专利名称：重组蛇毒金属蛋白酶Jerdonitin的高效稳定表达和纯化及其应用的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及分子生物学、生物技术、医药领域。
背景技术：
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蛇毒中含有多种具有活性的蛋白质，在抗血、止血、镇痛和抗肿瘤等多方面具有良好的应用前景。蛇毒去整合素含有Arg-Gly-Asp (RGD)序列，半胱氨酸含量丰富。因为大部分细胞整合素(integrins)都能识别RGD序列，而大多数细胞外基质(extracellular matrix, ECM)蛋白成分都含有RGD序列，故去整合素可凭借其RGD识别序列而成为细胞外基质与细胞整合素间结合的强有力的竞争性拮抗剂，从而抑制整合素参与的多种生理活动。因RGD模体能被血小板纤维蛋白原受体odlbp3识别，其还具有抑制ADP诱导的血小板聚集的作用。因此，去整合素可运用于与细胞黏附相关的疾病研究领域，如血管新生、肿瘤转移、血栓症等。但是蛇毒成分复杂，从蛇毒中直接分离目的蛋白不但难度高、工艺繁琐，而且蛇资源日益匮乏，蛇毒来源受限，若应用分子生物学方法体外表达蛇毒蛋白，则可大大降低生产成本，提高蛋白质产量。
从菜花烙铁头蛇毒中分离纯化到野生型蛇毒金属蛋白酶Jerdonitin属于一种新型的II型蛇毒金属蛋白酶。Jerdonitin的cDNA由金属蛋白酶、间隔区和去整合素区组成，说明它是二型蛇毒金属蛋白酶。与其它二型相比，Jerdonitin多了两个半胱氨酸(Cys219 and Cys238)分别位于间隔区和去整合素区。Cys219将和后面去整合素区自由的半胱氨酸残基Cys238形成一对二硫键，这对二硫键可能阻止了去整合素区的释放。因此，与其它二型蛇毒金属蛋白酶不同的是，Jerdonitin的成熟蛋白经过后翻译加工过程仍由金属蛋白酶、间隔区和去整合素区组成。野生型Jerdonitin已经被检测到显著抑制血小板聚集的活性(IC50为 120 nM)，证明了蛇毒金属蛋白酶Jerdonitin含有去整合素结构域这一结构特 占。
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本申请提供了一套完善的蛇毒金属蛋白酶Jerdonitin在巴斯德毕氏酵母中 高效稳定表达和纯化的技术方法，并发现本重组蛇毒金属蛋白酶Jerdonitin不 仅具有接近于野生型蛇毒金属蛋白酶Jerdonitin的抑制血小板聚集的活性，而 且首次验证了其能够抑制肿瘤细胞的生长。该重组蛇毒金属蛋白酶Jerdonitin 的获得方法具有直接表达、成本低，稳定性高，表达量高、分离纯化工艺简便、 活性高等特点。该重组蛇毒金属蛋白酶Jerdonitin不仅可以满足市场需要，又 能保护蛇资源。该重组蛇毒金属蛋白酶Jerdonitin可考虑作为新型抗血栓和抗 肿瘤药物，为临床治疗提供新的思维和手段。
发明内容
本项发明的内容之一是重组蛇毒金属蛋白酶Jerdonitin的高效稳定表达。以 全长Jerdonitin基因为模板，设计正向引物和反向引物，进行PCR扩增目的基 因-，将此目的基因与克隆载体经限制性内切酶酶切；然后连接目的基因和克隆 载体，获得含目的基因Jerdonitin的重组质粒；重组质粒转入大肠杆菌进行 扩增；大量抽提重组质粒；重组质粒经过酶切线性化后，将此重组质粒电转入 到酵母表达菌株中，建立能稳定表达Jerdonitin的工程菌株；在甲醇诱导下 表达Jerdonitin目的蛋白。
本项发明的内容之二是重组蛇毒金属蛋白酶Jerdonitin的纯化技术方法。 根据表达的蛋白的性质，选择用DEAE阴离子琼脂糖柱阶段性洗脱初步捕获蛋 白，再用中压液相色谱凝胶层析柱superdex75 HR10/30和阴离子交换柱Mono QHR5/5纯化，纯化蛋白在SDS-PAGE电泳中呈现为一条带。本项发明的内容之三是重组蛇毒金属蛋白酶Jerdonitin在制备抗血栓药 物的应用。该重组蛇毒金属蛋白酶Jerdonitin具有抑制血小板聚集的活性。该 活性接近于野生型蛇毒金属蛋白酶Jerdonitin的抑制血小板聚集的活性。因此 该重组蛇毒金属蛋白酶Jerdonitin可考虑作为新型抗血栓药物。
本项发明的内容之四是重组蛇毒金属蛋白酶Jerdonitin在制备抗肿瘤药 物的应用。本实验首次验证了该重组蛇毒金属蛋白酶Jerdonitin能够显著性地抑 制肿瘤细胞的生长。因此该重组蛇毒金属蛋白酶Jerdonitin可考虑作为新型抗 肿瘤药物，为临床治疗提供了新的思维和手段。
图l 时间梯度甲醇诱导表达重组蛇毒金属蛋白酶Jerdonitin的 SDS-PAGE电泳图和纯化后SDS-PAGE电泳图，其中M为蛋白分子量标准；
0、 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7为每天取20 ul表达培养液离心后的上清液；P为纯化 后的重组蛇毒金属蛋白酶Jerdonitin。
图2重组蛇毒金属蛋白酶Jerdonitin对血小板聚集的剂量抑制性作用。 图3重组蛇毒金属蛋白酶Jerdonitin对肿瘤细胞(Be17402人源肝癌细胞、 BGC823人源胃癌细胞、K562人源白血病细胞)增殖的抑制作用。
具体实施例方式
实施例一 重组蛇毒金属蛋白酶Jerdonitin的表达
1、 从菜花烙铁头蛇的毒腺中，利用RT-PCR体外扩增出Jerdonitin的全长 cDNA基因。以Jerdonitin全长基因为模板，申请人设计并由引物合成公司合 成如下PCR引物
正向引物，5 ，-CGGAATTCGAGCTCTATAATCTTGGAATCTG-3 ， 反向引物，5 ，-GCTCTAGATAGGCATGGAAGGGATTTC画3 ，2、 PCR扩增，PCR条件为94°C， 2分钟；94°C， 45秒，60°C， 2分钟，25个 循环后，72°C， IO分钟。PCR产物经0.8。/。琼脂糖电泳，回收约1500bp片段。 琼脂糖回收的具体步骤如下50^1 PCR反应物与6^1加样缓冲液、6^1染色液混 合，室温放置l分钟，用电压72V，电泳约45分钟，将与理论长度相同的条带， 切割，放入无菌管中，加75(HUQG缓冲液，50'C熔胶，溶液倒入Qiaquickspin柱， 16000g离心30秒，弃上清，再离心一次，加30pl无菌水于柱中心，静置l分 钟，16000g离心l分钟，收集清液，-20。C保存。
3、 PCR回收产物，用限制性内切酶EcoRIandXbaI酶切，乙醇沉淀回收；同 样酶切毕赤酵母表达载体pPICZaC，用T4 DNA连接酶16"C过夜连接目的基因 和载体；65"C灭活5分钟；取1.5^1连接物与预冷的感受态细胞TOP10F混合， 加入1毫升LB溶液，37。C温育1小时，取200jxl涂LB平板(25 ug/ml Zeocin)， 37'C培养14小时；挑选菌落，以250rpm转速于37'C摇床中培养12小时；小 量抽提重组质粒；酶切鉴定；酶切鉴定正确的克隆由DNA测序公司测序。
4、 重组质粒经SacI酶切线性化后，电转化入酵母菌株，涂100pg/ml Zeocin YPDS平板，进行稳定转染菌株的筛选，并进行PCR鉴定。稳定转染、正确重 组子用甲醇诱导发酵表达，发酵7天的培养液，离心取上清，15% SDS-PAGE 电泳检验分子量。电泳检测到一条分子量大约为33 KD的条带,符合成熟态 Jerdonitin由882个核苷酸翻译294个氨基酸的分子量的大小。甲醇诱导3天后 即达到最高表达平衡点(图1)。
实施例二重组蛇毒金属蛋白酶Jerdonitin的纯化
1、 高表达量重组蛇毒金属蛋白酶Jerdonitin的菌株扩大培养，甲醇诱导3天， 上清稀释4倍体积过50 mM pH 8.0 Tris-HCl (pH 8.0)缓冲溶液平衡的阴离子快速 交换柱DEAE， 50mMpH8.0Tris-HCl(pH8.0)缓冲溶液(含0.08M氯化钠)洗脱，收集峰处蛋白；
2、 DEAE柱纯化的蛋白用高压液相色谱凝胶层析柱superdex75 HR10/30进 一步分离，使用50mMpH8.0Tris-HCl(pH8.0)缓冲溶液(含0.15M氯化钠) 洗脱；
3、 凝胶层析柱纯化过的蛋白溶液透析后用阴离子交换柱Mono Q HR 5/5 梯度洗脱纯化，收集峰蛋白，15%SDS-PAGE电泳检验，纯度达99%以上(图 1)。
实施例三重组蛇毒金属蛋白酶Jerdonitin对血小板聚集的剂量抑制性作用
1、 采集人空腹全血加入装有3.28%枸椽酸钠的塑料离心管中，血液与枸椽钠的 比例为9:1;
2、 1000rpm室温离心5min,取米黄色上清即为人富血小板血浆(PRP);
3、 将余液继续以4000 g室温离心10 min，取上清即为人贫血小板血(platelet-poor plasma, PPP);
4、 取2只比色杯，分别加入PPP和PRP各300^1，置于聚集仪中37。C热5min, 用PPP校零，测定PRP中的血小板数。然后用PPP稀释PRP调整血小板数
至3 x103 4d;
5、 将PPP、用PPP调整后的加入30ul的PBS或不同浓度重组蛇毒金属蛋白酶 Jerdonitin的PRP置于LBY-NJ2型血小板聚集仪中37。C温育3min;
6、 以PPP调零；
7、 将PRP样品加入终浓度为3umol/L的ADP启动血小板的凝聚反应.(图2)
8、 重组蛇毒金属蛋白酶Jerdonitin抑制ADP诱导的血小板聚集呈剂量依赖性， 半抑制剂量IC5G约为248 nM.实施例四MTT法鉴定重组蛇毒金属蛋白酶Jerdonitin抑制肿瘤细胞(Bel7402 人源肝癌细胞、BGC823人源胃癌细胞、K562人源白血病细胞)生长
1、 肿瘤细胞(Bel7402人源肝癌细胞、BGC823人源胃癌细胞、K562人源白血 病细胞)以4xl0、ell/well浓度接种于96孔细胞培养板中，于37'C、 5%(302培 养箱中培养24h;
2、 加入梯度浓度的重组蛇毒金属蛋白酶Jerdonitin (对照加入同量的PBS)继续 培养72h;
3、 加入15 ul 5 mg/ml的MTT继续培养4h;
4、 吸去培养液，加入与培养液等量的DMSO;
5、 振荡10min，使结晶充分溶解；
6、 用酶标仪上测定578 nm各孔的光吸收值A;
7、 计算细胞存活率-试验孔A均值/对照孔A均值xlOOy。，抑制率=(对照孔A 均值一试验孔A均值)对照孔A均值xl00n/。；(图3)
8、 重组蛇毒金属蛋白酶Jerdonitin对K562细胞、Bel7402细胞和BGC细胞 的半数抑制浓度(IC50)分别为0.816 umol/L 、 0.990 umol/L和0.602 umol/L。
权利要求
1、重组蛇毒金属蛋白酶Jerdonitin的高效稳定表达和纯化的方法，包括如下步骤1)、重组蛇毒金属蛋白酶Jerdonitin的高效稳定表达以全长Jerdonitin基因为模板，设计正向引物和反向引物，进行PCR扩增目的基因；将此目的基因与克隆载体经限制性内切酶酶切；然后连接目的基因和克隆载体，获得含目的基因Jerdonitin的重组质粒；重组质粒转入大肠杆菌进行扩增；大量抽提重组质粒；重组质粒经过酶切线性化后，将此重组质粒电转入到酵母表达菌株中，建立能稳定表达Jerdonitin的工程菌株；在甲醇诱导下表达Jerdonitin；2)、重组蛇毒金属蛋白酶Jerdonitin的纯化方法根据表达的蛋白的性质，选择用阴离子琼脂糖柱阶段性洗脱初步捕获蛋白，再用凝胶层析柱和阴离子交换柱纯化，可获得纯度较高的蛋白。
2、 按权利要求l所述的方法，其特征在于所述PCR扩增Jerdonitin基因所 用的引物为正向引物，5 '-CGGAATTCGAGCTCTATAATCTTGGAATCTG-3, 反向引物，5 ，誦GCTCTAGATAGGCATGGAAGGGATTTC-3 ， 所述的克隆载体为pPICZaC;所述用于酶切目的基因与克隆载体的限制性内切 酶为EcoRI和Xbal;所述的重组质粒线性化是用SacI酶切含有Jerdonitin 重组质粒；所述的酵母表达菌株为X-33。
3、按权利要求l所述的方法，其特征在于所述的阴离子琼脂糖柱为DEAE阴 离子琼脂糖柱；所述的凝胶层析柱为凝胶层析柱superdex75 HR10/30 ;所述 的阴离子交换柱为阴离子交换柱Mono Q HR 5/5 。
4、 重组蛇毒金属蛋白酶Jerdonitin在制备抗血栓药物的应用。
5、 重组蛇毒金属蛋白酶Jerdonitin在制备抗肿瘤药物的应用。全文摘要
本发明提供了重组蛇毒金属蛋白酶Jerdonitin的高效稳定表达和纯化的技术方法。重组蛇毒金属蛋白酶Jerdonitin在酵母细胞中的大量表达及目的蛋白的纯化，纯化蛋白在SDS-PAGE电泳中呈现为一条带。该重组蛇毒金属蛋白酶Jerdonitin的获得方法具有直接表达、成本低，稳定性高，表达量高、分离纯化工艺简便、活性高等特点。本发明发现本重组蛇毒金属蛋白酶Jerdonitin不仅具有接近于野生型蛇毒金属蛋白酶Jerdonitin的抑制血小板聚集的活性，而且首次验证了其能够抑制肿瘤细胞生长的活性，从而能够作为一种新型抗血栓和抗肿瘤新药。
文档编号A61P7/02GK101497887SQ20081007059
公开日2009年8月5日 申请日期2008年2月2日 优先权日2008年2月2日
发明者朱丽丽, 王婉瑜, 黄明东 申请人:中国科学院福建物质结构研究所