专利名称：牦牛大肠埃希氏菌病灭活疫苗及其制备方法和应用的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及一种兽用灭活疫苗及其制备方法，具体地，本发明涉及一种牦 牛大肠埃希氏菌病灭活疫苗及其制备方法和应用。属于生物医药技术领域。
背景技术：
大肠埃希氏菌病，俗称"大肠杆菌病"，是牦牛的一种重要传染病，在西藏 又称为牦牛"瘦死病"，对牦牛生产产生严重的危害。致病性大肠杆菌产生肠毒 素， 一般将产生肠毒素的致病性大肠杆菌统称为产肠毒性大肠杆菌 (￡> /erator扭n/c co// ， ETFC)。
西藏属高海拔、高寒地区，拥有广袤的藏北草原、邦达草原等，是我国五 大牧区之一。有"高原之舟"美称的牦牛是主要牲畜，它提供给广大牧民们肉 食、奶、酥油、毛皮等人们的衣食住行都离不开它。牦牛养殖业是藏族人们的 传统产业，也是西藏农牧民耐以生存和发展的最重要的支柱产业，也是提高我
区人民收入水平和提高生活质量的支柱之一。西藏自治区有牦牛400万余头， 预期收入可达人民币80亿元。然而牦牛"瘦死病"严重地危害着牦牛的养殖， 据调査，牦牛"痩死病"发病率为10.1%，死亡率为2.5%，致死率为45.0%。 牦牛的死亡，给农牧民带来较大的经济损失，使西藏畜牧产业的发展受到影响。 全国有牦牛1300万余头，发生该病所造成的经济损失更是难以估量。因此，尽 早有效地解决牦牛"瘦死病"的防疫问题已迫在眉睫。
发明内容
本发明的目的在于提供一种牦牛大肠埃希氏菌病灭活疫苗及其制备方法和 应用。该疫苗安全、抗体效价高，对牦牛具有较好的免疫保护性。 本发明的具体技术方案如下-
一种牦牛大肠埃希氏菌病灭活疫苗，其特征在于它是由5份体积的灭活
菌液与1份体积的氢氧化铝胶混匀得到的含菌数为15 20亿/mL的铝胶苗；其 中，配制菌液的菌株为牦牛大肠埃希氏菌西藏-9903，该菌株的保藏编号为 CCTCCNO: M 208216。
所述氢氧化铝胶的制备方法为先用无离子水将三氧化铝配成8% (W/V)
的溶液，加温至56 6(TC;再用无离子水将氢氧化钠配成4% (W/V)的溶液， 逐滴加入三氯化铝溶液中，至pH达5.6 6.0为终点；然后56 60。C保温8
410min，最后再分装于瓶中12rC灭菌25 30min，经无菌检查后2'C 8'C保存
备用o
本发明所述牦牛大肠埃希氏菌病灭活疫苗的制备方法按如下工艺步骤进
行
A、 菌株的分离及保藏
本发明所述的菌株为从西藏自然病死的牦牛体内分离得到，为革兰氏阴性 杆菌，有鞭毛，生化特性符合细菌分类学中大肠埃希氏菌的特性，属产肠毒素
性大肠杆菌，该菌株已于2008年11月11日在中国典型培养物保藏中心保藏， 保藏编号为CCTCCNO: M 208216。
B、 培养基的制备
a牦牛肉汤的制备
取新鲜优质的牦牛臀部肉，去除脂肪、筋膜后绞碎，将碎肉与蒸馏水按1 : 2 的重量/体积比混合搅拌均匀后，置于2'C 8'C的温度下浸泡过夜。次日取出 后再煮沸25 30分钟并不断搅拌，经过滤后，将肉汤与从肉渣中压榨出的肉汤 混合，再置于2'C 8'C的温度下沉淀过夜，次日吸上清液经滤纸过滤，滤液即 为牦牛肉汤，经12rC灭i25 30分钟后于2'C 8'C贮存备用。
b蛋白胨牦牛肉汤的制备
取蛋白胨2克、氯化钠0.5克及肉汤100毫升置于有刻度的容器中，在搅 拌下于5(TC 6(TC加热溶解至煮沸，然后用40% (W/V)氢氧化钠溶液将肉汤 的pH调节至7.4 7.6，并继续煮沸8 10分钟，补足失去的水分，用滤纸过滤， 滤液经121'C灭菌25 30分钟后2。C 8。C贮存备用。
c固体培养基的制备
取蛋白胨牦牛肉汤100亳升，加入1.5克的琼脂粉后置于有刻度的容器中， 在搅拌下于90。C 95。C加热溶解至煮沸，然后用40。/。氢氧化钠溶液将肉汤的pH 调节至7.4 7.6，并继续煮沸8 10分钟，补足失去的水分，用2层纱布包1 层脱脂棉过滤，滤液经12rC灭菌25 30分钟后制成普通琼脂斜面和普通琼脂 平板，待凝固后置于36 37'C培养22 24小时作无菌检查。
C、 生产用种子的制备 a —级种子繁殖
取2'C 8'C保藏的真空冷冻干燥菌种1株，酒精棉球消毒后，用砂轮划痕 后掰开，用灭菌lmL注射器吸取0.5mL蛋白胨牦牛肉汤将冻干菌种融化，在蛋 白胨牦牛肉汤中接种0.3mL，置36 37'C培养12 18小时；然后划线接种于 普通琼脂平板上，36 37。C培养12 18小时，选取光滑圆整菌落5 10个，混 合后再接种于普通琼脂斜面上，36 37'C培养12 18小时，取培养物作革兰氏
5染色镜检，纯粹后作为一级种子。 b 二级种子繁殖
取一级种子接种于蛋白胨牦牛肉汤培养基中，36 37'C振摇100 120rpm/min，培养12 18小时，取培养物作革兰氏染色镜检和纯粹检验，纯粹 后作为制苗种子。
D、 制苗用菌液的制备 a菌液培养
将制苗种子按培养基总量的1%接种于蛋白胨牦牛肉汤培养基中，36 37 "C搅拌培养12 16小时；发酵条件为先于0.05 0.1Mpa下通3 4小时的小 气量，接着于0.15 0.2Mpa下通4 5小时的中气量，最后于0.25 0.3Mpa下 通5 7小时的大气量。
b菌液灭活
于菌液中加入占其总重量0.3 0.6% (V/V)的甲醛溶液，搅拌30分钟， 其间每隔2小时搅拌5分钟，36 37'C灭活22 24小时并作无菌检验。
E、 配苗
取5份体积的灭活菌液，加入1份体积的氢氧化铝胶，即制成含菌数达15 20亿/mL的铝胶苗亦即牦牛大肠埃希氏菌病灭活疫苗。
F、 分装及成品检验
按100mL/瓶分装为成品，经无菌检査后于2。C 8。C保存。 本发明所述的牦牛大肠埃希氏菌病灭活疫苗成品经物理性状检验上部为 淡黄色澄明液体，下部为黄白色沉淀物(沉淀物为灭活的牦牛ETEC菌和铝胶 佐剂)，振摇后成均匀混浊液。经无菌检验逐瓶取样培养96小时无菌生长； 经安全检验用6倍量的灭活疫苗接种动物观察30日均无不良反应；经免疫效 力检验灭活疫苗免疫动物后，血清抗体效价高，100%的免疫动物受到保护，
即该灭活疫苗符合中华人民共和国《兽用生物制品质量标准》。
本发明所述牦牛大肠埃希氏菌病灭活疫苗的应用方法如下
作用与用途用于预防粍牛"瘦死病"或称牦牛大肠杆菌病，牦牛注射该 灭活疫苗后，可获得6 12个月的免疫期。
用法与用量牦牛不论大小， 一律初次免疫，每头牦牛颈部皮下接种疫苗 l毫升；第14日再次免疫，即每头牦牛颈部皮下接种疫苗2毫升。
贮藏:2 8°〇保存，有效期为1 1.5年。
注意事项疫苗在临用前应仔细检査，瓶内有异物或摇不散的凝块等物均 不宜使用；注射前将疫苗振摇使其充分均匀；应防冻，冻结后不能使用。
下面通过有关试验数据，对本发明所述牦牛大肠埃希氏菌病灭活疫苗的安全性、免疫效力、稳定性作进一步说明。
一、 安全性检验
1、 豚鼠用250 300克的豚鼠20只，分为4组，每组5只。1 3组为 试验组，4组为对照组。1、 2、 3组试验豚鼠分别接种疫苗，在每只豚鼠左大腿 内侧皮下接种牦牛大肠埃希氏菌病灭活疫苗lmL。 4组对照组在每只豚鼠左大 腿内侧皮下注射肉汤lmL。豚鼠接种疫苗后第14日，在右大腿内侧皮下再次 重复接种疫苗2mL。对照豚鼠每只在右大腿内侧皮下再次注射肉汤2mL。接种 后观察结果至14日，全部健活。
2、 家兔用0.8 1.0千克的家兔25只，分为5组，每组5只。1 3组 为试验组，4 5组为对照组。1、 2、 3组试验家兔接种疫苗，在每只家兔左侧 颈部皮下各接种牦牛大肠埃希氏菌病灭活疫苗lmL。 4 5组对照组在每只家兔 左侧颈部皮下注射肉汤lmL。家兔接种疫苗后第14日，在右侧颈部皮下再次 重复接种疫苗2mL。对照组家兔每只在右侧颈部皮下再次注射肉汤2mL。接种 后观察结果至14日，全部健活。
3、 牦牛用1 3月龄健康易感牦牛12头，分3组。1 2组为试验组， 每组5头；3组为对照组，2头。试验组每头牦牛接种牦牛大肠埃希氏菌病灭活 疫苗2mL。 1组牦牛在左侧颈部皮下接种；2组牦牛在左侧臀部肌肉接种。3组 的1头牦牛在左侧颈部皮下注射，另1头牦牛在左侧臀部肌肉注射，每头牦牛 注射肉汤2mL。牦牛接种疫苗后第14日，在右侧再次与首次接种的相同部位 重复接种疫苗4mL。对照牦牛每头再次注射肉汤4mL。接种后观察结果至14 日，全部健活。
4、 结论豚鼠、家兔、牦牛对疫苗是敏感的，同时使用疫苗后均是安全 的，否则豚鼠、家兔、牦牛注射后会有反应。豚鼠、家兔进行安全检验可以反 应疫苗对牦牛也是安全的。
二、 效力检验
1、 用豚鼠检用250 300克豚鼠5只，各皮下接种疫苗0.5mL，首免后 第14日，皮下加强接种疫苗lmL。加强接种后第22日，连同条件相同的对照 豚鼠5只，各皮下注射强毒液1MLD (含20 40亿个活菌，观察14日。对照 豚鼠死亡4只，免疫豚鼠全部保护。
2、 用牦牛检用3 6月龄健康易感牦牛5头，各皮下接种疫苗lmL，首 免后第14日，皮下加强接种疫苗2mL。加强接种后第22日，连同条件相同的 对照牦牛3头，各肌肉注射强毒菌液1MLD(含200 400亿个活菌)，观察14 日。对照牦牛死亡2头，免疫牦牛全部保护。
三、 抗体效价检测
7将12头试验牦牛随机分成3组，分别接种不同批号的疫苗。在每头牦牛颈 部皮下初次免疫接种lmL， 14日时再次免疫接种2mL。疫苗接种前和再次接种 疫苗后3、 6、 9、 12个月分别在试验和对照牦牛耳静脉采血，分离血清，在"V" 型96孔微量凝集板上进行凝集试验，血清倍比稀释，然后各孔加入50nl抗原。 大肠埃希氏菌阳性和阴性血清同被检粍牛血清的作法。置36。C 37。C温箱作用 2 4小时，再置室温放置过夜判定抗体效价，其结果是牦牛免疫后至12个月， 抗体效价为2.4 3.010，抗体效价仍然很高，牦牛体内抗体水平下降速度较慢。 牦牛对大肠埃希氏菌病灭活疫苗的免疫持续期可达12个月以上。
由上述可知，本发明的有益效果表现在
本发明所述的牦牛大肠埃希氏菌病灭活疫苗安全性好、抗体效价高，免疫 接种部位及接种后牦牛在生理、精神方面均未出现异常反应，因而对牦牛具有 较好的免疫保护性，解决了国内外牦牛大肠埃希氏菌病的防疫问题。
具体实施例方式
实施例l菌种保藏及氢氧化铝胶的制备
一种牦牛大肠埃希氏菌病灭活疫苗，其特征在于它是由5份体积的灭活 菌液与1份体积的氢氧化铝胶混匀得到的含菌数为15 20亿/mL的铝胶苗；其 中，配制菌液的菌株为牦牛大肠埃希氏菌西藏-9903，该菌株的保藏编号为 CCTCCNO: M 208216。
所述氢氧化铝胶的制备方法为先用无离子水将三氧化铝配成8% (W/V)
的溶液，加温至56 6(TC;再用无离子水将氢氧化钠配成4% (W/V)的溶液， 逐滴加入三氯化铝溶液中，至pH达5.6 6.0为终点；然后56 6(TC保温8 10min，最后再分装于瓶中12rC灭菌25 30min，经无菌检査后2'C 8。C保存
备用o
实施例2培养基的制备 a牦牛肉汤的制备
取新鲜优质的牦牛臀部肉，去除脂肪、筋膜后绞碎，将碎肉与蒸馏水按1 : 2 的重量/体积比混合搅拌均匀后，置于2'C 8'C的温度下浸泡过夜。次日取出 后再煮沸25 30分钟并不断搅拌，经过滤后，将肉汤与从肉渣中压榨出的肉汤 混合，再置于2'C 8。C的温度下沉淀过夜，次日吸上清液经滤纸过滤，滤液即 为牦牛肉汤，经12rC灭菌25 30分钟后于2。C 8。C贮存备用。
b蛋白胨牦牛肉汤的制备
取蛋白胨2克、氯化钠0.5克及肉汤100毫升置于有刻度的容器中，在搅拌下于50'C 6(TC加热溶解至煮沸，然后用40%氢氧化钠溶液将肉汤的pH调 节至7.4 7.6，并继续煮沸8 10分钟，补足失去的水分，用滤纸过滤，滤液 经12rC灭菌25 30分钟后2'C 8"C贮存备用。 c固体培养基的制备
取蛋白胨牦牛肉汤100毫升，加入1.5克的琼脂粉后置于有刻度的容器中， 在搅拌下于9(TC 95"C加热溶解至煮沸，然后用40n/。氢氧化钠溶液将肉汤的pH 调节至7.4 7.6，并继续煮沸8 10分钟，补足失去的水分，用2层纱布包1 层脱脂棉过滤，滤液经12rC灭菌25 30分钟后制成普通琼脂斜面和普通琼脂 平板，待凝固后置于36 37'C培养22 24小时作无菌检査。
实施例3生产用种子的制备 a —级种子繁殖
取2'C 8'C保藏的真空冷冻干燥菌种1株，酒精棉球消毒后，用砂轮划痕 后掰开，用灭菌lmL注射器吸取0.5mL蛋白胨牦牛肉汤将冻干菌种融化，在蛋 白胨牦牛肉汤中接种0.3mL，置36 37t培养12 18小时；然后划线接种于 普通琼脂平板上，36 37'C培养12 18小时，选取光滑圆整菌落5 10个，混 合后再接种于普通琼脂斜面上，36 37。C培养12 18小时，取培养物作革兰氏 染色镜检，纯粹后作为一级种子。 '
b 二级种子繁殖
取一级种子接种于蛋白胨牦牛肉汤培养基中，36 37t:振摇100 120rpm7min，培养12 18小时，取培养物作革兰氏染色镜检和纯粹检验，纯粹 后作为制苗种子。
实施例4制苗用菌液的制备 a 菌液培养
将制苗种子按培养基总量的1%接种于蛋白胨牦牛肉汤培养基中，36 37 'C搅拌培养12 16小时；发酵条件为先通3 4小时的小气量(把进气阀的 螺旋旋转1圈，进入少量气体，气体使菌液的液体微动)，接着通4 5小时的 中气量(把进气阀的螺旋旋转2圈，进入气体，气体使菌液的液体翻动)，最后 通5 7小时的大气量(把进气阀的螺旋旋转3圈，进入大量气体，气体使菌液 的液体像海水一样翻动)。
b菌液灭活
于菌液中加入占其总重量0.3 0.6% (V/V)的甲醛溶液，搅拌30分钟，
9其间每隔2小时搅拌5分钟，36 37'C灭活22 24小时并作无菌检验。 实施例5配苗及成品
取5份体积的灭活菌液，加入1份体积的氢氧化铝胶，即制成含菌数达15 20亿/mL的铝胶苗亦即牦牛大肠埃希氏菌病灭活疫苗。按100mL/瓶分装为成 品，经无菌检查后于2'C 8'C保存。
实施例6 成品检验
牦牛大肠埃希氏菌病灭活疫苗成品经物理性状检验上部为淡黄色澄明液 体，下部为黄白色沉淀物(沉淀物为灭活的牦牛ETEC菌和铝胶佐剂)，振摇后
成均匀混浊液。经无菌检验逐瓶取样培养96小时无菌生长；经安全检验用 6倍量的灭活疫苗接种动物观察30日均无不良反应；经免疫效力检验灭活疫
苗免疫动物后，血清抗体效价高，100%的免疫动物受到保护，即该灭活疫苗符
合中华人民共和国《兽用生物制品质量标准》。
权利要求
1、一种牦牛大肠埃希氏菌病灭活疫苗，其特征在于它是由5份体积的灭活菌液与1份体积的氢氧化铝胶混匀得到的含菌数为15～20亿/mL的铝胶苗；其中，配制菌液的菌株为牦牛大肠埃希氏菌西藏-9903，该菌株的保藏编号为CCTCC NOM208216；所述氢氧化铝胶的制备方法为先用无离子水将三氧化铝配成8％的溶液，加温至56～60℃；再用无离子水将氢氧化钠配成4％的溶液，逐滴加入三氯化铝溶液中，至pH达5.6～6.0为终点；然后56～60℃保温8～10min，最后再分装于瓶中121℃灭菌25～30min，经无菌检查后2℃～8℃保存备用。
2、 如权利要求1所述牦牛大肠埃希氏菌病灭活疫苗的制备方法，其特征在于按如下工艺步骤进行A、 菌株的分离及保藏从西藏自然病死的牦牛体内分离得到保藏编号为CCTCC NO: M 208216 的菌株；B、 培养基的制备a牦牛肉汤的制备取新鲜优质的粍牛臀部肉，去除脂肪、筋膜后绞碎，将碎肉与蒸馏水按1 : 2 的重量/体积比混合搅拌均匀后，置于2'C 8'C的温度下浸泡过夜，次日取出 后再煮沸25 30分钟并不断搅拌，经过滤后，将肉汤与从肉渣中压榨出的肉汤 混合，再置于2。C 8"C的温度下沉淀过夜，次日再吸上清液经滤纸过滤，滤液 即为牦牛肉汤，经12rC灭菌25 30分钟后于2。C 8。C贮存备用；b蛋白胨牦牛肉汤的制备取蛋白胨2克、氯化钠0.5克及肉汤100毫升置于有刻度的容器中，在搅 拌下于5(TC 6(TC加热溶解至煮沸，然后用40%氢氧化钠溶液将肉汤的pH调 节至7.4 7.6，并继续煮沸8 10分钟，补足失去的水分，用滤纸过滤，滤液 经121。C灭菌25 30分钟后2。C 8。C贮存备用；c固体培养基的制备取蛋白胨牦牛肉汤100毫升，加入1.5克的琼脂粉后置于有刻度的容器中， 在搅拌下于9(TC 95'C加热溶解至煮沸，然后用40。/。氢氧化钠溶液将肉汤的pH 调节至7.4 7.6,并继续煮沸8 10分钟，补足失去的水分，用2层纱布包1 层脱脂棉过滤，滤液经12rC灭菌25 30分钟后制成普通琼脂斜面和普通琼脂 平板，待凝固后置于36 37卩培养22 24小时作无菌检査；C、 生产用种子的制备a —级种子繁殖取2'C 8'C保藏的真空冷冻干燥菌种1株，酒精棉球消毒后，用砂轮划痕 后掰开，用灭菌lmL注射器吸取0.5mL蛋白胨牦牛肉汤将冻干菌种融化，在蛋 白胨牦牛肉汤中接种0.3mL，置36 37'C培养12 18小时；然后划线接种于 普通琼脂平板上，36 37t:培养12 18小时，选取光滑圆整菌落5 10个，混 合后再接种于普通琼脂斜面上，36 37'C培养12 18小时，取培养物作革兰氏 染色镜检，纯粹后作为一级种子；b 二级种子繁殖取一级种子接种于蛋白胨牦牛肉汤培养基中，36 37'C振摇100 120ipm/min，培养12 18小时，取培养物作革兰氏染色镜检和纯粹检验，纯粹 后作为制苗种子；D、 制苗用菌液的制备a菌液培养 .将制苗种子按培养基总量的1%接种蛋白胨牦牛肉汤培养基中，36 37°。搅 拌培养12 16小时；发酵条件为先于0.05 0.1Mpa下通气3 4小时，接着 于0.15 0.2Mpa下通气4 5小时，最后于0.25 0.3Mpa下通气5 7小时；b菌液灭活'于菌液中加入占其总重量0.3 0.6%的甲醛溶液，搅拌30分钟，其间每隔 2小时搅拌5分钟，36 37'C灭活22 24小时并作无菌检验；E、 配苗取5份体积的灭活菌液，加入1份体积的氢氧化铝胶，即制成含菌数达15 20亿/mL的铝胶苗亦即牦牛大肠埃希氏菌病灭活疫苗；F、 分装及成品检验按100mL/瓶分装为成品，经无菌检查后于2'C 8。C保存。
3、 一种如权利要求1所述的牦牛大肠埃希氏菌病灭活疫苗在预防牦牛"痩 死病"中的应用。
4、 如权利要3所述的牦牛大肠埃希氏菌病灭活疫苗在预防牦牛"瘦死病" 中的应用，其特征在于牦牛注射该灭活疫苗后获得6 12个月的免疫期。
5、 如权利要求3所述的牦牛大肠埃希氏菌病灭活疫苗在预防牦牛"瘦死病" 中的应用，其特征在于该疫苗采用牦牛颈部皮下注射，每头牦牛颈部皮下接 种疫苗1毫升，第14日再次免疫，每头牦牛颈部皮下接种疫苗2毫升。
全文摘要
本发明涉及一种牦牛大肠埃希氏菌病灭活疫苗及其制备方法和应用，它是由5份体积的灭活菌液与1份体积的氢氧化铝胶混匀得到的含菌数为15～20亿/mL的铝胶苗；其中，配制菌液的菌株为牦牛大肠埃希氏菌西藏-9903，该菌株的保藏编号为CCTCC NOM 208216。本发明所述的牦牛大肠埃希氏菌病灭活疫苗安全性好、免疫抗体效价高，免疫接种部位及接种后牦牛在生理、精神方面均未出现异常反应，因而对牦牛具有较好的免疫保护性，解决了国内外牦牛大肠埃希氏菌病的防疫问题。
文档编号A61K39/108GK101485884SQ20081014800
公开日2009年7月22日 申请日期2008年12月25日 优先权日2008年12月25日
发明者曾群辉 申请人:西藏农牧学院