专利名称：一种肿瘤靶向重组dna疫苗及其制备与应用的利记博彩app
技术领域：
本发明属基因工程领域，涉及一种肿瘤靶向重组DNA疫苗。更具体的说，本发明 涉及一种与肿瘤发生发展相关C0X-2的DNA疫苗，该疫苗在患者体内诱导产生对肿瘤 耙向杀伤的CTL反应，实现肿瘤治疗的目标。
背景技术：
肿瘤在其癌变历程中，需要促进因子加快癌变速度，在众多肿瘤促进因子中环氧 合酶-2 (Cyclooxygenase-2， C0X-2)是一种重要的促进因子之一。C0X-2与其同工酶 C0X-l是分解花生四烯酸(Arachidonic acid)生成各种内源性前列腺(Prostaglandins, PGs)过程中关键的限速酶(Cell， 1995, 83(3): 493-501; Cell, 1996, 87(5): 803-809; Cell, 1998, 93(5): 705-716)。 COX酶(EC 1.14. 99.1)具有环氧合酶和过氧化酶两种 活性，COX-l在正常组织中组成型表达，而C0X-2在组织中为诱导型表达(Cell, 1996， 87(5): 803-809)。 COX-2主要参与细胞的生长分化，在肿瘤的发生、发展、浸润和转 移中发挥重要作用。相关研究显示环氧合酶-2 (Cyclooxygenase-2， COX-2)在肺癌、 乳腺癌、胃癌、肝癌、直肠癌、结肠癌、前列腺癌与宫颈癌等肿瘤组织中高表达，而 正常组织不表达或低表达。敲除尸^s^(C0X-2基因)小鼠的研究发现C0X-2有利于肿瘤 的产生，而C0X-2抑制剂可抑制肿瘤的形成。C0X-2通过下述多种途径参与肿瘤的发生 发展1)促进细胞生长与增殖；2)抑制癌细胞凋亡；3)促进肿瘤侵袭转移；4)促 进肿瘤血管的形成；5)抑制免疫反应；6)参与致癌物代谢；7)提高多药抗药性。因 此，C0X-2可作为肿瘤防治的一个重要靶点。此外，C0X-2己是炎症治疗与癌痛治疗的 靶点。流行病调查发现，长期使用非甾体抗炎药能有效预防肿瘤发生。
目前肿瘤免疫治疗可分为主动免疫治疗和被动免疫治疗，主要采用单克隆抗体、 蛋白疫苗、基因疫苗、噬菌体疫苗和细胞疫苗等。生产商已开发了一系列产品，如抗 EGF单克隆抗体商品名为ABX-EGF (N Engl J Med， 2003 ， 349 (5) :427-34)，抗EGFR单 克隆抗体商品名为ERBITUX，又名Cetuximab, IMC-C225 (Semin Oncol， 2003， 30(6): 39-50)， HER2的人源化单克隆抗体商品名Herc印tin (http:〃www. herc印tin. com)等。主动免疫治疗通过接种疫苗如蛋白与DNA疫苗诱导体内产生抗体、CTL及ADCC反应，达 到免疫杀伤作用。2002年4月Niethammer等报道了构建以VEGF受体2作为新型口服DNA疫 苗的动物实验，结果表明，该DNA疫苗能使小鼠耐受致死剂量肿瘤细胞的接种而不长肿 瘤，并縮小已成长的肿瘤。在不同的动物试验中均确认了其抗肿瘤的效果(Nat Med, 2002,8(12): 1369-1375)。英国生物技术公司Plotherics PL开发的VEGF基因疫苗目前 巳进入了预临床试验阶段。
目前已有用肿瘤细胞内特异促进因子的DNA疫苗的抗肿瘤作用的报道，如人端粒酶 逆转录酶(Human telomerase reverse tanscriptase, hTERT)与凋亡抑制蛋白
(Survivin)，其抗原表位肽是经细胞内蛋白酶体加工的产物，能在体外诱导特异性细 胞毒性CD8+Th细胞(Immunity, 1999,10(6): 673-679; Cancer Res， 2000,60:4845 -4849)。基因疫苗抗肿瘤的机理虽然还没有定论，但本领域研究者们共识为基因疫苗 在细胞内表达抗原，部分抗原在细胞蛋白酶体加工，经MHCI呈递在细胞表面，诱导特 异性细胞毒性CD8+细胞；另一部分抗原分泌到胞外被其它免疫细胞摄取，在溶酶体作 用下加工成多肽，与MHCII分子结合，转运到细胞表面被CD4+细胞识别，进一步产生体 液免疫与细胞免疫。COX-2在肿瘤细胞中高表达，在正常组织不表达或低表达。肿瘤细 胞所表达的COX-2同样可被蛋白酶体加工，部分MHC I限制方式呈递在细胞表面，产生 CTL细胞反应。COX-2的DNA疫苗可诱导CTL细胞特异杀伤C0X-2异常表达的肿瘤细胞。但 尚未见关于C0X-2 DNA疫苗的相关报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种肿瘤靶向重组DNA疫苗，具体涉及一种与肿瘤发生发展 相关COX-2的DNA疫苗。该疫苗能在在患者体内诱导产生对肿瘤靶向杀伤的CTL反应， 实现肿瘤治疗的目标。
本发明的另一个目的是提供所述的肿瘤耙向重组DNA疫苗的制备方法。 本发明的进一步目的是提供所述的肿瘤靶向重组DNA疫苗在肿瘤预防与治疗中的 应用。
本发明采用基因工程技术，将肿瘤细胞异常表达C0X-2、 5'-AACGTT-3'序列(免疫 刺激DNA序列Immunostimulatory DNA sequence, ISS)、鼠源泛素蛋白(MJbi)及其 pVAXl载体重组成为pVAXl-/rfJbi-ISS-COX-2-ISS;目的DNA疫苗在原核细胞扩增后， 制备无内毒素高纯的DNA疫苗，免疫小鼠，刺激机体产生CTL反应，杀伤C0X-2异常表达肿瘤细胞，实现肿瘤靶向治疗的目的。
本发明所述的疫苗的DNA序列包括鼠源泛素蛋白(/ziJbi)、 5'-AACGTT-3'序列 (I匪nostimulatory DNA sequence, ISS)、 COX-2蛋白的DNA序列及pVAXl载体。
本发明提供的肿瘤靶向重组DNA疫苗，其特征是，用于制备该疫苗的蛋白是环氧 合酶-2 (COX-2)的功能片段，其编码序列如SEQ ID NO 1所示，氨基酸序列如SEQ ID N0 2所示；为了加快目标蛋白C0X-2的加工与呈递，在C0X-2蛋白的N端连接一段鼠 源的泛素蛋白』bi，其编码序列如SEQ ID NO 3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO 4所 示；机体产生较强的免疫反应，需要免疫原的刺激，免疫刺激DNA序列ISS可激活T 细胞、B细胞及NK细胞，诱导Thl细胞免疫功能，在//Ubi序列与COX-2交接处及COX-2 的3'端均有ISS序列，其序列如SEQ ID NO 5所示。
本发明提供的肿瘤靶向重组DNA疫苗在基本载体pVAXl的多克隆位点MCS处插入 SEQ ID NO 7的片段/zUbi-ISS-COX-2-ISS，构建成编码鼠源泛素蛋白/dJbi与COX-2融 合蛋白抗原，融合蛋白抗原之间由SEQ ID NO 6的柔性接头连接，制得肿瘤耙向重组 DNA疫苗，命名为pVAXl-yziJbi-ISS-COX-2 - ISS。
本发明的肿瘤耙向重组DNA疫苗通过下述方法制备
1) 以pVAXl (购自Invitrogen公司)为基本载体，该载体含有卡那霉素抗性基因 的表达框与多克隆位点(Multiple cloning site, MCS);
2) 在pVAXl的MCS位点插入C0X-2表达框，所述COX-2表达框的构成是从5' 端到3'端方面依次为(I )转录调控区的巨细胞病毒早期启动子/增强子P^v， (II) MJbi序列，(III) ISS序列，(IV) C0X-2基因序列，(V) ISS序列，(VI)牛生长激素 的多聚腺苷酰化信号(BGHpA)，
所得DNA疫苗载体命名为pVAXl-MJbi-ISS-C0X-2-ISS。
所述的疫苗，其中的PcMv使重组蛋白高水平表达、Wbi加快COX-2抗原加工与呈 递、ISS序列作为免疫佐剂激活机体免疫系统，诱导肿瘤靶向CTL产生、杀伤COX-2 异常表达的肿瘤细胞。
本发明中涉及的各种细菌扩增、培养、转化、鉴定、纯化等方法采用本领域公知 的常规条件与步骤。
本发明所涉及的原核细胞为大肠杆菌DH5a 。
本发明的肿瘤靶向的DNA疫苗载体pVAXl-MJbi-ISS-COX-2-ISS转化大肠杆菌DH5ci可得到含有该疫苗载体的大肠杆菌转化子。
本发明通过扩大培养上述含pVAXl-MJbi-ISS-C0X-2-ISS疫苗载体的大肠杆菌转化 子，经提取纯化得pVAXl-y iJbi-ISS-C0X-2-ISS疫苗并测定浓度，通过动物实验等检验 疫苗的效果，如DNA疫苗免疫动物，接种肿瘤细胞，观察杀伤效应(预防性实验)，或 者在长有肿瘤的动物体内注射该疫苗，观察抗肿瘤效果(治疗性实验)。
预防性实验结果表明预防组比对照组全部成瘤性晚9天，接瘤后的第21天全部 成瘤，对照组为接瘤后的第12天全部成瘤，表明，该肿瘤靶向DNA疫苗可明显降低B16 黑色素瘤细胞的小鼠成瘤性。
本发明肿瘤靶向DNA疫苗可强烈杀伤B16肿瘤细胞，抑制肿瘤生长，在接瘤后的 第30天，抑瘤率为63.4%，治疗组动物成活率明显高于对照组，生成期可达60天。治 疗性实验结果表明治疗组比对照组全部成瘤性晚2天，为接瘤后15天；本发明肿瘤 靶向DNA疫苗能降低B16黑色素瘤细胞动物成瘤性；该DNA疫苗在B16肿瘤细胞接瘤 后的第25天，抑瘤率为58.9%，且治疗组动物成活率明显高于对照组，其生成期可超 过45天；上述结果证实本发明的肿瘤靶向重组DNA疫苗，免疫动物后具有良好预治 肿瘤效果。
本发明还提供了一种肿瘤靶向重组DNA疫苗的应用，其特征是，将该疫苗应用于 制备肿瘤预防与治疗的药剂。
本发明还提供了一种肿瘤靶向重组DNA疫苗的应用，其特征是，将该疫苗应用于 制备炎症治疗的药剂，这主要是通过该疫苗杀伤炎症细胞。
本发明还提供了一种肿瘤耙向重组DNA疫苗的应用，其特征是，将该疫苗应用于 制备癌痛治疗的药剂。
本发明制备的肿瘤靶向DNA疫苗具有以下特点
1、 本发明以肿瘤细胞异常表达的C0X-2分子为DNA疫苗的靶基因，免疫实验动物 并诱导产生针对异常表达C0X-2的肿瘤细胞的CTL反应、导致肿瘤细胞生长受到抑制 和促进肿瘤细胞凋亡，实现肿瘤生物靶向治疗的目标。
2、 5'-AACGTT-3'序列为ISS序列，ISS作为免疫佐剂激活机体免疫系统，可作用 与T细胞、B细胞及NK细胞等免疫效应细胞，并促进IL-6、 IL-12、 IL-18及IFN等多 种细胞因子的分泌，具有较强诱导Thl细胞免疫功能。
3、泛素/ziJbi与C0X-2融合表达连接可增强C0X-2蛋白在蛋白酶体中的降解、呈递，
6提高并加快抗原诱导的CTL免疫应答。
4、 本疫苗易构建、易改造、制备成本低廉并可大规模生产。
5、 本疫苗物理化学性质稳定，20-25'C下可保存、便于运输与使用。
6、 本疫苗可长时间诱导免疫反应，与常规的多肽(蛋白疫苗)相比，免疫接种量 与接种次数少。
7、 本疫苗含有/HUbi序列与ISS序列，既加快了DNA疫苗的免疫效能，同时避免各 种对人体有害的免疫佐剂。
以下通过
与具体实施方式
对本发明作进一步说明
图1 pVAXl-zsUbi-ISS-C0X-2-ISS肿瘤耙向DNA疫苗结构示意图。
图2含有』bi的片段的质粒pVAXl-MJbi结构示意图。
图3 pVAXl-/zDbi-ISS-C0X-2-ISS肿瘤耙向DNA疫苗构建示意图。
图4 pVAXl-/ziUbi-ISS-C0X-2-ISS肿瘤耙向DNA疫苗抗肿瘤作用(免疫治疗)。
图5 pVAXl-MJbi-ISS-C0X-2-ISS肿瘤耙向DNA疫苗对肿瘤生长的影响(免疫治疗)。
图6 pVAXl-/wUbi-ISS-C0X-2-ISS肿瘤耙向DNA疫苗抗肿瘤作用(免疫预防)。
图7 PVAXl-/sUbi-ISS-C0X-2-ISS肿瘤耙向DNA疫苗对肿瘤生长的影响(免疫预防)。
具体实施方式
实施例l C0X-2基因克隆 A549细胞总mRNA提取
A549细胞培养于含10X小牛血清的完全1640培养液，置37'C、 5%0)2培养箱，胰蛋 白酶消化后离心收集细胞，弃上清，按照Trizol提取试剂盒(华舜公司)进行总mRNA 提取，电泳检测。
弓I物设计与RT-PCR扩增 根据GenBank数据库BC013734登陆号提供的C0X-2基因序列及pVAXl载体上的酶切 位点设计引物，在上下引物中分别引入)9aMn和&oRI酶切位点，引物由上海赛百盛
基因技术有限公司合成
上游引物(SEQ ID NO 8 ) : 5、 -CGGGATCCGGTGGGGGCGG，Cg77CCTTGCTGTTCCAACCCA
TGTC-3'(下划线为"a/rfU位点，加粗的为部分柔性接头序列，斜体为ISS序列)；下游引物(SEQ ID NO 9):
5、-CGGAATTCTTA雄6T7CAGTTCAGTCGAACGTTCTTTTAG-3'(下划线为AcoR I位点，斜 体为ISS序列)。
按Promega公司RT试剂盒说明进行C0X-2基因cDNA合成。
PCR反应体系为50uL:
cDNA为模板 1 u L,
5U/ u L ￡r7a<7 DNA聚合酶 0. 3 u L，
10XPCR Buffer 5n L，
10 ,1 / L d證 4 ix 1，
10 pmol /L上游引物 2nL，
10 pmol/L下游引物 2uL，
双蒸水 35. 7 u L
总体积 50uL。
循环参数为
94'C预变性 5 min;
94'C变性 30 S，
58。C退火 60 S，
72。C延伸 120 S， 30个循环;
72'C延伸 10 min, l个循环;
4'C保存 ~。 PCR扩增产物在l. 0%的琼脂糖凝胶电泳。
用PCR产物回收试剂盒(TaKaRa公司)回收大小约1. 8 kb左右上述产物，用TJ)NA 连接酶(TaKaRa公司)将PCR纯化C0X-2 DNA片段与pMD19-T (TaKaRa公司)载体片 段相连，其质粒载体命名为pMD19-ISS-C0X-2-ISS。
连接反应体系20 uL
COX-2DNA片段 5 u L
pMD19-T载体片段 8uL
T4DNA连接酶 0. 5 p L
T4DNA连接酶Buffer 2 u L双蒸水 4. 5 u L
总体积 20 uL
16'C连接过夜。
将连接产物转化DH5a感受态大肠杆菌，蓝白筛选，阳性克隆接种于含5 mL Amp 的LB培养液中，37'C振摇过夜，提取质粒DNA行PCR与酶切鉴定(具体操作按照《分 子克隆实验指南》第三版(J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著黄培堂等译2000)相关方 法进行)，并送上海捷瑞生物工程公司测序。测序结果与GenBank数据库BC013734登 陆号提供的C0X-2基因的序列一致，序列见SEQ ID NO 1。
实施例2 鼠源MJbi基因克隆 小鼠睾丸组织总mRNA提取
无菌条件下C57BL/6雄性小鼠(中科院上海实验动物中心)的睾丸组织，并用DEPC 处理的双蒸水清洗2次，取0.5克组织、捣碎，按照Trizol提取试剂盒(华舜公司)进 行总mRNA提取，电泳检测。 引物设计与RT-PCR扩增
按GenBank数据库X51703登陆号提供的MJbi基因序列及pVAXl载体上的酶切位点设 计引物，在上下引物中分别引入AVwffl和ife/rfil酶切位点，引物由上海赛百盛基因技 术有限公司合成
上游引物(SEQ ID NO 10) : 5'-CGAAGCTTGCCACCATGCAGATCTTCGTGAAAACC-3'(下 划线为历/70ffl位点)；
下游引物(SEQ ID NO 11): 5' -CGGGATCCGCCACCGCCTCCGCCACCTCTCAGGCGAAGGACCA-3' (下划线为5』I位点，加粗的为柔性接头序列)。
按Pr omega公司RT试剂盒说明进行/riJb i基因cDNA合成。
PCR反应体系为50nL:
cDNA为模板 0.5uL，
5U/ii L ￡r7"a<7 DNA聚合酶. 0. 3 u L，
10XPCR Buffer 5uL，
10腸l /L d酵 4ti 1，
10 pmol /L上游引物 2uL,
1Opmol/L下游引物 2pL，5 min; 30 S， 30 S，
30 S， 30个循环; 7 min， l个循环；
双蒸水 36. 2 u L
总体积 50uL。 循环参数为
94'C预变性 94'C变性 58'C退火 72'C延伸 72'C延伸
4'C保存 oo。 PCR扩增产物在2. 0%的琼脂糖凝胶电泳。
用PCR产物回收试剂盒(TaKaRa公司)回收大小约230 bp左右上述产物，用T4DNA 连接酶将PCR纯化MJbi DNA片段与PMD19-T载体片段相连，其质粒载体命名为 p腿9-暴i。
连接反应、连接产物转化DH5a及其测序的实验方法同1.2方案中相应部分。测 序结果与GenBank数据库X51703登陆号提供的MJbi基因的序列一致，序列见SEQ ID NO 3。
实施例3构建pVAXl-zzUbi-ISS-COX-2-ISS肿瘤靶向DNA疫苗重组载体 pVAXl-zzUbi重组载体的构建 在含20u g/mL Amp抗性的LB培养5mL, 37。C震荡过夜培养含pMD19-MJbi质粒的 DH5a感受态大肠杆菌，按《分子克隆实验指南》第三版提取pMD19-MJbi质粒DNA。
同样在含50 u g/mL Kan抗性的LB培养5mL， 37。C震荡过夜培养含pVAXl质粒的DH5 a 感受态大肠杆菌，按《分子克隆实验指南》第三版提取pVAXl质粒DNA。
用历'"dll和Aa/zH I (TaKaRa公司)分别双酶切pMD19-/ Ubi质粒DNA与pVAXl质粒 DNA (Invitrogen公司)，酶切反应体系为80uL: 质粒DNA 20 yL
幼'慮 3uL fe/zH I 3 P L
10Xbuffer K 8u L双蒸水 46 u L
总体积 80uL。 37"C水浴酶切过夜。
PCR扩增产物在琼脂糖凝胶电泳。用DNA凝胶回收试剂盒分别回收230bp的/ziJbi DNA片段与3. Okb的pVAXl DNA片段，T4 DNA连接酶连接上述片段 连接反应体系20uL
/sUbi DNA片段5nL
pVAXl DNA片段8"
T4DNA连接酶0.5uL
T4DNA连接酶Buffer2uL
双蒸水4. 5nL
总体积
16'C连接过夜。
将连接产物转化DH5a感受态大肠杆菌，涂布在50ug/mL Kan抗性的LB固体培 养基上过夜培养，阳性克隆接种于含50ug/mL Kan抗性5 mL LB培养液中，37。C振摇 过夜，提取质粒DNA行PCR与A'/7cffl和5』I酶切鉴定(具体操作按照《分子克隆实 验指南》第三版(J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著黄培堂等译2000)相关方法进行)。
pVAXl-znUbi-ISS-COX-2-ISS重组载体的构建
在含20 P g/mL Amp抗性的LB培养5mL， 37。C震荡过夜培养含pMD19-ISS-COX-2-ISS 质粒的DH5a感受态大肠杆菌，按《分子克隆实验指南》第三版提取 pMD19-ISS-COX-2-ISS质粒DNA。
同样在含50 u g/mL Kan抗性的LB培养5mL， 37。C震荡过夜培养含pVAXl-/dJbi质 粒的DH5 a感受态大肠杆菌，按《分子克隆实验指南》第三版提取pVAXl-Wbi质粒DNA。 用fe/ziU和fcoRl (TaKaRa公司生产)分别双酶切pVAXl-MJbi质粒DNA与 pMD19-ISS-C0X-2-ISS质粒DNA (Invitrogen公司)，酶切反应体系为80uL (酶切反 应体系与酶切条件同重组载体的构建)
PCR扩增产物在琼脂糖凝胶电泳。用DNA凝胶回收试剂盒分别回收l. 8kb的ISS-COX-2-ISS DNA片段与3. 2kb的pVAXl-zzUbi DNA片段，T4 DNA连接酶连接上述片段(连接 反应体系与酶切反应条件同上述)。
11连接产物pVAXl-』bi-ISS-COX-2-ISS转化DH5 a感受态大肠杆菌、Kan抗性转化 子大规模培养、碱裂解法制备pVAXl-/BUbi-ISS-C0X-2-ISS疫苗DNA。yW〃^dlI和5』I 酶切鉴定MJbi DNA片段，用5a/zH I和ScoR I鉴定ISS-COX-2-ISS DNA片段， 和￡coR I鉴定Wbi-ISS-COX-2-ISS DNA片段，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳依次可获 得230bp， 1.8kb及2.0kb地下的片段，鉴定结果与预期相符合(具体反应体系与反应 条件参见3. 1方案)。酶切鉴定后并送上海鼎安生物公司测序，其测序结果见SEQ ID NO 7。
实施例4 大量制备与纯化pVAXl-MJbi-ISS-C0X-2-ISS疫苗DNA
采用碱裂解法大量制备pVAXl-/*bi-ISS-COX-2-ISS疫苗及对照pVAXl质粒DNA， TritonX-IOO去除内毒素，PEG8000沉淀后溶于生理盐水中，测定八26。〃28。值为1. 8，调 整浓度为lug/uL(具体操作按照《分子克隆实验指南》第三版(J.萨姆布鲁克，D.W. 拉塞尔著黄培堂等译2000)相关方法进行)。
实施例5肿瘤靶向DNA疫苗实验治疗肿瘤
1) 建立动物实验肿瘤模型 体外培养小鼠B16黑色素瘤细胞
小鼠B16黑色素瘤细胞预活化，B16黑色素瘤细胞接种在含10%小牛血清的DMEM 培养液中，置37'C、 5%0)2培养箱；
小鼠B16黑色素瘤细胞培养，胰蛋白酶消化预活化后B16黑色素瘤细胞，离心收集 细胞用无小牛血清的DMEM培养液中清洗2-3次，接种在含10%小牛血清的DMEM培养 液中，置37'C、 5%(:02培养箱4-5天，备用；
荷黑色素瘤B16小鼠C57BL/6为模型
实验用鼠6~8周龄、体重18 22g、健康雌性C57BL/6纯系小鼠(早)(购至中科 院上海实验动物中心)，在动物房培养3-4天(以小鼠适应新的环境)，
胰蛋白酶消化B16黑色素瘤细胞，用PBS (pH7.4)清洗2-3次，经细胞计数后，在 C57BL/6纯系小鼠右前肢腋下皮下接种5 X 106-7 X106，选取9-10天内肿瘤大小为1-3mm 的小鼠作为实验用鼠。
2) 黑色素瘤的免疫治疗实验治疗组(IO只)C57BL/6接种B16黑色素瘤后的第3天注射100ug本发明肿瘤靶 向DNA疫苗在小鼠大腿股四头肌注射25%蔗糖高渗溶液15-20min后，再注射 1 u g/u LpVAXl-函i-ISS-COX-2-ISS DNA疫苗100 ^L，每周1次，共3次；
对照组(IO只)C57BL/6接种B16黑色素瘤后的第3天注射100 u g本肿瘤靶向DNA 疫苗在小鼠大腿股四头肌注射25%蔗糖高渗溶液15-20min后，再注射1 u g/y L pVAXl DNA疫苗100;/L，每周1次，共3次；
接种肿瘤细胞后10天，观察成瘤性；观察肿瘤大小，测定肿瘤长径与短径，肿瘤 体积(國3)=(长径/2) X短径、计算抑瘤率=(对照组瘤体积-实验组瘤体积)/对照组 瘤体积X10(E，观察小鼠的生存期；
实验结果显示，治疗组比对照组全部成瘤性晚2天，为接瘤后15天；开始成瘤为
接瘤后的第12天，而对照组为接瘤后的第10天，本发明肿瘤靶向DNA疫苗可降低B16 黑色素瘤细胞动物成瘤性；肿瘤体积大小表明pVAXl-yrfJbi-ISS-C0X-2-ISS DNA疫苗 具有明显的抗肿瘤作用，能抑制B16肿瘤细胞生长，在接瘤后的第25天，抑瘤率为58. 9% (图4与图5),治疗组动物成活率明显高于对照组，其生成期超过45天。实验结果证 实本pVAXl-zriJbi-ISS-C0X-2-ISS DNA疫苗具有良好的抗肿瘤作用。
表1是pVAXl-/dJbi-ISS-C0X-2-ISS DNA疫苗免疫治疗对B16黑色素瘤细胞动物成 瘤性的影响。
表2是pVAXl-MJbi-ISS-COX-2-ISS DNA疫苗免疫治疗对B16黑色素瘤细胞动物生 存期的影响(活动物)。
表1
接瘤后时间(d)10111213141516
对照组(n=10)14910101010
治疗组(n=10)001791010
表2接瘤后时间(d)15202530354045
对照组(n=10)101071000
治疗组(n=10)101010101092
实施例6肿瘤靶向DNA疫苗对肿瘤的免疫预防实验
1)建立荷黑色素瘤B16小鼠C57BL/6为动物实验肿瘤模型方法同实施例5;2)黑色素瘤的免疫预防实验
实验组在C57BL/6小鼠大腿股四头肌注射25%蔗糖高渗溶液15-20min后，再注射 1 u g/u L pVAXl-满i-ISS-C0X-2-ISS DNA疫苗100 ^L,每周1次，共4次，末次免 疫结束后，在C57BL/6纯系小鼠右前肢腋下皮下接种5X1(T-7X106， 10天观察肿瘤大 小，测定肿瘤长径与短径，肿瘤体积=(长径/2) X短径2，计算抑瘤率=(对照组瘤体 积-实验组瘤体积)/对照组瘤体积X 100%，观察小鼠的生存期；
对照组在C57BL/6小鼠大腿股四头肌注射25%蔗糖高渗溶液15-20min后，再注射 lug/ixLpVAXl DNA疫苗100;/L，每周1次，共4次，末次免疫结束后，在C57BL/6 纯系小鼠右前肢腋下皮下接种5XlCf-7X106。 IO天观察肿瘤大小，肿瘤测定与体积计 算方法与实验组的相同。
实验结果显示，预防组比对照组全部成瘤性晚9天，为接瘤后21天；开始成瘤期 为16天，而对照组为10天，表明，该肿瘤耙向DNA疫苗可明显降低B16黑色素瘤细 胞的小鼠成瘤性。肿瘤体积结果表明pVAXl-』bi-ISS-COX-2-ISS DNA疫苗具有明显 的抗肿瘤作用，可强烈杀伤B16肿瘤细胞，抑制肿瘤生长，在接瘤后的第30天，抑瘤 率为63.4% (图6与图7)，治疗组动物成活率明显高于对照组，生成期可达60天。 实验证实pVAXl-Wbi-ISS-COX-2-ISS DNA疫苗具有良好的肿瘤预防作用。 表3 pVAXl-MJbi-ISS-C0X-2-ISS DNA疫苗免疫预防对B16黑色素瘤细胞动物成瘤 性的影响。
表4 pVAXl-/zUbi-ISS-COX-2-ISS DNA疫苗预防治疗对B16黑色素瘤细胞动物生存 期的影响(活动物)。
表3
接瘤后时间(d)101112131416182021
对照组(n=10)2810101010101010
治疗组(n=10)0000013910
表4接瘤后时间(d)20253035 4045505560 65
对照组(n=10)10930 00000 0
治疗组(n=10)10101010 109721 0序列表
SEQUENCE LISTING <110>同济大学附属上海市肺科医院 <120〉 一种肿瘤靶向重组DNA疫苗及其制备与应用 <130〉 81 <160〉 11
<170> Patentln version 3.1
<210> 1 <211〉 1764 <212〉 DNA <213> Homo sapiens
<220〉 <221〉 CDS <222〉 ("..(1764) <223>
<400〉 1
cct tgc tgt tec aac cca tgt caa aac cga ggt gta tgt atg agt gtg 48 Pro Cys Cys Ser Asn Pro Cys Gin Asn Arg Gly Val Cys Met Ser Val 15 10 15
gga ttt gac cag tat aag tgc gat tgt acc egg aca gga ttc tat gga 96 Gly Phe Asp Gin Tyr Lys Cys Asp Cys Thr Arg Thr Gly Phe Tyr Gly 20 25 30
gaa aac tgc tea aca ccg gaa ttt ttg aca aga ata aaa tta ttt ctg 144 Glu Asn Cys Ser Thr Pro Glu Phe Leu Thr Arg lie Lys Leu Phe Leu 35 40 45aaa ccc act cca aac aca gtg cac tac ata ctt acc cac ttc aag gga 192 Lys Pro Thr Pro Asn Thr Val His Tyr lie Leu Thr His Phe Lys Gly 50 55 60
ttt tgg aac gtt gtg aat aac att ccc ttc ctt cga aat gca att atg 240 Phe Trp Asn Val Val Asn Asn lie Pro Phe Leu Arg Asn Ala lie Met 65 70 75 80
agt tat gtg ttg aca tec aga tea cat ttg att gac agt cca cca act 288 Ser Tyr Val Leu Thr Ser Arg Ser His Leu lie Asp Ser Pro Pro Thr 85 90 95
tac aat get gac tat ggc tac aaa age tgg gaa gcc ttc tct aac etc 336 Tyr Asn Ala Asp Tyr Gly Tyr Lys Ser Trp Glu Ala Phe Ser Asn Leu 100 105 110
tec tat tat act aga gcc ctt cct cct gtg cct gat gat tgc ccg act 384 Ser Tyr Tyr Thr Arg Ala Leu Pro Pro Val Pro Asp Asp Cys Pro Thr 115 120 125
ccc ttg ggt gtc aaa ggt aaa aag cag ctt cct gat tea aat gag att 432 Pro Leu Gly Val Lys Gly Lys Lys Gin Leu Pro Asp Ser Asn Glu lie 130 135 140
gtg gaa aaa ttg ctt eta aga aga aag ttc ate cct gat ccc cag ggc 480 Val Glu Lys Leu Leu Leu Arg Arg Lys Phe lie Pro Asp Pro Gin Gly 145 150 155 160
tea aac atg atg Ut gca ttc ttt gcc cag cac ttc acg cat cag ttt 528 Ser Asn Met Met Phe Ala Phe Phe Ala Gin His Phe Thr His Gin Phe 165 170 175
ttc卿aca gat cat aag cga ggg cca get ttc acc aac ggg ctg ggc 576 Phe Lys Thr Asp His Lys Arg Gly Pro Ala Phe Thr Asn Gly Leu Gly 180 185 190
cat ggg gtg gac tta aat cat att tac ggt gaa act ctg get aga cag 624 His Gly Val Asp Leu Asn His lie Tyr Gly Glu Thr Leu Ala Arg Gin 195 200 205
cgt aaa ctg cgc ctt ttc aag gat gga aaa atg aaa tat cag ata att 672 Arg Lys Leu Arg Leu Phe Lys Asp Gly Lys Met Lys Tyr Gin .lie lie 210 215 220
gst gga gag atg tat cct ccc aca gtc aas gat act csg ges gsg atg 720 Asp Gly Glu Met Tyr Pro Pro Thr Val Lys Asp Thr Gin Ala Glu Met 225 230 235 240
ate tac cct cct caa gtc cct gag cat eta egg ttt get gtg ggg cag 768 lie Tyr Pro Pro Gin Val Pro Glu His Leu Arg Phe Ala Val Gly Gin 245 250 255
gag gtc ttt ggt ctg gtg cct ggt ctg atg atg tat gcc aca ate tgg 816 Glu Val Phe Gly Leu Val Pro Gly Leu Met Met Tyr Ala Thr lie Trp 260 265 270ctg egg gaa cac aac aga gta tgc gat gtg ctt aaa cag gag cat cct 864 Leu Arg Glu His Asn Arg Val Cys Asp Val Leu Lys Gin Glu His Pro 275 280 285
gaa tgg ggt gst gag cag ttg ttc cag aca age agg eta ata ctg ata 912 Glu Trp Gly Asp Glu Gin Leu Phe Gin Thr Ser Arg Leu lie Leu lie 290 295 300
gga gag act att aag att gtg att gaa gat tat gtg caa cac ttg agt 960 Gly Glu Thr lie Lys lie Val lie Glu Asp Tyr Val Gin His Leu Ser 305 310 315 320
ggc tat cac ttc aaa ctg aaa ttt gac cca gaa eta ctt ttc aac aaa1008 Gly Tyr His Phe Lys Leu Lys Phe Asp Pro Glu Leu Leu Phe Asn Lys 325 330 335
caa ttc cag tac caa aat cgt att get get gaa ttt aac acc etc tat1056 Gin Phe Gin Tyr Gin Asn Arg lie Ala Ala Glu Phe Asn Thr Leu Tyr 340 345 350
cac tgg cat ccc ctt ctg cct gac acc ttt caa att cat .gac cag aaa1104 His Trp His Pro Leu Leu Pro Asp Thr Phe Gin lie His Asp Gin Lys 355 360 365
tac aac tat caa cag ttt ate tac aac aac tct ata ttg ctg gaa cat1152 Tyr Asn Tyr Gin Gin Phe lie Tyr Asn Asn Ser lie Leu Leu Glu His 370 375 380
gga att acc cag ttt gtt gaa tea ttc acc agg caa att get ggc agg 1200 Gly lie Thr Gin Phe Val Glu Ser Phe Thr Arg Gin lie Ala Gly Arg 385 390 395 400
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tac cgc aaa cgc ttt atg ctg aag ccc tat gaa tea ttt gaa gaa ctt 1344 Tyr Arg Lys Arg Phe Met Leu Lys Pro Tyr Glu Ser Phe Glu Glu Leu 435 440 445
aca gga gaa sag gaa atg tct gca gag ttg gas gca etc t3t ggt gac 1392 Thr Gly Glu Lys Glu Met Ser Ala Glu Leu Glu Ala Leu Tyr Gly Asp 450 455 460
ate gat get gtg gag ctg tat cct gcc ctt ctg gta gaa aag cct egg 1440 lie Asp Ala Val Glu Leu Tyr Pro Ala Leu Leu Val Glu Lys Pro Arg 465 470 475 480
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gcc tea att cag tct etc ate tgc aat aac gtg aag ggc tgt ccc ttt1632 Ala Ser lie Gin Ser Leu lie Cys Asn Asn Val Lys Gly Cys Pro Phe 530 535 540
act tea ttc agt gtt cca gat cca gag etc att. aaa aca gtc acc ate1680 Thr Ser Phe Ser Val Pro Asp Pro Glu Leu lie Lys Thr Val Thr lie 545 550 555 560
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cta cta aaa gaa cgt teg act gaa ctg aac gtt taa 1764
Leu Leu Lys Glu Arg Ser Thr Glu Leu Asn Val 580 585
<210〉 2
<211〉 587
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
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Gly Phe Asp Gin Tyr Lys Cys Asp Cys Thr Arg Thr Gly Phe Tyr Gly 20 25 30
Glu Asn Cys Ser Thr Pro Glu Phe Leu Thr Arg lie Lys Leu Phe Leu 35 40 45
Lys Pro Thr Pro Asn Thr Val His Tyr lie Leu Thr His Phe Lys Gly 50 55 60
Phe Trp Asn Val Val Asn Asn lie Pro Phe Leu Arg Asn Ala lie Met 65 70 75 80Ser Tyr Val Leu Thr Ser Arg Ser His Leu lie Asp Ser Pro Pro Thr 85 90 95
Tyr Asn Ala Asp Tyr Gly Tyr Lys Ser Trp Glu Ala Phe Ser Asn Leu 100 105 110
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Pro Leu Gly Val Lys Gly Lys Lys Gin Leu Pro Asp Ser Asn Glu lie 130 135 140
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Ser Asn Met Met Phe Ala Phe Phe Ala Gin His Phe Thr His Gin Phe 165 170 175
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Glu Val Phe Gly Leu Val Pro Gly Leu Met Met Tyr Ala Thr lie Trp 260 265 270
Leu Arg Glu His Asn Arg Val Cys Asp Val Leu Lys Gin Glu His Pro 275 280 285
Glu Trp Gly Asp Glu Gin Leu Phe Gin Thr Ser Arg Leu lie Leu lie 290 295 300Gly Glu Thr lie Lys lie Val lie Glu Asp Tyr Val Gin His Leu Ser 305 310 315 320
Gly Tyr His Phe Lys Leu Lys Phe Asp Pro Glu Leu Leu Phe Asn Lys 325 330 335
Gin Phe Gin Tyr Gin Asn Arg lie Ala Ala Glu Phe Asn Thr Leu Tyr 340 345 350
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Tyr Asn Tyr Gin Gin Phe lie Tyr Asn Asn Ser lie Leu Leu Glu His 370 375 380
Gly lie Thr Gin Phe Val Glu Ser Phe Thr Arg Gin lie Ala Gly Arg 385 390 395 400
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Tyr Arg Lys Arg Phe Met Leu Lys Pro Tyr Glu Ser Phe Glu Glu Leu 435 440 445
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Pro Asp Ala lie Phe Gly Glu Thr Met Val Glu Val Gly Ala Pro Phe 485 490 495
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Thr Ser Phe Ser Val Pro Asp Pro Glu Leu lie Lys Thr Val Thr lie 545 550 555 560
Asn Ala Ser Ser Ser Arg Ser Gly Leu Asp Asp lie Asn Pro Thr Val 565 570 575
Leu Leu Lys Glu Arg Ser Thr Glu Leu Asn Val 580 585
<210〉 <211> <212> <213>
<220〉 <221〉 <222> <223>
3
228
DNA
小鼠
CDS
(1)..(228)
<400〉 3
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144
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<210〉 4
<211〉 76
<212> PRT <213〉小鼠
<400> 4
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<210> 5 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial
<400> 5 6 83cgtt
<210〉 6 <211> 36 <212> DNA
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<400〉 6
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<400> 7
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gsc3cc3tcg sgsscgtgss ggcc33g3tc csggstsssg sgggcstccc ccctgsccsg 120
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taccgcaasc gctttstgct gasgccctst g83tcatttg sagaacttsc 3ggaga333g 1620
gaaatgtctg csgagttggs sgcsctctat ggtgacatcg 3tgctgtgg3 gctgtatcct 1680
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sagccaagca cttttggtgg 3g3agtgggt tttcsaatca tcaacactgc ctcaattcag 1860
tctctcatct gcaataacgt gaagggctgt ccctttactt cattcagtgt tccagatcca 1920
gsgctcstta 333cagtc3c C3tc3atgc3 agttcttccc gctccggsct agatgatstc 1980
aatcccacag tactactaaa agaacgttcg actgaactga acgtttaa 2028
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<400〉 9
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<210〉 11
<2"〉 43
<212〉 DNA
<213> Artificial
<400> 11
cgggstccgc csccgcctcc gccscctctc 8ggcg33gg3 ccs 4权利要求
1、一种肿瘤靶向重组DNA疫苗，其特征是，含有环氧合酶-2蛋白(COX-2)，鼠源泛素蛋白mUbi，免疫刺激DNA序列ISS及载体pVAX1。
2、 按权利要求1所述的肿瘤靶向重组DNA疫苗，其特征是所述的环氧合酶-2蛋白具有SEQ ID NO 1的编码序列及SEQ ID NO 2的氨基酸序列；所述的鼠源泛素蛋白mUbi具有SEQ ID NO 3的编码序列及SEQ ID NO 4的氨基酸序列；所述的免疫刺激DNA序列ISS DNA序列如SEQ ID NO 5。
3、 权利要求l的肿瘤靶向重组DNA疫苗的制备方法，其特征是，在基本载体pVAXl的多克隆位点MCS处插入SEQ ID NO 7的片段/wUbi-ISS-COX-2-ISS，构建成编码鼠源泛素蛋白mUbi与COX-2融合蛋白抗原，融合蛋白抗原之间由SEQIDN0 6的柔性接头连接，制得肿瘤靶向重组DNA疫苗，命名为pVAXl-wUbi-ISS-COX-2 —ISS。
4、 按权利要求3所述的方法，其特征是所述的载体pVAXl的MCS位点插入COX-2表达框，所述的COX-2表达框的构成是从5'端到3'端方面依次为(I )转录调控区的巨细胞病毒早期启动子/增强子PcMV, (II)mUbi序列，(III) ISS序列，(IV) COX-2基因序列，(V) ISS序列，(VI)牛生长激素的多聚腺苷酰化信号(BGHpA)，所得DNA疫苗载体命名为pVAXl-wUbi-ISS-COX-2-ISS。
5、 肿瘤靶向重组DNA疫苗在制备肿瘤预防与治疗药剂中的用途。
6、 肿瘤靶向重组DNA疫苗在制备治疗炎症的药剂中的用途。
7、 肿瘤靶向重组DNA疫苗在制备治疗癌痛药剂中的用途。
全文摘要
本发明涉及基因工程领域，涉及肿瘤靶向重组DNA疫苗及其制备、应用。本发明利用基因工程方法，将鼠源泛素mUbi、COX-2及免疫刺激DNA序列ISS进行重组。在基本载体pVAX1的多克隆位点MCS处插入片段mUbi-ISS-COX-2-ISS，构建成编码鼠源泛素蛋白mUbi与COX-2融合蛋白抗原，融合蛋白抗原之间由柔性接头连接，制得肿瘤靶向重组DNA疫苗，本发明疫苗免疫动物体后，能激活机体免疫反应，在体内快速诱导COX-2特异的高效CTL反应，靶向杀伤COX-2异常表达的肿瘤细胞，实现肿瘤靶向治疗的目标。本发明制备简单、安全性高、生产成本低、可大规模化生产、免疫应答持久，还可用于炎症治疗与癌痛治疗领域。
文档编号A61K39/00GK101648011SQ20081004158
公开日2010年2月17日 申请日期2008年8月11日 优先权日2008年8月11日
发明者周彩存, 亮 唐, 王和勇, 恒 罗, 赵应敏 申请人:同济大学附属上海市肺科医院