专利名称：从木鳖子中提取免疫佐剂成分的方法
技术领域：
本发明属于制药技术领域，涉及中药有效成分的提取技术，具体为一种从中药木鳖子中 提取免疫佐剂成分的方法。
技术背景木鳖子是我国传统中药葫芦科植物木鳖(Mowor&ca coc/^cW股ra" (Lour.) Spreng)的成 熟种子，味苦，微甘，性温，有毒，入肝、脾、胃经，具有消肿散结，攻毒疗疮功能。我们 在前期的研究工作中采用乙醇回流提取、减压浓縮、101澄清剂澄清、乙醚萃取、正丁醇萃 取、吸附性大孔树脂纯化等步骤从木鳖子中获得一种淡黄色带清香味的木鳖子提取物粉末。 通过醋酐-浓硫酸反应(Liebermann-Burchard reaction)、氯仿-浓硫酸反应(Salkowski reaction)、泡沫反应、紫外光谱分析以及溶血试验证明，该提取物含三萜皂甙。免疫学试验表明，该提取物具有免疫增强作用，可以显著提高模式抗原OVA诱导的小鼠 IgG的抗体水平。将该提取物和灭活0型口蹄疫抗原混合免疫猪，观察免疫后血清抗体滴度、 抗0型口蹄疫病毒VP1结构蛋白抗体水平的变化。结果表明该提取物和灭活口蹄疫疫苗混合 的试验组比对照组可以产生更高的抗口蹄疫病毒抗体滴度、抗0型口蹄疫病毒VP1结构蛋白 抗体水平。该提取物对鸡禽流感疫苗也显示良好的佐剂作用。有关木鳖子提取物的制备方法，己经获得国家发明专利权(公开号CN1748725)。由于 其良好的免疫佐剂性能，正在申请用途方面的国家发明专利(公开号CN1748792)。但是目 前的提取方法得率较低，从每公斤原料药材中只能获得2克左右的提取物，在一定程度上限 制该项发明的应用。发明内容本发明的目的是提供一种从中药木鳖子中提取免疫佐剂成分的方法。所得到的木鳖子提 取物为一种具有免疫佐剂作用的含三萜皂甙成分的黄色粉末。本发明在现有技术基础上改进 了提取工艺，大幅度提高了得率，从每公斤木鳖子中可获得8克提取物。提取物中含有三砲 皂甙成分，其佐剂作用和己有技术得到的提取物相同。本发明从中药木鳖子中提取免疫佐剂成分的方法包括以下步骤-(1) 将原料木鳖子粉碎后用石油醚浸泡脱脂，连续脱脂3-4次；(2) 将脱脂木鳖子粉末在70%乙醇中浸泡，回流提取2-5次，合并提取液，过滤，减 压浓縮；(3) 浓縮液挥去溶剂后得褐色固体，用水溶解，溶液离心后去沉淀；(4) 将去沉淀后的水溶液加进吸附性大孔树脂柱，静置15-30小时后，先后用水和30 %乙醇洗柱去除杂质；(5) 用60-70%乙醇洗脱，减压浓縮洗脱液，将浓縮的洗脱液真空干燥，得黄色粉末 状含免疫佐剂成分的木鳖子精提物。按以上方法获得的木鳖子粗提物或木鳖子精提物产品均为本发明的产品，该产品中含三 砲皂武类化学成分。
图1:三组小鼠二免后血清抗体水平的比较，上标字母不同者表示有显著差异(P〈0. 05)具体实施方式
实施例一木鳖子提取物的制备木鳖子3000g，粉碎，用石油醚脱脂3次，每次10.5L，共去掉脂质 601. 5g。残渣用70%乙醇60匸回流提取5次，每次12L，合并提取液。减压浓縮，挥千溶剂 得175g褐色固体，用1.8L水^f解，溶液离心沉淀G600g)。取上清液过D101吸附大孔树 脂柱，首先分别用水和30%乙醇洗脱，然后用60%乙醇洗脱，每次洗脱剂用量2倍柱体积。收集60%乙醇洗脱剂，挥干溶剂得26g淡黄色的粉末，得率为8.67克/公斤生药。 实施例二木鳖子提取物性质的分析为证实本发明方法所得木鳖子提取物的性质，以及是否含有三路 皂甙等免疫佐剂有效成分，特进行以下试验。1. Molish反应将组分配制成0. 05%的水溶液，取2mL，加入几滴10% a -甲萘酚乙醇溶液， 然后加入lmL浓硫酸，有紫色环出现。2. Libermann—burchard反应取组分10 mg溶于20mL正丁醇中，取2mL，力[]lmL冰乙酸， 不振摇，加lmL浓硫酸，试管底部变为棕黄色，放置3 4 h后，变为棕红色。3. 泡沫反应将组分配制成0. 05%的水溶液，取2mL,用力振摇试管lmin出现泡沫，静置 15min后仍有大量泡沫存在。4. 溶血性试验将ECMS各组分用生理盐水中配成1000ug/mL样品溶液。用二倍稀释法将 各组分的溶液在lmL的塑料离心管中稀释成2 500u g/mL的溶液。各管加入等量的0. 5%绵 羊红细胞，置37。C孵育30rain，离心，取上清液，在405 nm波长测定OD值。结果表明该 提取物在62. 5 n g/ml时有溶血作用。以上结果提示木鳖子提取物含三萜皂甙。实施例三木鳖子提取物的免疫佐剂活性试验材料和方法将ICR小鼠随机分成3组(6只/组)(1)颈部皮下注射含10lig卵清白蛋白(OVA); (2) OVA + 50yg提取物A (本发明方法制备)；(3) OVA + 50ug提取物B (按公 开号CN1748725的现有方法制备)。两周以后用同样方法加强免疫一次。 间接ELISA法检测血清中抗OVAIgG:在96孔酶标板每孔加入100 U 1包被液(含5 u g OVA/ml 的0.05mol/L碳酸盐缓冲液)，置4'C孵育18h后，洗涤液(PH7. 4磷酸盐缓冲液PBS)洗涤3 次，每次3min。每孔加入300 u 1含1%小牛血清的PBS封闭液(0. Olmol/L, pH7. 4)，于 3厂c孵育lh后，用洗涤液洗涤3次，每次3min。在96孔酶标板每孔加入1200倍待检血清100 u 1。于37'C孵育2 h后，用洗涤液洗涤3次，每次3 min。加入经1:500稀释的羊 抗小鼠IgG抗体(CHEMIC0N International, Inc)， 100"1/孔，37。C孵育2h，用洗涤液洗 涤3次，每次3 min。加入TMB(四甲基联苯二胺，SIGMA-ALDRICH公司)底物溶液显色，100 P 1/ 孔，37'C孵育15 min，加2N貼04 50 U 1/孔终止反应。用酶标仪在450nm波长测定0D值。 实验结果如图1所示，提取物A组和提取物B组的抗体水平显著高于对照组，而提取物A 组和提取物B组之间无统计学差异。说明两种提取物的免疫佐剂作用强度相似。而现有技术从每公斤原料药材中只能获得2克左右的含免疫佐剂有效成分的提取物，本 发明从每公斤木鳖子中可获得8克含免疫佐剂有效成分的提取物。在经济效益上得到近4倍 的提高。
权利要求
1、从木鳖子中提取免疫佐剂成分的方法，其特征在于以下步骤(1)将原料木鳖子粉碎后用石油醚浸泡脱脂，连续脱脂3-4次；(2)将脱脂木鳖子粉末在70％乙醇中浸泡，回流提取2-5次，提取液过滤后减压浓缩；(3)浓缩液挥去溶剂后用水溶解，溶液离心后去沉淀；(4)将去沉淀后的水溶液加进吸附性大孔树脂柱，静置15-30小时后，先后用水和30％乙醇洗柱去除杂质；(5)用60-70％乙醇洗脱，减压浓缩洗脱液，将浓缩的洗脱液真空干燥，得黄色粉末状含免疫佐剂成分的木鳖子提取物。
全文摘要
本发明公开了一种从木鳖子中提取免疫佐剂成分的方法。将中药木鳖子粉碎后用石油醚脱脂，再用乙醇回流提取，提取液过滤后减压浓缩，经吸附性大孔树脂柱纯化，获得一种淡黄色具有清香味的木鳖子提取物粉末。本发明的制备方法比原有的制备方法近4倍的提高了得率。理化分析和溶血试验表明该提取物含三萜皂甙成分。本发明所得木鳖子含三萜皂甙提取物毒性低，口服和肌肉注射小鼠后无不良反应，在疫苗制造领域具有广泛应用前景。
文档编号A61K36/185GK101224231SQ20081005935
公开日2008年7月23日 申请日期2008年1月25日 优先权日2008年1月25日
发明者胡松华 申请人:浙江大学