专利名称：一种骨形态发生蛋白-7的可溶性制剂及应用的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及一种骨形态发生蛋白-7 (OP-l/BMP-7)的可溶制剂及应用，尤其涉及一 种重组人骨形态发生蛋白-7 (rhOP-l/rhBMP-7)的可溶性制剂及其作为治疗肾脏疾病和 血管钙化，以及脑中风、肝和肺纤维化药物的辟用。属生物技术制药领域。
背景技术：
骨形态发生蛋白-7 (bone morphogenetic protein BMP"7， BMP-7)又名成骨蛋白 -1 (osteogenic protein, OP-1)，属于BMPs家族中的一员，同属转化生长因子-P (TGF-P)超家族中的成员，具有强大的骨诱导活性。对它的成骨作用有大量研究，临床上已 将BMP-7用于骨缺损和脊柱融合的治疗研究。同时，BMP-7还是肾脏发育的重要诱导因子，在胚胎期肾脏全程表达，BMP-7基因 敲除的小鼠由于肾形成障碍，出生时即有肾发育不良/肾囊肿，出生后第一周即因尿毒 症死亡。BMP-7的主要功能是维持肾小管上皮细胞分化和组织细胞凋亡，其作用一是通 过防止TGF- P 1介导的肾小管上皮细胞急性的破坏来维持肾小管上皮细胞的成熟及功能 状态；另一方面，通过抑制前炎症细胞因子的表达，减少炎症细胞的积聚以防止肾纤维 化。BMP-7在肾脏疾病治疗中可以增强肾功能，改善组织学参数，减少肾小球严重，稳 定肾血流，增加动物生存率。在多种肾脏疾病模型中，BMP-7可以防止肾小管间质纤维 化，减少肾小球硬化及改善糖尿病肾病动物模型的肾功能。此外，BMP-7可防止血管的 增殖紊乱，有助于维持血管的完整性。因此，BMP-7对于慢性肾病的主要并发症，包括 肾性骨营养不良和血管钙化均有疗效。新近研究表明，人成骨蛋白-l(hOP-l)能产生显 著的抗缺血效应。目前市场上已经有BMP-7埋植剂(OP-1 Implant)和BMP-7泥灰(OP-1 Putty)两 种剂型，分别用于治疗骨缺损和脊柱修补。BMP-7埋植剂(0P-1 Implant)是美国Stryker Biotech公司开发的制剂，其处方是将rhBMP-7与牛胶原复合制备成灭菌干粉。后来 Stryker Biotech公司又开发了 OP-1 putty,作为后外测(横突间)腰椎融合术的载体 材料，OP-1 putty由rhBMP-7、牛骨I型-胶原基质和羧甲基纤维素(CMC)等组分制成。 然而除上述的剂型外，目前剂型开发所遇到的问题是虽然真核哺乳动物表达的BMP-7 可溶，但是其溶解度极低，由于其分子的溶解度小，不易溶解，阻碍了其他剂型的发展 和临床的应用。发明内容针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种骨形态发生蛋白-7的可溶性 制剂及其作为治疗肾脏疾病和血管钙化，以及脑中风、肝和肺纤维化药物的应用。本发明所述骨形态发生蛋白-7的可溶性制剂，其特征是，所述可溶性制剂以1000ml 体积量计，含如下重量的主、辅料骨形态发生蛋白-7 10mg 500mgL-精氨酸 蛋白稳定剂 注射用水 或者骨形态发生蛋白-7尿素蛋白稳定剂 注射用水 或者 骨形态发生蛋白-7尿素L-精氨酸蛋白稳定剂注射用水34. 84g 69.68g0g 100g 加至总体积为1000ml:10mg 500mg30g 120g0g 100g加至总体积为lOOOml;10mg 500mg 30g 120g 34.84g 69.68g Og 100g加至总体积为1000ml,上述骨形态发生蛋白-7的可溶性制剂进一步优选的方式是所述可溶性制剂以 1000ml体积量计，含如下重量的主、辅料骨形态发生蛋白-7 L-精氨酸 蛋白稳定剂 注射用水 或者 骨形态发生蛋白-7尿素蛋白稳定剂 注射用水 或者 骨形态发生蛋白-7尿素L-精氨酸蛋白稳定剂注射用水100mg 300mg 47g 57g 20g 70g加至总体积为1000ml;100rag 300mg 40g 80g20g 70g 加至总体积为1000ml:100mg 300mg 40g 80g 47g 57g 20g 70g加至总体积为1000ml。上述骨形态发生蛋白-7的可溶性制剂最优选的方式是所述可溶性制剂以1000ml 体积量计，含如下重量的主、辅料骨形态发生蛋白-7 200mg 300mg 尿素 60g 70g L-精氨酸 50g 55g 蛋白稳定剂 40g 60g 注射用水 加至总体积为1000ml。上述骨形态发生蛋白-7是指经动物组织提取的BMP-7或基因工程制备的重组人骨 形态发生蛋白-7 (rhBMP-7)或与人BMP-7序列类同且其完整序列相似度不低于60%的各 种基因重组人BMP-7;所述骨形态发生蛋白-7是单体分子或是其二聚体分子或者它们的 混合物，其中混合物中二聚体比例不低于50%，或者是BMP-7与BMP-4、 BMP-5或BMP-6 等比例混合的杂合二聚体。其中所述重组人骨形态发生蛋白-7可以是本领域人员共知的哺乳动物细胞(如CHO, COS or BSC等)的表达产物，也可以是酵母等真菌的表达产物，也可以是原核细 胞如大肠杆菌、枯草杆菌等的表达产物；所述重组人rhBMP-7纯度为95%以上，其氨基 酸序列如SEQ ID NO. 1所示。上述蛋白稳定剂是指人血清白蛋白、组织纤维蛋白原、甘露醇之一或它们的等比例 混合物。其中，所述蛋白稳定剂优选指人血清白蛋白。 上述骨形态发生蛋白-7的可溶性制剂优选是注射剂或冻干粉针剂。本发明所述骨形态发生蛋白-7的可溶性制剂的制备方法，其步骤是按处方量称取尿素或L-精氨酸，配成浓度为0. 5 2.0 M/L的尿素溶液(pH 3. 5-7. 4) 或浓度为0. 2 0. 4M/L的L-精氨酸溶液(调pH=3. 5-7. 4),或配成0. 5~2. 0 M/L的尿 素溶液与0. 2~0. 4M/L的L-精氨酸溶液的任意体积比的混合液;将处方量的骨形态发生 蛋白-7 (BMP-7)加入上述溶液中，同时按处方量加入或不加蛋白稳定剂(血清白蛋白、 组织纤维蛋白原或甘露醇)，然后用相应种类和浓度的上述溶液定容至1000毫升，使 BMP-7的最终浓度为0.01 0.5mg/ml (10. 0 500u g/ml);然后经去热源、过滤除菌， 分装成临床常用剂量的瓶装注射剂(规格50lig/瓶300ug/瓶lmg/瓶3rag/瓶；5mg/ 瓶;10mg/瓶)，或者以常规方法进一步冷冻干燥，制得骨形态发生蛋白-7的冻干粉针剂。 粉针剂在使用时以蒸馏水或者以生理盐水溶解使用。本发明所述骨形态发生蛋白-7的可溶性制剂的制备中，将BMP-7与蛋白助溶剂(如 氨基酸、尿素或表面活性剂)混合处理，也可以加入各种蛋白稳定剂(如人血清白蛋 白、组织纤维蛋白原、甘露醇)，即可获得可溶性BMP-7制剂。实验证实，本发明的rhBMP-7可溶性制剂具有溶解度高，在血清中无沉淀产生的特 点，其浓度达可达到0.2-1. Orag/ml。本发明所述骨形态发生蛋白-7的可溶性制剂经小 鼠毒性实验没有发现致死、过敏、血管刺激性等毒副作用。本发明所述骨形态发生蛋白-7的可溶性制剂作为治疗肾脏疾病和血管钙化，以及骨 质疏松、脑中风、肝和肺纤维化药物的应用。在临床上，本发明的BMP-7制剂可用于治疗肾脏疾病和血管钙化，也可以用于骨质 疏松、脑中风恢复、肝和肺纤维化的预防和治疗。其中具体治疗的肾脏疾病包括肾移植、 糖尿病肾病、肾毒性血清肾炎、遗传性肾病、高血压肾病、肾小球肾病、肾肥大、肾衰 等。进一步实验证实，本发明所述骨形态发生蛋白-7的可溶性制剂对肾衰模型动物的尿 素氮、肌酐、尿酸等实验检测具有明显的肾功能保护作用(见附图1 3)。
图l rhBMP-7可溶性制剂对模型动物的尿素氮清除作用。 图2 rhBMP-7可溶性制剂对模型动物的肌酐清除作用。 图3 rhBMP-7可溶性制剂对模型动物的尿酸清除作用。
具体实施方式
实施例l取纯化的哺乳动物细胞CH0表达的重组人rhBMP-7 (纯度达95%以上)300 mg加入 至0. 3M/L的L-精氨酸溶液(调pH-6.5)中，用相同浓度的L-精氨酸溶液定容至1000 毫升，使BMP-7的最终浓度为0.3 mg/ral，然后经去热源、过滤除菌，分装成临床常用 剂量的瓶装注射剂(3mg/瓶)。临床应用方法各种肾脏疾病以300 400ug重组人rhBMP"7/kg'体重的剂量，每 周2-3次，连续给药2-12周。同时检测尿量、血肌酑、尿酸等指标。实施例2按如下处方量取各组分骨形态发生蛋白-7 200mg尿素 60gL-精氨酸 50g血清白蛋白 40g用注射用水溶解上述组分，然后定容至1000毫升(pH7.0)，使BMP-7的最终浓度 为0.2 mg/ml (200" g/ml);然后经去热源、过滤除菌，以常规方法冷冻干燥，制得骨 形态发生蛋白-7的冻干粉针剂。上述骨形态发生蛋白-7是指纯度为95%以上由哺乳动物细胞COS表达的重组人 rhBMP-7，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。肾脏疾病应用方法粉针剂在使用时以蒸馏水或者以生理盐水溶解使用。以300~400ug重组人 rhBMP-7/kg体重的剂量，每周2-3次。连续给药2-12周。同时检测尿量、血肌酐、尿 酸等指标。实施例3取纯化的原核细胞表达的重组人rhBMP-7 (纯度达到97%以上)300呢加入至0. 3M/L 精氨酸溶液中(pH6.8-7.4)，用相同浓度的精氨酸溶液定容至1000亳升，使BMP-7的 最终浓度为0. 3 mg/ml (300ug/ml)，然后经去热源、过滤除菌，可分别分装成50ug/ 瓶；300ug/瓶；lmg/瓶；3mg/瓶；5mg/瓶；10mg/瓶的注射剂。实施例4按如下处方量称取各组分骨形态发生蛋白-7 300mg 尿素 120g组织纤维蛋白原 70g 按处方量称取尿素，用注射用水先配成2M/L尿素溶液(pH7.4);将处方量的骨形 态发生蛋白-7 (BMP-7)加入上述溶液中，同时按处方量加入组织纤维蛋白原，然后用 上述尿素溶液定容至1000毫升，使BMP-7的最终浓度为0.3mg/ml;然后经去热源、过 滤除菌，分装成临床常用剂量的瓶装注射剂(规格50ng/瓶；300ug/瓶lmg/瓶3mg/ 瓶5mg/瓶;10mg/瓶)，或者以常规方法进一步冷冻干燥，制得骨形态发生蛋白-7的冻 干粉针剂。粉针剂在使用时以蒸馏水或者以生理盐水溶解使用。实施例5按如下处方量称取各组分 骨形态发生蛋白-7 lOOmg L-精氨酸 47g 甘露醇 20g 按处方量称取L-精氨酸，用注射用水配成L-精氨酸溶液(调p^5.70),将处方量 的骨形态发生蛋白-7 (BMP-7)加入上述溶液中，同时按处方量加入甘露醇，然后用上 述L-精氨酸溶液定容至1000毫升，使BMP-7的最终浓度为0.1呢/1111,然后经去热源、 过滤除菌，以常规方法冷冻干燥，制得骨形态发生蛋白-7的冻干粉针剂。 粉针剂在使用时以蒸馏水或者以生理盐水溶解使用。序列表〈110〉山东省医药生物技术研究中心<120>—种骨形态发生蛋白-7的可溶性制剂及应用<141〉 2008-5-5<160> 1<210〉 1<211〉 431<212〉 PRT<213〉骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein) <221>重组人骨形态发生蛋白-7 (rhBMP-7) <222〉 (1)…(431)<400> 1 Met His ValArg Ser Leu Arg Ala Ala Ala Pro His Ser Phe510Ala Leu Trp Ala Pro Leu Phe Leu Leu Arg Ser Ala Leu Ala 20 25Glu Val His Ser Ser Phe lie His ArgPhe Ser Leu Leu Arg Ser lie Leu Gly His Asn SerAsp Asn 35Gin Glu Arg Arg Glu 50Leu Pro His Arg Pro 65Ala Pro Met Phe Met Leu 8040Met Gin Arg Glu lie Leu 55Arg Pro His Leu Gin Gly70Asp 85LeuTyr Asn Gly PhePro Tyr Lys Leu Gin Asp110Ser His Phe Leu Thr125Phe Val Asn Leu Val Glu His Asp 140Asp Lys115 Ala 130 Glu 145AlaSerAla Val Glu Glu Gly Gly Gly Pro Gly Gly Gin 95 100 Ala Val Phe Ser Thr Gin Gly Pro Pro Leu AlaAsp Met Val MetPhe Phe His ProVal15Asp30Arg45Ser60Lys75Met90Tyr105Ser120Ser135Arg150Arg Glu Phe Arg Phe Asp Leu Ser Lys lie160Ala Ala Glu Phe Arg lie Tyr LysTyr His His Arg Glu Phe Arg Phe Asp Leu Ser Lys lie Pro Gly Glu Alalie Arg Glu Arg Phe Asp Asn Glu Thr Phe Arg lie Ser ValValGin Val Leu Gin Leu Asp Ser Arg Phe Asp lie ThrSer lie Asn ProGin Asn Lys Gin Pro PheVal His Phe Arg SerGin Asn Arg Ala Asn ValGlu 155 Thr 170 Phe 185 Glu 200 Thr 215 Ala 230 Leu 245 Lys 260 Pro 275 Ser 290 Lys 305 Glu 320 Leu 335 Ala 350 Phe 365 Gin 380 Cys 395HisLeuLeu Gly Trp AlaArg Glu SerSer Glu GluThr Ser Asn His Trp Val Val Asn ProLeulieThrAla Glu AsnAla Gly Met Val Arg Ser ^ro Lys Ser SerLeu lie GlyHis Asn Leu Gly Leu Gin Leu Ser Val Glu Thr Leu AspArg His Ala Phe Phe Lys Ala Lys GinArg GinGlu Uu Tyr Val Ser Phe Arg Asp Leu GlyTyr TyrLys Lys HisAsp Trp lie lie Ala Pro Glu Gly Tyr 350Gly Glu Cys Ala Phe Pro Leu Asn Ser His Ala lie Val Gin Thr Leu Val HisVal Pro Lys Pro Cys Cys Ala Pro Thr Gin Leu Asn Ala lieLeu 160 Arg 175 Phe 190 Glu 205 Glu 220 Trp 235 Glu 250 lie 265 Phe 280 Gly 295 Gin 310 Asp 325 Arg 340 Ala 355 Tyr 370 Phe 385 Gin 400AspAsp Leu Gly TrpPheLeuGly Gly ThrThr Gly Ser Lys Gin Arg Asn Gin Glu Ala Leu ArgSer Asp GinAlaAla Trp CysMet Asn Ala Thrlie Asn Pro GluGlu 165 Tyr 180 Tyr 195 teu 210 Val 225 Arg 240 Gin 255 Pro 270 Glu 285 Ser 300 Met 315 Cys 330 Gin 345 Glu 360 Asn 375 Thr 390 Ser 405Val Leu Tyr Phe Asp Asp Ser Ser Asn Val lie Leu Lys Lys Tyr 410 415 420Arg Asn Met Val Val Arg Ala Cys Gly Cys His 425 430
权利要求
1.一种骨形态发生蛋白-7的可溶性制剂，其特征是，所述可溶性制剂以1000ml体积量计，含如下重量的主、辅料骨形态发生蛋白-710mg～500mgL-精氨酸34.84g～69.68g蛋白稳定剂 0g～100g注射用水加至总体积为1000ml或者骨形态发生蛋白-710mg～500mg尿素30g～120g蛋白稳定剂 0g～100g注射用水加至总体积为1000ml；或者骨形态发生蛋白-710mg～500mg尿素30g～120gL-精氨酸34.84g～69.68g蛋白稳定剂 0g～100g注射用水加至总体积为1000ml。
2.如权利要求1所述骨形态发生蛋白-7的可溶性制剂，其特征是，所述可溶性制剂 以1000ml体积量计，含如下重量的主、辅料 骨形态发生蛋白-7 100mg 300mg47g 57g 20g 70g加至总体积为1000ml;L-精氨酸 蛋白稳定剂 注射用水 或者骨形态发生蛋白-7尿素蛋白稳定剂 注射用水 或者骨形态发生蛋白-7尿素L-精氨酸 蛋白稳定剂 注射用水100mg 300mg 40g 80g20g 70g 加至总体积为1000ml;100mg 300mg 40g 80g 47g 57g 20g 70g加至总体积为1000ml。
3.如权利要求2所述骨形态发生蛋白-7的可溶性制剂，其特征是，所述可溶性制剂 以1000ml体积量计，含如下重量的主、辅料 骨形态发生蛋白-7 200mg 300mg 尿素 60g 70g L-精氨酸 50g 55g蛋白稳定剂 40g 60g注射用水 加至总体积为1000ml。
4. 如权利要求1 3之一所述骨形态发生蛋白-7的可溶性制剂，其特征是，所述骨形 态发生蛋白-7是指经动物组织提取的BMP-7或基因工程制备的重组人骨形态发生蛋白 -7或与人BMP-7序列类同且其完整序列相似度不低于60%的各种基因重组人BMP-7;所 述骨形态发生蛋白-7是单体分子或是其二聚体分子或者它们的混合物,其中混合物中二 聚体比例不低于50%,或者是BMP-7与BMP-4、BMP-5或BMP-6等比例混合的杂合二聚体。
5. 如权利要求4所述骨形态发生蛋白-7的可溶性制剂，其特征是，所述骨形态发生 蛋白-7是指纯度为95^以上由哺乳动物细胞CHO、 COS或BSC表达的重组人rhBMP-7, 其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
6. 如权利要求4所述骨形态发生蛋白-7的可溶性制剂，其特征是，所述骨形态发生 蛋白-7是指纯度为95%以上由酵母细胞、大肠杆菌或枯草杆菌表达的重组人rhBMP-7， 其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
7. 如权利要求1 3之一所述骨形态发生蛋白-7的可溶性制剂，其特征是，所述蛋白 稳定剂是指人血清白蛋白、组织纤维蛋白原、甘露醇之一或它们的等比例混合物。
8. 如权利要求7所述一种骨形态发生蛋白-7的可溶性制剂，其特征是，所述蛋白稳 定剂是指人血清白蛋白。
9. 如权利要求1 3之一所述骨形态发生蛋白-7的可溶性制剂，其特征是，所述可溶 性制剂是注射剂或冻干粉针剂。
10. 权利要求1 3之一所述骨形态发生蛋白-7的可溶性制剂作为治疗肾脏疾病和血 管钙化，以及骨质疏松、脑中风、肝和肺纤维化药物的应用。
全文摘要
本发明公开了一种骨形态发生蛋白-7的可溶性制剂，含有骨形态发生蛋白-7、L-精氨酸或/和尿素、蛋白稳定剂及注射用水；具有溶解度高，在血清中无沉淀产生的特点，其浓度达可达到0.2-1.0mg/ml。本发明所述骨形态发生蛋白-7的可溶性制剂在临床上可用于治疗肾脏疾病和血管钙化，也可以用于治疗脑中风恢复、肝和肺纤维化的治疗。
文档编号A61P9/14GK101269213SQ20081001587
公开日2008年9月24日 申请日期2008年5月9日 优先权日2008年5月9日
发明者翠 张, 王世立, 王素红, 葛鲁娜, 迟名峰, 韩金祥 申请人:山东省医药生物技术研究中心