专利名称：：以猪伪狂犬病病毒为载体的日本血吸虫基因重组活疫苗生产工艺及制品的利记博彩app
技术领域：
：本发明提供一种以猪伪狂犬病病毒为载体的日本血吸虫基因重组活疫苗的生产工艺及制品，用于家畜(牛、羊)日本血吸虫病的预防和治疗，属于动物传染病疫苗制备
技术领域：
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背景技术：
：曰本血吸虫病是一种严重危害人类健康、影响经济和社会发展的人兽共患寄生虫病，除感染人外，还能感染牛、羊等家畜，给畜牧业造成重大经济损失。只靠药物治疗还不能解决人畜重复感染的问题。因此，研制动物血吸虫疫苗是控制和消灭血吸虫病的重要基础和技术保障。现代分子生物学及免疫学技术的发展，使血吸虫疫苗的研究已由死疫苗、减毒活疫苗等传统疫苗发展到了核酸疫苗、基因工程疫苗等新型疫苗。日本血吸虫传统疫苗虽然诱导的保护力高，但缺乏足够的虫种资源，且存在安全、贮藏及运输等问题，未能得到实际运用。血吸虫虫体大，抗原复杂，至今用单一一种基因工程苗诱导的免疫保护效果都不够理想。进一步分离、鉴定一些与血吸虫生长、发育相关的保护性抗原基因，探讨多价混合疫苗(Cocktailvaccine)、多表位基因工程疫苗的免疫协同作用，是提高疫苗免疫保护效果的有效途径。
发明内容本发明的目的是提供一种以猪伪狂犬病病毒为载体的日本血吸虫免疫预防用的基因重组活疫苗，用于家畜(牛、羊)日本血吸虫病的预防和治疗。本发明还公开了上述基因重组活疫苗的生产工艺，适用于工业化生产。本发明的日本血吸虫基因重组活疫苗是以伪狂犬病病毒为载体，日本血吸虫保护性抗原基因为目的基因的病毒活载体疫苗。通过同源重组的方法利用日本血吸虫保护性抗原基因表达盒取代伪狂犬病病毒复制非必需基因TK、PK、gG或gl，其中目的基因表达单元含有巨细胞病毒(CMV)启动子和多聚A(polyA)信号结构。本发明的基因重组活疫苗的生产工艺包括以下步骤A.日本血吸虫保护性抗原基因的克隆通过RT-PCR或人工合成的方法获得保护性抗原全长基因或含有抗原表位的序列，如Sj26GST、FABP、Sj23等。B.重组质粒的构建首先将日本血吸虫保护性抗原基因克隆入真核表达载体pVAXl或pIRESneo中。a.将Sj26GST基因克隆入真核表达载体pVAXl构建重组质粒pVAX/Sj26GST;b.将血吸虫FABP基因克隆入pVAX/Sj26GST构建重组质粒pVAX/Sj26GST-FABP;c.将经步骤c获得的重组质粒pVAX/Sj26GST-FABP中的Sj26GST-FABP基因亚克隆入真核表达载体pIRESneo的多克隆位点，构建重组质粒pIRES/GF，在此基础上，将血吸虫Sj23基因克隆入pIRES/GF的Xbal/Smal位点，替代该位点的Neo基因，构建重组质粒pIRES/GF23;d.提取伪狂犬病毒基因组DNA，用限制性内切酶(Ascl)或PCR的方法获获得含有完整TK、PK、gG或gl的片段,将此片段克隆入pPolyII的多克隆位点，构建中间转移载体p8KD;e.将上述经a、b、c、d步骤构建的重组真核表达载体含有日本血吸虫保护性抗原基因的表达单元，其特征在于含有巨细胞病毒(CMV)启动子和多聚A(polyA)结构，克隆入中间转移载体p8KD的适宜酶切位点，构建成重组中间转移载体；f.将lacZ基因表达单元克隆入中间转移载体p8KD的适宜酶切位点，构建成重组中间转移载体p8KD/lacZ;C.重组中间病毒rPRV/LacZ的获得将重组中间转移载体p8KD/lacZ与伪狂犬病毒的基因组DNA经脂质体共转染Vero细胞，在X-gal存在时经蓝白斑筛选，获得rPRV/LacZ;D.重组病毒的获得提取重组中间病毒PRV/LacZ的基因组，经限制性内切酶EcoRI酶切后与上述e构建的重组中间转移载体共转染Vero细胞，在X-gal存在时经蓝白斑筛选、PCR及IFA鉴定获得日本血吸虫重组活载体疫苗；E.疫苗的制备将上述D构建的重组病毒以Vero细胞增殖后，加入保护剂，并按国家有关要求制成冻干制品。本品为淡黄色中性冻干制剂，由于伪狂犬病病毒(pseudorabiesvirus,PRV)能感染猪、牛、羊、犬、猫等多种家畜和野生动物，引起以发热、奇痒及脑脊髓炎为特征的伪狂犬病。PRV是疱疹病毒科、疱疹病毒甲亚科、水痘病毒属的成员。PRV基因组为线性双股DNA,约150kb,由长独特区(UL)和短独特区(US)及US两侧的末端倒转重复(TR)与内部重复(IR)组成，可编码70-100种蛋白质，成熟的病毒粒子约有50种蛋白。在上述基因产物中，UL区段中的gC、TK及US区段中的PK、gG、gl、11K和28K为病毒增殖的非必需成分，TK、gC、gl、PK和CP(衣壳蛋白)等与PRV毒力相关。TK基因缺失株的神经毒力明显降低，如果与其它的毒力基因(如gE)联合缺失时，PRV强毒即可变成为一个双基因缺失弱毒疫苗株。多种PRV缺失弱毒株的构建成功，为开发研制伪狂犬病基因工程疫苗奠定了坚实的基础。由于PRV基因缺失疫苗株缺失了目的基因的几百甚至几千个碱基，缺失区域明确，所以它们返祖的可能性极小，不存在安全性问题。鉴于PRV基因组庞大，具有较多的增殖非必需区和非编码区，在这些区域内缺失或插入外源基因不会影响PRV复制，并且PRV具有广泛的宿主范围，以PRV为载体研制动物血吸虫多价疫苗成为可能，确保了本发明的研制成功。本发明的积极效果在于制备的重组病毒具有良好的遗传稳定性，以此病毒制备的疫苗免疫小鼠、牛、羊后，可诱导产生特异细胞免疫和体液免疫，具有良好的免疫保护效果，无毒副作用，制品容易保存，便于运输，保质期限长，生产工艺简单，适合于工业化生产。附图及其说明图h重组日本血吸虫Sj26GST(Sj23、FABP)基因伪狂犬病病毒载体活疫苗的制备。图2:多价日本血吸虫伪狂犬病病毒载体活疫苗的制备。图3:重组病毒间接免疫荧光检测结果。A.重组病毒的免疫荧光结果；B.阴性对照；A.rPRV/Sj26GST(rPRV/Sj23，rPRV/FABP，rPRV/Sj26GST-FABP,rPRV/Sj26GST-FABP邻3);B.NegativecontrolrPRV/lacZ。表l:日本血吸虫重组活载体疫苗对小鼠的免疫保护作用。具体实施例方式下面通过实施例和具体的操作步骤旨在进一步举例描述本发明，而不是以任何方式限制本发明。在不背离本发明的精神和原则的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的待批权利要求范围之内。实施例1重组日本血吸虫Sj26GST基因伪狂犬病病毒载体活疫苗的制备按照附图1所示的工艺路线制备重组日本血吸虫Sj26GST基因伪狂犬病病毒载体活疫苗。具体步骤如下1.日本血吸虫保护性抗原Sj26GST基因的克隆及真核表达载体的构建用1500条血吸虫尾蚴感染家兔，45天后解剖。用无菌枸橼酸钠生理盐水进行门静脉灌注，收集成虫，无菌生理盐水洗涤，去除附着在虫体表面的血液成分。取新鲜成虫0.5g,在冰上进行匀浆，运用Trizol方法制备成虫mRNA。通过RT-PCR的方法获得保护性抗原Sj26GST。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳确定后，将得到的基因克隆至pMD-18T载体，构建重组质粒pMD/Sj26GST，采用双脱氧末端终止法测其序列。将Sj26GST基因亚克隆入真核表达载体pVAXl构建重组质粒pVAX/Sj26GST。2.伪狂犬病病毒重组中间转移载体及重组中间病毒rPRV/LacZ的构建提取伪狂犬病毒基因组DNA，用PCR方法或限制性内切酶Ascl酶切基因获得含有完整TK、PK、gG或gl的片段,将此片段克隆入pPolyII的多克隆位点，构建中间转移载体p8KD。利用HindIII酶切质粒pBS-lacZ回收lacZ表达盒，并将其克隆入中间转移载体p8KD的合适酶切位点，构建成重组中间转移载体p8KD-LacZ;将其与PRV亲本株基因组DNA，经脂质体共转染Vero细胞，在X-gal存在时经蓝白斑筛选，获得重组中间病毒rPRV/LacZ。3.重组日本血吸虫Sj26GST基因伪狂犬病病毒载体活疫苗的构建通过双酶切从日本血吸虫真核表达载体pVAX/Sj26GST获得目的基因Sj26GST表达盒，并将其克隆入中间转移载体p8KD的合适酶切位点，从而构建伪狂犬病病毒重组转移载体p8KD/Sj26GST;在Vero细胞上增殖重组中间病毒rPRV/LacZ，碱裂解法提取基因组副A，由于PRV的基因组DNA中没有EcoRI酶切位点，而构建的重组中间病毒rPRV/LacZ中lacZ基因中含有EcoRI。用EcoRI将病毒rPRV/LacZ的基因组酶切，应用脂质体介导转染技术将其与伪狂犬病病毒重组中间转移载体p8KD/Sj26GST共转染Vero细胞，经同源重组日本血吸虫保护性抗原基因表达盒置换出了LacZ基因表达盒，待产生细胞病变后收毒。将病毒液接种Vero细胞，用含1%低熔点琼脂糖的画EM维持液覆盖于37'C5%0)2的条件下培养，当出现细胞病变时，在X-gal存在时经蓝白斑筛选，挑取单个白斑接种于Vero细胞扩大培养，利用日本血吸虫GST基因的PCR检测方法鉴定阳性重组病毒，如此进行三次纯化，获得重组日本血吸虫Sj26GST基因伪狂犬病病毒载体活疫苗rPRV/Sj26GST。4.重组R本血吸虫SJ26GST基因伪狂犬病病毒载体活疫苗的鉴定PCR鉴定利用闩本血吸虫Sj26GST基因特异性引物Pl和P2，以重组中间病毒rPRV/LacZ作为对照，按常规方法进行PCR扩增。Sj26GST特异性引物Pl:5'-ATGGCTTGTGGGCATGTTAAGCTTA-3';P2:5'-TTAAAATGCCGTTGCATGTCTCTCTG-3'。重组病毒rPRV/Sj26GST扩增得到目的条带，而对照组没有得到扩增产物，表明重组毒构建成功。间接免疫荧光将日本血吸虫重组伪狂犬病病毒接种于Vero细胞中，待细胞病变后，按常规方法进行间接免疫荧光试验。经过间接免疫荧光分析，感染重组病毒的Vero细胞出现绿色荧光，而对照组中则没有出现荧光，表明构建的重组毒能够表达FI本血吸虫Sj26GST(图3)。5.重组疫苗rPRV/Sj26GST的制备将获得的进行鉴定，30次传代后发现其遗传性稳定，外源蛋白可以稳定表达，并且具有良好的生物学特性。以重组病毒接种Vero细胞，经转瓶悬浮培养增殖，至病毒TCID,,,达10"个TCH/0.lmL，加入明胶蔗糖作为保护剂，按常规方法冻干制成疫苗。为表明本发明在预防日本血吸虫免疫预防的效果，下列试验给予证明6.rPRV/Sj26GST疫苗的安全性试验随机取10只BALB/c小鼠，用rPRV/Sj26GST(1XlO'H/ml)对其中的5只进行免疫接种，肌注0.2ml/只；另5只小鼠作为阴性对照，肌注0.2ml生理盐水/只。对实验小鼠进行隔离饲养，每天观察其精神、食欲、体温等临床变化情况。观察21d。在饲养观察期间未见免疫小鼠出现体温升高、发痒、食欲减少等感染症状。证明该疫苗是安全的。7.rPRV/Sj26GST疫苗的免疫原性实验随机取20只BALB/c小鼠，用rPRV/Sj26GST(1X105TCID5/ml)对其中的10只进行免疫接种，肌注0.2ml/只；另IO只小鼠作为阴性对照，肌注0.2ml生理盐水/只。免疫后30天经皮肤感染日本血吸虫尾呦，每只小鼠感染40土2条，40天后剖检按常规方法，计算小鼠的成虫减虫率及肝减卵率(表l)。实施例2重组日本血吸虫Sj23基因伪狂犬病病毒载体活疫苗的制备按照附图1所示的工艺路线制备重组日本血吸虫Sj23基因伪狂犬病病毒载体活疫苗。具体歩骤如下1.日本血吸虫保护性抗原Sj23基因的克隆及真核表达载体的构建用1500条血吸虫尾蚴感染家兔，45d后解剖。用无菌枸橼酸钠生理盐水进行门静脉灌注，收集成虫，无菌生理盐水洗漆，去除附着在虫体表面的血液成分。取新鲜成虫0.5g，在冰上进行匀浆，运用Trizol方法制备成虫mRNA。通过RT-PCR的方法获得保护性抗原Sj23。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳确定后，将得到的基因克隆至pMD-18T载体，构建重组质粒pMD/Sj23，采用双脱氧末端终止法测其序列。将Sj23基因亚克隆入真核表达载体pVAXl构建重组质粒pVAX/Sj23。2.伪狂犬病病毒重组中间转移载体及重组中间病毒rPRV/LacZ的构建按照实施例1构建重组中间病毒rPRV/LacZ。3.重组日本血吸虫Sj23基因伪狂犬病病毒载体活疫苗的构建通过双酶切从日本血吸虫真核表达载体pVAX/Sj23获得目的基因Sj23表达盒，并将其克隆入中间转移载体p8KD的合适酶切位点，从而构建伪狂犬病病毒重组转移载体p8KD/Sj23;在Vero细胞上增殖重组中间病毒rPRV/LacZ，碱裂解法提取基因组DNA。用EcoRI将病毒rPRV/LacZ的基因组酶切，应用脂质体介导转染技术将其与伪狂犬病病毒重组中间转移载体p8KD/Sj23共转染Vero细胞，经同源重组日本血吸虫保护性抗原基因表达盒置换出了LacZ基因表达盒，待产生细胞病变后收毒。将病毒液接种Vero细胞，用含1%低熔点琼脂糖的DMEM维持液覆盖于37'C5%C02的条件下培养，当出现细胞病变时，在X-gal存在时经蓝白斑筛选，挑取单个白斑接种于Vero细胞扩大培养，利用日本血吸虫Sj23基因的PCR检测方法鉴定阳性重组病毒，如此进行三次纯化，获得重组日本血吸虫Sj23基因伪狂犬病病毒载体活疫苗rPRV/Sj23。4.重组円本血吸虫Sj23基因伪狂犬病病毒载体活疫苗的鉴定PCR鉴定利用日本血吸虫Sj23基因特异性引物Pl和P2,以重组中间病毒rPRV/LacZ作为对照，按常规方法进行PCR扩增。Sj23特异性引物Pl:5'-ATGGCGACTTTGGGTACTGGGATGAGGTG-3';P2:5'-TTAAACATTCTGATAATCGTGTATTCGT-3'。重组病毒rPRV/Sj23扩增得到目的条带，而对照组没有得到扩增产物，表明重组毒构建成功。间接免疫荧光将R本血吸虫重组伪狂犬病病毒接种于Vero细胞中，待细胞病变后，按常规方法进行间接免疫荧光试验。经过间接免疫荧光分析，感染重组病毒的Vero细胞出现绿色荧光，而对照组中则没有出现荧光，表明构建的重组毒能够表达R本血吸虫Sj23(图3)。5.重组疫苗rPRV/Sj23的制备将获得的进行鉴定，30次传代后发现其遗传性稳定，外源蛋白可以稳定表达，并且具有良好的生物学特性。以重组病毒接种Vero细胞，经转瓶悬浮培养增殖，至病毒TCID.;。达1(T个TCID5。/0.lmL，加入明胶蔗糖作为保护剂，按常规方法冻千制成疫苗。为表明本发明在预防F1本血吸虫免疫预防的效果，下列试验给予证明6.rPRV/Sj23疫苗的安全性试验随机取10只BALB/c小鼠，用rPRV/Sj23(1Xl(fTCID5,,/ml)对其中的5只进行免疫接种，肌注0.2ml/只；另5只小鼠作为阴性对照，肌注0.2ml生理盐水/只。对实验小鼠进行隔离饲养，每天观察其精神、食欲、体温等临床变化情况。观察21d。在饲养观察期间未见免疫小鼠出现体温升高、发痒、食欲减少等感染症状。证明该疫苗是安全的。7.rPRV/Sj23疫苗的免疫原性实验随机取20只BALB/c小鼠，用rPRV/Sj23(1X105TCID5/ml)对其中的10只进行免疫接种，肌注0.2ml/只；另IO只小鼠作为阴性对照，肌注0.2ml生理盐水/只。免疫后30天经皮肤感染日本血吸虫尾蚴，每只小鼠感染40土2条，40天后剖检按常规方法，计算小鼠的成虫减虫率及肝减卵率(表l)。实施例3重组日本血吸虫FABP基因伪狂犬病病毒载体活疫苗的制备按照附图1所示的工艺路线制备重组日本血吸虫FABP基因伪狂犬病病毒载体活疫苗。具体步骤如下-1.R本血吸虫保护性抗原FABP基因的克隆及真核表达载体的构建用1500条血吸虫尾呦感染家兔，45d后解剖。用无菌枸橼酸钠生理盐水进行门静脉灌注，收集成虫，无菌生理盐水洗涤，去除附着在虫体表面的血液成分。取新鲜成虫0.5g，在冰上进行匀浆，运用Trizol方法制备成虫mRNA。通过RT-PCR的方法获得保护性抗原FABP。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳确定后，将得到的基因克隆至pMD-18T载体，构建重组质粒pMD/FABP，采用双脱氧术端终止法测其序列。将FABP基因亚克隆入真核表达载体pVAXl构建重组质粒pVAX/FABP。2.伪狂犬病病毒重组中间转移载体及重组中间病毒rPRV/LacZ的构建按照实施例1构建重组中间病毒rPRV/LacZ。3.重组R本血吸虫FABP基因伪狂犬病病毒载体活疫苗的构建通过双酶切从日本血吸虫真核表达载体pVAX/FABP获得目的基因FABP表达盒，并将其克隆入中间转移载体p8KD的适宜酶切位点，从而构建伪狂犬病病毒重组转移载体p8KD/FABP;在Vero细胞上增殖重组中间病毒rPRV/LacZ，碱裂解法提取基因组DNA。用EcoRI将病毒rPRV/LacZ的基因组酶切，应用脂质体介导转染技术将其与伪狂犬病病毒重组中间转移载体p8KD/FABP共转染Vero细胞，经同源重组日本血吸虫保护性抗原基因表达盒置换出了LacZ基因表达盒，待产生细胞病变后收毒。将病毒液接种Vero细胞，用含1%低熔点琼脂糖的DMEM维持液覆盖于37°C5%0)2的条件下培养，当出现细胞病变时，在X-gal存在时经蓝白斑筛选，挑取单个白斑接种于Vero细胞扩大培养，利用日本血吸虫FABP基因的PCR检测方法鉴定阳性重组病毒，如此进行三次纯化，获得重组日本血吸虫FABP基因伪狂犬病病毒载体活疫苗rPRV/FABP。4.重组円本血吸虫FABP基因伪狂犬病病毒载体活疫苗的鉴定PCR鉴定利用R本血吸虫FABP基因特异性引物Pl和P2，以重组中间病毒rPRV/LacZ作为对照，按常规方法进行PCR扩增。FABP特异性引物Pl:5'-ATGTCTTCTTTCTTGGGAAAGT-3';P2:5'-TTACAATCGTTTGTAATTCCGAATAGC-3'。重组病毒rPRV/FABP扩增得到目的条带，而对照组没有得到扩增产物，表明重组毒构建成功。间接免疫荧光将日本血吸虫重组伪狂犬病病毒接种于Vero细胞中，待细胞病变后，按常规方法进行间接免疫荧光试验。经过间接免疫荧光分析，感染重组病毒的Vero细胞出现绿色荧光，而对照组中则没有出现荧光，表明构建的重组毒能够表达R本血吸虫FABP(图3)。5.重组疫苗rPRV/FABP的制备将获得的进行鉴定，30次传代后发现其遗传性稳定，外源蛋白可以稳定表达，并且具有良好的生物学特性。以重组病毒接种Vero细胞，经转瓶悬浮培养增殖，至病毒TCIDM达105—6个TCIDs。/0.lraL,加入明胶蔗糖作为保护剂，按常规方法冻干制成疫苗。为表明本发明在预防日本血吸虫免疫预防的效果，下列试验给予证明6.rPRV/FABP疫苗的安全性试验随机取10只BALB/c小鼠，用rPRV/FABP(1X105TCID5,,/ml)对其中的5只进行免疫接种，肌注0.2ml/只；另5只小鼠作为阴性对照，肌注0.2ml生理盐水/只。对实验小鼠进行隔离饲养，每天观察其精神、食欲、体温等临床变化情况。观察21d。在饲养观察期间未见免疫小鼠出现体温升高、发痒、食欲减少等感染症状。证明该疫苗是安全的。7.rPRV/FABP疫苗的免疫原性实验随机取20只BALB/c小鼠，用rPRV/FABP(1X105TCID5,)/ml)对其中的10只进行免疫接种，肌注0.2ml/只；另IO只小鼠作为阴性对照，肌注0.2ml生理盐水/只。免疫后30天经皮肤感染日本血吸虫尾蚴，每只小鼠感染40土2条，40天后剖检按常规方法，计算小鼠的成虫减虫率及肝减卵率(表l)。实施例4多价日本血吸虫伪狂犬病病毒载体活疫苗rPRV/Sj26GST-FABP的制备按照附图2所示的工艺路线制备多价H本血吸虫伪狂犬病病毒载体活疫苗。具体步骤如下1.闩本血吸虫多价真核表达载体的构建运用基因克隆技术按常规方法按照图2所示的技术路线构建含有R本血吸虫Sj26GST、FABP的多价真核载体pVAX/Sj26GST-FABP。2.多价日本血吸虫伪狂犬病病毒载体活疫苗的构建通过双酶切从日本血吸虫多价真核载体pVAX/Sj26GST-FABP回收目的基因表达盒，并将其克隆入中间转移载体p8KD的适宜酶切位点，从而构建伪狂犬病病毒重组转移载体p8KD/SJ26GST-FABP;在Vero细胞上增殖重组中间病毒rPRV/LacZ，碱裂解法提取基因组DNA，经限制性内切酶EcoRI酶切后，应用脂质体转染方法将其与伪狂犬病病毒重组中间转移载体转移载体p8KD/Sj26GST-FABP共转染Vero细胞，经同源重组5本血吸虫保护性抗原基因表达盒置换出了LacZ基因表达盒，待产生细胞病变后收毒，在X-gal存在时经蓝白斑筛选，挑取单个白斑接种于Vero细胞扩大培养，利用日本血吸虫GST、FABP基因的PCR鉴定阳性重组病毒，如此进行三次纯化，获得多价日本血吸虫重组伪狂犬病病毒载体活疫苗rPRV/Sj26GST-FABP。3.多价円本血吸虫伪狂犬病病毒载体活疫苗的鉴定PCR鉴定利用闩本血吸虫Sj26GST和FABP基因特异性引物Pl和P2，以重组中间病毒rPRV/LacZ作为对照，按常规方法进行PCR扩增。Sj26GST特异性引物Pl:5'-ATGGCTTGTGGGCATGTTAAGCTTA-3';P2:5'-TTAAAATGCCGTTGCATGTCTCTCTG-3'。FABP特异性引物PI:5'-ATGTCTTCTTTCTTGGGAAAGT-3';P2:5'_TTACAATCGTTTGTAATTCCGAATAGC-3'。重组病毒rPRV/Sj26GST-FABP扩增得到目的条带，而对照组没有得到扩增产物，表明重组毒构建成功。间接免疫荧光将R本血吸虫重组伪狂犬病病毒接种于Vero细胞中，待细胞病变后，按常规方法进行间接免疫荧光试验。经过间接免疫荧光分析，感染重组病毒的Vero细胞出现绿色荧光，而对照组中则没有出现荧光，表明构建的重组毒能够表达R本血吸虫Sj26GST、FABP(图3)。4.多价R本血吸虫伪狂犬病病毒载体活疫苗的制备将获得的进行鉴定，30次传代后发现其遗传性稳定，外源蛋白可以稳定表达，并且具有良好的生物学特性。以重组病毒接种Vero细胞，经转瓶悬浮培养增殖，至病毒TCIDM达10"个TCIDs。/0.lmL，加入明胶蔗糖作为保护剂，按常规方法冻干制成疫苗。为表明本发明在预防闩本血吸虫免疫预防的效果，下列试验给予证明5.多价闩本血吸虫伪狂犬病病毒载体活疫苗安全性试验随机取IO只BALB/c小鼠，用rPRV/Sj26GST-FABP(1X105TCID5。/ml)对其中的5只进行免疫接种，肌注0.2ml/只；另5只小鼠作为阴性对照，肌注0.2ml生理盐水/只。对实验小鼠进行隔离饲养，每天观察其精神、食欲、体温与粪便等临床变化情况。观察21d。在饲养观察期间未见免疫小鼠出现体温升高、发痒、食欲减少等感染症状。证明该疫苗是安全的。6.多价日本血吸虫伪狂犬病病毒载体活疫苗免疫原性实验随机取20只BALB/c小鼠，用rPRV/Sj26GST-FABP(1X105TCID5/ml)对其中的10只进行免疫接种，肌注0.2ml/只；另IO只小鼠作为阴性对照，肌注0.2ml生理盐水/只。免疫后30天经皮肤感染日本血吸虫尾蚴，每只小鼠感染40土2条，40天后剖检按常规方法，计算小鼠的成虫减虫率及肝减卵率(表1)。实施例5多价日本血吸虫伪狂犬病病毒载体活疫苗rPRV/Sj26GST-FABP-Sj23的制备按照附图2所示的工艺路线制备多价日本血吸虫伪狂犬病病毒载体活疫苗。具体歩骤如下1.日本血吸虫多价真核表达载体的构建运用基因克隆技术按常规方法按照图2所示的技术路线构建含有日本血吸虫Sj26GST、FABP和Sj23的真核载体pIRES/GF23。2.多价日本血吸虫伪狂犬病病毒载体活疫苗的构建通过双酶切从日本血吸虫多价真核载体pIRES/GF23回收目的基因表达盒，并将其克隆入中间转移载体p8KD的适宜酶切位点，从而构建伪狂犬病病毒重组转移载体p8KD/GF23;在Vero细胞上增殖重组中间病毒rPRV/LacZ，碱裂解法提取基因组DNA，经限制性内切酶EcoRI酶切后，应用脂质体转染方法将其与伪狂犬病病毒重组中间转移载体转移载体p8KD/GF23共转染Vero细胞，经同源重组日本血吸虫保护性抗原基因表达盒置换出了LacZ基因表达盒，待产生细胞病变后收毒，在X-gal存在时经蓝白斑筛选，挑取单个白斑接种于Vero细胞扩大培养，利用闩本血吸虫GST、FABP及Sj23基因的PCR鉴定阳性重组病毒，如此进行三次纯化，获得多价日本血吸虫重组伪狂犬病病毒载体活疫苗rPRV/GF23。3.多价闩本血吸虫伪狂犬病病毒载体活疫苗的鉴定PCR鉴定:利用日本血吸虫Sj26GST(Sj23、FABP)基因特异性引物Pl和P2，以重组中间病毒rPRV/LacZ作为对照，按常规方法进行PCR扩增。Sj26GST特异性引物Pl:5'-ATGGCTTGTGGGCATGTTAAGCTTA-3';P2:5'-TTAAAATGCCGTTGCATGTCTCTCTG-3'。Sj23特异性引物Pl:5'-ATGGCGACTTTGGGTACTGGGATGAGGTG-3';P2:5'-TTAAACATTCTGATAATCGTGTATTCGT-3'。FABP特异性引物Pl:5'-ATGTCTTCTTTCTTGGGAAAGT-3';P2:5'-TTACAATCGTTTGTAATTCCGAATAGC-3'。重组病毒rPRV/Sj26GST-FABP-Sj23扩增得到目的条带，而对照组没有得到扩增产物，表明重组毒构建成功。间接免疫荧光将日本血吸虫重组伪狂犬病病毒接种于Vero细胞中，待细胞病变后，按常规方法进行间接免疫荧光试验。经过间接免疫荧光分析，感染重组病毒的Vero细胞出现绿色荧光，而对照组中则没有出现荧光，表明构建的重组毒能够表达円本血吸虫Sj26GST、Sj23、FABP(图3)。4.多价日本血吸虫伪狂犬病病毒载体活疫苗的制备将获得的进行鉴定，30次传代后发现其遗传性稳定，外源蛋白可以稳定表达，并且具有良好的生物学特性。以重组病毒接种Vero细胞，经转瓶悬浮培养增殖，至病毒TCID5达105—6个TCIDs(,/0.lmL，加入明胶庶糖作为保护剂，按常规方法冻干制成疫苗。为表明本发明在预防日本血吸虫免疫预防的效果，下列试验给予证明5.多价R本血吸虫伪狂犬病病毒载体活疫苗安全性试验随机取10只BALB/c小鼠，用rPRV/SJ26GST-FABP-Sj23(1X105TCID5。/ml)对其中的5只进行免疫接种，肌注0.2ml/只；另5只小鼠作为阴性对照，肌注0.2ml生理盐水/只。对实验小鼠进行隔离饲养，每天观察其精神、食欲、体温与粪便等临床变化情况。观察21天。在饲养观察期间未见免疫小鼠出现体温升高、发痒、食欲减少等感染症状。证明该疫苗是安全的。6.多价R本血吸虫伪狂犬病病毒载体活疫苗免疫原性实验随机取20只BALB/c小鼠，用rPRV/SJ26GST-FABP-Sj23(1X105TCIDw/ml)对其中的10只进行免疫接种，肌注0.2ml/只；另10只小鼠作为阴性对照，肌注0.2ral生理盐水/只。免疫后30天经皮肤感染日本血吸虫尾蚴，每只小鼠感染40士2条，40天后剖检按常规方法，计算小鼠的成虫减虫率及肝减卵率(表l)。表l日本血吸虫重组活载体疫苗对小鼠的免疫保护作用<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>权利要求1、一种以猪伪狂犬病病毒为载体的日本血吸虫基因重组活疫苗，其特征在于包含有日本血吸虫保护性抗原基因及部分基因缺失的猪伪狂犬病病毒。2、根据权利要求1所述重组疫苗，其特征在于疫苗中重组病毒目的基因表达盒由巨噬细胞病毒(CMV)启动子、日本血吸虫保护性抗原基因及polyA信号组成。3、根据权利要求1所述重组疫苗，其特征在于血吸虫抗原基因包括Sj26GST、SjFABP和Sj23，构成单价重组活载体疫苗rPRV/Sj26GST、rPRV/FABP、rPRV/Sj23以及多价活载体疫苗rPRV/Sj26GST-FABP和rPRV/Sj26GST-FABP-Sj23。4、据权利要求1所述重组疫苗，其特征在于疫苗中猪伪狂犬病病病毒缺失了其复制非必需基因TK、PK、gG或gl。5、权利要求l所述的重组疫苗的制备工艺，包括以下步骤a.日本血吸虫保护性抗原基因的克隆；b.重组质粒的构建；c.重组病毒的获得；d.疫苗的制备。全文摘要本发明提供一种日本血吸虫重组活载体疫苗，由猪伪狂犬病病毒和日本血吸虫抗原基因组成，日本血吸虫抗原基因包括Sj26GST、SjFABP和Sj23，构成单价重组活载体疫苗rPRV/Sj26GST、rPRV/FABP、rPRV/Sj23以及多价活载体疫苗rPRV/Sj26GST-FABP和rPRV/Sj26GST-FABP-Sj23，其成虫减虫率为38.4％～56.5％，肝脏减卵率为38.8％～70.6％，能有效诱导抗日本血吸虫的免疫保护力，一次免疫能产生较为持久的免疫保护效果，对环境无污染和不良影响，无不良反应。文档编号A61K39/00GK101444622SQ20081005080公开日2009年6月3日申请日期2008年6月6日优先权日2008年6月6日发明者全刘,商立民,夏志平,扈荣良,朱兴全,袁子国申请人:中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所