专利名称：志贺氏菌IpaD蛋白及其作为抗志贺氏菌感染疫苗的用途的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及阻断志贺氏菌(Shigella)侵入动物细胞从而防止志贺氏菌感染或降 低其严重性的组合物和方法。更具体而言，本发明涉及从天然来源和/或通过合成或重组 技术获取的IpaD蛋白及其共轭体的使用以诱导具有对抗多种血清型的志贺氏菌特别是福 氏志贺氏菌(S.flexneri)的保护性活性的中和抗体。本发明的组合物可用于预防和/或 治疗由志贺氏菌属细菌造成的志贺氏菌痢疾。
背景技术：
许多革兰氏阴性病原性细菌使用第III型分泌(T3S)系统来与它们的宿主细胞 相互作用。每个T3S系统由跨越细菌包膜并延伸到细菌表面的分泌装置(T3SA)、运送通 过T3SA然后嵌入所述宿主细胞膜并形成孔的转运子、运送通过T3SA和所述转运子孔以到 达细胞质的效应子、与转运子和效应子相关的细胞质中的特异性分子伴侣和转录调节子组 成。T3SA的组装需要约15种蛋白。 隶属志贺氏菌属的细菌是人类志贺氏菌痢疾的病原体[l]。细菌侵入上皮细胞 和在巨噬细胞中诱导细胞凋亡所需的基因聚集在一个220-kb毒性质粒的称作侵入区域的 30-kb区域内。所述侵入区域含有编码T3SA成分的mxi和spa基因，编码运送通过T3SA 的蛋白的ipaA、B、C和D， ipgBl， ipgD及icsB基因，编码分子伴侣的ipgA、 ipgC、 ipgE和 spal5基因，以及编码转录调节子的virB和mxiE基因[2]。 在生长于培养液中的细菌内是弱活性的T3SA通过细菌与上皮细胞的接触而激活 [3] 。 ipaA、 ipaB、 ipaC和ipaD以及大多数mxi和spa基因的失活废除了细菌侵入上皮细 胞、在巨噬细胞内诱导细胞凋亡和表达接触溶血活性的能力。IpaB和IpaC含有疏水部分且 保持与溶解的红细胞膜关联，表明这两种蛋白是福氏志贺氏菌转运子的成分。此外，已经提 出IpaB和IpaC有效应子功能[4， 5， 6， 7， 8] 。 ipaB和ipaD而非ipaC的失活导致去调节的 T3SA，即本质上活性的T3SA，表明IpaB和IpaD在保持T3SA在没有诱导子时失活上起着重 要作用[9，10]。 IpaD的一小部分与细菌包膜相连[9，11]。 Picking及其合作者[12]报道 了 IpaD在T3SA活性控制中的作用可以与它在细菌侵入上皮细胞中的作用分开。
为得到对针状复合体的结构更深的认识，本发明人在用交联剂BS3处理的细菌上 进行了免疫电子显微镜分析，所述分析既在整个细菌上也在轻度纯化的针状复合体(NC) 上进行。本发明人为IpaD是位于针端的NC的成分且抗IpaD培育的抗体对福氏志贺氏菌 侵入上皮细胞具有抑制效果提出了证据。
图1 :用B^处理的负染色细菌的电子显微照片。箭头表示伸出细菌表面的针尖处 的显著致密体。线段代表100nm。 图2 :由单颗粒分析获得的NC的针部分的投影映射图(class-sums) 。 (A-B)从野 生型分离的NC的映射图，用BS3处理(A-C);来自野生型而不用BS3处理(D-F)和来自ipaD突变株而用B^处理(G-I)。箭头指向与不用B^处理制备的针部分相连的残余致密体。线 段代表10nm。 图3 :纯化NC的免疫印迹分析。用SDS-PAGE和使用MxiJ、MxiN和IpaD的特异性 抗体的免疫印迹分析了从野生型和IpaD缺乏菌株纯化的全细胞提取物(WCE)和交联(+CR) NC和非交联(-CR)NC。在从交联的野生型细菌制备的NC中IpaD仅富集到WCE水平。MxiJ 是表现完整T3SA的正对照。T3S的细胞质成分MxiN是表现非结合细胞质蛋白的污染的正 对照。 图4 :免疫电子显微镜所示IpaD局部化。将提纯自BS3处理的野生型细菌的NC与 抗IpaD抗体一起培养并负染色(A-D)。在E中显示了提纯自未用B^处理的细菌的250个 NC的平均图像作为对比。线段代表10nm。 图5 :上皮细胞受野生型福氏志贺氏菌的侵袭试验。将细菌与抗IpaD和抗IpaB多 克隆抗体的系列稀释液一起培养，并通过将细胞裂解液点板对细胞内的抗庆大霉素细菌计 数。相对于用PBS处理的野生菌株的侵入效率表达了在各个条件下的侵入效率。数值为至 少三次独立实验的平均值，误差线段表示标准偏差。 图6 :志贺氏菌菌株IpaD蛋白的现有技术氨基酸序列(GenBank登录号 AL391753)。 图7 :编码图6的IpaD蛋白(GenBank登录号AL391753)的现有技术核酸序列。
具体实施例方式
本发明人惊讶地发现IpaD特异性中和抗体能阻断志贺氏菌侵入允许细胞诸如上 皮细胞且在不同志贺氏菌血清型中观测到了该中和效果。就此而论，本发明具体涉及IpaD 蛋白，编码该蛋白或抗IpaD中和抗体的多核苷酸在引起对抗志贺氏菌感染的交叉保护组 合物的制备和方法施展中的使用。
定义 术语"动物"或"宿主"指容易或已知会被志贺氏菌菌株诸如福氏志贺氏菌感染的 任何动物。具体而言，所述动物包括人类。 术语"允许细胞"指能被志贺氏菌菌株感染的细胞。例如，这种细胞可以为不仅仅 限于上皮细胞或免疫系统细胞，特别是在小肠粘膜免疫系统中是志贺氏菌侵袭目标的那些 免疫系统细胞，诸如树突状细胞和单核细胞/巨噬细胞，而且包括B和T淋巴细胞，所述淋 巴细胞受到通过第III型分泌系统的志贺氏菌效应子的注入，尽管这不会导致志贺氏菌侵 袭。 术语"治疗"指一种过程，通过所述过程减轻或完全消除了与志贺氏菌菌株有关的 感染或疾病的症状。如本文所用，术语"防止"指一种过程，通过所述过程阻碍或延迟了与 志贺氏菌菌株有关的感染或疾病的症状。 术语"保护性应答"指对志贺氏菌相关疾病的发病或者由物种导致的感染的预防， 或减轻在动物中存在的这类疾病的严重性。 表述"可接受的载体"指容纳本发明所设想的组合物组成部分的载具，所述载具能 对动物宿主施用而没有不良反应。本领域内已知的合适载体包括但不限于金颗粒、无菌水、 生理盐水、葡萄糖、右旋糖或缓冲溶液。载体可包含包括稀释剂、稳定剂(例如，糖类和氨基
5酸)、防腐剂、润湿剂、乳化剂、PH缓冲剂、增粘添加剂、色素等等在内的助剂。 通常所理解和本文所用的"功能性衍生物"指具备与完整IpaD蛋白/肽序列生物
活性基本相似的功能性生物活性的蛋白/肽序列。换言之，它优选的是指基本保留了在对
动物施用所述功能性衍生物时引发产生对抗志贺氏菌菌株感染的抗IpaD中和抗体的能力
的多肽或其片段。 通常所理解和本文所用的"功能性片段"指对与完整IpaD核酸序列生物活性基本 相似的功能性生物活性编码的核酸序列。换言之，且在本发明的背景下，它优选的是指基本 保留了编码IpaD多肽/蛋白的能力的核酸或其片段，所述IpaD多肽/蛋白在对动物施用 时引发了对抗志贺氏菌菌株感染的抗IpaD中和抗体的产生。 术语"志贺氏菌血清型"指通过大写字母A D辨识的四组志贺氏菌痢疾志贺 氏菌(Shigella dysenteriae) (A)、福氏志贺氏菌(Shigellaflexneri) (B)、鲍氏志贺氏菌 (Shigella boydii) (C)和宋内氏志贺氏菌(Shigella sonnei) (D)。它们各自包含A组:8 种血清型，B组11种血清型和亚血清型，C组11种血清型，D组1种血清型。例如，志贺 氏菌血清型可以为但不限于福氏志贺氏菌2a、 lb及3a，痢疾志贺氏菌1和宋内氏志贺氏菌。
术语"中禾口"或"阻断"是指本发明的抗IpaD抗体的能力，所述抗IpaD抗体与IpaD 蛋白特异性结合并干扰IpaD蛋白的生物功能因而阻断了例如所述细菌将其毒性效应子传 输到目标细胞的能力。换言之，这类抗体有利地解除了所述病原体的威胁并使其既无法造 成损害又不能有效抵抗宿主免疫防御。
本发明的组合物 在一方面，本发明提供了治疗和/或预防志贺氏菌感染的组合物。本发明还提供
了阻断至少一种志贺氏菌血清型侵入允许细胞的组合物。本发明的这些预期组合物至少包
含下列组成部分之一 -IpaD多肽或其功能性衍生物；-编码IpaD多肽或其功能性片段的多核苷酸；-抗IpaD中和抗体。 本领域内的技术人员可以理解的是，本发明的组合物有利地在对宿主施用时提供 了对抗一种以上志贺氏菌血清型的交叉保护。换言之，本发明的组合物防止或显著降低了 一种以上志贺氏菌血清型对允许细胞的侵入。 本发明所预期的IpaD多肽或其功能性衍生物具有例如与GenBank登录号 AL391753的氨基酸序列相同或基本相同的氨基酸序列，并在本文中称为SEQ ID.NO:l(参 见图6)。在所述IpaD多肽的功能性衍生物的情形中，可以使用于2007年10月10日存在 CNCM的登录号为1-3839的pMal-IpaD质粒。该质粒编码从IpaD蛋白的130号密码子开始 的IpaD蛋白片段。 在提及氨基酸序列时通过"基本相同"可以理解的是，本发明所设想的多肽具有例 如对于SEQ ID冊1所示的部分或全部序列有至少75%同一性或85%同一性或甚至95% 同一性的氨基酸序列。 本发明所设想的多核苷酸或其功能性片段为如上所述的IpaD多肽或其功能性衍 生物进行编码。例如，这种多核苷酸具有与GenBank登录号AL391753的核苷酸序列相同或 基本相同的核苷酸或核酸序列， 在本文中称为SEQ ID N0:2(参见图7)。在所述IpaD多的pMal-IpaD质粒。 在提及核苷酸序列或多核苷酸序列时通过"基本相同"可以理解的是，本发明所 设想的多核苷酸具有例如对于SEQ ID冊2所示的部分或全部序列有至少65%同一性或 80%同一性或甚至95%同一性的核酸序列。 确定核酸和氨基酸"序列同一性"的技术也是本领域内已知的。典型地，所述技 术包括确定基因的mRNA核苷酸序列、DNA序列自身和/或确定由该基因编码的氨基酸序 列，并将这些序列与第二核苷酸或氨基酸序列比较。 一般而言，"同一性"指两个多核苷 酸序列的核苷酸对核苷酸，或多肽序列的氨基酸对氨基酸的各自严格对应。可通过确定 两个或多个序列(多核苷酸或氨基酸)的"百分比同一性"来比较所述两个或多个序列。 不管是核酸序列还是氨基酸序列，两个序列的百分比同一性是两个对准的序列之间的严 格匹配数除以较短序列长度并乘以100。对核酸序列的大致比对由Smith & Waterman, Advances inApplied Mathematics 2:482-489(1981)的局部同源性算法提供。该算法 可通过使用计分矩阵而应用于氨基酸序列，所述计分矩阵由Dayhoff， Atlas of Protein Sequences and Structure, M. 0. Dayhoff ed. ，5suppl.3 :353-358， National Biomedical Research Fo皿dation，Washington，D. C. ， USA开发并由Gribskov，Nucl. Acids Res. 14(6): 6745-6763(1986)归一化。Genetics Computer G丽p(Madison， Wis.)在"BestFit"实用 程序应用中提供了确定序列的百分比同一性的该算法的示例性实现方式。在Wisconsin Sequence Analysis Package Program Ma皿al， Version 8(1995)(可从Genetics Computer Group,Madison, Wis.获取)中说明了该方法的缺省参数。在本发明的背景下确立百分比同 一性的优选方法是使用MPSRCH程序包，该程序包由University of Edinburgh版权所有， 由JohnF. Collins禾口 Shane S. Sturrok开发并由IntelliGenetics， Inc. (Mo皿tainView， Calif.)分发。Smith-Waterman算法可以从这套程序包中采用，其中对计分表使用缺 省参数(例如，空隙开放罚分为12，空隙延长罚分为1，空隙为6)。在所产生数据中"匹 配"("Match")值反映了"序列同一性"。计算序列之间的百分比同一性或相似性的其它 适合程序通常在本领域内已知，例如，另一个比对程序是BLAST,使用缺省参数。例如，可 使用BLASTN和BLASTP，使用下列缺省参数遗传密码=标准；过滤=无；链型=两种均有； 截止=60 ;期望=10 ;矩阵BL0SUM62 ;描述=50条序列；分类=高分；数据库=非冗余， GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS翻译+瑞士 (Swiss)蛋白+Spupdate+PIR。
可通过各种本领域内技术人员已知的方法来制备与IpaD蛋白特异性结合的本 发明所设想的中和抗体。例如，可对动物施用所述IpaD多肽以便诱导多克隆抗体的产 生。另一种方式是，如本文所述使用的抗IpaD中和抗体可为单克隆抗体，所述抗体使 用已知杂交瘤技术制备(参见，例如Hammerling等，In Monoclonal Antibodies and T-CeIIHybridomas， Elsevier, NY， 1981)。关于本发明所设想的抗体，术语"特异性结合"指 以相对高亲和力结合到一个或多个IpaD多肽的表位的抗体，但所述抗体不显著识别和结 合除所述IpaD多肽外的其它分子。如本文所用，术语"相对高亲和力"指所述抗体和所述 IpaD多肽之间的结合亲和力至少为106M—、且优选为约107M—1而更优选为108M—1 101QM—、 该亲和力的确定优选在标准竞争性结合免疫检测条件下进行，所述标准竞争性结合免疫检 测条件是本领域技术人员的常识。 可以理解的是，对阻碍志贺氏菌侵入细胞的抗体的筛选和鉴定在本领域技术人员
7的知识范围内。 在优选实施方式中，本发明的组合物还包含佐剂。如本文所用，术语"佐剂"指加 入本发明的组合物中以增加所述组合物的免疫原性的物质。佐剂如何作用的机理还未完全 知晓。据信某些佐剂通过缓慢释放抗原来增强免疫应答(体液应答和/或细胞应答)，而 其它佐剂本身是强免疫原性的且据信它们协同地发挥功能。已知佐剂包括但不限于油和水 乳状液(例如，弗氏(Freund' s)完全佐剂和弗氏不完全佐剂)、白喉杆菌-parvuin、 Quil A、细胞因子诸如IL 12、Emulsigen-Plus⑧、卡介苗(Bacillus Calmette Guerin)、氢氧化 铝、葡聚糖、硫酸右旋糖苷、氧化铁、海藻酸钠、Bacto佐剂、某些合成高分子诸如聚氨基酸和 氨基酸共聚物、皂苷、石蜡油和胞壁酰二肽。佐剂还包括基因佐剂诸如在共接种的DNA中编 码的免疫调制分子，或CpG寡核苷酸。所述共接种的DNA可以与质粒免疫原在同一质粒构 建中或在单独DNA载体中。 根据本发明的优选实施方式，所述组合物还可包含多糖(polyosidic)抗原，诸如 W0 2005/003995中所述多糖抗原。例如，设想的多糖抗原可以为但不限于对应于目的菌株 的0侧链(血清型的要素)的合成多糖，特别是那些优选考虑其高流行率的血清型福氏志 贺氏菌2a、lb及3a、痢疾志贺氏菌1和宋内氏志贺氏菌。还可用从相似血清型的细菌培养 物中提取的脂多糖(LPS)解除所设想的多糖抗原的毒性。
处理方法和组合物 本发明所设想的IpaD多肽或功能性衍生物、编码它们的多核苷酸或功能性片段 及抗体可以多种方式用于志贺氏菌感染的治疗和/或预防，或用于阻断志贺氏菌菌株侵入 允许细胞。 例如，且根据本发明的一个方面，所述IpaD多肽可作为免疫原用于特异性抗IpaD 中和抗体的产生。如前所述，可以使用适当的已知筛选方法来确定适合的抗IpaD中和抗 体，例如通过测量特定抗体阻碍或阻断志贺氏菌菌株侵入细胞的能力。
根据另一方面，编码IpaD多肽或其衍生物的多核苷酸可用在DNA免疫方法中以产 生抗IpaD中和抗体。亦即，可将它们并入在注射后可复制和表达的载体中从而在体内产生 所述抗原多肽。例如，可将多核苷酸合并到在CMV启动子控制下的在真核细胞中有功能性 的质粒载体中。优选的是将所述载体进行肌肉注射。 本发明的多核苷酸在基因免疫中的使用将优选地采用适当的输送方法或输送系 统诸如质粒DNA在肌肉中直接注射[Wolf等H M G(1992) 1 :363 ;Tumes等，Vaccine (1999)， 17 :2089 ;Le等，Vaccine (2000) 18 :1893 ;Alves等，Vaccine (2001) 19 :788]、 带佐 剂或不带佐剂的质粒DNA注射[Ulmer等，Vaccine (1999) 18 :18 ;MacLaughlin等， J. ControlRelease(1998)56 :259 ;Hartikka等，Gene Then (2000) 7 :1171-82 ;Be読nisty and Reshef， PNAS USA(1986)83 :9551 ;Singh等，PNASUSA(2000)97 :811]、通过与特异性 载体复合的DNA的传输来耙向细胞[Wa等，J Biol Chem(1989) 264 :16985 ;Ch即lin等， Infect. Immun. (1999)67 :6434]、注射复合或封装于各种脂质体形式中的质粒[Ishii等， AIDS Research and Human Retroviruses(1997) 13 :142 ;Perrie等，Vaccine(2001) 19 : 3301]、用不同轰击方法的DNA的施用[Tang等，Nature (1992) 356 :152 ;Eisenbraun等， DNA Cell Biol (1993) 12 :791，Chen等，Vaccine(2001) 19 :2908]以及带活性载体的DNA的 施用[Tubulekas等，Gene (1997) 190 :191 ;Pushko等，Virology (1997) 239 :389 ;Spreng等FEMS (2000) 27 :299 ;Dietrich等，Vaccine (2001) 19 :2506]。 本发明的另一方面是被动免疫的特异性抗IpaD中和抗体的使用。 此外，本发明的另一方面是提供治疗和/或预防动物中的志贺氏菌感染的方法。
本发明所述方法包括对所述动物施用本发明的组合物的步骤。 此外，本发明的另一方面是提供阻断至少一种志贺氏菌血清型侵入允许细胞的方 法，所述方法包括允许通过将抗IpaD中和抗体与能感染所述允许细胞的志贺氏菌菌株接 触来形成免疫复合物的步骤，所述免疫复合物防止或显著降低了所述志贺氏菌菌株对允许 细胞的侵入。 本发明的组合物的成分或组成部分的量优选为治疗有效量。设想成分的治疗有效 量是允许所述组合物执行其免疫学作用(例如产生抗IpaD中和抗体)而不会在所述组合 物所施用的宿主中造成过度副作用所必须的量。待使用的成分和待施用的组合物的确切量 将根据诸如受治疗的病况类型、待治疗的动物的类型和年龄、施用模式以及所述组合物中 的其它成分等因素而变化。 本发明的组合物可通过各种施用途径给予动物。例如，所述组合物可以以诸如无 菌可注射水性悬浮液或油状悬浮液的无菌可注射制剂形式施用。这些悬浮液可根据本领域 内已知技术使用适当的分散剂或润湿剂和悬浮剂来配制。所述无菌可注射制剂也可为在肠 胃外可用的无毒稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液。可以将它们在肠胃外施用， 例如静脉内、肌肉内或皮下注射、输注或口服。适当剂量可以取决于诸如所述组合物内各成 分的量、所需效果(短期或长期)、施用途径、待治疗的动物的年龄和体重等因素而变化。任 何其它本领域内熟知的方法也可用于本发明的组合物的施用。 本发明的另一方面是提供用于本发明所设想的任何上述方法中的试剂盒。 一个试 剂盒可以包含执行预定检测所必须的两个或多个成分。所述成分可为化合物、试剂、容器和 /或装置。例如，试剂盒内的一个容器可容纳特异地中和IpaD蛋白的单克隆抗体或其片段 或多克隆抗体。另外的一个或多个容器可包含待用于所述检测的组成部分诸如试剂或缓冲 液。本发明所设想的其它试剂盒可包含如上所述的至少一个IpaD多肽或编码它的多核苷 酸以引导对抗志贺氏菌IpaD蛋白的中和免疫应答。 参考下列实施例将使本发明更易于理解。这些实施例是对本发明的广泛应用范围 的说明性实施例而并非旨在限制本发明的范围。可以在其中进行修改和变化而不背离本发 明的主旨和范围。尽管在实践中可以使用任何与本文所述相似或等同的方法和材料，在下 文中将对优选的方法和材料进行说明。
实施例 大量革兰氏阴性病原菌使用第III型分泌(T3S)系统来将毒性蛋白注入动物和植 物宿主细胞内。所述T3S装置的核心被称为针状复合体，由横穿两层细菌膜的基本主体和 伸出细菌表面上方的针组成。在福氏志贺氏菌中，要求IpaD在细菌与宿主接触前抑制T3S 装置的活性，且已经提出IpaD协助细菌蛋白转移侵入宿主细胞。本发明人通过对交联细菌 和轻度纯化的针状复合体的电子显微镜分析研究了 IpaD的定位。该分析揭示了针尖处的 显著致密体的存在。单颗粒分析、免疫标记和生化分析的组合表明IpaD形成了针尖处结构 的一部分。据显示抗IpaD抗体阻断了细菌侵入上皮细胞。
—般材料和方法
9
细菌菌株和生长培养基 本研究中使用的菌株是野生型福氏志贺氏菌5菌株M90T-Sm[13]，它的ipaD衍生 物SF622[14]。细菌在37t:的胰蛋白酶酪蛋白大豆培养液(TSB) (Sigma)中生长。
针状复合体(NC)的纯化 如文献[15]所述纯化NC。通过离心收集37t:的lL TSB中在指数生长期的细菌，重 新悬浮在25mL磷酸盐缓冲生理盐水中并在lmM二 (磺基琥珀酸亚胺基)辛二酸酯(BS3)的 存在下在37t:培养30min。添加lOOmM Tris-HCl到所述混合物中并在37。C培养15min。收 集BS3处理的培养物并将其重新悬浮在添加了 lmM苯甲基磺酰氟的冰冷裂解缓冲液(0. 5M 蔗糖，20mM Tris-HCl[pH 7. 5] ， 2mM EDTA， 0. 5mg/mL溶菌酶)中并在4t:培养45min然后 在37t:培养15min。将所得原生质球与0. 01% Triton X-100 —起培养30min然后用4mM MgCl2禾口 80 ii g/mL DNA酶(Sigma)在30。C处理20min。通过离心(20， OOOg， 4°C ， 20min)除 去碎片，膜组分通过离心(110，000g，4°C，30min)颗粒化并重新悬浮在TET缓冲液中(20mM Tris-HCl pH 7. 5， lmM EDTA， 0. 01 % Triton X-100)。如文献[16]所述用抗MxiJ、MxiN和 IpaD培育的抗体进行免疫印迹分析。
电子显微镜和图像分析 在辉光放电的镀碳铜网上用2X醋酸铀对全细胞和纯化NC样品进行负染色。电子 显微镜分析在工作于120kV的装有场发射枪的PhilipsCM120FEG型电子显微镜上进行。用 放大率为80， 000倍的4000SP 4K慢扫描CCD相机在样本等级以3.75 A的像素尺寸(二进 制存储图像后)记录图像，并用"GRACE"软件进行半自动样本选择和数据采集[17]。如文 献[15]所述进行包括多参考和非参考方法的单颗粒分析、多元统计分析和分类。对于免疫 标记，将纯化NC与亲和纯化的IpaD多克隆抗体(pAbs) —起在最终浓度0. 132ng/ y L下在 2(TC培养lh。如上所述对样品用2%醋酸铀进行染色并观测。
侵袭试验 在抗IpaD抗体(稀释1/2000 1/50)或抗IpaB抗体(1/50)存在下将2mL野生型 的培养液或指数生长期的mxiD菌株(0D6。。 为0. 4)在37。C培养lh并将细菌在含2105Hela 细胞的板上在2000g离心10min。在37。C培养lh后，在lh中用2mL EBSS冲洗细胞三次 并与含50iig/mL庆大霉素的2mL MEM介质一起培养。在用2mL EBSS冲洗三次后，将板与 0. 5%脱氧胆酸盐溶液在2(TC培养15min并稀释细胞裂解液然后点板到琼脂板上进行菌落 计数。 实施例1 :T3SA针尖处的显著结构 蛋白纯化过程倾向于选择不含有微弱相连的亚单元的最稳定复合体。近来，本发 明人揭示了低达0. 01%浓度的Triton-XlOO表面活性剂足以诱导NC从细胞膜释放(Sani 等，2006)。为检测与所述针相连的潜在性不稳定亚单元，本发明人在任何纯化前在细菌上 用B^进行了交联步骤。电子显微镜分析表明，在B^处理后，大多数细菌显示了在针尖尽 头处有额外致密体的附器(图1)。 如文献[18]所述在表面活性剂溶解细胞膜后从BS3处理的细菌中纯化NC。对含 足够数量的带针尖处额外致密体的NC的制备物进行结构分析。为计算孤立NC的二维投影 映射，用单颗粒分析对电子显微镜图像进行分析。本发明人选择了数百张NC图像，所述NC 带相对直而短的针端附器且长度接近45nm。平均化的NC清晰地显示了在针尖以及基本主
10体的上部附近致密体的存在(图2A和图2B ;也参见图4ENC的全图)。然而，NC在平均化 后由于针长度的变化而看上去有点模糊。当在屏蔽基部后将投影对齐并分类后获得了针部 分尖端的更锐利特征(图2C)。针尖的任何一端处致密体的存在是交联颗粒的平均映射的 显著特征。相反，由没有交联的野生型菌株制备的颗粒的平均映射显示了缺乏大多数这些 致密体的针(图2D F)。在这些样品中在交联制备物中存在强致密体的相同位置上可看 到微弱的致密体(箭头，图2E和2F)。这些结果表明，在不存在交联时，大多数纯化NC失 去了形成交联后观测到的致密体的额外分子。为鉴定形成T3SA针尖处的致密体的分子，本 发明人用缺乏IpaD表达的ipaD突变体进行了类似实验。需要IpaD与IpaB —起在没有诱 导剂时保持T3SA失活且一小部分IpaD与膜相连[9]。从BS3处理的ipaD突变体中纯化的 NC在针尖的任一端都没有显示致密体(图2G I)，这表明IpaD是该结构组成部分的一部 分或其组装所必需。 实施例2 : IpaD存在于T3SA针尖处 为测试IpaD是否构成所观测的致密体，用SDS-PAGE和免疫印迹分析了从BS3处 理的野生型细菌中纯化的NC(图3)。与由非交联细菌制备的NC相比(图3，右图，右列)， IpaD在由交联野生型细菌中制备的NC中富集，然而少量仍在非交联制备物中共纯化因而 确证了非交联NC的平均的针尖处微弱致密体。NC的主要成分MxiJ以相似量存在于所有制 备物中(图3)。使用识别T3S系统的细胞质成分的抗体的对照试验没有显示细胞内成分对 NC的任何污染(图3)，这表明制备物中IpaD的存在不是由于细胞质蛋白污染引起的。
为确认在NC尖端处检测到的致密体含有IpaD，本发明人使用抗IpaD血清进行了 免疫染色。抗体特异性地结合到了由BS3处理的野生型细菌制备的NC的针尖(图4A D)。 还观察到某些针与它们的尖端相连，推测是与带两个针的二价抗体相互作用的结果(左下 图，图4D)。在对照实验中，没有发现与从ipaD突变体中分离的NC的针相结合的抗体(数 据未显示)。 实施例3 :抗IpaD抗体阻断细菌侵入上皮细胞 由于IpaD是细菌侵入上皮细胞所必需[14]，且由于如本文所示IpaD位于T3SA 的尖端，本发明人研究了抗IpaD抗体是否会干扰细菌侵入HeLa细胞。将细菌与不同浓度 的抗IpaD血清一起培养，或与抗IpaB血清一起培养作为对照，使用所述细菌感染HeLa细 胞。细菌在抗IpaD血清而非抗IpaB血清中的暴露以剂量依赖的方式抑制了细菌侵入。用 抗IpaD抗体的处理还抑制了福氏志贺氏菌2a菌株的侵入(数据未显示)。
关于实施例1 3的一般性讨论 在细菌与上皮细胞接触后，福氏志贺氏菌T3SA被激活且通过ipaB或ipaD的失活 而去调制。本发明提出这些蛋白是形成连接T3SA的复合体所必需。本文中，本发明人提出 了 IpaD存在于针尖处的证据。来自交联细菌的表面暴露的针的透射电子显微照片显示在 针尖处存在显著结构，而轻度纯化的NC的免疫印迹分析表明IpaD与所述交联NC —起被共 纯化。 从交联野生型细菌分离的NC的计算平均图显示了针尖任何一端处的显著致密 体。在从未用交联剂处理的野生型菌株和从用交联剂处理的ipaD突变体分离的NC中都 没有观察到该特征。免疫电子显微镜的结果表明在针尖处所观测到的致密体含有IpaD分 子。然而，无法从2D投影映射中获取所述额外致密体的确切形状。两个额外物质的维度为约7X7nm。由于IpaD的大小为37kDa，在这些结构中可能存在数个IpaD的拷贝。事 实上，已提出IpaD可形成寡聚物[19]。 IpaD存在某些与小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocolitica)的LcrV相似的结构相似性，因为所述两个蛋白具有相似大小且都是所提 出的转运子嵌入宿主细胞的细胞膜所必需，所述转运子为福氏志贺氏菌内的IpaB和IpaC 以及小肠结肠炎耶尔森菌内的YopB和UopD [9， 20， 21]。近期数据表明LcrV位于T3SA针的 尖端处[20]。耶尔森菌内的结构看上去与志贺氏菌内结构稍有不同，其侧面的伸出致密体 较小且尖端不同。 对T3Sa针尖处的含结构组成部分的IpaD的鉴定提供了对福氏志贺氏菌T3SA的 组成和结构的进一步认识。不久前还用生化方法显示了 IpaD定位在T3SA针尖，在那里它 发挥作用控制转运子分泌并正确嵌入宿主细胞膜[22]。然而，本发明的单颗粒分析直接显 示了 IpaD在针尖处的位置而且为IpaD在细菌与细胞接触前充当T3SA的接头的假设增加 了可信度。如同对耶尔森菌的LcrV所提出的一样，IpaD也可能帮助转运子的成分嵌入细 胞膜。通过用抗IpaD中和抗体处理来对细菌侵入HeLa细胞的抑制表明抗体与IpaD的结 合干扰了该蛋白的功能。在动物研究中也已显示LcrV是瘟疫疾病的保护性抗原[23，24]。 于是，IpaD代表了可有效对抗几种血清型的志贺氏菌的疫苗制剂的令人感兴趣的目标。
实施例4 :抗IpaD抗体在体内的保护性效果 将109CFU福氏志贺氏菌血清型5a单独或在不同稀释度的对IpaD特异的兔多克 隆血清存在下接种到运行于兔中的小肠髂肠管。所述抗IpaD多克隆血清在用由pMal-IpaD 表达载体表达的IpaD蛋白功能性衍生物进行免疫作用后产生，所述pMal-IpaD表达载体于 2007年10月10日保藏在CNCM，登记号为1-3839。该模型总结了在人类志贺氏菌痢疾期间 随着该肠侵袭性细菌对小肠上皮的撕裂、侵袭和炎性破坏而观察到的系列损伤。这些损伤 表现出小肠绒毛的形貌改变和水肿的组合，伴以炎性细胞滤出液，特别是多核中性粒细胞， 以及脓肿并最终在肠腔内形成溃疡。总之，这引起了通常为侵袭性的腔内粘液脓性渗出液。
通过比较仅接种了细菌的小肠肠管内与在抗IpaD多克隆血清存在下接受了细菌 的小肠肠管内的组织破坏，观察到了依赖于所述抗IpaD抗体浓度的保护性效果。事实上， 当所用血清未稀释时，未见任何损伤。然而，当所用血清为1/10稀释时，出现非常轻微的损 伤，而当使用1/100稀释时损伤更明显，但这些都没有在仅用细菌时观察到的严重。使用导 向非相关蛋白的对照多克隆血清没有观察到任何保护。因此，所观察到的保护特异地与抗 IpaD抗体的存在相关。
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权利要求
阻断至少一种志贺氏菌血清型侵入允许细胞的组合物，所述组合物至少包含下列组成部分之一-IpaD多肽或其功能性衍生物；-编码IpaD多肽的多核苷酸或其功能性片段；和/或-抗IpaD中和抗体。
2. 用于志贺氏菌感染的治疗和/或预防的组合物，所述组合物至少包含下列组成部分之一 -IpaD多肽或其功能性衍生物；-编码IpaD多肽的多核苷酸或其功能性片段；和/或-抗IpaD中和抗体。
3. 如权利要求l或2所述的组合物，其中所述IpaD多肽具有与SEQ ID NO:l相同或基本相似的氨基酸序列。
4. 如权利要求1或2所述的组合物，其中所述多核苷酸具有与SEQ ID N0:2相同或基本相似的核苷酸序列。
5. 如权利要求1 4中任一项所述的组合物，其中所述抗IpaD中和抗体是多克隆的。
6. 如权利要求1 4中任一项所述的组合物，其中所述抗IpaD中和抗体是单克隆的。
7. 如权利要求1 6中任一项所述的组合物，还包含多糖抗原。
8. 至少下列组成部分之一用于阻断至少一种志贺氏菌血清型侵入允许细胞的用途，所述组成部分包括-IpaD多肽或其功能性衍生物；-编码IpaD多肽的多核苷酸或其功能性片段；和/或-抗IpaD中和抗体。
9. 至少下列组成部分之一用于志贺氏菌感染的治疗和/或预防的用途，所述组成部分包括-IpaD多肽或其功能性衍生物；-编码IpaD多肽的多核苷酸或其功能性片段；和/或-抗IpaD中和抗体。
10. 如权利要求8或9所述的用途，其中所述IpaD多肽具有与SEQID NO:l相同或基本相似的氨基酸序列。
11. 如权利要求8或9所述的用途，其中所述多核苷酸具有与SEQID N0:2相同或基本相似的核苷酸序列。
12. 如权利要求8 11中任一项所述的用途，其中所述抗IpaD中和抗体是多克隆的。
13. 如权利要求8 11中任一项所述的用途，其中所述抗IpaD中和抗体是单克隆的。
14. 如权利要求8 13中任一项所述的用途，还包含多糖抗原。
15. 阻断至少一种志贺氏菌血清型侵入允许细胞的试剂盒，所述试剂盒包含-IpaD多肽或其功能性衍生物；-编码IpaD多肽的多核苷酸或其功能性片段；和/或_抗IpaD中和抗体。
16. 治疗和/或预防动物中志贺氏菌感染的方法，所述方法包括对所述动物施用如权利要求1 7中任一项所定义的组合物的步骤。
17. 阻断至少一种志贺氏菌血清型侵入允许细胞的方法，所述方法包括通过将抗IpaD中和抗体与能感染所述允许细胞的志贺氏菌菌株相接触而允许形成免疫复合物的步骤，所述免疫复合物阻止或显著降低所述志贺氏菌菌株对所述允许细胞的侵入。
18. 如权利要求17所述的方法，所述方法包括体内方法。
19. 如权利要求17或18所述的方法，其中所述抗IpaD中和抗体由包含所述允许细胞的宿主在对所述宿主施用IpaD多肽或其功能性衍生物和/或编码IpaD多肽的多核苷酸或其功能性片段后产生。
20. 如权利要求19所述的方法，其中所述IpaD多肽具有与SEQ IDNO :1相同或基本相似的氨基酸序列。
21. 如权利要求19所述的方法，其中所述多核苷酸具有与SEQ IDNO :2相同或基本相似的核苷酸序列。
22. 如权利要求17所述的方法，其中通过被动免疫宿主从而将所述抗IpaD中和抗体提供给包含所述允许细胞的宿主。
全文摘要
本发明涉及阻断志贺氏菌侵入动物细胞从而提供对抗志贺氏菌感染的保护或降低其严重性的组合物和方法。更具体而言，本发明涉及从天然来源和/或通过合成或重组技术获取的IpaD蛋白及其共轭体的使用以诱导具有对抗几种血清型的志贺氏菌特别是福氏志贺氏菌的保护性活性的中和抗体。本发明的组合物可用于预防和/或治疗由志贺氏菌属细菌造成的志贺氏菌痢疾。
文档编号A61K39/00GK101707918SQ200780046068
公开日2010年5月12日 申请日期2007年10月12日 优先权日2006年10月12日
发明者克劳德·帕索特, 埃格伯特·J·伯克马, 安妮·博蒂奥克斯, 穆萨·萨尼, 菲利普·桑索尼蒂, 阿德贝尔莫奈姆·阿拉奥伊 申请人:巴斯德研究院;国家健康与医学研究院;布鲁塞尔自由大学;格罗宁根大学