专利名称：携带结核基因的减毒细菌载体结核疫苗及制备方法和应用的利记博彩app
技术领域：
本发明属于分子微生物学和感染免疫领域，涉及携带结核分枝杆菌基因ESAT6 和Ag85B的减毒鼠伤寒沙门氏菌载体疫苗，涉及该疫苗的制备方法，这种重组的减 毒鼠伤寒沙门氏菌载体疫苗可以用以抵抗结核分枝杆菌的感染，也具有能抵抗伤寒 沙门菌感染的免疫中的应用。
背景技术：
结核病(Tuberculosis,TB)是一种由结核杆菌感染引起的严重危害人类健康的 传染病。据世界卫生组织(WHO)统计资料显示，全球有近1/3的人感染结核杆菌， 每年有300万人死于结核病，每年新发病人数达800 1000万。卡介苗(BCG)是 目前唯一的结核预防性疫苗，但其对成人结核病的预防效果不稳定，保护效果从0 % 80%不等，而且会干扰对结核病的诊断。因此寻找一种安全、有效、廉价且操 作简便的预防结核病的新型疫苗成为当务之急。
在结核分支杆菌中，抗原85 (antigen 85， Ag85)复合体为优势的分泌蛋白及 保护性抗原，包括Ag85A、 Ag85B和Ag85C三种蛋白成分。Ag85B含量最大，是 一种能诱导明显Thl型免疫反应的免疫原性蛋白，早期分泌性的6-kD的蛋白(early secreted antigenic target 6-kDa antigen,ESAT6)是结核感染机体早期分泌的 一种同样可以诱导明显Thl型免疫应答的优势抗原，可以诱导T细胞发生明显细胞 免疫应答。
而卡介苗(BCG)是目前唯一预防结核分枝杆菌感染的疫苗，但其缺失ESAT6 基因，而ESAT6是一种保护性抗原。因而有必要构建具有ESAT6等保护性疫苗以 弥补BCG疫苗的不足。
而减毒鼠伤寒沙门氏菌&/附0"6//" /)^Wwwn'iwj SL7207是细胞内侵袭性细菌， 可以通过肠道及上呼吸道途径感染，侵入粘膜相关淋巴组织(MALT)，被MALT 内的专职抗原递呈细胞(APC)吞噬，并在其中增殖。减毒鼠伤寒沙门氏菌与机体 相互作用可产生特异性的免疫应答，诱导IgG及肠sIgA的生成，并产生特异性细胞免疫，由于其能靶向感染APC，因而是一种很好的疫苗备选载体，从粘膜免疫方面 进一步提高机体对呼吸道病原微生物如结核等感染的防御能力。
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种携带结核基因的减毒细菌载体结核疫苗 Sa/mcme"a iy_p/n' nwn'wmSL7207(pVAX-l-Ag85B) 以及 SaZmoneWa (yj /u'mwn'Mm SL7207(pVAX-l-ESAT6-Ag85B)，疫苗可以稳定表达结核分支杆菌的优势抗原。该 减毒鼠伤寒沙门氏菌载体疫苗制备方便，经口服途径免疫后，可以明显增强小鼠的 细胞免疫、体液免疫以及粘膜免疫应答，全面提高机体的抗结核分支杆菌的免疫力， 它们产生的黏膜和血清SIgA水平强于BCG和DNA疫苗。并且5Wwo"e〃a (y; /n'附wr/wm SL7207(pVAX-l-ESAT6-Ag85B)免疫保护能力大于DNA疫苗或 S^Zmowe//a J>_p/ imwn'w i SL7207(pVAX-l-Ag85B);联合^f吏用Sa/moweZ/fl /^p/ >nwn.w 7 SL7207(pVAX-l-ESAT6-Ag85B)和BCG的免疫保护作用最强，大于单独BCG的免 疫保护作用。
本发明的另个一目的是在于提供了一种制备携带结核基因的减毒细菌载体结核 疫苗的方法，该方法较简便易行，且所制备的疫苗可以稳定的表达结核分支杆菌蛋 白。
本发明的再一个目的是在于提供了一种携带结核基因的减毒细菌载体结核疫苗 在制备治疗或预防结核分枝杆菌的感染药物中的应用。
为了实现上述目的，本发明选用减毒鼠伤寒沙门氏菌Sa/mo"e"a 0^"'附"Hmwj SL7207菌株做为载体，与其他伤寒沙门氏菌株相比，安全性较高。
本发明的目的基因是结核分支杆菌基因Ag85B以及ESAT6， 二者在结核感染 的过程中发挥重要的作用，可以明显诱导Thl型免疫应答，是制备结核分支杆菌疫 苗的首选抗原。
本发明利用同源重组的方法将结核分支杆菌基因插入到真核表达载体质粒中， 然后将构建成功的真核表达质粒转入减毒鼠伤寒沙门氏菌中使其稳定表达结核分支 杆菌抗原，刺激机体产生有效的免疫应答。
本发明釆用以下技术方案
发明的减毒鼠伤寒沙门氏菌载体疫苗5Wwo"e//a O^/z/mwn'ww SL7207(pVAX-l-Ag85B) 以 及 Sa/wo"e/Za /^/ /H7nwr/w附SL7207(pVAX-l-ESAT6-Ag85B),已在中国典型培养物保藏中心保存，CCTCC: M 208241及CCTCC:M 208242。其制备步骤如下
一、构建含有结核分支杆菌H37Rv菌株Ag85B以及ESAT6-Ag85B (相关文献在 《J Immunol.》第154巻上发表)融合基因真核表达质粒pVAX-l-Ag85B以及 pVAX-l-ESAT6-Ag85B。 antigen 85B (Ag85B) 以及早期分泌抗原(early secreted antigenic target 6-kDa antigen, ESAT6)以结核分支杆菌H37Rv菌株基因组为模板通过 PCR方法获得。Ag85B上下游弓l物分另lJ是5'-TGAATTCAAATGTTCTCCCGGCCG-3， 和5'-AAAGCTTTCAGCCGGCGCCTAA-3，,(酶切位点分别是5amHI、五coRI)， 然后将获得的Ag85B与pVAX-l分别作3"wHI 、 ￡coRI双酶切后连接得到 pVAX-l-Ag85B真核表达质粒；ESAT6上下游引物分别为 5'-GCAAGCTTATGACAGAGCAGCAGTGGAA-3， 禾口 5'-TTCCTAGGTGCGAACATCCCAGTGACGT-3'.(酶切位点分别为历"dIII and 5"附HI)，然后将PCR获得的ESAT6以及构建成功的pVAX-l-Ag85B分别做历"din and BtzmHI双酶切，连接获得pVAX-l-ESAT6-Ag85B真核表达质粒。
二、利用电转化的方法(相关文献在1999年《FOLIA MICROBIOLOGICA》 第44巻发表)将克隆构建的真核表达质粒pVAX-l-Ag85B以及 pVAX-l-ESAT6-Ag85B转化到&/mo"e//。 0^"'附""'"w LB5000菌株(相关文献在 1992年《VACCINE》第IO巻发表)中进行修饰后提取质粒再转化至减毒鼠伤寒沙 门氏菌5W附o"e/Zfl 0^hi附wi"附SL7207 (相关文献已发表在《infection and immunity》 第61巻)中，并将其传代20代后鉴定其稳定性，免疫印迹(WesternBlot)检测构 建的减毒鼠伤寒沙门氏菌载体疫苗中GST-Ag85B以及GST-ESAT6-Ag85B融合蛋白 的表达；最后保存鉴定正确后的菌种&/wo"e〃a 0^W附wWwm SL7207(pVAX-l-Ag85B) 以及Sa/附o"eZ/a 0^2z'附wzm/m SL7207(pVAX-l國ESAT6-Ag85B)。
一种携带结核基因的减毒细菌载体结核疫苗Sa/nto"e"a (y; Wmwiwn SL7207(pVAX-l-Ag85B)以及&Zwo"e//a O^/jz'mwWwm SL7207(pVAX-l-ESAT6-Ag85B)
的应用过程是
将申请人制备的疫苗Sa/wo"e〃a 0^"'wwn'ww SL7207(pVAX-1 -Ag85B)以及 0^"'OT"Wwm SL7207(pVAX-l-ESAT6-Ag85B)在含有卡那霉素及链霉素的无菌LB培养基中37度培养过夜，收集细菌后以无菌PBS调整其浓度，按每只小鼠l Xl()SCFU的量以灌胃途径免疫BalB/C小鼠，每两周免疫一次，共免疫三次。免疫后 小鼠一部分用于特异性抗体、黏膜免疫和细胞免疫等免疫指标的检测，另一批小鼠 免疫三次后在ABSL-III级实验室进行结核分枝杆菌H37Rv攻毒(尾静脉及滴鼻)实 验，观察感染后小鼠的生存率、脾脏肺脏的病理变化及结核分枝杆菌菌落计数、肺 脏结核分枝杆菌的抗酸染色等进一步评估携带结核分枝杆菌Ag85B以及 ESAT6-Ag85B的减毒鼠伤寒沙门氏菌载体疫苗对结核分枝杆菌感染的免疫保护作
用。所构建的减毒鼠伤寒沙门氏菌载体疫苗可以作为制备治疗或预防结核分枝杆菌 的感染药物中的应用，以及作为制备治疗或预防结核分枝杆菌感染的疫苗药物中的 应用。
发明的优点和效果
本发明构建了一种可以稳定表达结核分支杆菌基因的减毒伤寒沙门氏菌载体疫 苗5^/附0"6//" />p/ >wwn'ww SL7207(pVAX-l國Ag85B)以及iSfl/mo"e〃a /^p/zzTwt/n'ww SL7207(pVAX-l-ESAT6-Ag85B)，这种减毒鼠伤寒沙门氏菌载体疫苗能激发有效的 体液免疫、细胞免疫的同时，会显著的诱导机体产生粘膜性免疫应答，可以很好的 用来预防结核分支杆菌的感染。这种疫苗具有很多优点①可以稳定表达结核分枝 杆菌蛋白；②免疫后可有效的诱导粘膜和系统免疫应答；③制备方法及使用途径简 便，成本低，具有显著的经济效益。动物实验表明以这种减毒鼠伤寒沙门氏菌载 体疫苗免疫小鼠，小鼠能产生抗结核分支杆菌感染的特异性免疫应答，因此本发明 可以作为抗结核分支杆菌的候选疫苗。本发明为进一步拓展减毒伤寒沙门氏菌作为 口服疫苗载体的应用打下了基础，并为结核疫苗的研制提供了一条新的思路。
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图1 .含有结核分支杆菌基因Ag85B以及ESAT6-Ag85B融合基因的真核表达质粒 构建示意图。
1为DNA marker, 2为重组质粒pVAX-l-Ag85B酶切鉴定，3为重组质粒 pVAX-l -ES AT6-Ag85B的酶切鉴定。
将真核表达质粒酶切鉴定，pVAX-l大小为3.0kb， Ag85片段大小为860bp， ESAT6-Ag85B融合基因片段大小为1140bp，鉴定正确。图2.减毒鼠伤寒沙门氏菌载体疫苗的稳定性检测及Western Blot检测真核蛋白 Ag85B、 ESAT6-Ag85B的表达示意图
将疫苗菌株传代20代后提取质粒，做酶切鉴定，图2A: 1为DNA marker, 2 为疫苗51"^0"2//<3 /);p/zZww/wm SL7207(pVAX-l-Ag85B)的质粒表达鉴定，3为疫苗 Sfl/mowW/aO^^wi^wm SL7207(pVAX-l-ESAT6-Ag85B)的质粒表达鉴定。图2B:为 免疫后小鼠肌肉、脾脏、肺脏及肠道中蛋白Ag85B、 ESAT6-Ag85B的真核表达。
将减毒鼠伤寒沙门氏菌载体疫苗传代20代后提取质粒鉴定，质粒没有丢失， 构建的真核表达质粒在Sa/mo"d/a 0^"'mwn'wm SL7207中稳定表达；疫苗免疫小鼠 后在多个脏器中稳定表达真核蛋白Ag85B、 ESAT6-Ag85B。
图3.质粒DNA疫苗以及减毒鼠伤寒沙门氏菌载体疫苗免疫小鼠血清特异性抗体 的ELISA检测的示意图.
阴性对照以真核表达载体pVAX-l以及减毒伤寒沙门氏菌株5Wmo"e/to 妙/z/,n',SL7207免疫的小鼠；空白对照以PBS免疫的小鼠。
血清中抗体随着免疫次数的增加而明显升高且减毒伤寒载体疫苗组明显高于空 载体对照组，减毒鼠伤寒沙门氏菌载体疫苗免疫三次后的小鼠血清中抗体亚型 IgG2a也明显高于空载体对照组。
图4.质粒DNA疫苗以及减毒鼠伤寒沙门氏菌载体疫苗免疫小鼠的特异性黏膜 免疫水平，即胃肠及血清SIgA的ELISA检测的示意图.
减毒鼠伤寒沙门氏菌载体疫苗组小鼠的肠道及血清SIgA水平最高，进一步提高 机体的抗结核分支感染能力。
图5.ELISP0T法检测免疫后小鼠特异性T细胞分泌的细胞因子的表达示意图。
伤寒沙门氏菌载体疫苗组分泌IFN-Y的细胞数量明显高于对照组，而IL4不明显， 呈现出以Thl型免疫反应为主的免疫应答。
图6.流式细胞术检测细胞免疫水平CD8+T细胞颗粒酶释放结果示意图。
颗粒酶释放实验显示减毒伤寒沙门氏菌载体疫苗组的CD8+T淋巴细胞针对结 核分支杆菌的特异性免疫应答增强。
图7.经疫苗免疫后小鼠感染结核分枝杆菌后生存率观察结果示意图。
减毒鼠伤寒沙门氏菌载体疫苗可以明显延长感染结核分枝杆菌的小鼠的生存时 间，提高其生存率。图8.经疫苗免疫后小鼠感染结核分枝杆菌后小鼠肺脏结核分枝杆菌的抗酸染色 结果示意图。
图9.经疫苗免疫后小鼠感染结核分枝杆菌后小鼠肺脏HE染色结果示意图。 经减毒鼠伤寒沙门氏菌载体疫苗免疫组的小鼠肺脏病理变化明显轻于对照组， 肺组织结构清晰，肺泡融合少。
具体实施例方式
实施例l:
减毒鼠伤寒沙门氏菌载体疫苗5b/wo"e〃a 0^&附"hww SL7207(pVAX-l-Ag85B) 以及fe/mo"e〃fl/^p/zz'ww/wm SL7207(pVAX隱l-ESAT6-Ag85B)的制备，其步骤是
A、 构建含有结核分支杆菌H37Rv菌株Ag85B以及ESAT6-Ag85B (相关文献在 《J Immunol.》第154巻上发表)融合基因真核表达质粒pVAX-l-Ag85B以及
pVAX-l-ESAT6-Ag85B。抗原85B (Ag85B) 以及分泌性6-kDa蛋白(ESAT6)以 结核分支杆菌H37Rv菌株基因组为模板通过PCR方法获得。Ag85B上下游引物分别 是 5'-T^MEI￡AAATGTTCTCCCGGCCG-3' 和
5'-AAAGCTTTCAGCCGGCGCCTAA-3，,(酶切位点分别是Sa附HI、五coRI)，然 后将获得的Ag85B与pVAX-l分别作SamHI、五coRI双酶切后连接得到pVAX-l-Ag85B 真核表达质粒 ；ESAT6 上下游引物分别为 5'-GCAAGCTTATGACAGAGCAGCAGTGGAA-3， 和 5'-TTCCTAGGTGCGAACATCCCAGTGACGT-3'.(酶切位点分别为州wdIII and ^ mffl)，然后将PCR获得的ESAT6以及构建成功的pVAX-l-Ag85B分别做/Z/"d111 and BawHI双酶切，连接获得pVAX-l-ESAT6-Ag85B真核表达质粒。
B、 利用电转化的方法(相关文献在1999年《FOLIA MICROBIOLOGICA》 第44巻发表)将克隆构建的真核表达质粒pVAX-l-Ag85B以及 pVAX-l-ESAT6-Ag85B转化到&/wo"e//a O^/zz'ww/w/w LB5000菌株(相关文献在 1992年《VACCINE》第IO巻发表)中进行修饰后提取质粒再转化至减毒鼠伤寒沙 门氏菌5b/wo"e//fl 0^/ >wwn-ww SL7207 (相关文献已发表在《infection and immunity》 第61巻)中，鉴定后保存菌种&/附0加//"0/; /2^^/"附31^7207(^/^-1-八经858)以及
0^/z/附wn'ww SL7207(pVAX-l-ESAT6-Ag85B)。将保存的菌种传代(传代 方法取10微升保存的菌液，加入到含有5微升卡那霉素和5微升链霉素的5毫升LB培养基中，37度摇床中培养)20代后提取质粒鉴定疫苗的稳定性并免疫小鼠后 检测真核蛋白Ag85B以及ESAT6-Ag85B的表达情况。 重组疫苗效果的鉴定
申请人将该减毒鼠伤寒沙门氏菌载体疫苗Sa/mone〃a 0^Wwwn'wm SL7207(pVAX-l-Ag85B)以及5W/mo"e〃a O^/nmwzww SL7207(pVAX隱l隱ESAT6陽Ag85B) 按每只小鼠lXl()SCFU的量以灌胃途径免疫BalB/C小鼠，每两周免疫一次，共免疫 三次。每次免疫后两周取各组小鼠的尾静脉血检测血清中针对结核分支杆菌Ag85B 蛋白的特异性抗体IgG;第三次免疫后两周取小鼠尾静脉血检测结核分支杆菌Ag85B 蛋白的特异性抗体IgGl、 IgG2a以及小鼠胃、肠、血清中的分泌性IgA表达；同时， 还将另一批小鼠免疫三次后进行结核分枝杆菌H37Rv攻毒(尾静脉及滴鼻)实验， 观察感染后小鼠的生存率、脾脏肺脏的病理变化及结核分枝杆菌菌落计数、肺脏结 核分枝杆菌的抗酸染色等进一步评估携带结核分枝杆菌Ag85B以及ESAT6-Ag85B 的减毒鼠伤寒沙门氏菌载体疫苗对结核分枝杆菌感染的免疫保护作用。
实验发现，经构建的减毒鼠伤寒沙门氏菌载体疫苗免疫后的小鼠抗原85B特异 性的抗体IgG、 IgGl、 IgG2a以及分泌粗gA表达水平明显提高，提高了小鼠的体液 免疫和粘膜免疫功能；同时，构建的伤寒沙门氏载体疫苗还可以显著促进IFN-Y、 颗粒酶等的分泌和释放，极大的提高了小鼠的细胞免疫功能；同时，小鼠感染实验 也发现，经构建的减毒鼠伤寒沙门氏菌载体疫苗免疫的小鼠，生存率明显提高，肺 脏病理变化明显减轻，脾肺结核分枝杆菌计数明显减少。从多方面证实，所构建的 减毒鼠伤寒沙门氏菌载体疫苗可以作为制备治疗或预防结核分枝杆菌的感染药物中 的应用，以及作为制备治疗或预防结核杆菌感染的疫苗药物中的应用。
权利要求
1、一种携带结核基因的减毒细菌载体结核疫苗，其特征在于Salmonellatyphimurium SL7207(pVAX-1-Ag85B)，CCTCC保藏号为CCTCCM 208241。
2、 一种携带结核基因的减毒细菌载体结核疫苗，其特征在于Salmonella typhimurium SL7207(pVAX陽l-ESAT6-Ag85B), CCTCC保藏号为CCTCC: M 208242。
3、 一种用于实现权利要求1或2所述的携带结核基因的减毒细菌载体结核疫苗的制备方法，它包括下列步骤A、 构建含有结核分支杆菌Ag85B以及ESAT6-Ag85B融合基因真核表达质粒 pVAX-l-Ag85B以及pVAX-l-ESAT6-Ag85B， Ag85B和ESAT6基因分别以结核分支 杆菌H37Rv菌株基因组为模板通过PCR方法获得，Ag85B上下游引物分别是 5'-TGAATTCAAATGTTCTCCCGGCCG-3 ， 和 5'-AAAGCTTTCAGCCGGCGCCTAA-3，，然后将获得的Ag85B与pVAX-l分别作 5amHI、五coRI双酶切后连接得到pVAX-l-Ag85B真核表达质粒；ESAT6上下游引物 分 另U 为 5'-GCAAGCTTATGACAGAGCAGCAGTGGAA-3， 和 5'隱TTCCTAGGTGCGAACATCCCAGTGACGT-3'，然后将PCR获得的ESAT6以及构 建成功的pVAX-l-Ag85B分别做历mlin and BawHI双酶切，连接获得 pVAX-l-ESAT6-Ag85B真核表达质粒；B、 利用电转化的方法将克隆构建的真核表达质粒pVAX-l-Ag85B以及 pVAX-l-ESAT6-Ag85B转化到LB5000菌株中进行修饰后提取质粒再转化至减毒鼠 伤寒沙门氏菌SL7207中，鉴定后保存菌种SWmoweZ/fl 0^^附""wm SL7207(pVAX-l-Ag85B) 以 及 5^/附o"e//(3 />p/zz'mwn'w/w SL7207(pVAX-l-ESAT6-Ag85B)，将保存的菌种传代20代后提取质粒鉴定疫苗的稳 定性并免疫小鼠后检测真核蛋白Ag85B以及ESAT6-Ag85B的表达。
4、根据权利要求1或2所述的一种携带结核基因的减毒细菌载体结核疫苗在制 备治疗或预防结核分枝杆菌的感染药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种携带结核基因的减毒细菌载体结核疫苗及制备方法和应用，首先构建含有结核分支杆菌Ag85B、ESAT6-Ag85B基因的真核表达质粒；其次是利用电转化的方法将所构建的真核表达质粒转化至减毒鼠伤寒沙门氏菌中，减毒鼠伤寒沙门氏菌可以稳定表达结核分枝杆菌蛋白。联合使用Salmonella typhimurium SL7207(pVAX-1-ESAT6-Ag85B)和BCG的抵抗结核杆菌感染免疫保护作用最强，大于单独BCG的免疫保护作用；它们产生的黏膜和血清SIgA水平强于BCG和DNA疫苗。并且Salmonella typhimurium SL7207(pVAX-1-ESAT6-Ag85B)免疫保护能力大于DNA疫苗或Salmonella typhimurium SL7207(pVAX-1-Ag85B)。方法简便，成本低，使用方便，具有能抵抗伤寒沙门菌感染，又能抵抗结核杆菌感染的免疫保护。稳定表达结核分枝杆菌蛋白，免疫后可诱导粘膜和系统免疫应答，具有显著的经济效益。
文档编号A61K39/112GK101428143SQ20081023672
公开日2009年5月13日 申请日期2008年12月9日 优先权日2008年12月9日
发明者王其龙, 章晓联 申请人:武汉大学