专利名称：藻胆蛋白在制备以碘钨灯治咽喉癌细胞的光敏剂中的应用的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及一种医学肿瘤学临床用药物，特别是涉及一种藻胆蛋白在制备以碘钨
灯治咽喉癌细胞的光敏剂中的应用。
背景技术：
光动力疗法是近20年来建立和发展起来的一种新型肿瘤疗法。其原理主要通过光敏剂富集于病灶处，并在光照下产生光敏损伤来实现对肿瘤细胞的杀伤作用。光动力治疗在很大程度上取决于采用的光敏剂的性质。传统光敏剂具有严重的皮肤光毒性等缺点，开发新型光敏剂成为研究热点。藻胆蛋白是很好的纯天然色素，可用于食物、化妆品、荧光检测等领域，近年来，根据其吸收光谱的特征和产生自由基特点，藻红蛋白、藻蓝蛋白均可作为光敏剂，国内首先有报道100iig/mL螺旋藻藻蓝蛋白经铜泵激光器辐照12J/cn^，使大肠癌细胞HR8348存活率仅为22.2X。之后又有报道用提取自多管藻的藻红蛋白处理口腔8113细胞和小鼠S180细胞，再经488nm氩离子激光器辐照25J/cm2，发现细胞存活率分别为25%和24%。藻胆蛋白以其高效、无毒、副作用小等优点，被认为是光动力学治疗法中一种非常有前景的光敏剂。
发明内容
本发明的目的是要提供一种藻胆蛋白在制备以碘钨灯治咽喉癌细胞的光敏剂中的应用，本发明中所指的藻胆蛋白是选择从条斑紫菜中提取的条斑紫菜藻红蛋白R-PE、条斑紫菜藻蓝蛋白C-PC。从假设至实验中发现在碘钨灯下，条斑紫菜藻红蛋白R-PE、条斑紫菜藻蓝蛋白C-PC对咽喉癌H印-2细胞同样具有杀伤作用，条斑紫菜藻红蛋白R-PE、条斑紫菜藻蓝蛋白C-PC均对咽喉癌细胞H印-2且具有较高杀伤率，是一种有效的光敏剂。
我国是一个紫菜生产大国，对条斑紫菜已大量实施了人工栽培，年产量可达20亿张左右，所以条斑紫菜与螺旋藻、多管藻相比，来源丰富，目前市场上大多是自然凉干的紫菜，销售价格在每千克20-30元，而每吨饲料级螺旋藻干粉6-8万元人民币(60-80元/千克)，曾一度高达每kg 30美元(约240元/千克)，是紫菜的十倍，另相对于多管藻也价格便宜的多，因此，本发明选用来源广泛，采购价格便宜的条斑紫菜为原料，并且，从条斑紫菜提取高纯度藻红蛋白R-PE、藻蓝蛋白C-PC工艺简单，成本低廉，得率较高。另外，本发明利用碘钨灯为光源，不但体积小巧、价格低廉、光源成本低，而且对肿瘤细胞仍具有较高的杀伤率，而一般的大型激光器体型庞大，价格昂贵，使用不便，且治疗成本相当高。
由于本发明通过实验证明能以条斑紫菜藻红蛋白R-PE或条斑紫菜藻蓝蛋白C-PC作为光敏剂，并能通过碘钨灯辐照来完成对咽喉癌H印-2细胞的杀伤作用，同时也证明条斑紫菜藻红蛋白R-PE、藻蓝蛋白C-PC均对咽喉癌H印-2细胞具有较高杀伤率，是一种有效的光敏剂。这样，有利于对咽喉癌H印-2细胞的灭杀过程大大降低使用成本，更有利于实现在光动力治疗的应用中广泛使用。
具体实施例方式
下列实例进一步说明本发明。
实施例一 本实施例中所用的材料为条斑紫菜藻红蛋白R-PE和咽喉癌H印-2细胞株，其中条斑紫菜藻红蛋白R-PE购自杭州奥维生物工程有限公司，咽喉癌H印-2细胞株购自中科院细胞所。 (1)、咽喉癌H印-2细胞株用含10%小牛血清的1640培养液培养，培养条件为37°C、5% C02浓度及饱和湿度； (2)、当细胞生长旺盛时，用含0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)的0.25%胰酶消化细胞，洗涤吹散细胞稀释至107ml，每孔100ii L接种于96孔板； (3)、将浓度100 ii g/mL、纯度为5. 5 "564 /48。 )的条斑紫菜藻红蛋白R-PE的无血清培养基替代上述培养液，培养4小时； (4)、用碘钨灯辐照上述96孔板4小时，被照射样品与光源之间加隔热水槽以消除温度影响，并加有相应滤光片以滤去杂波，辐照功率密度约70mW/cm2，累计能量密度50J/cm2 ;
(5)、碘钨灯辐照结束后再换入上述新鲜培养液继续培养24小时，用MTT法测定各孔吸光度； (6)、以不加任何处理的培养细胞为空白对照，以单用藻胆蛋白不加碘钨灯辐照以及不加藻胆蛋白单用碘钨灯辐照的培养细胞作为阴性对照； (7)、结果显示100 ii g/mL浓度条斑紫菜藻红蛋白R-PE对咽喉癌H印-2细胞的杀伤率为77%。
实施例二 本实施例中所用的材料为条斑紫菜藻蓝蛋白C-PC和咽喉癌H印-2细胞株，其中条斑紫菜藻蓝蛋白C-PC购自杭州奥维生物工程有限公司，咽喉癌H印-2细胞株购自中科院细胞所。 (1)、以纯度为4. O(UU条斑紫菜藻蓝蛋白C-PC替代条斑紫菜藻红蛋白R-PE做实施例一中(i)-(e)各步操作； (2)、结果显示100 ii g/mL浓度条斑紫菜藻蓝蛋白C_PC对咽喉癌H印-2细胞的杀伤率为66%。
实施例三
梯度对照步骤
1J中瘤细胞培养 咽喉癌H印-2细胞株用含10%小牛血清的1640培养液培养，培养条件为37°C，5% C02浓度及饱和湿度，当细胞生长旺盛时，用含0. 02%乙二胺四乙酸(EDTA)的0. 25%胰酶消化细胞，洗涤吹散细胞稀释至10e/mL，每孔100i! L接种于96孔板，以备光动力学反应用。 2、条斑紫菜藻红蛋白R-PE、条斑紫菜藻蓝蛋白C-PC介导的光动力反应对咽喉癌H印-2细胞生存率的影响 将条斑紫菜藻红蛋白R-PE、条斑紫菜藻蓝蛋白C-PC不同终浓度(10、25、50、100 ii g/mL)的培养基分别替代原培养基，培养4小时后，用碘钨灯辐照，碘钨灯辐照时，被照射样品与光源之间加隔热水槽以消除温度影响，辐照功率密度约70mW/cn^，累计能量密度50J/cm2，辐照结束后继续培养24小时，用MTT法测定各孔吸光度。以不加任何处理的培养细胞为空白对照。每个浓度梯度均设置12个平行组，分别计算细胞存活率。按照以下公式计算存活率 存活率=(实验组吸光度平均值/对照组吸光度平均值)X 100%
采用SPSS 12. 0统计软件和t检验进行统计分析。 条斑紫菜藻红蛋白R-PE、条斑紫菜藻蓝蛋白C-PC介导的光动力学反应对体外培养的咽喉癌H印-2细胞的具体杀伤作用见表1。 表1条斑紫菜藻红蛋白R-PE、条斑紫菜藻蓝蛋白C-PC光动力杀伤对咽喉癌H印-2
细胞存活率的影响(100J/cm2， xS )
藻红、藻蓝蛋白 ^ ^~~^
浓度梯度 0 (对照) 10 25 50 100/(IJg』L/1)____
12 12 12 12
79±3. 7* 68±2.9** 43±3. 1**23士2. 5**
83±2. 2* 69±2. 7* 52±2. 2**34±2. 5** t检验，*p < 0. 05， **p < 0. 01 3、辐照能量对咽喉癌H印-2细胞生长的影响 同前方法收集培养细胞，培养液中不含条斑紫菜藻红蛋白R-PE、条斑紫菜藻蓝蛋
白C-PC，直接用碘钨灯隔水辐照，照射能量分别达到25、50、100J/cm2。每个能量梯度均设
置12个平行组，分别计算细胞存活率，并进行统计学处理。 辐照能量对咽喉癌H印-2细胞生长的具体影响见表2。 表2不同能量辐照对咽喉癌H印-2细胞生存率的影响(XS )
累计辐照能量 /( J.cm-2)0 (对照)2550100
重复例数12121212
细胞存活率％/90±6.685±5.587±4.7
p值
与对照组比较>0.05>0.05>0.05
组间比较>0.05>0.05 t检验，p > 0. 05无显著性 4、条斑紫菜藻红蛋白R-PE、条斑紫菜藻蓝蛋白C-PC本身对咽喉癌H印-2细胞生长
重复例数 12
R-PE组存活率%
C-PC组存活率%的影响。 同上述方法收集培养细胞，分别换入含条斑紫菜藻红蛋白R-PE、条斑紫菜藻蓝蛋 白C-PC终浓度为10、25、50、100ii g/mL的培养液，不接受光源辐照，但保持同样的培养环境 和换液条件继续培养24、48、72h。每个能量梯度均设置12个平行组，分别计算细胞存活率， 并进行统计学处理。 条斑紫菜藻红蛋白R-PE和条斑紫菜藻蓝蛋白C-PC对咽喉癌H印-2细胞生长的具 体影响见表3。 表3条斑紫菜藻红蛋白R-PE、条斑紫菜藻蓝蛋白C-PC本身对咽喉癌H印细胞存活
率的影响(:《S )
藻红、藻蓝蛋ri
浓度梯度/o (对照)10 25 50 100 (|Jg. mL ) _
94±1. 5 94±1.3
83±2. 3* 85士1. 9*
72±2. 9氺氺 68±3. 2氺*
94±0. 9 92士1.4承
86土2. 0 81±2. 2*
79±2. 6林 73±2. 7林
重复例数 R-PE24h存活率 %
R-PE48h存活率 %
R-PE72h存活率 %
C-PC24h存活率 %
C-PC48h存活率 %
C-PC72h存活率 %
12
12 12 103±1.3 105±1.3
97±2. 6 88±3. 5 99士1. 2 95士1. 6 87士2. 7
95±2. 5 79±3. 6* 104±1. 2 91士2. 3 85±3. 6 t检验，*p < 0. 05， **p < 0. 01 综上所述，从表1-3显示条斑紫菜藻红蛋白R-PE和条斑紫菜藻蓝蛋白C-PC对咽 喉癌H印-2细胞光动力杀伤的效果。 可以看出，在碘钨灯辐照条件下，当条斑紫菜藻红蛋白R-PE浓度为10 ii g. mL—1时， 对咽喉癌H印-2细胞杀伤效果不显著(存活率79% )，在浓度增加到5倍时，咽喉癌H印-2 细胞存活率为43%，当浓度为100ii g. mL-l时，咽喉癌H印-2细胞存活率仅为23%，杀伤 效果极其显著，甚至低于所报道的用提取自多管藻的藻红蛋白激光光动力条件下处理口腔 8113细胞的存活率。 条斑紫菜藻蓝蛋白C-PC对咽喉癌H印-2细胞的处理结果与条斑紫菜藻红蛋白 R-PE类似，在其蛋白浓度为100ii g. mL—1时，在辐照条件下的细胞存活率仅为34%。
如不加藻胆蛋白，光用碘钨灯辐照对咽喉癌H印-2细胞的杀伤效果不明显，在累 计辐照能量达到100J. cm—2时的细胞存活率为87%。 在不加碘钨灯辐照的条件下，藻胆蛋白对咽喉癌H印-2细胞的作用效果较为复 杂。总体来说，随着蛋白浓度增大，藻胆蛋白对咽喉癌H印-2细胞的抑制率增加。在24-72h 内，藻胆蛋白对咽喉癌H印-2细胞的抑制作用随时间成正比，在lOOyg. mL—1的条斑紫菜藻红蛋白R-PE作用细胞后72小时内，咽喉癌H印-2细胞存活率降为68% ，与相同浓度条斑紫 菜藻红蛋白R-PE光动力作用后的细胞存活率(23% )相比很不明显。单用条斑紫菜藻蓝蛋 白C-PC的作用效果与条斑紫菜藻红蛋白R-PE相似，细胞最低存活率为73%。
总而言之，结果表明条斑紫菜藻红蛋白R-PE和条斑紫菜藻蓝蛋白C-PC在碘钨灯 辐照下对咽喉癌H印-2细胞确有明显杀伤效果。
权利要求
藻胆蛋白在制备以碘钨灯治咽喉癌细胞的光敏剂中的应用。
全文摘要
藻胆蛋白在制备以碘钨灯治咽喉癌细胞的光敏剂中的应用。本发明所指的藻胆蛋白是选择从条斑紫菜中提取的条斑紫菜藻红蛋白R-PE、条斑紫菜藻蓝蛋白C-PC，在碘钨灯下，对咽喉癌Hep-2细胞具有杀伤作用且有较高杀伤率，是一种有效的光敏剂。其来源丰富，价格低廉，提取工艺简单，采用碘钨灯作为光源且体积小巧、价格低廉、光源成本低，总之，利用条斑紫菜藻红蛋白R-PE或条斑紫菜藻蓝蛋白C-PC作为光敏剂，在碘钨灯下灭杀咽喉癌Hep-2细胞，可以大大降低在光动力治疗的过程中的使用成本，有利于广泛推广使用。
文档编号A61K41/00GK101757608SQ20081020769
公开日2010年6月30日 申请日期2008年12月25日 优先权日2008年12月25日
发明者何培民, 李春霞, 柳俊秀, 汪卿, 王源, 蔡春尔 申请人:上海海洋大学