专利名称：：花色苷及调控ywhag基因的表达在防治动脉粥样硬化中的应用的利记博彩app
技术领域：
：本发明涉及一种花色苷的单体，矢车菊素-3,5-二葡萄糖苷改善氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)致小鼠RAW264.7巨噬细胞系损伤的作用，并探讨其作用机制。因此，矢车菊素-3,5-二葡萄糖苷可在制备治疗或预防动脉粥样硬化发生发展的药物中应用。为了实现上述目的，本发明采用以下技术措施本发明采用小鼠RAW264.7巨噬细胞(小鼠单核巨噬细胞白血病细胞，来源于上海中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，目录号TCM13)进行实验，通过噻唑蓝(MTT)法测定矢车菊素-3,5-二葡萄糖苷(购于美国Sigma公司，目录号74397)对ox-LDL处理的RAW264.7巨噬细胞活性的影响。并提取细胞总RNA，用AffymetrixMouseU4302.0基因表达谱芯片(来源于美国Affymetrix公司)进行标记杂交实验，RMA(Robustmultiarrayanalysis)法对Affyemtrix基因芯片的扫描结果进行差异基因分析，筛选出差异基因，随后采用实时定量PCR法对表达的差异基因进行进一步验证，具体探讨矢车菊素-3,5-二葡萄糖苷的作用机制。具体
发明内容如下A.矢车菊素-3,5-二葡萄糖苷为花色苷单体(购买于美国Sigma公司，目录号74397)，可人工合成，研究证实无任何毒副作用。B.矢车菊素-3,5-二葡萄糖苷对小鼠RAW264.7巨噬细胞的作用将培养的小鼠RAW264.7巨噬细胞(来源于上海中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，目录号TCM13)接种于96孔板，待细胞长成80~90%融合的单层后，随机分为6组，即空白对照组、30、60、90、120、150pmol/L花色苷组，每组重复8孔，分别加以0、30、60、90、120、150pmol/L矢车菊素-3,5-二葡萄糖苷处理，置于37。C、5%C02培养箱中培养24小时后，以3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(噻唑蓝，MTT)法检测细胞的存活率，倒置相差显微镜观察细胞的形态。C.矢车菊素-3,5-二葡萄糖苷对氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)致小鼠RAW264.7巨噬细胞系损伤的改善作用将培养的小鼠RAW264.7巨噬细胞接种于96孔板，待细胞长成80~90%融合的单层后，随机分为6组，即空白对照组、0、30、60、90、120pmol/L花色苷组，每组重复8孔，实验中先以0、30、60、90、120pmol/L浓度的矢车菊素-3,5-二葡萄糖苷预处理细胞1小时，然后加入ox-LDL(终浓度40mg/L)，空白对照组用无血清常规RPMI1640培养基代替ox-LDL和花色苷，置于37。C、5y。C02培养箱中共同孵育24小时后，以倒置相差显微镜观察细胞的形态，MTT法检测细胞的存活率。D.矢车菊素-3,5-二葡萄糖苷对ox-LDL处理小鼠RAW264.7巨噬细胞系基因表达谱的作用将培养的小鼠RAW264.7巨噬细胞接种于60ml培养瓶中，待细胞长成80~90%融合的单层后，随机分为3组，g口①对照组RPMI1640培养基常规培养细胞；②ox-LDL组ox-LDL终浓度为40mg/L;③花色苷+ox-LDL组先用60pmol/L的花色苷培养细胞1小时，然后加入终浓度为40mg/L的ox-LDL。每组重复3次，各组细胞继续培养24小时后收获细胞，分别提取纯化各组细胞总RNA，利用AffymetrixMouseU4302.0基因表达谱芯片(来源于美国Affymetrix公司)进行标记杂交实验，RMA(Robustmultiarrayanalysis)法对Affyemtrix基因芯片的扫描结果进行差异基因分析，筛选出差异基因。E.矢车菊素-3,5-二葡萄糖苷对ox-LDL处理小鼠RAW264.7巨噬细胞系YWHAG(酪氨酸3-单加氧酶/色氨酸5-单加氧酶激活蛋白，Y多肽)基因表达的作用将培养的小鼠RAW264.7巨噬细胞接种于60ml培养瓶中，待细胞长成80~90%融合的单层后，随机分为3组，即①对照组RPMI1640培养基常规培养细胞；②ox-LDL组ox-LDL终浓度为40mg/L;③花色苷+ox-LDL组先用60pmol/L的花色苷培养细胞1小时，然后加入终浓度为40mg/L的ox-LDL。每组重复3次，各组细胞继续培养24小时后收获细胞，分别提取纯化各组细胞总RNA，用实时定量PCR法对基因芯片筛选出的差异基因YWHAG的表达进行检测。本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果1、矢车菊素-3,5-二葡萄糖苷为一种花色苷的单体，化学结构清楚，可人工合成，研究证实无任何毒副作用。2、本发明表明，当矢车菊素-3,5-二葡萄糖苷浓度为30、60、90、120pmol/L时，小鼠RAW264.7巨噬细胞呈椭圆形，细胞生长状态良好，MTT结果显示细胞活力与正常对照组没有显著差异。说明矢车菊素-3,5-二葡萄糖苷浓度在30120pmol/L范围内为安全浓度。3、本发明表明，矢车菊素-3，5-二葡萄糖苷浓度在30~120pmol/L范围内均可改善ox-LDL对RAW264.7细胞的损伤作用，且其改善作用没有剂量依赖性。4、本发明表明，矢车菊素-3,5-二葡萄糖苷主要保护了ox-LDL对脂质内膜的破坏，增强了细胞增殖能力和组织结构的再形成能力。5、本发明表明，矢车菊素-3,5-二葡萄糖苷能上调ox-LDL导致的YWHAG蛋白基因的低表达，从而发挥其抗动脉粥样硬化作用。图1.不同浓度花色苷作用于RAW264.7巨噬细胞24小时后细胞活力比较。*与对照组比较，p<0.05。图2.不同浓度花色苷对氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)处理的RAW264.7巨噬细胞活力的影响。*与对照组比较，P<0.05;#与ox-LDL组比较，P〈0.05。图3.显微镜下观察120pmol/L花色苷对氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)处理RAW264.7巨噬细胞的形态(x200)。图4.定量PCR中Ct值(Cyclethreshold,循环阈值)设定示意图。图5.定量PCR法检测各组细胞中YWHAG基因的表达水平。具体实施例方式下面用矢车菊素-3,5-二葡萄糖苷进行关于对氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)处理的小鼠RAW264.7巨噬细胞系保护作用的实验研究及机制探讨，说明其在制药领域的新用途。实施例1:矢车菊素-3，5-二葡萄糖苷对小鼠RAW264.7巨噬细胞的作用1实验材料1.1实验药物矢车菊素-3,5-二葡萄糖苷为花色苷的一种单体，购于美国Sigma公司，目录号74397，英文名Cyaninchloride,也称为Cyanidin-3,5-di-0-glucoside，分子式C27H31C10I6,分子量646.98，化学结构如下所示。一OH1.2实验对象小鼠RAW264.7巨噬细胞即小鼠单核巨噬细胞白血病细胞，来源于上海中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，目录号TCM13。1.3试剂3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(噻唑蓝，MTT)购自美国Fluka公司；二甲基亚砜(DMSO)购自美国Sigma公司；RPMI-1640培养基及胎牛血清购自美国GibC0公司；胰蛋白酶购自武汉生命科学技术公司。1.4仪器二氧化碳培养箱购自美国SHEL-LAB公司；超净工作台(YJ-1450型)购自苏州净化设备公司；倒置相差显微镜购自德国LEICA公司；荧光酶标仪购自瑞士TECAN公司。2实验方法2.1RAW264.7细胞的培养正常生长的RAW264.7细胞培养于含10%胎牛血清、20%mmol/L4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)及125mg/L谷氨酸盐的RPMI-1640培养基中，培养条件为37°C、5%C02,接种密度为1x107个/L，倍增时间为4S72h。2.2分组及给药方法采用不含血清的RPMI-1640培养基依次稀释矢车菊素-3,5-二葡萄糖苷。常规培养RAW264.7细胞，调整细胞密度为1x107个/L，然后均匀接种于无菌96孔培养板中，37°C、5%(302培养24小时，使细胞生长成良好单层。实验开始前用等体积无血清培养基静止培养24小时使细胞同步化，随后随机分为①空白对照组无血清培养基培养；②花色苷组矢车菊素-3，5-二葡萄糖苷终浓度分别为30、60、90、120、150nmol/L。每组重复8孔，置于37。C、5%(302培养箱中培养24小时后进行检测。2.3MTT法培养于96孔板中的细胞处理结束后，吸出细胞孔中的残余液体，用预热至37'C的PBS溶液漂洗2次；然后每孔加20^的MTT(5mg/ml溶于磷酸盐缓冲液)溶液及180^的不含血清的RPM-I1640培养基，于37。C继续培养4小时；随后每孔加入100^DMSO，在水平摇床上缓慢振荡IO分钟，以溶解细胞中的紫色结晶物；最后在酶标仪上570nm处测定其光吸收值。细胞对照空OD值-实验孔OD值细胞增殖抑制率(％)=-,一—"~^-X100%细胞对照空OD值2.4观测的指标(1)倒置相差显微镜观察细胞形态改变(2)MTT法检测细胞活力2.5数据处理数据以5is表示，多组均数进行方差齐性检验和单因素方差分析，各组间的比较采用Tukey法。3实验结果倒置相差显微镜观察显示，正常的RAW264.7细胞呈椭圆形或多边形，贴壁生长。当矢车菊素-3,5-二葡萄糖苷浓度为30、60、90、120pmol/L时，细胞仍呈椭圆形，细胞生长状态良好。当矢车菊素-3,5-二葡萄糖苷浓度达150pmol/L时，.出现部分细胞脱落、漂浮。MTT实验结果(图l)显示，当矢车菊素-3,5-二葡萄糖苷浓度为30、60、90、120pmol/L时，细胞活力与正常对照组无明显差异。当矢车菊素-3,5-二葡萄糖苷浓度达150]imol/L时，细胞活力与正常对照组相比明显下降。以上实验结果表明，矢车菊素-3,5-二葡萄糖苷浓度在30120^mol/L范围内为安全浓度。实施例2:矢车菊素-3，5-二葡萄糖苷对ox-LDL致小鼠RAW264.7巨噬细胞系损伤的改善作用1实验材料1.1实验药物矢车菊素-3,5-二葡萄糖苷同具体实施例l。1.2实验对象小鼠RAW264.7巨噬细胞同具体实施例1。1.3试剂ox-LDL购自北京协和生化室；MTT购自美国Fluka公司；DMSO购自美国Sigma公司；RPMI-1640培养基及胎牛血清购自美国Gibco公司；胰蛋白酶购自武汉生命科学技术公司。1.4仪器同具体实施例1。2实验方法-.2.1RAW264.7细胞的培养同具体实施例1。2.2分组及给药方法采用不含血清的RPMI-1640培养基依次稀释矢车菊素-3,5-二葡萄糖苷。常规培养RAW264.7细胞，调整细胞密度为1xl07个/L，然后均匀接种于无菌96孔培养板中，37°C、5XC02培养24小时，使细胞生长成良好单层。实验开始前用等体积无血清培养基静止培养24小时使之同步化，随后随机分为①空白对照组无血清培养基常规培养；②ox-LDL组ox-LDL终浓度为40mg/L。③花色苷+ox-LDL组分别用安全浓度为30、60、90、120pmol/L的矢车菊素-3,5-二葡萄糖苷培养细胞1小时，然后加入终浓度为40mg/L的ox-LDL继续培养。每组重复8孔，置于37°C、5%C02培养箱中培养24小时后进行检测。2.3MTT法同具体实施例1。2.4观测的指标(1)倒置相差显微镜观察细胞形态改变。(2)MTT法检测细胞活力2.5.数据处理数据以^±5表示，多组均数进行方差齐性检验和单因素方差分析，各组间的比较采用Tukey法。3实验结果MTT实验结果(图2)显示，40mg/L的ox-LDL能明显降低细胞活力，而不同安全浓度的矢车菊素-3,5-二葡萄糖苷(30、60、90、120nmol/L)均能明显改善ox-LDL对细胞的损伤，提高细胞活力。图3显示的是倒置相差显微镜下观察的正常对照、40mg/L的ox-LDL及矢车菊素-3,5-二葡萄糖苷浓度为120pmol/L是细胞的生长状况图。以上实验结果表明，矢车菊素-3,5-二葡萄糖苷可改善ox-LDL对RAW264.7细胞的损伤，且浓度没有剂量依赖性。实施例3:矢车菊素-3,5-二葡萄糖苷对ox-LDL处理小鼠RAW264.7巨噬细胞系基因表达谱的作用1实验材料1.1实验药物矢车菊素-3,5-二葡萄糖苷同具体实施例l。1.2实验对象小鼠RAW264.7巨噬细胞同具体实施例l。1.3试剂ox-LDL购自北京协和生化室；MTT购自美国Fluka公司；DMSO购自美国Sigma公司；RPMI-1640培养基及胎牛血清购自美国Gibco公司；胰蛋白酶购自武汉生命科学技术公司；TRIZOL试剂购自上海生物工程公司产品；RNA纯化试剂盒(RNeasyTotalRNAIsolationkit)来源于美国QIAGEN公司；AffymetrixMouseU4302.0基因表达谱芯片来源于美国Affymetrix公司；逆转录试剂盒购自美国Promega公司；乙醇、异丙醇、正庚垸、正己垸、乙腈均为色谱级，购自上海国药集团；三氯乙酸、氢氧化钠、氢氧化钾、氯仿均为化学纯，购自上海国药集团。1.4仪器'二氧化碳培养箱购自美国SHEL-LAB公司；超净工作台(YJ-1450型)购自苏州净化设备公司；倒置相差显微镜购自德国LEICA公司。2实验方法2.1RAW264.7细胞的培养同具体实施例l。2.2分组及给药方法常规培养RAW264.7细胞，调整细胞密度为1xl(^个/L，然后均匀接种于无菌60ml培养瓶中，37°C、5XC02培养24小时，使细胞生长成良好单层。实验开始前用等体积无血清培养基静止培养24小时使之同步化，随后随机分为-①空白对照组无血清培养基常规培养；②ox-LDL组ox-LDL终浓度为40mg/L。③花色苷+ox-LDL组先用60pmol/L的矢车菊素-3,5-二葡萄糖苷培养细胞1小时，然后加入终浓度为40mg/L的ox-LDL继续培养。每组重复3次，置于37°C、5%C02培养箱中继续培养24小时后收获细胞供检测。2.3RNA的提取及检测2.3.1总RNA的提取(TRIZOL法).1)均质化取2xl(/细胞加入lmlTRIZOL，用lml移液器反复吹打。2)均质化的样品在153(TC放置5分钟，然后加入0.2倍体积的氯仿，盖子盖紧后剧烈振摇15秒使混匀，在1530。C放置23分钟，4°C，7000rpm离心15分钟，离心后形成下层红色的酚氯仿相，中间相和上层无色水相。3)将上层水相转移至一个新的离心管(水相的体积大约为均质化时所用TRIZOLl体积的60。/。)，加入0.8倍体积的异丙醇，剧烈振摇使混匀，4'C，7000rpm离心15分钟，弃上清。4)加入70%(ml/ml)酒精，颠倒离心管数次以洗去沉淀所含盐分。如沉淀较大可用移液器头先将沉淀打散。然后4。C，7000rpm离心10分钟，弃上清。5)重复以上步骤l次。6)153(TC晾干，然后加入适量的无RNA酶的水溶解。.7)用分光光度计分析RNA浓度，在260nm波长，10D约等于40叱/ml的RNA。8)1%(mg/ml)琼脂糖电泳。2.3.2RNA的纯化(QIAGENRNeasyTotal認AIsolationkit)具体方法按QIAGEN公司随试剂盒提供的操作手册进行。2.4基因芯片和分析方法基因芯片制作由上海生物芯片有限公司完成。使用AffymetrixMouseU4302.0基因表达谱芯片，该芯片含45000个探针集，34000个已知功能基因2.4.1样本类型与基因芯片编号表l:样本分组及意义<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>应用RMA(Robustmultiarrayanalysis)对Affyemtrix基因芯片的eel格式文件进行数据预处理，该文件中包含了每个探针集的原始强度。RMA完全基于基因的PM探针信号值，在计算信号值的过程中，进行五个步骤'①通过探针邻近区域背景的加权平均对每个探针背景校正；②去除信号响应值为P的基因占基因总数比例低于50%的样本；③对校正后的PM对数转换；估计PM对数转换后的均值，而后对均值进行指数化；⑤对指数化后的均值去除极大极小值后，进行标准化。2.4.3差异基因显著性分析经过数据预处理后，分析花色苷+ox-LDL组、正常对照、ox-LDL组三组间的差异表达基因。寻找组间差异基因的方法是基于随机方差模型的方差分析方法。由于每组中的样本数量较少，无法判断样本分布是否符合正态分布，因此，不能简单地使用基于正态分布进行分组样本的方差分析。在此，使用贝叶斯统计理论的共轭先验分布推断基因标化后信号值(之后简称信号值)在样本中的均值和方差中的分布。若要保证两者符合正态分布，则这两者的联合共轭先验分布则应该为反伽马分布。因此，问题将溯源至确定先验分布是否为反伽马分布，而后在确定其超参数。在此，发明人使用极大似然法确定先验分布。由于随机方差模型分析根据实际数据推断先验分布，从而推断出理论分布，因此，在应用贝叶斯方法处理统计问题时，不但完全利用有限的样本信息，还利用7先验分布，从而推导出实际的后验分布状况。因此，大大增加了对有限信息的利用效率，从而更为有效地提高差异表达基因鉴别的准确性。2.4.4分析对象花色苷+ox-LDL组、正常对照、ox-LDL组三组的所有基因检测值。2.4.5统计学方法在此，以任何两个分组间之间都不存在差异作为零假设，而后检验零假设是否成立，从而发现分组间的显著性差异基因。在此，t值为<formula>formulaseeoriginaldocumentpage16</formula>23实验结果基因芯片结果显示在34000个已知功能基因中，有差异基因309条。其中，ox-LDL组和对照组比较上调基因24条，下调基因87条；花色苷+ox-LDL组和ox-LDL组比较上调基因16条，下调基因22条。经共表达基因的显著性分析后，筛选出两个基因群构建基因功能相似性网络，计算网络中心点，得出在花色苷+ox-LDL组禾Dox-LDL组比较中，YWHAG(酪氨酸3-单加氧酶/色氨酸5-单加氧酶激活蛋白，Y多肽)基因是矢车菊素-3,5-二葡萄糖苷上调的主要调控基因。矢车菊素-3，5-二葡萄糖苷主要保护了ox-LDL对脂质内膜的破坏，增强了细胞增殖能力和组织结构的再形成能力。实施例4:矢车菊素-3,5-二葡萄糖苷对ox-LDL处理小鼠RAW264.7巨噬细胞系YWHAG(酪氨酸3-单加氧酶/色氨酸5-单加氧酶激活蛋白，Y多肽)基因表达的作用1实验材料1.1实验药物矢车菊素-3,5-二葡萄糖苷同具体实施例l。1.2实验对象小鼠RAW264.7巨噬细胞同具体实施例1。1.3'试剂ox-LDL购自北京协和生化室；MTT购自美国Fluka公司；DMSO购自美国Sigma公司；RPMI-1640培养基及胎牛血清购自美国Gibco公司；胰蛋白酶购自武汉生命科学技术公司；TRIZOL试剂购自上海生物工程公司产品；RNA纯化试剂盒(RNeasyTotalRNAIsolationkit)来源于美国QIAGEN公司；反转录试剂购于美国Invitrogen公司；定量PCR试剂(PowerSYBRGreenPCRMasterMix)购于美国ABI公司；引物由上海英骏生物技术有限公司合成；乙醇、异丙醇、正庚烷、正己烷、乙腈均为色谱级，购自上海国药集团；三氯乙酸、氢氧化钠、氢氧化钾、氯仿均为化学纯，购自上海国药集团。1.4仪器二氧化碳培养箱购自美国SHEL-LAB公司；超净工作台(YJ-1450型)购自苏州净化设备公司；倒置相差显微镜购自德国LEICA公司；定量PCR仪(7300SequenceDetectionSystem)购于美国ABI公司。2实验方法2.1RAW264.7细胞的培养同具体实施例1。2.2分组及给药方法常规培养RAW264.7细胞，调整细胞密度为1xlO7个/L，然后均匀接种于无菌60ml培养瓶中，37°C、5%<:02培养24小时，使细胞生长成良好单层。实验开始前用等体积无血清培养基静止培养24小时使之同步化，随后随机分为-①空白对照组无血清培养基常规培养；②ox-LDL组ox-LDL终浓度为40mg/L。③花色苷+ox-LDL组先用60pmol/L的矢车菊素-3,5-二葡萄糖苷培养细胞1小时，然后加入终浓度为40mg/L的ox-LDL继续培养。每组重复3次，置于37°C、5%C02培养箱中继续培养24小时后收获细胞供检测。2.3RNA的提取及检测2.3.1总RNA的提取(TRIZOL法)同具体实施例3。2.3.2RNA的纯化(QIAGEN脂easyTotalRNAIsolationkit)同具体实施例3。2.4RT-PCR反应2.4.1cDNA第一链合成(1)从-8(TC冰箱中取出RNA，在2025。C下解冻，然后在0.2mlPCR管中配制反应溶液。总RNA3叱01igo-dT(15)(lpg/|il)0.5|aldNTPmix(10mM)ddH20CDEPC)_Xpi总体积12^1(2)将反应管置于PCR仪中，65'C预变性5分钟。(3)变性反应结束后在PCR管中配制cDNA第一链合成反应体系5Xfirst-strandbuffer4.0pi0.1MDTT2.0^1RNAinhibitor1.0^1SuperscriptII(200U/1.0ddH20(DEPC)_Xpl总体积20|al(4)将PCR管子置于PCR仪中进行反应，42'C保温50分钟后，7(TC变性15分钟，4'C保存。2.4.2SYBRGreenRT-PCR反应体系2xSYBRGreenPCRbuffer12.5ulprimer(5pmo1)1Template(10ng)+ddH2011.5|al5(TC孵育2分钟，然后95'C，IO分钟；接着进行40个循环95°C，15秒；60°C，l分钟。仪器使用ABI公司的Prism7300系统。2.4.3YWHAG基因引物设计引物设计如下ForwardPrimer:GCGCGGACGTTCTCAGAReversePrimer:CCTTAGCGAAACACGGAGTTG2.5'统计、作图方法(1)通过一系列的参数设定分析，得到不同样本相对于不同基因的Ct值。Ct值，C代表Cycle(循环)，t代表threshold(阈值)，Ct值的含义是每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数(如图4所示)。.(2)研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。因为比较的是转录水平的差异，所以通过检测每个样品的管家基因，将目的基因归一化。PCR产物的增长形式为2n，如果各种试剂和外部所加条件均理想化，N就是循环数。所以先得到ACt:Ct待测基因一Ct管家基因，再转换为原始模板浓度=2.ACt2.6重复性检验每个样品3个平行样，计算同一样品的3个平行样Ct值的变异系数，分析样品目标基因定量结果的批内变异系数。3实验结果实时定量RT-PCR结果如图5所示，其进一步验证了基因芯片结果，证实矢车菊素-3,5-二葡萄糖苷能上调ox-LDL导致的小鼠RAW264.7巨噬细胞中YWHAG基因的低表达。权利要求1、一种花色苷在制备治疗或预防动脉粥样硬化的药物中的应用。2、一种调控YWHAG基因的表达在制备治疗或预防动脉粥样硬化药物中的应用。3、根据权利要求1所述的一种应用，其特征在于所述的花色苷为矢车菊素-3,5-二葡萄糖苷。全文摘要本发明公开了一种花色苷及调控YWHAG基因的表达在制备治疗动脉粥样硬化药物中的用途。涉及花色苷单体矢车菊素-3，5-二葡萄糖苷对氧化低密度脂蛋白致巨噬细胞损伤的改善作用，并探讨其作用机制。本发明采用小鼠RAW264.7巨噬细胞系进行实验，通过MTT法测定矢车菊素-3，5-二葡萄糖苷对氧化低密度脂蛋白处理的RAW264.7巨噬细胞活性的影响。并提取细胞总RNA，用AffymetrixMouseU4302.0基因表达谱芯片进行标记杂交实验，RMA法对Affyemtrix基因芯片的扫描结果进行差异基因分析，筛选出差异基因，随后采用实时定量PCR法对表达的差异基因进行进一步验证。结果证实，矢车菊素-3，5-二葡萄糖苷能上调YWHAG基因表达，对氧化低密度脂蛋白损伤的巨噬细胞具有明显的保护作用。文档编号A61K31/7042GK101347441SQ20081019685公开日2009年1月21日申请日期2008年9月3日优先权日2008年9月3日发明者张叶敏,阳李,欧阳静萍,毕勇毅,同沈,王保华申请人:武汉大学