专利名称：：一种抗氧化活性虫草多糖的提取方法
技术领域：
：本发明涉及一种抗氧化活性虫草多糖的提取方法，尤其是一种以虫草菌蝙蝠蛾拟青霉(P"ec/to，ces/7e戸'a/Wchen&DaiCs-4)发酵废液为原料提取抗氧化活性虫草多糖的方法。(二)
背景技术：
：目前世界上已发现虫草属真菌350多种，其中我国记录有70余种。野生的冬虫夏草主要产于四川、西藏、云南、青海等海拔3000m以上的寒冷地带，由于其生长条件的限制及过度采挖，产量很低，所以价格昂贵。近年来，随着人们逐渐发现和认识虫草的滋补疗效和提高人体免疫功能，虫草的开发利用备受世人的极大关注，对虫草的研究有了突飞猛进的发展。虫草多糖是一类高分子复合物，它作为虫草的主要活性成分之一，是虫草中含量最高的药理活性物质。从1977年开始，日本和中国的科技工作者开展了对虫草多糖的研究工作，目前已经在天然冬虫夏草以及人工培育的虫草真菌中分别分离纯化出多种多糖组分，并对其理化性质和药理活性进行了研究。虽然已有的研究报道在所用虫草菌丝体原料上存在着差异，以及分离纯化的多糖产品各不相同，但都从不同角度肯定了虫草多糖的免疫调节及抑制肿瘤等功能。虫草多糖被认为是当前世界上非常好的免疫促进剂之一。因此，虫草多糖作为保健食品和医药产品有着广泛的开发前景。深层发酵技术问世以后，人工虫草菌丝的产量问题得到了解决。在目前的工业化生产中，虫草发酵废液作为副产物，普遍被舍弃，不仅污染了环境，也是一种资源浪费，造成了虫草的主要生物活性物质——虫草多糖的大量损失。
发明内容本发明目的是提供一种抗氧化活性虫草多糖的^是取方法，尤其是一种以虫草菌蝙蝠蛾拟青霉(户ae"7o"少cas/z卬/a/Wchen&DaiCs-4)发酵废液为原料提取抗氧化活性虫草多糖的方法，充分利用现行生产工艺中直接排放的发酵废液，提高利用率。本发明釆用的技术方案是一种抗氧化活性虫草多糖的提取方法，所述方法包括(1)以含有抗氧化活性虫草多糖的蝙蝠蛾拟青霉(尸aecz7o，ces/zep^/Wchen&DaiCs-4)发酵废液为原料，离心耳又上清液；(2)将步骤(1)所得上清液调pH至4.5~5.0,加入2~5倍体积的50%100%(V/V)乙醇(浓度100%时即为无水乙醇)，沉淀20~60min,离心，耳又;冗，定物；(3)将步骤(2)所得沉淀物依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，烘干，得到含有抗氧化活性虫草多糖的粗多糖粉末。本发明中所述含有抗氧化活性虫草多糖的溶液为虫草菌发酵废液，为虫草菌蝙蝠蛾拟青霉(尸ae"7o，c^/ze;/a/^chen&DaiCs-4)经发酵获得的发酵液去除菌丝体后的液体成分，可解决当今虫草发酵液利用不充分和易造成环境污染等问题，提高了发酵废液的利用率，增加经济收益。所述粗多糖粉末可直接应用于保健食品和医药领域，也可按照常规方法进一步纯化后应用于制备保健食品和药物。本发明中，为提高虫草多糖品质，所述含有抗氧化活性虫草多糖的粉末可进一步经复溶去除不溶物，酶解去除蛋白，脱色，透析去除小分子杂质，最后以乙醇沉淀，得到所述抗氧化活性虫草多糖。具体的，所述方法按如下顺序步骤进行(l)将总糖含量为1315g/L的虫草菌发酵废液浓缩至原体积的1/201/30得浓缩液1，4500r/min离心10min,取上清液；(2)步骤(1)上清液调pH至4.55.0，加入25倍体积的50%~100%(V/V)乙醇，沉淀2030min,4500r/min离心15min,耳又沉淀物；(3)步骤(2)沉淀物依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，6(TC烘干，得到含有抗氧化活性虫草多糖的粗多糖粉末；(4)将步骤(3)粗多糖粉末以50~100倍质量的蒸馏水溶解，调pH7.0~7.5,4500r/min离心5min去除不溶物，取上清液；(5)取步骤(4)上清液，加入质量为粗多糖粉末质量50100倍的蒸馏水，调pH为7.08.0,按4~6xl05U/g粗多糖的添加量加入胰蛋白酶，37。C保温酶解24h，4500r/min离心5min,取上清液，加入体积为上清液1/4的Sevag试剂(氯仿正丁醇=4:1,体积比)，15~25°C振荡30min，4500r/min离心20min，取上层液体蒸馏去除有机溶剂，得含有多糖的溶液；(6)将步骤(5)所得含多糖溶液以浓氨水调pH7.08.0,搅拌下滴加30%的H202溶液至多糖溶液呈淡黄色后，装入cut-of为14000Da的透析袋，蒸馏水中透析24h,去除小分子杂质后，将透析袋内溶液减压浓缩至原体积的1/81/10得浓縮液2,加入体积为浓缩液2体积2~5倍的50%~100%(V/V)乙醇醇沉，离心取沉淀，烘干，得到所述抗氧化活性虫草多糖。将提取得到的虫草多糖进行体外抗氧化试验，结果表明，提取得到的虫草多糖具有很高的清除超氧阴离子自由基、羟基自由基(.OH)的活性。本发明有益效果主要体现在提取获得虫草多糖抗氧化活性高，具有良好应用前景，且可充分利用发酵废液资源，减少环境污染、增加经济收益。具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述,但本发明的保护范围并不仅限于此实施例l:虫草菌发酵废液的获得发酵菌种为虫草菌蝙蝠蛾拟青霉(Pae"7o，cM/^p/a/Wchen&DaiCs-4)。种子培养基按如下组成配制葡萄糖1.5g，蛋白胨2g，无机盐0.5g，水100mL,pH7.0;发酵培养基按如下组成配制蔗糖2g，豆粕粉6g,蛋白胨2g,无机盐0.5g,水100mL,pH7.2;500mL三角瓶中装种子培养基150mL,灭菌后接入斜面菌种，在摇床转速为120r/min、25。C培养3d，得种子液；将种子液以体积比5%接种量接入种子罐，逐级放大到20n^通用型搅拌发酵罐，25°C,培养5d。发酵结束后用板框压滤机过滤，去除茵丝体，得到虫草发酵废液(总糖含量约为14g/L)。实施例2:虫草多糖的提取取4要照实施例1方法制备的虫草发酵废液1000mL,浓缩至42mL,浓缩液为深褐色粘稠液体，pH值1.5，密度1.304g/mL,固形物含量51.33%。称取20g浓缩液，用50mL蒸馏水稀释后，4500r/min，离心10min，取上清液，调上清液pH值至4.88，加入4倍体积的无水乙醇沉淀20min后，4500r/min离心15min,收集沉淀，将沉淀物依次用无水乙醇10mL、丙酮10mL、乙醚10mL洗涤，最后于60。C左右烘干，得到3.57g浅褐色粗多糖粉末，提取率为7.75%。随后再进一步去除杂质。取2.0g粗多糖粉末重新用100mL蒸馏水溶解，调pH至7.2,离心(4500r/min,5min)去除不溶物。取上清液，加入100mL蒸馏水将粗多糖配成1%(w/w)左右的溶液，调pH至8左右，按粗多糖胰蛋白酶=50:1(质量比)的比例加入胰蛋白酶(25000U/mg,市售)，37。C保温24h，然后离心(4000r/min,5min),去除沉淀。上清液再以Sevag法继续去除蛋白(Sevag法操作均在低温下进行)；按上清液Sevag试剂(氯仿正丁醇=4:1,体积比)体积比=4:1的比例力口入预冷的Sevag试剂，低温(20°C)下于摇床振荡30min，4500r/min离心20min,混合液分层，上层为多糖溶液，下层为Sevag试剂，中间为变性蛋白质。取上层多糖溶液于旋转蒸发仪上低压蒸馏除去溶于其中的有机溶剂。多糖溶液以浓氨水调pH至7.0左右，不断滴加30%(v/v)的H202溶液，并不断搅拌至多糖溶液呈淡黄色为止。将多糖溶液装入cut-of为14000Da的透析袋，蒸馏水中透析24h,去除小分子杂质。将透析袋内溶液减压浓缩至原体积的1/10得浓缩液，再加入浓缩液4倍体积的无水乙醇，沉淀20min后离心(4500r/min，15min)，收集沉淀，将沉淀物依次用无水乙醇10mL、丙酮10mL、乙醚10mL洗涤，最后于60。C左右烘干，得到淡黄色多糖粉末0.58g,多糖提取率6.7%。实施例3:1.以提取率为参考的醇沉工艺的确定根据Box-Behnken中心组合试验设计原理，综合单因素试验结果，选取乙醇量、醇沉时间和pH值3个对多糖得率的影响较为显著的因素，并在单因素试验基础上采用三因素三水平的响应面分析方法。试验分析方案如表1:表l<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>经过design-Expert软件分析，列出22组优化方案，综合考虑，选择乙醇体积为上清液体积的4倍，醇沉时间20min,pH值为4.88的优化结果，理论提取率为7.80%,用此方案经过三次重复试^r，分别得出提取率为7.8%、7.70%、7.79%。表明此优化方案可行，与预期结果吻合。2.体外抗氧化活性测定就粗多糖体外抗氧化活性进行测定，结果表明粗多糖具有很好的清除超氧阴离子自由基和羟基自由基(OH)活性，分别采用NBT光还原法、Fenton反应法测定，结果见表2。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>权利要求1.一种抗氧化活性虫草多糖的提取方法，所述方法包括(1)以含有抗氧化活性虫草多糖的蝙蝠蛾拟青霉(Paecilonyceshepialidchen&DaiCs-4)发酵废液为原料，离心取上清液；(2)将步骤(1)所得上清液调pH至4.5～5.0，加入2～5倍体积的50％～100％(说明书中说明即可)乙醇，沉淀20～60min，离心，取沉淀物；(3)将步骤(2)所得沉淀物依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，烘干，得到含有抗氧化活性虫草多糖的粗多糖粉末。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述蝙蝠蛾拟青霉发酵废液，为虫草菌蝙蝠蛾拟青霉(户ae"7w^cas/z甲/a/Wchen&DaiCs-4)经发酵获得的发酵液去除菌丝体后的液体成分。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述含有抗氧化活性虫草多糖的粉末进一步经复溶去除不溶物、酶解去除蛋白、脱色、透析去除小分子杂质，最后以乙醇沉淀，得到所述抗氧化活性虫草多糖。4.如^l利要求2所述的方法，其特4正在于所述方法如下(l)将总糖含量为1315g/L的虫草菌发酵废液浓缩至原体积的1/20~1/30得浓缩液1，浓缩液1加入25倍体积的蒸馏水稀释，4500r/min离心10min,耳又上清液；(2)步骤(1)上清液调pH至4.5~5.0,加入2~5倍体积的50%100%乙醇，沉淀2030min,4500r/min离心15min,耳又沉淀物；(3)步骤(2)沉淀物依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，60。C烘干，得到含有抗氧化活性虫草多糖的粗多糖粉末；(4)将步骤(3)粗多糖粉末以50100倍质量的蒸馏水溶解，调pH7.0~7.5，4500r/min离心5min去除不溶物，耳又上清液；(5)取步骤(4)上清液，加入质量为粗多糖粉末质量50100倍的蒸馏水，调pH为7.08.0，按4~6xl05U/g粗多糖的添加量加入胰蛋白酶，37。C保温酶解24h,4500r/min离心5min，取上清液，加入体积为上清液1/4的Sevag试剂，1525。C振荡30min,4500r/min离心20min，取上层液体蒸馏去除有机溶剂，得多糖溶液；(6)将步骤(5)多糖溶液以浓氨水调pH7.08.0,搅拌下滴加30%的&02溶液至多糖溶液呈淡黄色后，装入cut-of为14000Da的透析袋，蒸镏水中透析24h，去除小分子杂质后，将透析袋内溶液减压浓缩至原体积的1/81/10得浓缩液2,加入体积为浓缩液2体积25倍的50%100%乙醇，离心取沉淀，烘干，得到所述抗氧化活性虫草多糖。全文摘要本发明提供了一种抗氧化活性虫草多糖的提取方法，尤其是一种以虫草菌蝙蝠蛾拟青霉(Paecilonyceshepialidchen&DaiCs-4)发酵废液为原料提取抗氧化活性虫草多糖的方法。所述方法包括以含有抗氧化活性虫草多糖的溶液为原料，离心取上清液；上清液调pH至4.5～5.0，加入2～5倍体积的50％～100％(V/V)乙醇，沉淀20～60min，离心，取沉淀物依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，烘干，得到含有虫草多糖的粗多糖粉末。文档编号A61P37/00GK101353382SQ20081012087公开日2009年1月28日申请日期2008年9月11日优先权日2008年9月11日发明者何军邀,吴力平,李国权,普王,明郑申请人:浙江工业大学