专利名称：一种治疗肝衰竭的药物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及生物医学领域中的药物及其制备方法，特别是涉及一种治疗肝衰竭的 药物及其制备方法。
背景技术：
肝脏是人体最大的内脏器官，也是功能最复杂的器官之一，它担负着许多非常重 要的生理功能，如各种物质代谢的中枢、分泌胆汁、合成蛋白和凝血因子、以及解毒 等，对维持生命和内环境的稳定起到重要作用。目前，终未期肝病，如急性肝衰竭、 肝硬化和肝癌等均危及生命，且死亡率极高， 一直是医学界难以解决的问题。据统计，
全世界约有3亿多肝病患者，其中三分之一在我国，我国是肝病大国，是世界上终末 期肝病发病率最高的地区之一，每年因肝病而死亡者人数众多。原位肝移植是肝功能 衰竭及先天性肝代谢疾病唯一成熟的治疗方法。据美国UNOS报道，在过去十年里， 全世界共实施26040例肝移植;据中华器官移植学会及全国肝移植协作组的统计，1976 年至2004年，我国内地共完成各种类型肝移植5000余例。此外，供肝缺乏是世界各 国面临的主要问题。尽管近年来发展了背驮式、劈离式和活体劈离式等多种肝移植术 式，以求最大程度地利用供肝，但仍不能解决等待肝移植患者与供肝者之间的巨大差 额，且因其具有操作复杂、患者常需终生免疫抑制和花费巨大等缺点，临床应用受到 极大的限制。
随着20世纪90年代生物人工肝概念的提出和不断发展，体外生物型人工肝为肝 衰竭的治疗开辟了一条新途径。虽然近年来几种以培养肝细胞为基础的生物型人工肝 已进行了 I-ni期临床试验，且取得了令人鼓舞的疗效，但这些系统要真正得到临床 推广应用，还必须获得足够数量，且具有高度活性及良好功能的肝细胞，这也成为限 制其发展的最主要因素。目前，研究的焦点主要集中在利用肝细胞来替代肝功能，但
免疫排斥是其发展的瓶颈。近几年发展起来的微囊技术具有有效的免疫隔离屏障，随 着该技术的发展，扩大了供肝细胞来源，解决了供体缺乏这一难题。微囊化肝细胞移 植在治疗各种肝病中的研究正受到越来越多的关注，其临床效果也更加值得期待。
微囊(Microcapsules)技术是一种利用天然的或合成的高分子成膜材料(囊材) 把液体或固体药物(囊心物)包嵌形成直径1-5000 um (通常为5-250 um)微小胶囊 的技术。囊膜具有透膜或半透膜性质，囊心物可藉压力、pH值、温度或提取等方法释出。根据包囊技术和囊心物、囊材的性质不同，微囊的囊粒可以是囊心物外包囊材的 膜壳型或囊心物与囊材镶嵌在一起的镶嵌型。囊粒可以是球形、葡萄串形、表面平滑 或折叠而不规则等各种形状。目前制药工业中常采用各种药物的微囊制成各种剂型， 如散剂、胶囊剂、注射剂、混悬剂、咀嚼片、含片、洗剂、埋植片、软膏剂、涂剂、 栓剂、膜剂、敷料等。
制备微囊的过程称为微型包囊术(Microencapsulation)，简称微囊化。药物微 囊化后具有许多优越性
1. 能减少复方制剂中药物之间的配伍禁忌，隔绝药物组分间的反应。
2. 遮蔽药物的苦味或异味，如磺胺类药物。
3. 控制药物的释放。
(1) 控释或缓释药物，可采用惰性薄膜、可生物降解的材料等来达到控释或 缓释的作用。
(2) 使药物在特定的部位释放，对于治疗指数比较低的药物可制成靶向制剂， 提高药物的疗效。
4. 降低药物的毒性。
5. 用微囊制备的药物制剂具有以下优越性
(1) 控释或缓释药物。用微囊配制散剂，流动性好，齐U量比较准确。可改善 药物的易吸湿引湿性，粉末不易结块。
(2) 用微囊灌注空心胶囊，流动性好，装量准确。
(3) 可直接用微囊压制片剂，可压性良好。制得的颗粒流动性好，填入冲模 的量准确，片重差异较小；也可以减小压片时粉末飞扬。
6. 保护药物，如易氧化、对水气敏感等药物；使液态或挥发性药物成为稳定的粉末。
7. 更利于药物的贮存。
8. 可将活细胞或生物活性物质包裹，如酶、胰岛素血红蛋白等。
发明内容
本发明的目的是提供一种安全、疗效确切的治疗肝衰竭的药物。
为实现上述目的，本发明采取以下设计方案 一种治疗肝衰竭的药物，它的有效 成分为采用微囊技术混合包裹的肝细胞和表达重组人碱性成纤维细胞生长因子
(rhbFGF)的人胎肝基质细胞。
所述肝细胞和表达重组人碱性成纤维细胞生长因子的人胎肝基质细胞的混合比 例可为10-1: 1，优选为7: 1。所述肝细胞的来源是广泛的，如可工业获取的大鼠、小鼠、猪或人等哺乳动物的 肝细胞，或经不同干细胞诱导而来的肝细胞或肝样细胞，优选为来自大鼠的肝细胞。
可采用生物技术领域的常规方法诱导干细胞成为肝细胞或肝样细胞。
所述表达重组人碱性成纤维细胞生长因子的人胎肝基质细胞为转染重组人碱性 成纤维细胞生长因子基因的转基因人胎肝基质细胞。
可按照常规方法将重组人碱性成纤维细胞生长因子基因转染人胎肝基质细胞，如 通过含有重组人碱性成纤维细胞生长因子基因的重组真核表达载体将重组人碱性成 纤维细胞生长因子基因导入人胎肝基质细胞。
用于构建含有重组人碱性成纤维细胞生长因子基因的重组真核表达载体的出发
载体可为pEGFP-Nl、 pCMV5、 pSilencel. 0-U6 (Ambion， Austin, TX， USA) 、 pEGFP-Nl、 pSV40、 pCI-neo (购于Promega公司)、pTEFl、 pPICZ a 、 pAM82或pAAh5等。
所述携带有重组人碱性成纤维细胞生长因子基因的重组真核表达载体可通过脂 质体介导法、电转、腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒或慢病毒等常规的生物学方法 转化人胎肝基质细胞。
本发明的第二个目的是提供一种制备上述治疗肝衰竭的药物的方法。
本发明所提供的制备方法，可包括以下步骤
1) 将肝细胞悬液与表达重组人碱性成纤维细胞生长因子的人胎肝基质细胞混合 形成混合物；
2) 将步骤1)获得的肝细胞与表达重组人碱性成纤维细胞生长因子的人胎肝基质 细胞混合物微囊化，得到治疗肝衰竭的药物。
在上述药物的制备方法中，步骤l)中的混合物中肝细胞和表达重组人碱性成纤 维细胞生长因子的人胎肝基质细胞的混合比例可为10-1: 1，优选为7: 1。
以上方法中，所述肝细胞的来源是广泛的，如可工业获取的大鼠、小鼠、猪或人 等哺乳动物的肝细胞，或经不同干细胞诱导而来的肝细胞或肝样细胞，优选为来自大 鼠的肝细胞。
以上方法中，所述表达重组人碱性成纤维细胞生长因子的人胎肝基质细胞为转染 重组人碱性成纤维细胞生长因子基因的转基因人胎肝基质细胞。
以上方法中，可按照常规方法将重组人碱性成纤维细胞生长因子基因转化人胎肝 基质细胞，如通过含有重组人碱性成纤维细胞生长因子基因的重组真核表达载体将重 组人碱性成纤维细胞生长因子基因导入人胎肝基质细胞。
以上方法中，用于构建含有重组人碱性成纤维细胞生长因子基因的重组真核表达 载体的出发载体可为pEGFP-Nl、 pCMV5、 pSilencel. 0—U6 (Ambion， Austin, TX， USA)、
6pEGFP-Nl、 pSV40、 pCI-neo (购于Promega公司)、pTEFl、 pPICZ a 、 pAM82或pAAh5 等。
以上方法中，所述携带有重组人碱性成纤维细胞生长因子基因的重组真核表达载 体可通过脂质体介导法、电转、腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒或慢病毒等常规的 生物学方法转化人胎肝基质细胞。
以上方法中，可用改良的Seglen胶原酶/EGTA两步灌注法(Seglen P0. Preparation of isolated rat liver cells. Methods Cell Biol 1976;13: 29)制 备肝细胞悬液将肝细胞重悬于含8-12%小牛血清(FBS)的1640培养液中，然后 测定细胞存活率，若存活率大于90%，得到肝细胞悬液。
以上方法中，步骤2)中将肝细胞与表达重组人碱性成纤维细胞生长因子的人胎 肝基质细胞混合物微囊化的方法可为对步骤l)获得的细胞悬液进行离心，弃上清 液，将细胞沉淀重悬于质量/体积(W/V)百分浓度为1.0-2. 0%的藻酸钠溶液中，然后 将细胞悬液置于气流式微囊形成仪中，调整气流量为2-6 L/min(氧气)，用3-6号针 尖打出，滴入质量/体积(W/V)百分浓度为1.0_2.0%的氯化钙溶液中，静置20-30min 后，形成聚集，洗涤；然后，将混合细胞置入质量/体积百分浓度为0.05-0. 15%的 多聚赖氨酸溶液中静置4-8min，洗涤；再将混合细胞置入质量/体积百分浓度为 0. 1-0.2%的藻酸钠溶液中，静置2-6min，洗涤；最后，将混合细胞加入质量/体积 百分浓度为1.0-2.0%的柠檬酸三钠溶液中，静置3-7min，洗涤，得到微囊化的肝细 胞与表达重组人碱性成纤维细胞生长因子的人胎肝基质细胞混合物，即本发明治疗肝 衰竭的药物。
在上述将肝细胞与表达重组人碱性成纤维细胞生长因子的人胎肝基质细胞混合 物微囊化过程中所用的洗涤液均为生理盐水。
此外，本发明治疗肝衰竭的药物可制成多种剂型，如注射液或冷冻注射剂等。上 述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。
需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载 体包括药学领域常规的稀释剂、吸收促进剂、表面活性剂等。
上述肝衰竭的药物的用量一般为10-100mL/kg体重/day (请提供常规剂量)，疗 程一般为10-20天，并可根据实际情况调整。
为提高疗效，本发明的药物还可以与抗生素、免疫刺激剂等进行组合治疗。
本发明提供了一种治疗肝衰竭的药物及其制备方法。该药物的有效成分为采用微 囊技术混合包裹的肝细胞和表达重组人碱性成纤维细胞生长因子的人胎肝基质细胞。 实验证明，本发明的药物对大鼠肝细胞寿命和功能发挥起到支持作用，将其植入急性肝衰竭小鼠模型腹腔内，可见该药物对肝衰竭小鼠的肝功恢复起到促进作用，移植后 的小鼠存活率得到显著提高，且肝组织坏死程度明显减轻。本发明为肝细胞移植及生 物人工肝等提供了一条新的途径，在医学和生物制药领域，尤其是提高肝功能和遏制 肝衰竭药物的制备领域具有较大的实际意义和广阔的应用前景。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
图1A为体外单独培养的大鼠肝细胞的细胞形态
图IB为体外混合培养的大鼠肝细胞与人胎肝基质细胞的细胞形态
图1C体外混合培养的大鼠肝细胞与表达重组人碱性成纤维细胞生长因子的人胎
肝基质细胞的细胞形态
图ID为荧光显微镜下的体外混合培养的大鼠肝细胞与表达重组人碱性成纤维细
胞生长因子的人胎肝基质细胞
图IE为体外单独培养的微囊化大鼠肝细胞的细胞形态
图IF为体外混合培养的微囊化大鼠肝细胞与人胎肝基质细胞的细胞形态
图1G为体外混合培养的微囊化大鼠肝细胞与表达碱性成纤维细胞生长因子的人
胎肝基质细胞的细胞形态
图1H为体外混合培养的微囊化大鼠肝细胞与表达碱性成纤维细胞生长因子的人 胎肝基质细胞的荧光显微镜观测结果
图2A为I、 II、 III、 IV、 V组白蛋白含量检测结果
图2B为I、 II、 III、 IV、 V组谷丙转氨酶含量检测结果
图2C为I、 II、 m、 IV、 V组肝细胞色素酶P450-CYP3A4的活性检测结果检测
结果
图3A为I、 II、 III、 IV、 V组移植小鼠的存活率统计结果 图3B和图3C为IK III、 IV、 V组移植小鼠的丙氨酸氨基转移酶(ALT)及白蛋白 (ALB)含量统计结果
图4为I、 II、 III、 IV、 V组移植小鼠肝组织的病理学观察结果 图5A至图5E为I、 II、 III、 IV、 V组移植小鼠肝组织PCNA表达情况的检测结
果
图6为H、 III、 IV、 V组移植小鼠的微囊回收率统计结果
具体实施例方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见以下文献: 组织工程基础与应用筏义人科学出版社，2007，
8组织工程原理(美)R. P.兰扎，R.兰格，J.瓦康提主编化学工业出版社2006， 组织工程方法(美)A.阿塔拉，R. P.兰扎主编化学工业出版社2006， 细胞培养司徒镇强，吴军正世界图书出版公司2007。
所述百分比浓度如无特别说明均为质量/体积(W/V)百分比浓度或体积/体积(V/V) 百分比浓度。
实施例1、制备治疗肝衰竭的药物
用本发明的方法制备治疗肝衰竭的药物，具体过程包括以下步骤
1) 大鼠肝细胞悬液的制备
选择雄性Wistar大鼠(体重150g，由军事医学科学院动物中心提供)，用改良 的Seglen胶原酶/EGTA两步灌注法(Seglen PO. Pr印aration of isolated rat liver cells. Methods Cell Biol 1976;13: 29)制备肝细胞悬液将大鼠肝细胞按5X105 个/mL的浓度重悬于含10X(8-12X均可)小牛血清(FBS)的1640培养液(购自Gibcol) 中，然后用台盼蓝拒染法(细胞培养司徒镇强，吴军正世界图书出版公司2007) 测定细胞存活率，结果存活率大于90%，符合要求，得到大鼠肝细胞悬液。
需要说明的是，上述以大鼠为例说明了获得肝细胞悬液的其中一种途径，是实验 室获取肝细胞的一种方式，但并非构成对本发明肝细胞来源的限制。工业应用中，所 述肝细胞的来源应该是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的肝细胞都可以 作为本发明的原料，如来源于大鼠、小鼠、猪或人等哺乳动物的离体肝细胞，也包括 从细胞库中取得、或商业购买获得的肝细胞，还包括经可以商业获取的不同干细胞用 已知方法诱导而来的肝细胞或肝样细胞，目前可以诱导为肝细胞的干细胞包括骨髓间 充质干细胞、胚胎干细胞和肝干细胞等。
2) 表达重组人碱性成纤维细胞生长因子的人胎肝基质细胞的获得
参考文献(《慢病毒介导的稳定表达bFGF的胎儿肝脏基质细胞株的建立》，生 物化学与生物物理进展2007, 34(2): 207-214)中记载的方法获得表达重组人碱性 成纤维细胞生长因子(rhbFGF)的人胎肝基质细胞。
同样，人胎肝基质细胞的获取过程中的任何生物材料并不限于参考文献介绍的来 源，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可作为其来源，其目标在于从 具有可应用来源的生物材料中按照参考文献记载的方法获得表达重组人碱性成纤维 细胞生长因子(rhbFGF)的人胎肝基质细胞。
3) 将步骤l)提示得到的大鼠肝细胞悬液与步骤2)提示获得的表达重组人碱性 成纤维细胞生长因子的人胎肝基质细胞混合，大鼠肝细胞与表达重组人碱性成纤维细胞生长因子的人胎肝基质细胞的混合比例为7 : 1，即使混合液中大鼠肝细胞的浓度为 5X105个/mL，表达重组人碱性成纤维细胞生长因子的人胎肝基质细胞的浓度为7X101 个/mL。
在具体实施中，大鼠肝细胞与表达重组人碱性成纤维细胞生长因子的人胎肝基质 细胞的混合比例可以在(10-1) : l均可，在此恕不一一罗列。
4)将步骤3)获得的大鼠肝细胞与表达重组人碱性成纤维细胞生长因子的人胎肝 基质细胞混合物微囊化，方法为对步骤3)获得的细胞悬液进行离心(500rpm， 5min), 弃上清液，将细胞沉淀重悬于质量/体积百分浓度为1.5% (1.0_2.0%均可)的藻酸 钠溶液中，然后将细胞悬液置于气流式微囊形成仪中，调整气流量为4 L/min (2-6 L./min均可)(氧气)，用4.5号(3-6号均可)针尖打出，滴入质量/体积百分浓度为 1.5% (1.0-2. 0%均可)的氯化钙溶液中，静置25min(20-30min均可)后，用生理盐 水洗涤2遍，每遍5min;然后，将混合细胞置入质量/体积百分浓度为0. 1 %
(0.05-0. 15%均可)的多聚赖氨酸溶液中静置6min (4-8min均可)，用生理盐水洗 涤2遍，每遍5min;再将混合细胞置入质量/体积百分浓度为0. 15% (0. 1-0.2%均 可)的藻酸钠溶液中，静置4min (2-6min均可)，用生理盐水洗涤2遍，每遍5min; 最后，将混合细胞加入质量/体积百分浓度为1.5% (1.0-2.0%均可)的柠檬酸三钠 溶液中，静置5min (3-7min均可)，用生理盐水洗涤2遍，每遍5min，得到微囊化 的肝细胞与表达重组人碱性成纤维细胞生长因子的人胎肝基质细胞混合物，即本发明 治疗肝衰竭的药物。
将本发明治疗肝衰竭的药物置于含10%小牛血清的DMEM培养液(Dulbecco' s modified Eagle's medium,购自Gibcol公司，配制方法将10g低糖DMEM粉末溶 于1L三蒸水中，再每升加入4g HEPES、 3. 7g Na2HCO:,及0. 3g谷胺酰铵，调pH值至 7.0-7.4，加入青霉素、链霉素至终浓度为100U/mL，用0.22Mm的微孔滤膜超滤除菌， 最后，每90mL加入10mL胎牛血清(fetal bovine serum, FCS))， 4'C保存，备用。
实施例2、微囊化混合共培养的大鼠肝细胞和表达重组人碱性成纤维细胞生长因 子的人胎肝基质细胞的细胞形态观察及其体外功能测定
一、微囊化混合共培养的大鼠肝细胞和表达重组人碱性成纤维细胞生长因子的人 胎肝基质细胞的体外培养和细胞形态观察
观察体外单独培养的大鼠肝细胞(I组)、体外混合培养的大鼠肝细胞和人胎肝
基质细胞(n组)或表达重组人碱性成纤维细胞生长因子的人胎肝基质细胞(m组)
(混合比例均为7:1)的细胞形态，方法为将大鼠肝细胞重悬于含10%小牛血清 的DMEM培养液中，制成浓度为2. 5X 1()S个/mL的细胞悬液，然后将其接种于六孔板中，
10再按7: 1的比例接种人胎肝基质细胞或表达重组人碱性成纤维细胞生长因子的人胎 肝基质细胞(细胞浓度均为7X104个/mL，每种接种2孔)，以未接种的为对照，然 后将此六孔板置于37'C、 5% C02孵养箱中培养4周，在激光共聚焦显微镜下观察并 记录各组细胞形态的变化。同时，用相同方法观察体外单独培养的微囊化大鼠肝细胞 (IV组)、体外混合培养的微囊化的大鼠肝细胞(V组)和人胎肝基质细胞或表达重 组人碱性成纤维细胞生长因子的人胎肝基质细胞(VI组)(混合比例均为7 : 1，混合 及微囊化方法与实施例1相同)的细胞形态。
观察结果体外平面单独培养大鼠肝细胞24小时后，可见30-50%的细胞粘附于 平皿表面，继续培养24小时后，大鼠肝细胞的粘附率达70%，肝细胞开始铺展，变 得扁平，在细胞中央可见细胞核透明易识别，但无聚集生长倾向；体外培养48小时 后，大鼠肝细胞变得更加扁平， 一小部分邻近的细胞因铺展而开始融合，形成索状细 胞团(见图1A);培养至2周时，已有细胞开始逐渐死亡。混合共培养的大鼠肝细胞， 接种即时就和人胎肝基质细胞或表达重组人碱性成纤维细胞生长因子的人胎肝基质 细胞己有相互粘附聚集倾，培养24小时后，大部分大鼠肝细胞和表达重组人碱性成 纤维细胞生长因子的人胎肝基质细胞呈片状相连。培养48小时后，混合培养的大鼠 肝细胞与人胎肝基质细胞进一步聚集成不规则的小片状，细胞连接紧密，外周松散(见 图1B)，并保持此形态约l周，l周后细胞状态下降，开始出现死亡细胞。而混合培 养的大鼠肝细胞与表达重组人碱性成纤维细胞生长因子的人胎肝基质细胞与前者相 比，不但聚集而成的不规则片状区域更大，满布视野，而且外周保持紧密，见图1D 和图1H，其中发绿色荧光的细胞(如图中箭头所指)为表达重组人碱性成纤维细胞生 长因子的人胎肝基质细胞，并保持此形态直至终止培养，培养2周后，细胞才逐渐死 亡。
体外单独培养微囊化大鼠肝细胞48小时后，在激光共聚焦显微镜下可见微囊呈 圆球形，表面光滑，肝细胞呈圆形，均匀地分布于微囊内(见图1E);微囊化混合共 培养的大鼠肝细胞与人胎肝基质细胞在微囊内均呈圆形，并有聚集趋势，相互接触呈 小团块状，但小团块间未见接触(见图1F);在微囊化混合共培养的大鼠肝细胞与表 达重组人碱性成纤维细胞生长因子的人胎肝基质细胞在微囊内，表达重组人碱性成纤 维细胞生长因子的人胎肝基质细胞围绕肝细胞聚集生长，聚集趋势非常明显，相互接 触形成类肝组织样较大的团块，并悬浮于微囊内呈三维生长(见图1G)。在荧光显微 镜下清晰可见表达重组人碱性成纤维细胞生长因子的人胎肝基质细胞在与大鼠肝细 胞形成的团块中所发出的绿色荧光，见图1H，其中发绿色荧光的细胞(如图中箭头所 指)为表达重组人碱性成纤维细胞生长因子的人胎肝基质细胞。
11对于微囊化混合共培养的大鼠肝细胞与表达重组人碱性成纤维细胞生长因子的 人胎肝基质细胞在10-1: 1范围内混合形成的其它系列药物进行同样的体外培养和细 胞形态观察，得到与图1G类似的结果。
上述细胞形态观测结果表明囊内转rhbFGF人胎肝基质细胞对大鼠肝细胞维持寿 命和功能发挥有明显的支持作用。
二、微囊化混合共培养的大鼠肝细胞和表达重组人碱性成纤维细胞生长因子的人 胎肝基质细胞的体外功能测定
用与步骤一相同的方法体外培养上述六组细胞(I组、II组、III组、IV组、V组、 VI组)，隔天换液时取细胞培养上清，培养4周后，用OLYMPUS AU2600全自动生化 仪分别检测六组细胞培养上清中微量白蛋白和谷丙转氨酶的含量，同时检测肝细胞色 素酶P450-CYP3A4的活性，检测方法为各组隔天换液后，将细胞用PBS洗涤3次， 加入睾酮(Testosterone)工作液(CYP3A4典型底物，Sigma 500nM， PBS稀释)，在 37"C下与细胞共孵育2小时，分别取孵育0、 2小时点，加入等体积含5% (W/V)内 标非那西汀的乙腈终止反应，然后14000rpm离心5min，取上清液通过质谱仪(型号 为Agilent7600，购自Agilent Co.)进样检测细胞上清中睾酮的剩余量，以此来评 价肝细胞色素酶P450-CYP3A4的活性(空白对照孔平行操作，复孔)。
微量白蛋白和谷丙转氨酶的含量检测结果用OLYMPUS AU2600全自动生化仪检 测细胞培养上清后，发现各组肝细胞均产生一定量的白蛋白。在整个培养期间，III组 所产生的白蛋白量高于I、 II组，VI组所产生的白蛋白量高于IV、 V组，特别是VI组 所产生的白蛋白量明显高于其它各组(尸<0.05，说明差异显著)。培养至14天时， I、 II、 III、 IV、 V组白蛋白含量开始下降，并低于第O天水平，但VI组白蛋白含量 仍然高于初始水平，并且维持到实验结束(见图2A，图中，从左至右的柱依次对应I 组、II组、III组、IV组、V组、VI组，图2B至2C同)。此外，各组肝细胞均释放一 定量的谷丙转氨酶，第2天时，VI组细胞培养上清中的谷丙转氨酶含量比第O天下降 约3倍。但培养至第14天时，各组的谷丙转氨酶量无显著性差异(见图2B)。上述 检测结果表明微囊内转rhbFGF胎肝基质细胞对大鼠肝细胞维持寿命和功能发挥有明 显的支持作用。
肝细胞色素酶P450-CYP3A4的活性检测结果各组肝细胞均不同程度的代谢了部 分睾酮。第2天，VI组细胞培养上清中睾酮剩余量已开始明显低于其它各组(尸<0. 05， 说明差异显著)，而其它各组间差异无统计学意义；第21天，I、 II、 III、 IV、 V 组培养上清中睾酮剩余量已明显接近孵育前的初始浓度500nM，而VI组睾酮剩余量仍 明显低于其它各组和初始浓度(尸<0.05，说明差异显著)(见图2C)。上述检测结果表明微囊内转rhbFGF人胎肝基质细胞对大鼠肝细胞维持P450-CYP3A4酶的活性有明显的促进作用。
对于大鼠肝细胞与表达重组人碱性成纤维细胞生长因子的人胎肝基质细胞在
10-1: l范围内混合形成的其它系列药物(如6: 1、 8: 1等)进行相同的功能检测，
结果与上述实验结论相同，在此不再一一罗列。
实施例3、本发明治疗肝衰竭药物的药效检测
用小鼠急性肝衰竭模型检测本发明药物的疗效，检测方法如下
一、 小鼠急性肝衰竭模型的建立
实验前将100只BALB/c系小鼠(购自军事医学科学院动物中心)饲养一周，然后将部分小鼠用乙醚麻醉、消毒后，行上腹正中横行切口，暴露肝脏，依次结扎并切
除大鼠肝左叶和中叶(约占全肝的70%)，仅保留右叶，方叶和尾状叶；术后给饮IO
%葡萄糖水，标准鼠食饲养，不同时间监测动物的存活情况和血生化指标。
二、 体内移植方法和步骤
将步骤一获得的急性肝衰竭模型小鼠于肝脏切除术后立即进行腹腔移植，将急性肝衰竭模型小鼠分成五组(每组i5只，i组为空白对照，n组、in组、iv组为对照，
V组为实验组)，在位于腹腔正中3腿处，用12号针头，分别注入lmL空囊(II组)、微囊化大鼠肝细胞(III组)、微囊化大鼠肝细胞与人胎肝基质细胞(IV组)，以及微囊化大鼠肝细胞与表达重组人碱性成纤维细胞生长因子的人胎肝基质细胞(V组，实施例一中7: l混合药物)(m组、IV组、V组均含有大鼠肝细胞5X1()5个，IV组、V组中均含有7X104个人胎肝基质细胞或表达重组人碱性成纤维细胞生长因子的人胎肝基质细胞)，术后常规肌注青霉素10万单位，每日1次，连续注射3天。
三、 微囊化混合肝细胞移植对肝衰竭小鼠生存状态及肝功能的影响步骤二中的I、 II、 III、 IV组移植小鼠在72小时均出现严重的肝功能衰竭状态，
表现为活动障碍、嗜睡、昏迷，此时的存活率分别为40%、 40%、 46.70%、 60%;与之相比，植入本发明药物(微囊化混合肝细胞与表达重组人碱性成纤维细胞生长因子的人胎肝基质细胞)的V组移植小鼠未出现严重的肝衰竭症状，存活率为86.70%。至7天时，V组小鼠的存活率是其它各组的两倍。7天后，各组小鼠的存活率分别为20%、 20%、 26.70%、 40%和80%。与其它组相比，V组小鼠的存活率明显优于其它各组(尸< 0.05，说明差异显著)，其它组间无显著差异(见图3A)。
小鼠肝功能受损在切除术后48小时内达到高峰，以后逐渐下降；V组移植后24小时丙氨酸氨基转移酶(ALT)较其它各组均有明显好转(尸<0.05，说明差异显著)，而自移植48小时起，V组ALT及白蛋白(ALB)含量均较其它组明显好转，具有显著性
13差异(尸< 0.05，说明差异显著)；移植后第7天，各组间生化指标差异不明显，无统计学意义(见图3B和图3C)。
上述检测结果表明微囊化混合肝细胞与转rhbFGF人胎肝基质细胞对肝衰竭小鼠肝功恢复有明显的促进作用。
四、 腹腔移植后肝组织的病理学观察
行肝大部切除术48小时后发现，步骤二中的I、 II、 III、 IV组移植小鼠残存的肝脏呈黄白色、无光泽，肝组织肿胀明显，失去弹性，边缘圆钝易碎裂；镜下肝组织大片坏死(见图4中的A)，失去正常肝小叶结构(见图4中的D)，汇管区紊乱(见图4中的B)，肝细胞严重变性，部分细胞溶解，细胞核碎裂，细胞界限不清，肝窦裂隙增大(见图4中的C)，血管内皮细胞脱落，还可见到大片淡染区域，有明显的炎性细胞浸润。与之相比，V组肝脏也呈黄白色，略有光泽，肝组织轻度肿胀，但较其它组明显减轻，中叶和尾叶轻度肥大；在光镜下观察肝组织，与其它组相比，V组肝组织坏死程度明显减轻，肝小叶结构稍有紊乱，肝索间裂隙不规则增大，偶尔可见肝细胞变性坏死，有少量炎性细胞浸润，汇管区肝细胞增生明显，可见大量双核或多核细胞(见图4中的E)。上述病理学观察结果表明微囊化混合肝细胞与转rhbFGF人胎肝基质细胞对肝衰竭小鼠肝功恢复有明显的促进作用。
同时，利用免疫组织化学方法检测肝组织PCNA (增殖细胞核抗原)的表达情况，检测方法参见《免疫组织化学实验技术及应用》倪灿荣，马大烈，戴益民化学工业出版社2006; —抗为小鼠抗大鼠PCNA (购自中山)，二抗为山羊抗小鼠IgG (购自中山)，以此来反映肝衰竭小鼠肝组织的增殖状态。在光镜下可见，肝切除术后24小时，V组(见图5中的E)与其它组相比，阳性信号表达已开始迅速升高，48小时表达量最高，其后表达量逐渐下降；阳性细胞核表达区域从汇管区周围逐渐向中央静脉周围区推进，24小时集中在汇管区周围；至48小时，阳性表达除小叶中央静脉周围区外，其余细胞核均为阳性；至96小时以后，从汇管区周围向中央静脉周围逐渐转为阴性。而其它组值(1、 II、 III、 IV组)(见图5中的A、 B、 C禾nD)至72小时，阳性信号表达才逐渐开始表达，至实验结束表达量一直很低。上述检测结果表明微囊化混合肝细胞与转rhbFGF人胎肝基质细胞对肝衰竭小鼠肝脏再生的促进作用。
五、 微囊的回收
移植4周后，对步骤二中的五组小鼠进行腹腔灌洗，收集腹腔内游离或附着于肝包膜的微囊。在光镜下观察回收的微囊后，发现II组中的空囊大多具有良好的外形，呈圆形，囊壁光滑、完整，囊外无纤维化现象，回收率达(89±52) %。 III、 IV组大部分在腹腔内呈游离状态，腹腔冲洗可取出微囊，小部分微囊粘附于大网膜、肠系膜间，回收率分别为(76±45) %、 (78±67) %，在光镜下下观察大部分细胞胞膜破裂、萎縮，胞浆浑浊不清，提示大部分细胞已经死亡。V组微囊小部分游离于腹腔，多在肝脏断端周围聚集成团或附着于肝组织表面，回收率为(77±94) %，在光镜下观察到微囊内大鼠肝细胞与表达重组人碱性成纤维细胞生长因子的人胎肝基质细胞相互接触成团，细胞膜均完整光滑，胞浆饱满，表明仍有肝细胞存活。各组间回收率差异存在统计学意义(尸〈0.05，说明差异显著)(见图6)。上述回收率统计结果表明微囊有较好的回收率。
实施例4、制备治疗肝衰竭的药物及其疗效检测
一、制备治疗肝衰竭的药物.
用本发明的方法制备治疗肝衰竭的药物，具体过程包括以下步骤
1) 大鼠肝细胞悬液的制备
选择雄性Wistar大鼠(体重150g)，用改良的Seglen胶原酶/EGTA两步灌注法(Seglen PO. Preparation of isolated rat liver cells. Methods Cell Biol1976;13:29)制备肝细胞悬液将大鼠肝细胞按4X105个/mL的浓度重悬于含8X(8-12%均可)小牛血清的1640培养液中，然后用台盼蓝拒染法测定细胞存活率，结果存活率大于90%，符合要求，得到大鼠肝细胞悬液。
2) 表达重组人碱性成纤维细胞生长因子的人胎肝基质细胞的获得
参考文献(《慢病毒介导的稳定表达bFGF的胎儿肝脏基质细胞株的建立》，生物化学与生物物理进展2007， 34(2): 207-214)中记载的方法获得表达重组人碱性成纤维细胞生长因子的人胎肝基质细胞。
3) 将步骤l)制备的大鼠肝细胞悬液与步骤2)获得的表达重组人碱性成纤维细胞生长因子的人胎肝基质细胞混合，大鼠肝细胞与表达重组人碱性成纤维细胞生长因子的人胎肝基质细胞的混合比例为8 : 1 (10-1: l均可)，即使混合液中大鼠肝细胞的浓度为4X105个/mL，表达重组人碱性成纤维细胞生长因子的人胎肝基质细胞的浓度为5X104个/mL。
4) 将步骤3)获得的大鼠肝细胞与表达重组人碱性成纤维细胞生长因子的人胎肝基质细胞混合物微囊化，方法为对步骤3)获得的细胞悬液进行离心(600rpm， 3min)，弃上清液，将细胞沉淀重悬于质量/体积百分浓度为1.0% (1.0-2.0%均可)的藻酸钠溶液中，然后将细胞悬液置于气流式微囊形成仪中，调整气流量为6 L/min (2-6L/min均可)(氧气)，用5号(3-6号均可)针尖打出，滴入质量/体积百分浓度为2.0% (1.0-2.0%均可)的氯化钙溶液中，静置30min(20-30min均可)后，用生理盐水洗涤2遍，每遍5min;然后，将混合细胞置入质量/体积百分浓度为0. 05%
15(0.05-0. 15%均可)的多聚赖氨酸溶液中静置8min (4-8min均可)，用生理盐水洗涤2遍，每遍5niin;再将混合细胞置入质量/体积百分浓度为0. 2% (0. 1-0. 2%均可)的藻酸钠溶液中，静置2min (2-6min均可)，用生理盐水洗涤2遍，每遍5min;最后，将混合细胞加入质量/体积百分浓度为2.0% (1.0-2.0%均可)的柠檬酸三钠溶液中，静置7min (3-7min均可)，用生理盐水洗涤2遍，每遍5min，得到微囊化的肝细胞与表达重组人碱性成纤维细胞生长因子的人胎肝基质细胞混合物，即本发明治疗肝衰竭的药物。将本发明治疗肝衰竭的药物置于含10%小牛血清的DMEM培养液中备用。
二、本发明治疗肝衰竭药物的疗效检测
用与实施例三相同的方法检测本发明药物的疗效，结果较其它组，移植有本发明药物的肝衰竭模型小鼠的存活率及肝功能均得到显著提高，肝组织坏死程度明显减轻，肝小叶结构稍有紊乱，肝索间裂隙不规则增大，偶尔可见肝细胞变性坏死，有少量炎性细胞浸润，汇管区肝细胞增生明显，可见大量双核或多核细胞；肝组织PCNA
(增殖细胞核抗原)的表达情况良好；此外，微囊小部分游离于腹腔，多在肝脏断端周围聚集成团或附着于肝组织表面，回收率为(77±94) %，在光镜下观察到微囊内大鼠肝细胞与表达重组人碱性成纤维细胞生长因子的人胎肝基质细胞相互接触成团，细胞膜均完整光滑，胞浆饱满，表明仍有肝细胞存活。上述检测结果表明本发明的药物对肝衰竭具有较好的疗效，可用于肝衰竭的治疗，以及进一步用于肝细胞移植及生物人工肝的制备等。
实施例5、制备治疗肝衰竭的药物及其疗效检测
一、制备治疗肝衰竭的药物
用本发明的方法制备治疗肝衰竭的药物，具体过程包括以下步骤
1) 大鼠肝细胞悬液的制备
选择雄性Wistar大鼠(体重150g)，用改良的Seglen胶原酶/EGTA两步灌注法(Seglen PO. Preparation of isolated rat liver cells. Methods Cell Biol
1976:13:29)制备肝细胞悬液将大鼠肝细胞按6X 105个/1^的浓度重悬于含12%(8-12%均可)小牛血清的1640培养液中，然后用台盼蓝拒染法测定细胞存活率，
结果存活率大于90%，符合要求，得到大鼠肝细胞悬液。
2) 表达重组人碱性成纤维细胞生长因子的人胎肝基质细胞的获得
参考文献(《慢病毒介导的稳定表达bFGF的胎儿肝脏基质细胞株的建立》，生物化学与生物物理进展2007， 34(2): 207-214)中记载的方法获得表达重组人碱性成纤维细胞生长因子的人胎肝基质细胞。3) 将步骤l)制备的大鼠肝细胞悬液与步骤2)获得的表达重组人碱性成纤维细胞生长因子的人胎肝基质细胞混合，大鼠肝细胞与表达重组人碱性成纤维细胞生长因子的人胎肝基质细胞的混合比例为6 : 1 (10-1: l均可)，即使混合液中大鼠肝细胞的浓度为6Xl05个/mL，表达重组人碱性成纤维细胞生长因子的人胎肝基质细胞的浓度为1Xl。5个/mL。
4) 将步骤3)获得的大鼠肝细胞与表达重组人碱性成纤维细胞生长因子的人胎肝基质细胞混合物微囊化，方法为对步骤3)获得的细胞悬液进行离心(500rpra， 5min)，弃上清液，将细胞沉淀重悬于质量/体积百分浓度为2.0% (1.0-2.0%均可)的藻酸钠溶液中，然后将细胞悬液置于气流式微囊形成仪中，调整气流量为2 L/min (2-6L/min均可)(氧气)，用3号(3-6号均可)针尖打出，滴入质量/体积百分浓度为1.0% (1.0-2. 0%均可)的氯化l丐溶液中，静置20min(20-30rain均可)后，用生理盐水洗涤2遍，每遍5min;然后，将混合细胞置入质量/体积百分浓度为0. 15%
(0.05-0. 15%均可)的多聚赖氨酸溶液中静置4min (4-8min均可)，用生理盐水洗涤2遍，每遍5min;再将混合细胞置入质量/体积百分浓度为0. 1% (0. 1-0. 2%均可)的藻酸钠溶液中，静置6min (2-6rain均可)，用生理盐水洗涤2遍，每遍5min;最后，将混合细胞加入质量/体积百分浓度为1.0% (1.0-2.0%均可)的柠檬酸三钠溶液中，静置3min (3-7min均可)，用生理盐水洗涤2遍，每遍5min，得到微囊化的肝细胞与表达重组人碱性成纤维细胞生长因子的人胎肝基质细胞混合物，即本发明治疗肝衰竭的药物。将本发明治疗肝衰竭的药物置于含10%小牛血清的DMEM培养液中备用。
二、本发明治疗肝衰竭药物的疗效检测
用与实施例三相同的方法检测本发明药物的疗效，结果较其它组，移植有本发明药物的肝衰竭模型小鼠的存活率及肝功能均得到显著提高，肝组织坏死程度明显减轻，肝小叶结构稍有紊乱，肝索间裂隙不规则增大，偶尔可见肝细胞变性坏死，有少量炎性细胞浸润，汇管区肝细胞增生明显，可见大量双核或多核细胞；肝组织PCNA
(增殖细胞核抗原)的表达情况良好；此外，微囊小部分游离于腹腔，多在肝脏断端周围聚集成团或附着于肝组织表面，回收率为(77±94) %，在光镜下观察到微囊内大鼠肝细胞与表达重组人碱性成纤维细胞生长因子的人胎肝基质细胞相互接触成团，细胞膜均完整光滑，胞桨饱满，表明仍有肝细胞存活。上述检测结果表明本发明的药物对肝衰竭具有较好的疗效，可用于肝衰竭的治疗，以及进一步用于肝细胞移植及生物人工肝的制备等。
1权利要求
1、一种治疗肝衰竭的药物，它的有效成分为采用微囊技术混合包裹的肝细胞和表达重组人碱性成纤维细胞生长因子的人胎肝基质细胞。
2、 根据权利要求l所述的药物，其特征在于所述肝细胞和表达重组人碱性成 纤维细胞生长因子的人胎肝基质细胞的混合比例为10 1: 1。
3、 根据权利要求1或2所述的药物，其特征在于所述肝细胞来源于大鼠、小 鼠、猪或人，或经干细胞诱导而来的肝细胞或肝样细胞；所述表达重组人碱性成纤维 细胞生长因子的人胎肝基质细胞为转染重组人碱性成纤维细胞生长因子基因的重组 人胎肝基质细胞。
4、 一种制备权利要求1所述的治疗肝衰竭的药物的方法，包括以下步骤1 )将肝细胞制成悬液与表达重组人碱性成纤维细胞生长因子的人胎肝基质细胞 混合形成细胞混合物；2)将步骤l)获得的细胞混合物微囊化，得到治疗肝衰竭的药物。
5、 根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述步骤l)中的细胞混合物中肝 细胞和表达重组人碱性成纤维细胞生长因子的人胎肝基质细胞的混合比例为10-1: 1。
6、 根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于所述步骤l)中的肝细胞来源 于大鼠、小鼠、猪或人，或经干细胞诱导而来的肝细胞或肝样细胞；所述表达重组人 碱性成纤维细胞生长因子的人胎肝基质细胞为转染携带重组人碱性成纤维细胞生长 因子基因的重组人胎肝基质细胞。
7、 根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于所述步骤l)中用Seglen胶 原酶/EGTA两步灌注法制备肝细胞悬液将肝细胞重悬于含8-12%小牛血清的1640 培养液中，然后测定细胞存活率，若存活率大于90%，得到肝细胞悬液。
8、 根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于所述步骤2)中将肝细胞与表 达重组人碱性成纤维细胞生长因子的人胎肝基质细胞混合物微囊化的方法为对步骤 1)获得的细胞悬液进行离心，弃上清液，将细胞沉淀重悬于质量/体积百分浓度为 1.0-2.0%的藻酸钠溶液中，然后将细胞悬液置于气流式微囊形成仪中，调整气流量 为2-6L/min，用3-6号针尖打出，滴入质量/体积百分浓度为1. 0-2. 0%的氯化钙溶 液中，静置20-30min后，洗涤;然后，将混合细胞置入质量/体积百分浓度为0. 05-0. 15 %的多聚赖氨酸溶液中静置4-8min，洗涤；再将混合细胞置入质量/体积百分浓度为 0. 1-0.2%的藻酸钠溶液中，静置2-6min，洗涤；最后，将混合细胞加入质量/体积 百分浓度为1.0-2. 0%的柠檬酸三钠溶液中，静置3-7min，洗涤，得到微囊化的肝细胞与表达重组人碱性成纤维细胞生长因子的人胎肝基质细胞混合物。
9、根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述洗涤液均为生理盐水。
全文摘要
本发明公开了一种治疗肝衰竭的药物及其制备方法。该药物的有效成分为采用微囊技术混合包裹的肝细胞和表达重组人碱性成纤维细胞生长因子的人胎肝基质细胞。其制备方法包括以下步骤1)将肝细胞悬液与表达重组人碱性成纤维细胞生长因子的人胎肝基质细胞混合；2)将步骤1)获得的肝细胞与表达重组人碱性成纤维细胞生长因子的人胎肝基质细胞混合物微囊化，得到治疗肝衰竭的药物。本发明为肝细胞移植及生物人工肝等提供了一条新的途径，在医学和生物制药领域，尤其是提高肝功能和遏制肝衰竭药物的制备领域具有较大的实际意义和广阔的应用前景。
文档编号A61K9/50GK101496815SQ20081005754
公开日2009年8月5日 申请日期2008年2月2日 优先权日2008年2月2日
发明者雪 南, 伟 师, 越 滕, 王韫芳, 白慈贤, 裴雪涛 申请人:中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所