一个目的是提供一种多聚体结合试剂和由其获得的多 聚体缀合物，其具有改进的体内性质，例如，减小的肾排除，并且其与单 体结合分子相比导致减少的体内所述缀合物剂量。本发明的另一个目的是 提供一种多聚体结合试剂，其包含显示出与单体结合分子的亲和力相比更 高亲和力的缀合物。此外， 一个目的是提供生产那些试剂和构建体的方法， 以及后者在体外应用，例如，确定、分开和/或分离相应的结合配偶体中的 用途，或在体内应用，例如，在诊断、预防和治疗其中直接或间接涉及相 应结合配偶体的疾病中的用途。
这些目的是通过独立权利要求的主题实现的。优选的实施方案记述在从属权利要求中。
存在对定义明确的多价聚合物试剂的需要，所述明确的多价聚合物试 剂能够将活性试剂，特别是生物活性试剂多聚体化。本发明满足该要求。
根据本发明，意外地证明，这种多聚体试剂中使用的已经相对短的聚 合物链可以导致亲和力的大幅增加。因此，本发明的多聚体缀合物意外地 对相应结合配偶体表现出显著增加的结合亲和力。作为实例，与单体PEG
化结合分子相比，四聚体缀合物(包含四聚体化的PEG化的结合分子)导致 亲和力作用增加至少多于30倍。此外，意外证明，己经小的合成起始材 料可以用于在非常有效的汇集合成中制备根据本发明的多聚体试剂。
总之，本缀合物显示出意外的和改进的结合特性，其可以在体内和体 外应用中使用。
发明详述
根据第一方面，本发明提供一种下式的多聚体试剂 Z-(X-Pol-Y)n
糾
Z是同官能-多官能烃，优选是支化的，具有l-50个碳原子，其任选包 含杂原子；
X是具有l-15个，优选2-10个，更优选3-5个碳原子的烃连接体，其 任选含有杂原子并其能够在Z和Pol之间形成稳定的键； Pol是水溶性无毒聚合物； Y是能够偶联到生物活性试剂的偶联剂，和 n是来自4-20，优选4-15，更优选4-8的整数。
Z优选选自寡月安(oligoamines)、寡幾酸(oligocarboxylic acids)、寡硫醇 (oligothiols)、寡烯(oligoalkens)、寡炔(oligoalkynes)、寡肼(oligohydrazines)、 寡叠氮化物(oligoazides)。
注意到Z优选不选自天然化合物，诸如肽化合物和氨基酸化合物。证 明的是，由于使用那些化合物，杂质被引入到反应混合物中，从而导致不
12希望的作用。在实践应用中，这可以意味着降低的产物收率，质量变化，
以及微生物毒素污染。因此，z优选通过从同样是合成材料的化学纯合成
起始材料的合成制备。
在其它优选的实施方案中，Z是非手性的。证明通过利用那些化合物， 多聚体试剂的缀合物可以与手性药物形成非对映异构体。如果药物具有低 的分子量，则这具有特别的相关性。这种非对映异构体具有不同的物理化
学性质并且经常显示出不同的关于其体内活性的药理性质。因此，非对映 异构体在药物制备中是非常不理想的。
注意的是，化合物的这些组对应于用于多聚体试剂合成中的z的起始
材料，并且不必然反映Z在最终化合物Z-(X-Pol-Y)n中的精确化学结构。 例如，如果Z是寡胺，则在最终合成的结构Z-(X-Pol-Y)n中，X可以例如 是酰胺-连接体(如下定义)。
特别优选的是寡胺，诸如1,2-乙二胺、二亚乙基三胺、三亚乙基四 胺、五亚乙基六胺、四亚乙基五胺、亚丙基胺诸如双(2-氨基丙基)-胺、环 聚胺诸如1,4,7-三氮杂环壬烷、1,4,7,10-四氮杂环十二垸、星状聚胺诸如 N l ，N l -双(2-氨基乙基)-l,2-乙二胺、多熔素和精胺，优选季戊四胺。
关于Z的其它同官能-多官能烃是寡羧酸、寡硫醇、寡烯、寡炔、寡叠 氮化物。
在一个优选的实施方案中，X选自由酰胺-、酉旨-、硫醚-、三唑-、脲-、 C-C-或氨基甲酸酯(urethan)-键组成的组，优选三唑-、酰胺-或酯-键。按照 本发明，酰胺-键是最优选的(符合以上用作Z的优选的寡胺)。
在本发明的多聚体试剂中，Pol优选是分子量<10,000 Da,更优选 <2,000Da,最优选〈,000Da的聚合物，或，换言之，在150 Da和IO，OOO Da之间的范围内。该范围非常重要，原因如下
如果Pol的分子量低于150 Da，则特别在其中大的生物分子与多聚体 试剂偶联的情况下可能发生位阻。因此，从本发明的观点来看，优选Pol 的分子量的较低范围是150Da。
注意到，特别地，具有低于2,000的分子量的Pol是优选的，因为， 在技术方面，那些聚合物可以以基本均匀的长度，即以"非-分散的 (non-dispersed)"性质获得。那些非分散的聚合物又将导致最终产物的优良特征和质量。
上限< 10,000 Da是可推荐的，鉴于生产成本将增加，反应时间将增加， 并且最重要地，在该情形中与多聚体试剂结合的单独生物活性试剂将像单 个分子一样表现。或者，换言之，如果Po1〉 10,000，则亲和力不能增加 太多。
在优选的实施方案中，Pol是聚乙二醇(PEG)。通过使用PEG化的分子， 可以利用PEG的突出特征，例如，无毒性，并且可以提供具有定制的分 子量的总缀合物，其通过不流过肾过滤屏障而减少缀合物从身体排除。
在另一个实施方案中，Pol是非-分散或低分散的。或者换言之，这包 括基本上无分子量的分布的分子，即该分子不是多分散的。
分散性的量度是多分散性指数(PDI)，其意指给定聚合物样品中的分子 量的分布。如上提及地，计算的PDI是重均分子量除以数均分子量。它表 示一批聚合物中单独分子量的分布。PDI具有总是大于1的值，但是当聚 合物链接近理想的高斯分布(=单分散性)时，PDI接近1。相反，通过分离 精确定义数量的乙二醇单元的PEG，例如通过顶替层析，PEG < 2000可以 以非-分散质量获得(US6245238)。
根据本发明，n是来自4-20,优选4-15,更优选4-8的整数。因此，将 n的下限规定为4。假定该数字对以充分增高的亲和力告终是关键的，如 果使用其中n=2或3的多聚体，则所述亲和力可能显著降低。在另一方面， n越高，则制备多聚体试剂的方法将越复杂。用于制备n〉20的多聚体试 剂的成本将过高，反应速率将过慢，并且物质Z不太可能以充分均匀性获 得(即，不是多分散的)。n还可以在4-8、 4-7、 4-6或4-6的范围内。此外， 它可以是4、 5、 6、 7或8。
在一个优选的实施方案中，Y分别独立地选自这样的化合物的组，所 述化合物可以与氨基、巯基、羧基、胍基、羰基、羟基、肼基、炔基、杂 环、C-亲核体基、C-亲电子体基、磷酸酯或硫酸酯结合，或可以与金属形 成螯合物或络合物，或可以与表面如塑料、金、铜、或硅形成键。
Y执行使多聚体试剂随后偶联于生物技术或合成产物以及天然产物和 技术产物的功能，即根据本发明的化合物优选含有活化的官能团Y。在活 化的形式中，Y各自优选地独立选自由(0-烷基)2、 -08020 ^&(三氟代乙烷磺酰基)、(0-芳基)-叠氮化物、(O-垸基)-叠氮化物、O-炔-CO-Q、马来酰 亚胺基、-O-CO-硝基苯基或三氯苯基、-S-S-烷基、-S-S-芳基、-SOr烯基(乙 烯砜)或-卤素(Cl、Br或I)组成的组，其中Q独立选自由H,0-芳基、0-苄 基、O-N-琥珀酰亚胺、O-N-磺基琥珀酰亚胺、O-N-苯邻二甲酰亚胺、O-N-戊二酰亚胺、O-N-四氢苯邻二甲酰亚胺、N-降冰片烯-2,3-二羧酰亚胺、羟 基苯并三唑和羟基-7-氮杂苯并三唑组成的组。Y优选是-CO-Q基。出现在 生物缀合物化学(Bioconjugate Chem,)1995， 6， 150-165中的Zalipsky， S.的综 述提供了关于可能的活化的很好回顾。通过参考将该综述作为整体引入本 文。
活化官能团容许根据本发明的化合物与生物活性化合物共价结合，由 此形成高度理想的稳定缀合物。与结合分子的偶联优选通过活性分子中的 合适基团，例如，已经被引入到该分子中的半胱氨酸残基实现。
注意到，在一个实施方案中，本发明的多聚体试剂仅携带相等的关于 Y的化合物。这种类似活化的实例在下文中关于四聚体显示。然而，本发 明还提供这样的实施方案，其中在一个多聚体分子中使用不同类型的Y活 化，即不同的Y组，其独立选自上述组。
本发明的多聚体试剂例如具有下述结构
C137H260N8O60
精确质量2977,75 分子量2979,55
<formula>formula see original document page 15</formula>在第二方面，本发明提供一种多聚体缀合物，其中如上解释的多聚体
试剂经由Y组分偶联到生物活性试剂。
该生物活性试剂优选独立选自具有治疗或诊断相关性的肽、蛋白、核 酸或小分子。因此，在本发明的上下文中，所述缀合物可以包括相等的生 物活性试剂，或作为备选方案，可以包括一种或多种不同的独立选择的生 物活性试剂。
作为实例，所述生物活性试剂可以选自生长因子或其受体，如TNF、 VEGF、或EGF。在一个优选的实施方案中，所述生物活性试剂具有像抗 体、抗体片段、抗体样分子和支架蛋白一样的抗原结合活性。
术语"结合活性"用于本发明的上下文中时，意指对特异性靶分子具 有结合亲和性的分子。
更精确地，所述试剂可以是生物受体，优选G蛋白-偶联受体(GPCR; 例如人GLP-1受体、人PTH受体)、或EGF受体、HER2 、 HER3 、 VEGF/R1 -4、 Ep-CAM、或配体或其结构域、肿瘤标记(前列腺特异性膜抗原(PSMA))、 细胞因子(肿瘤坏死因子a(TNF-a)、肿瘤坏死因子J3(TNF-13))、白细胞介素 (例如IL-2、 IL-6、 IL-ll、 IL-12)、生长因子(例如NGF(神经生长因子)及其 前体-形式(pro-form)、 ProNGF、 BMPs、 EGF、 MIA、 MIA-2、 FGFs、血管 内皮生长因子(VEGF)、 PDGF、 P1GF、 IGFs)、激酶、整联蛋白(例如，糖 蛋白受体nb/ma(GPIIb/nia))、 HSA(人血清清蛋白)、F4丝束蛋白、T和B 细胞抗原，优选CD4、 CDll、 CD14、 CD16、 CD20、 CD22、 CD25、 CD34、 CD47、 CD56、 CD83、 CD154、 CTLA-4、免疫球蛋白或其部分，例如全抗 体、(例如免疫球蛋白G、 E、 M)、例如人免疫球蛋白M的Fc部分或抗原 结合位点区域中的抗体片段、或糖(路易斯(Lewis) Y、路易斯X)、或毒素 如真菌毒素、或激素如皮质醇。
另外的实例是活性试剂和靶向试剂(targetingaent)的组合，例如，氨基 羧基酯如饱和或不饱和co-氨基羧基酯、染料、荧光标记、抗生素、小或大 沟粘合齐U(minor or major groove binder)、生物素化自由基、链霉抗生物素 自由基、嵌入自由基(intercalatingradical)、烷基化自由基、类固醇、脂质、 聚胺、叶酸、受体激动剂或受体拮抗剂、酶抑制剂、肽、抗体或抗体片段、 氨基糖、糖或寡糖如半乳糖、葡萄糖或甘露糖、反义聚合物、改性表面、表面活性剂或络合剂。
如果使用抗体，则该抗体可以选自由多克隆抗体、单克隆抗体、人源 化抗体、嵌合抗体和合成抗体组成的组。
抗体可以另外连接到有毒和/或可检测的试剂。
术语"抗体"，在本文中用于指完整抗体以及抗体片段，其具有一些选
择性结合到表位的能力。这种片段包括，但不限于，Fab, F(ab')2和Fv抗 体片段。术语"表位"意指抗体的互补位可以与其结合的抗原的任何抗原 决定子。表位决定子通常由化学活性的表面分子基团(例如，氨基酸或糖残 基)组成，并通常表现出三维结构以及特异性物理性质。
如上提及地，多克隆抗体的生产普遍已知。详细流程可以在下列文献 中发现例如，Green等，多克隆抗血清的生产(Production of Polyclonal
Antisera)， 在免疫化学方案(/mmM"0c/2ewz'ca/ Pratoco/力中(Manson， 编辑)
第l-5页(Human出版社(HumanaPress) 1992)以及Coligan等，兔、大鼠、 小鼠和仓鼠中的多克隆抗血清生产(Production of Polyclonal Antisera in
Rabbits, Rats， Mice and Hamsters),在现/^^疫学》f樹Cwre"f尸ra ocofe /" /mm認o/ogv)中，第2.4.1部分(1992)。另外，专家熟悉若干关于纯化和浓 縮多克隆抗体，以及单克隆抗体的技术(Coligan等，第9单元，现代免疫学
流禾呈(CWreW尸ratoco/s /" 7mmM"o/ogy)， Wiley Interscience， 1994)。
单克隆抗体的生产也是普通己知的。实例包括杂交瘤方法(Kohler和 Milstein， 1975, ^然(A^we), 256:495-497, Coligan等.，第2.5.1 - 2.6.7部 分；禾口 Harlow等.，贫沐'实教皇手鐵j"/7.&。(i^.'爿丄a6orato^y Ma冊"/),第 726页(Cold Spring Harbor出版社(Cold Spring Harbor Pub.) 1988).)、三体 瘤(trioma)技术、人B-细胞杂交瘤技术(Kozbor等.，1983，今日免疫学 (Immunology Today) 4:72)，以及用于生产人单克隆抗体的EBV-杂交瘤技 术(Cole,等.，1985，在单克隆抗体和癌症治疗(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy)中，Alan R. Liss， Inc.,第77-96页)。
抗体或适体的优选备选方案是具有抗体样结合行为的蛋白组。所述蛋 白可以优选选自由晶体、内孢囊素、热激蛋白、冷激蛋白、p-螺旋蛋白、 脂笼蛋白、certins、纤连蛋白或转录因子或是GFP、NGF、靛胭脂(tendamistat) 或溶菌酶组成的组。具体地，结晶可以在用于设计新结合分子中起结合蛋白或起起始蛋白
的作用，所述新结合分子具有占优势的卩-片(beta-sheet)结构，诸如，具体
地，y-晶体，即目镜的结构蛋白。优选地，晶体源自脊椎动物、啮齿类动 物、鸟类或鱼类，且更优选地选自a-、 13-或y-晶体蛋白，更优选地，其是
y-n晶体蛋白。
关于这一点，参考US 10/030,605的公开内容，通过参考将其引入本文。
抗体或适体的另一种备选方案可以是选自由"泛蛋白-样蛋白"蛋白超 家族的蛋白组成的组的结合分子，具体地，具有泛蛋白-样折叠基序的那些， 及其各自具有泛蛋白-样折叠基序的片段或融合蛋白。WO2004/106368涉
及该"泛蛋白-样蛋白"的超家族的修饰蛋白，即具有泛蛋白-样折叠的蛋 白。作为所述修饰的结果，所述蛋白具有先前不存在的关于预定的结合配 偶体的结合亲和性。也通过参考将WO2004/106368的内容引入本文。
对于这两个结合蛋白组，有效的是，由于在蛋白表面上形成邻近区域 的那些氨基酸的修饰，所述结合蛋白在该蛋白的至少一个表面-暴露区域中 优选具有先前不存在的关于预定结合配偶体的结合亲和性，同时维持原始 折叠基序。
在另一个实施方案中，本发明的缀合物的总尺寸使得分子的肾排除显 著减慢。这可以通过提供具有总分子量> 50,000 Da的缀合物实现。因此， 通过使用该尺寸的缀合物，可以提供具有长期活性的长-循环化合物。这种 类型的缀合物优选用于治疗患者中的慢性病症。
作为备选的实施方案，可将总尺寸设置为小于50,000 Da，从而提供提 供相对短期活性的缀合物，由此特别适合于治疗急性病症。
本发明的多聚体缀合物与其衍生自的未修饰的生物活性试剂相比，优 选表现出增加的亲和力。如以上提及的，单体分子的亲和力在使用本发明 的缀合物结构时，可以增强约30倍。
在第三方面中，本发明提供一种药物或诊断组合物，其含有前述权利 要求中的一项或多项的多聚体缀合物和一种或多种辅剂和/或稀释剂。
因此，对于根据本发明修饰和选择的蛋白，可以使用广谱的可能应用。 它们不仅可以用在医学-制药领域中，还可以用在分析学、营养和食品工业、营养增补剂、化妆品、医学和非医学诊断和分析等领域中。自然地，应用 领域取决于所选择的结合配偶体的类型。
在人和兽医治疗和预防领域中，制药用药物可以通过本身已知的方法
制备。取决于盖伦制剂(galenic preparation),这些组合物可以静脉内、腹 膜内、肌内、皮下、经皮或通过其它施用方式施用。药物制剂的类型取决 于待治疗的疾病类型、疾病的严重性、待治疗的患者以及医学领域中的技 术人员己知的其它因素。施用可以通过注射或灌输，通过吸入或通过常规 使用的其它方法亲本进行的。
使所述组合物适应于包含治疗有效剂量。待施用的剂量的量取决于待 治疗的生物体、疾病的类型、患者的年龄和体重以及本身己知的其它因素。
该组合物可以包含本身已知的辅剂。这些包括例如稳定剂、表面活性 剂、盐、缓冲剂、着色剂等。
药物组合物可以采用用于局部或经皮施用的液体制剂、霜剂、洗剂的 形式，气雾剂，采用粉末剂的形式，采用乳剂或脂质体制剂的形式。该组 合物优选是无菌的、非-致热的和等张的，且包含本身已知的制药常规和药 用添加剂。另外，参考美国药典(U.S.pharmac叩oeia)的规则。
在第四方面中，本发明提供一种生产如上文所述的多聚体试剂的方法， 其通过使同官能-多官能试剂Z与同官能或异官能聚合物X-Pol-Y反应， 从而形成稳定的键并获得Z-(X-Pol-Y)n。
注意到该反应可以通过将X-Pol-Y与Z简单聚合.，或，作为备选方案， 通过如下略述的汇集合成进行。
汇集合成是一种策略，其目的是改进多步骤化学合成的效率。在线性 合成中，总收率随着每个反应步骤快速降低A — B — C —D。在汇集合 成中，反应时间表可以如下A —B;C —D;B + D —E，导致高得多的总 收率。汇集合成特别是在复杂分子的合成领域中具有优势，并且因此可以 特别用于本方法中。
在另一个方面中，本发明涉及一种制备如上定义的多聚体缀合物的方 法，其包括下列步骤
-将如上定义的生物活性试剂和多聚体试剂溶解在合适的溶剂中；
-使如本文中定义的多聚体试剂Z-(X-Pol-Y)n与所述生物活性试剂在
19相同的溶液中反应；禾口
-将所述多聚体缀合物纯化为基本上同质的制剂。 该方法中使用的溶剂优选能够溶解生物活性试剂和多聚体试剂二者。
溶剂可以选自但不限于极性或非极性溶剂，例如选自有机溶剂诸如DMF、 DMSO、醇、二氯甲垸、氯仿、THF、 DMA、乙酸乙酯或水性缓冲液体系 诸如硼酸盐、碳酸盐、三羟甲基氨基甲垸、磷酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐、 或甲酸盐缓冲液。
在该方法的第一步中，生物活性试剂优选以0.1-25 mg/ml，优选1-10 mg/ml的浓度溶解在溶剂中。溶剂具有在3和12之间，优选在4和10之 间，更优选在5和9之间的pH，并具有小于250 mM，优选在10和150 mM 之间，更优选在50和100 mM之间的缓冲盐的总浓度。其还可以包含添 加剂诸如盐、稳定剂、变性剂、和还原剂或氧化剂。
优选地，参考待多聚化的生物活性试剂的摩尔量，将多聚体试剂 Z-(X-Pol-Y)n以l:n以下的摩尔比加入到生物活性试剂的溶液中。
例如通过适当的搅拌或摇动，将步骤2中的反应溶液连续均化，并保 持在-20。C禾卩5CTC，优选(TC和37。C，更优选4。C和25"之间的温度。
在该方法的最终步骤中，将多聚体缀合物纯化为纯度>90重量％，更 优选>95重量％的基本上同质的制剂，且，优选地，纯化通过色谱法、沉 淀、或尺寸排阻诸如渗析或交叉流动过滤进行。
另一个方面提供一种可以通过以上方法获得的多聚体试剂和一种多聚 体缀合物。
本发明的多聚体缀合物可以用于诊断、预防和治疗其中直接或间接涉 及相应的结合配偶体的疾病。
在下文中，提供实施例进一步举例说明本发明。然而，本发明不局限 于此，且下列实施例仅基于以上说明显示本发明的实用性。为了完整公开 本发明，还参考本申请和附录中引用的文献，将其全部内容通过参考引入 本申请。
本发明进一步通过随后的实施例和


。附图显示如下
图1:单体Affilin 8A7与它的靶即人TNFa结合的浓度依赖性ELISA(圆 形)。将与BSA的结合绘制为参比(正方形)。图2:单体Affilin 8A7(正方形)和四聚体Affilin 8A7(圆形)与人TNFa 结合的浓度依赖性ELISA。将与BSA(三角形)和微量滴定板的结合绘制为 参比(菱形)。
图3:四聚体Affilin 8A7(正方形)和四聚体泛蛋白野生型(圆形)与人 TNFa结合的浓度依赖性ELISA。
图4:四聚体19H2 Affilin与TNFa结合的浓度依赖性ELISA。在四聚 体(A)的一个臂中包含11个PEG单元的构建体表现出与关于具有23个 PEG单元的四聚体的检测相同的KD值。
图5:八聚体19H2 Affilin与TNFa结合的浓度依赖性ELISA。 Kd值 随单体到二聚体、四聚体和八聚体而增加。
实施例
按照本发明多聚化试剂的实例
不依赖于多聚化试剂的最终结构和活化， 一般的合成策略是汇集的 (convergent),并且如下从中心的同-或异-官能的支化/核单元Z开始，使 用有效偶联化学物将同-或异官能的PEG Po/与所述核单元的近端反应。 在第二步中，活化PEG部分的近端，从而导致基团r。在优选的实施方案 中，反应步骤1中使用的同-或异官能的PEGPol在一个近端已经具有了反 应性官能团r或保护的反应官能团"。在下文中， 一般程序记述为由聚
胺开始，但引入不同的反应基团y。这些一般反应可以容易地转移至基于
不是寡胺的Z的多聚化试剂。
按照本发明，寡胺可以用作核结构，其与异双官能或同双官能PEG反 应，以形成多聚化试剂。季戊四胺核结构可以如Hayes等所述合成(四面体 (r"ra/ze^o") 2003, 59, 7983-7996)。备选的寡胺可以选自精胺、寡亚乙基 胺如二亚乙基三胺或寡亚丙基胺如双(2-氨基丙基)-胺的组。此外，寡胺还 可以是杂环寡胺的成员，例如三环萜(cyclen)。作为多聚化试剂中的间隔团 以及在PEG化试剂方面使用的PEG单元在大多数情形中可商购获得，否 则PEG单元可以从作为聚(乙二醇)或其衍生物的关键原料开始进行合成。 这种PEG单元的合成是化学家公知的。
由于其高收率，酰胺化反应在肽化学中长期已知。因此，在优选实施方案中，胺核和PEG-单元将在酰胺化步骤中偶联。PEG-单元在具有活性 官能团Y的近端活化。基本上，对Y没有限制，在生物制药学改良领域 中公知许多实例，并在别处被公开。
分别通过还原氨基化和可逆席夫碱形成，醛官能团可以用于生物试剂 的缀合。存在不同的方法以引入醛。最优选地，可商购的异双官能PEG 作为关键原料使用。
这些PEG与中心核单元Z反应后，通过使用特定氧化方法诸如斯文 (Swern)、或Pfitzner-Moffat氧化(基于活化的DMSO的方法)或TEMPO-氧 化，直接氧化PEG-链的羧基末端，以引入醛官能团。为了稳定性原因， 最有利的是使用在醛官能和PEG单元的近端之间具有相对长的碳链的醛。 这些醛例如可以是丙醛、丁醛、或醛羧酸(例如6-醛庚酸)的衍生物。在另 外的实施方案中，用縮醛保护的醛的卤素或磺酸盐衍生物将PEG链的羟 基末端烷基化(US5990237、 US5252714)。另一种方法是通过与氨基-PEG 衍生物的酰胺化反应引入co-醛羧酸衍生物。
备选地，醛官能可以通过使寡胺与NHS活化的PEG-醛衍生物直接引 入。在该情形中，醛官能可以是未保护的或缩醛保护的。缩醛保护基团可 以通过酸催化去除以形成寡醛，或通过在稍微酸性条件下进行的还原氨基 化过程中原位裂解去除。
引入叠氮化物官能
叠氮化物官能团可以容易地通过使例如寡胺与NHS活化的PEG-叠氮 化物衍生物反应引入。这种的PEG的叠氮化物衍生物可以通过将HO-PEG-酸的羟基官能转化为相应的叠氮化物制备。这种方法是化学家公知的。
用于形成作为马来酰亚胺活化的多聚化试剂的一般程序
向处于二氯甲烷(90 mL)中的MAL-PEG-NHS (5.4 mmol)的溶液中加入 处于DMSO(c = 500 mg/mL)和三乙胺(100 jiL)中的寡胺(1.4 mmol， 500 mg/ml)的溶液。然后，在20-25。C搅拌反应混合物48小时。搅拌程序后，物稀释反应化合物。然后，分离有机相， 并在真空中去除溶剂。通过柱色谱法的纯化提供了作为无色的粘稠的油或 白色固体的最终产物(收率50-80 %)。
用于形成作为醛活化的多聚化试剂的一般程序(参见实施例5): 寡醇形成(Oligoolformation):
向处于二氯甲垸(20 mL)中的异双官能HO-PEG-NHS(2.21 mmol)的溶 液中加入处于DMSO(c = 75 mg/mL)中的寡胺(1 mL; 0.55 mmol)的溶液。 然后，在20-25。C搅拌反应混合物12小时。搅拌程序后，在减压条件下去 除溶剂。通过柱色谱法的纯化提供了作为无色的粘稠的油的最终产物(实施 例3)(收率50%)。
氧化
在IO分钟内，向处于-78。C(干冰浴)中的干二氯甲烷(30 mL)和DMSO (500 iiL)的混合物中加入草酰氯(l.l mL;在二氯甲烷中2M， 2 mmol; 5.5 当量)溶液。在-78。C再搅拌反应混合物15分钟。随后，在15分钟内，在 -78°〇加入处于二氯甲垸(8 mL)中的寡醇(01igool)(实施例3, 0.37 mmol)的 溶液。在-78。C再搅拌40分钟后，加入三乙胺(700 pL)。
在-78。C再搅拌反应化合物2小时。然后，将反应化合物加热到25"C， 并真空中去除溶剂。通过柱色谱法的纯化提供了作为无色的粘稠的油的最 终产物(实施例4)(收率50%)。
实施例lC"lH248Ni2064
精确质M: 3133,65 分子量3135,52
MALDI-MS: m/z: 3134.6 [M+H]十；3156.8 [M+Na]十；3172.8 [M+K]十. 'H-NMR (400 MHz, CDCI3): 5 = 2.42-2.52 (16H); 2.93 (8H); 3.37-3.41 (8H); 3,48-3.54 (8H); 3.55-3.69 (176H); 3.71-3.77 (8H); 3.79-3.84 (8H); 6.48 (4H); 6.67 (8H); 7.63-7.67 (4H).
13C-NMR (100.6 MHz, CDC13): 5 = 34.42; 34.58; 37.41; 38.61; 39.31; 45.41; 67.25; 69.77; 70.24; 70.34; 70.56; 70.62 (OCH2信号);134.29; 169.87; 170.57; 172.82.
实施例2
<formula>formula see original document page 24</formula>
精确质量5246,91 分子量5250,04
MALDI掘m/z: 5269.79 [M+Na]+.
'H-顧R (400 MHz, CDC13): 5 = 2,42-2.52 (16H); 2.82 (8H); 3.37-3.41 (8H); 3.48-3.54 (8H); 3.55-3.64 (368H); 3.71-3.75 (8H); 3.79-3.83 (8H); 6.58 (4H);<formula>formula see original document page 25</formula><formula>formula see original document page 26</formula>C113H220N15O52 精确质量2633,51 分子量2635,03
26
实施例5
o
精确质量2977,75 分子量2979,55
MALDI-MS: m/z: 2978.74 [M+H]+; 3000.75 [M+Na]+; 3016.71 [M+K]+. 'H-画R (300 MHz, CDC13): 5 = 1.63-1.66 (16H); 2.17-2.22 (8H); 2.41-2.52(16H); 2.79-2.83(8H); 3.40-3.48 (8H); 3.50-3.55 (8H); 3.56-3.68 (176H); 3.70-3.76 (8H); 6.50 (4H); 7.65 (4H); 9.73 (4H). 13C-NMR (75.4 MHz, CDC13): 5 =21,69; 25.16; 36.06; 37.41; 39.35; 41.03; 43,68; 45.41; 67,26; 69.91; 69.96; 70,26; 70.34; 70.62; 172.82; 202,38.
实施例6 (叠氮化物)
N H
<
、<formula>formula see original document page 27</formula>
精确质量3193,51 分子量3195,39
关于Affilin 8A7的实施方案
利用本发明中所述的多聚体工具，已经制备了泛蛋白基Affilin分子的 四聚体。具有针对人TNFa的亲和性的Affilin 8A7选自根据专利 WO2004/106368的组合泛蛋白文库。由噬菌体展示进行3轮亲和性富集后， 变体8A7代表人工结合位点中的共有序列。因此针对其它特征选择变体， 并且在表达和纯化以后，通过ELISA测量与预定靶即人TNFa的结合。图 1显示了 8A7单体与TNFa浓度依赖性特异性结合信号。可检测到弱但特 异性的相互作用，其具有3 的表观解离常数(KD)。为了测试泛蛋白支架本身或多聚体试剂是否具有针对TNFa的非特异
性亲和性，生成泛蛋白四聚体作为参比。为了确保马来酰亚胺活化的四聚
体PEG-分子与8A7和野生型泛蛋白的特异性偶联，利用重叠延长连接将 表面暴露的侧链丝氨酸58在DNA水平替换为半胱氨酸第一 PCR包含 10 pl Pwo缓冲液(10x,罗氏(Roche)), 2 (il dNTPs (10 mM,罗氏(Roche)), 1 pi Fl引物(IOO (iM), 1 pi SPWS57Crev引物(IOO |aM), 1 pl模板(处于 pET20b+中的8A7或泛蛋白，1:5稀释)，1 pl Pwo聚合酶(250 U，罗氏 (Roche))和84 pl无RNA酶的水。第二 PCR: 10 )il Pwo缓冲液(10x,罗氏 (Roche))， 2 )il dNTPs (10 mM,罗氏(Roche)), 1 pl SPWS57CfW引物(100 ,,1 nl pET20b+rev—助引物(100 ^M), 1 |ul模板(处于pET20b+中的8A7 或泛蛋白，1:5稀释)，1 |il Pwo聚合酶(250 U,罗氏(Roche))和84 |il无 RNA酶的水。这两个PCR利用下列流程运行94。C变性l分钟，随后进 行25次循环的变性(94。C,30秒)、退火(65。C，45秒)和延长(72。C, 40秒)。 25次循环后，最后的延长步骤进行5分钟(72t:)。由此产生的PCR片段利 用PCR纯化试剂盒(Quiagen, Hilden)纯化。这两个片段用在最后的PCR中， 所述PCF包含10 )al Pwo缓冲液(10x,罗氏(Roche)), 2 (al dNTPs (10 mM, 罗氏(Roche)), 1 pl Fl弓|物(100 ^M)， 1 pl WUBIFlagXhoIrev引物(100 pM)， 2 pi来自PCR 1的模板，2 |il来自PCR 2的模板，1 )ul Pwo聚合酶(250 U,罗氏(Roche))和81 ^无RNA酶的水。该PCR利用以上己经描述的PCR 程序运行。PCR后，产物利用PCR纯化试剂盒(Quiagen)纯化，并用Xbal 和Xhol消化。消化进行如下8 |il PCR片段(第三PCR), lplXhoI (普洛麦 格(P腿ega)), 1 pi Xbal (普洛麦格(Promega)), 2 jal BSA (10x,普洛麦格 (Promega)),2pl缓冲液H(罗氏(Roche))和6pl无RNA酶的水。混合物在 37。C温育3小时。pET20b+载体(Novagen)也用Xbal/Xhol消化，所述 Xbal/Xhol为2 ^ Xhol (普洛麦格(Promega)), 2 pi Xbal (普洛麦格 (Promega)), 2 )il BSA (10x,普洛麦格(Promega)), 2 |il缓冲液H (罗氏 (Roche)), 6 )il pET20b+载体和6 ^无RNA酶的水。混合物又在37。C温育 3小时。消化的PCR片段和载体通过凝胶提取纯化。PCR片段利用2 % NuSieve琼脂糖凝胶运行，且载体利用0.6 % SeaKem琼脂糖凝胶分离(二 者均来自BMA)。从凝胶中切割下片段，并利用凝胶提取试剂盒(Qukgen)提取DNA。纯化的片段用在连接反应中3 pi PCR片段，1 pl pET20b+载 体(Xbal/Xho1切割的)，1 T4连接酶(普洛麦格(Promega)), 2 pl T4连接酶 缓冲液(普洛麦格(Promega))和13 |il无RNA酶的水。连接在6。C温育过夜， 并且然后利用MinElute清除试剂盒(Quiagen)纯化。纯化的载体用于通过电 穿孔转化Nova蓝细胞。电穿孔后，将细胞涂布在含有100吗/ml氨苄青 霉素的LB-琼脂板(LB/Amp)上并在37。C温育过夜。
DNA序列分析显示从丝氨酸57到半胱氨酸的正确替换(见附录)。为 了表达8A7和泛蛋白，通过用LB/Amp稀释预培养物1:100，将克隆培养 在1.5L摇瓶中，并在37'C，以200rpm搅拌该培养物直到600nm处的光 学密度(OD6oo)为0.5。表达通过添加IPTG(最终浓度lmM)诱导。培养在 30。C和200 rpm下持续4小时。细菌细胞通过在4°C, 6000 x g离心20分 钟收获。将细胞沉淀混悬在30ml包括核酸酶(benzonase)和溶菌酶的 NPI-20缓冲液中。细胞通过在冰上进行超声波(3x20秒)破裂。在4。C和 40000x g离心混悬液30分钟后获得包含可溶性蛋白的上清液。两种与6 个组氨酸残基融合的蛋白通过室温下的亲和性层析纯化。用50 ml包括5 mM巯基乙醇(P-ME)的NPI-20平衡Ni-琼脂糖(5 ml, GE卫生保健(GE Healthcare))柱。将包含可溶性蛋白的上清液应用于该柱，随后进行使用 NPI-20 ((3-ME, 50 ml)的清洗步骤。以线性梯度到50 % NPI-500 ((3-ME)将结 合的蛋白洗脱到100ml中。通过SDS-PAGE，针对它们的纯度分析馏分。 汇集合适的馏分，并将其以lml/min流速应用于用包含10mMDTE的PBS (pH 7.4)平衡的凝胶过滤柱(Superdex 75， 1.6 x 60 cm, GE卫生保健(GE Healthcare))。汇集纯化的蛋白，并将其应用于用偶联缓冲液(50 mM磷酸 盐，pH 7.0)平衡的2x5ml Hitrap脱盐柱(GE卫生保健(GE Healthcare))。然 后，加入马来酰亚胺活化的四聚体PEG分子(按照权利要求8，实施例l)， 直到蛋白:PEG摩尔比为4:1。混合物在25。C温育2小时，并且然后通过在 25。C加入卩-ME 30分钟到最终浓度100 mM终止反应。用50 mM乙酸盐 缓冲液(pH 5.0) l:5稀释后，利用乙酸将混合物的pH值调至5.0。然后， 将蛋白质应用于来源S柱(Resource S column)(lml, GE卫生保健(GE Healthcare))。然后利用线性盐梯度0至1 M的NaCl (50 mM乙酸盐缓冲液, pH 5.0)洗脱未反应的单体蛋白和相应的四聚体。四聚体的纯度通过rpHPLC分析和凝胶电泳检验。四聚体的正确分子量利用MALDI分析验 证。
8A7(单体和四聚体)和四聚体泛蛋白与人TNFa的结合通过浓度依赖 性ELISA评估。将增加量的纯化的单体或四聚体应用于用人TNFou BSA 和PBS包被的NUNC-medisorp板。使用50 ^ (10 jag/ml)/孔的抗原包被在 4。C进行过夜。用PBS， 0.1 %吐温20 pH 7.4 (PBST)清洗该板后，利用封 阻溶液(PBS pH 7.4; 3 % BSA; 0.5%吐温20)在37。C封阻孔2小时。再用 PBST清洗孔三次。然后，在室温下，在孔中温育不同浓度的单体和四聚 体8A7Affilin以及四聚体泛蛋白1小时(50 pl体积)。用PBST清洗孔后， 以在PBST中稀释1:2000应用抗-FLAG POD缀合物(西格玛(Sigma))。用 300 pl缓冲液PBST/孔清洗该板三次。将50 )LilTMB底物溶液(KEM-EN-Tec) 加入到每个孔中，并温育15分钟。通过每孔加入50 nl0.2MH2SO4终止 反应。利用TECAN Sunrise ELISA-读数器(TECAN Sunrise ELISA-Reader) 对ELISA板进行读数。光度吸收测量在450 nm处进行，使用620 nm作 为参考波长。图2明确显示四聚体8A7与人TNFa的特异性结合，其具 有100nM的表观KD值。在与单体的比较中，亲和性增加30倍。不能检 测到泛蛋白四聚体与TNFcx的结合(图3)。
使用的序列如下 Fl引物
5' - ggag3cc3C3acggtttccctctegaaat组tttgtttaactttaag肌gg3g3tatecatatg SPWS57Crev引物
5' - cacaaagagtgcggccatcttccagttgcttgcctgcccagatgagcc SPWS57Cfw引物
5' - ggaagatggccgcactctttgtgactacaacatc 。ET20b+rev助引物5 ， - gggaagaaagcgaaaggagcgg
WUBIFlagXhoIrev弓|
;'-ccattccacctcgagacctttatcatcatcatctttgteatcgccgccacgcag3cgcagc
8A7 (S57C) DNA序列
GATAA
8A7 (S57C)氨基酸序列
EDGRTLCDYNILKTGPLHLVLRLRGGDYKDDDDKGLEHHHH朋
泛蛋白(S57C) DNA序列:
CTGATAA
泛蛋白(S57C)氨基酸序列:EDGRTLCDYNIQKESTLHLVLRLRGGDYKDDDDKGLEHHHHHH
关于A伍lin 19H2的实施方案
使用在Z和Y之间的连接体臂中具有11个和23个PEG单元的通式 物质，将另一种基于泛蛋白的Affilin(19H2)四聚化。
如对8A7 Affilin(如上)所述，进行表达、纯化和偶联以及四聚体的纯化。 ELISA用于检测这两种四聚体(PEGll和PEG23连接体)与其靶分子TNFa 的结合。图4显示连接体长度不影响四聚体的亲和力，二者均显示3，7nM 的表观KD。
还进行并测试遗传产生的二聚体的四聚化(单体的八聚化)以及单独的 二聚体。为了该目的，利用标准PCR技术二聚化19H2 Affilin。也插入两 个19H2分子之间的连接体序列。该连接体是双Gly4Ser标准连接体。所 述同源二聚体中的第二 19H2分子在位置57处具有替换(丝氨酸到半胱氨 酸)，从而选择性偶联具有马来酰亚胺活化的四聚体PEG(11)分子的二聚体 (通式见上)。如上关于单体所述地进行表达、纯化、偶联和结合分析。图 5显示19H2的单体、二聚体、四聚体和八聚体针对TNFa的结合性质的 比较。如可以由其得知的，八聚体表现出最佳结合性质。
权利要求
1.一种下式的多聚体试剂Z-(X-Pol-Y)n其中Z是同官能-多官能烃，优选是支化的，具有1-50个碳原子，其任选包含杂原子；X是具有1-15个，优选2-10个，更优选3-5个碳原子的烃连接体，其任选含有杂原子并其能够在Z和Pol之间形成稳定的键；Pol是水溶性无毒聚合物；Y是能够偶联到生物活性试剂的偶联剂，和n是来自4-20，优选4-15，更优选4-8的整数。
2. 权利要求1的多聚体试剂，其中X选自由酰胺-、酯-、硫醚-、三唑 -、脲-、C-C-、或氨基甲酸酯-键组成的组，优选三唑-、酰胺-或酯-键。
3. 权利要求1或2的多聚体试剂，其中Z选自寡胺、寡羧酸、寡硫醇、 寡烯、寡炔、寡肼。
4. 权利要求1-3中一项或多项的多聚体试剂，其中Pol是分子量 <10,000 Da，优选<2,000 Da，更优选<1,000 Da，最优选在150 Da和10,000 Da之间的聚合物。
5. 前述权利要求中一项或多项的多聚体试剂，其中Pol是聚乙二醇 (PEG)。
6. 前述权利要求中一项或多项的多聚体试剂，其中Pol是非-分散性的。
7. 前述权利要求中一项或多项的多聚体试剂，其中每个Y独立地选自 这样的化合物的组，所述化合物可以与氨基、巯基、羧基、胍基、羰基、 羟基、肼基、炔基、杂环、C-亲核体基、C-亲电子体基、磷酸酯或硫酸酯 结合，或可以与金属形成螯合物或络合物，或可以与表面如塑料、金、铜、 或硅形成键。
8.权利要求1-5中一项或多项的多聚体试剂，所述多聚体试剂具有下 列结构Cl37H260N8O60精确质量2977,75 分子量2979,55
9. 前述权利要求中一项或多项的多聚体试剂，其中八聚体通过遗传产 生的二聚体的四聚化产生。
10. —种多聚体缀合物，其中前述权利要求中一项或多项的所述多聚 体试剂经由y组分偶联到生物活性试剂。
11. 权利要求10的多聚体缀合物，其中所述生物活性试剂各自独立选 自具有治疗或诊断相关性的肽、蛋白、核酸或小分子。
12. 权利要求10或11的多聚体缀合物，其中所述生物活性试剂各自独立选自生长因子如tnf、 vegf、或egf或它们的受体。
13. 权利要求10-12中一项或多项的多聚体缀合物，其中所述生物活 性试剂具有像抗体、抗体片段、抗体样分子和支架蛋白一样的抗原结合活 性。
14. 权利要求11的多聚体缀合物，其中所述生物活性试剂选自y-晶体 蛋白。
15. 权利要求11的多聚体缀合物，其中所述生物活性试剂选自由下列 组成的组各自具有泛蛋白-样折叠基序的"泛蛋白-样蛋白"的蛋白超家族的蛋白，以及它们的各自具有泛蛋白-样折叠基序的片段或融合蛋白。
16. 权利要求14或15的多聚体缀合物，其中由于在所述蛋白表面上形成邻近区域的那些氨基酸的修饰，所述生物活性试剂在所述蛋白的至少 一个表面-暴露区域中具有先前不存在的关于预定结合配偶体的结合亲和 性，同时维持原始折叠基序。
17. 权利要求10-16中一项或多项的多聚体缀合物，其中所述缀合物 的总尺寸使得分子的肾排除显著减慢。
18. 权利要求10-17中一项或多项的多聚体缀合物，其中所述缀合物 与其衍生自的未修饰的生物活性试剂相比，表现出增加的亲和力。
19. 一种药物或诊断组合物，所述药物或诊断组合物含有前述权利要 求中一项或多项的多聚体缀合物以及一种或多种辅剂和/或稀释剂。
20. —种制备权利要求1-9的多聚体试剂的方法，所述方法通过使同 官能-多官能试剂Z与同官能或异官能聚合物X-Pol-Y反应，以形成稳定 的键和获得Z-(X-Pol-Y)n。
21. 权利要求20的方法，其中所述反应通过汇集合成进行。
22. —种制备权利要求10-18的多聚体缀合物的方法，所述包括下列 步骤-将权利要求中定义的生物活性试剂和多聚体试剂溶解在合适的溶 剂中；-使在权利要求20或21中获得的多聚体试剂Z-(X-Pol-Y、与所述生物活性试剂在所述生物活性试剂的相同的溶液中反应；和-将所述多聚体缀合物纯化为基本上同质的制剂。
23. 权利要求22的方法，其中所述溶剂能够溶解所述生物活性试剂和 所述多聚体试剂二者。
24. 权利要求22或23的方法，其中将所述生物活性试剂以0.1-25 mg/ml，优选l-10mg/ml的浓度溶解在所述溶剂中。
25. 权利要求22-24的方法，其中所述溶剂具有在3和12之间，优选 在4和10之间，更优选在5和9之间的pH。
26. 权利要求25的方法，其中所述溶剂具有小于250 mM，优选在10 和150mM之间，更优选在50和100mM之间的缓冲盐的浓度。
27. 权利要求22-26的方法，其中所述溶剂含有添加剂，例如盐、稳 定剂、变性剂、和还原剂或氧化剂。
28. 权利要求22-27中一项或多项的方法，其中参考待多聚化的所述 生物活性试剂的摩尔量，将所述多聚体试剂Z-(X-Pol-Y)n以l:n以下的摩 尔比加入到所述生物活性试剂的溶液中。
29. 权利要求22-28中一项或多项的方法，其中所述反应溶液被连续 均化，并保持在0'C和50°C，优选4。C和37t:，更优选4。C和25。C之间的 温度。
30. 权利要求22-29中一项或多项的方法，其中将所述多聚体缀合物 纯化为纯度>90重量％，更优选>95重量％的基本上同质的制剂。
31. 权利要求30的方法，其中所述纯化通过色谱法、沉淀、或尺寸排 阻诸如渗析或交叉流动过滤进行。
32. —种可通过权利要求20或21的方法获得的多聚体试剂。
33. —种可通过权利要求22-30中一项或多项的方法获得的多聚体缀
34. 根据权利要求10-18或33中一项或多项的多聚体缀合物用于诊 断、预防和治疗其中直接或间接涉及相应的结合配偶体的疾病的用途。
全文摘要
本发明涉及一种多聚体试剂和一种由此多聚体试剂和生物活性试剂形成的多聚体缀合物。所述多聚体缀合物与未修饰的生物试剂相比，具有较长的体内寿命和增加的亲和力。本发明还涉及一种包含所述缀合物的药物或诊断组合物及其生产方法。本发明另外提供所述缀合物用于检测、确定、分开和/或分离特异性结合配偶体以及用于诊断、预防和治疗其中直接或间接涉及所述特异性结合配偶体的疾病的用途。
文档编号A61K47/48GK101616691SQ200880004542
公开日2009年12月30日 申请日期2008年2月11日 优先权日2007年2月9日
发明者乌尔里克·菲德勒, 埃里克·菲德勒, 弗兰克·里恩德尔斯, 托马斯·海伊, 拉尔夫·克雷默, 马尔库斯·菲德勒 申请人:希尔蛋白质有限公司